CN113281422B

CN113281422B - 一种保健食品中14种镇静安神类非法添加物的测定方法

Info

Publication number: CN113281422B
Application number: CN202011456547.4A
Authority: CN
Inventors: 彭小东; 杨燕红; 王雪蓉; 李红洲; 张建; 陈学航; 马义虔; 梁桂娟; 龙四红; 李清伟; 陈大鹏; 谈晓君; 彭祖茂; 安睿; 肖超
Original assignee: Guizhou Product Quality Inspection And Testing Institute
Current assignee: Guizhou Product Quality Inspection And Testing Institute
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2040-12-11
Also published as: CN113281422A

Abstract

本发明公开了一种保健食品中14种镇静安神类非法添加物的测定方法，包括如下步骤：(1)标准溶液的配制；(2)样品前处理；(3)建立标准对照品数据库；(4)含量测定。本发明以14种非法添加化合物(巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、氯硝西泮、马来酸咪达唑仑、硝西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、奥沙西泮、劳拉西泮、地西泮、氯氮卓)为研究对象，采用高效液相色谱法通过对色谱柱、流动相、扫描光谱波长等条件的选择建立一种可以同时测定安神类保健品中14种非法添加物的快速检测方法，为加强食品质量监管提供技术支撑。

Description

一种保健食品中14种镇静安神类非法添加物的测定方法

技术领域

本发明涉及食品检测领域，特别涉及一种保健食品中14种镇静安神类非法添加物的测定方法。

背景技术

随着社会的发展，人们的工作、生活节奏加快，压力变大，失眠多梦、焦虑不安正成为困扰人们的常见问题。因此，纯植物或纯中药成分的安神类健康产品非常受大众欢迎。而临床常用的巴比妥等镇静药物，虽具有较强的镇静催眠作用，但长期服用，会使人产生不良反应甚至是毒副作用。

目前有关安神类保健食品中的非法添加的筛查方法较少，按照国家食品药品监督管理局出台的补充检验方法和检验项目的批准件中的检测方法，针对保健食品中非法添加化学成分的检测方法主要有理化分析、薄层色谱法、高效液相色谱法、气质联用法及液质联用法等，但不同的非法添加化学物质涉及的前处理方法、所用分析仪器及条件均有所不同，部分方法的步骤复杂，缺乏系统性，给日常的监管带来不便。因此，日常工作中对安神类保健食品中的非法添加的筛查存在检测操作繁琐、分析时间过长等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能快速同时测定保健食品中14种镇静安神类非法添加物的测定方法。

一种保健食品中14种镇静安神类非法添加物的测定方法，包括如下步骤：

(1)标准溶液的配制

标准品：浓度为1.0mg/mL且纯度大于98.0％的氯氮卓(CAS：58-25-3)、马来酸咪达唑仑(CAS：59467-94-6)、硝西泮(CAS：146-22-5)、艾司唑仑(CAS：29975-16-4)、奥沙西泮(CAS：604-75-1)、阿普唑仑：(CAS：28981-97-7)、劳拉西泮(CAS：846-49-1)、氯硝西泮(CAS：1622-61-3)、三唑仑(CAS：28911-01-5)、地西泮(CAS：439-14-5)、苯巴比妥(CAS：50-06-6)、司可巴比妥(CAS：76-73-3)、异戊巴比妥(CAS：57-43-2)溶液和纯度大于98.0％的固体巴比妥(CAS：57-44-3)；

准确称取巴比妥固体标准品0.0100g于10mL的容量瓶中，加入色谱甲醇溶解后，定容至刻度，制得1.0mg/mL的巴比妥标准溶液；

准确移取14种质量浓度为1.0mg/mL的标准品溶液各0.25mL，色谱甲醇定容至5mL，摇匀，配制成50μg/mL的混合标准溶液；

(2)样品前处理

样品粉碎后混匀，胶囊取内容物，准确称取供试样品5.00g，加入30mL三氯甲烷中，超声处理20min，再放至室温，减压浓缩至近干，准确加入5mL色谱甲醇进行溶解后，过0.22μm有机膜得到待测试样；

(3)建立标准对照品数据库

取混合标准溶液加入高效液相色谱仪，流动相A相采用0.2％乙酸溶液，流动相B采用乙腈，以流速2.0mL/min、柱温35℃进行梯度洗脱，采用紫外检测器进行光谱检测，建立标准对照品数据库；

(4)含量测定

将待测试样加入高效液相色谱仪，采用与步骤(3)相同条件进行检测，并通过谱库检索，与标准谱库进行对比确证，得到检测结果。

在一些实施方式中，所述步骤(3)中的高效液相色谱仪采用Agilent Poroshell120EC-C₁₈色谱柱，所述色谱柱规格为100mm×4.6mm×2.7μm。

在一些实施方式中，所述色谱柱的梯度洗脱程序为：0～9min，78％A；9.01～12min，60％A；12.5～15min，78％A。

在一些实施方式中，所述步骤(3)中光谱检测的检测波长为210nm。

本发明的有益效果是：以14种非法添加化合物(巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、氯硝西泮、马来酸咪达唑仑、硝西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、奥沙西泮、劳拉西泮、地西泮、氯氮卓)为研究对象，采用高效液相色谱法通过对色谱柱、色谱流动相、扫描光谱波长等条件的选择建立一种可以同时测定安神类保健品中14种非法添加物的快速检测方法，为加强食品质量监管提供技术支撑。

附图说明

图1为本发明一种保健食品中14种镇静安神类非法添加物的测定方法标准品HPLC色谱图；

图2为本发明的方法检测的14种非法添加物质的全波长扫描图；

图3为本发明的方法中的褪黑素维生素B6胶囊空白样的HPLC色谱图；

图4为本发明的方法中的模拟阳性样品的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对发明作进一步详细的说明。

实施例1

一种实施方式的一种保健食品中14种镇静安神类非法添加物的测定方法，包括如下步骤：

仪器设备：Aglient1260II高效液相色谱仪(配DAD检测器)，美国安捷伦公司；冷冻离心机：美国贝克曼库尔特公司；旋转蒸发仪：东京理化器械株式会社；混匀振荡器：Heidolph公司。

色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C₁₈柱(100mm×4.6mm×2.7μm，美国安捷伦公司)；

镇静安神类保健食品：多个镇静安神类保健食品样品购买自超市和药店；

甲醇、乙腈色谱纯，德国Merck公司；乙酸、甲醇分析纯，国药集团；实验用水为经超纯水仪处理的一级水。

(1)标准溶液的配制

模拟阳性样品：取褪黑素维生素B6胶囊，加入适量上述14种标准品，充分混匀，静置过夜后，作为模拟阳性样品。

(2)样品前处理

(3)建立标准校正曲线

取50μg/mL混合标准溶液,用甲醇稀释成浓度梯度为2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL的标准工作液，高效液相色谱仪对其进行分析，流动相A采用体积浓度为0.2％乙酸水溶液，流动相B采用色谱乙腈，以流速2.0mL/min、柱温35℃进行梯度洗脱，采用紫外检测器以210nm的检测波长进行光谱检测，得到10μg/mL的标准品HPLC色谱图，参照图1。同时以各组分浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，建立标准校正曲线。

高效液相色谱仪采用Agilent Poroshell 120EC-C₁₈100 mm×4.6mm×2.7μm色谱柱。

色谱柱的梯度洗脱程序为：0～9min，78％A；9.01～12min，60％A；12.5～15min，78％A。梯度洗脱百分比例为体积比，梯度洗脱程序如下表1：

表1梯度洗脱程序

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)	流速(mL/min)
				0	78	22	2
9.00	78	22	2
				9.01	60	40	2
12.00	60	40	2
				12.50	78	22	2
15.00	78	22	2

现有技术中的液相方法采用等度洗脱法，14种化合物的分析时间大于60min。流动相采用等度洗脱方法，分析时间过长，不利于常规分析。而本发明采用上表1的此梯度程序下，各组分的峰形较好,分离度符合分析要求，分析时间短(15min左右)，并结合使用了粒径更小的色谱柱，使得各组分的得到了更好的分离效果。另外，乙酸溶液可促进电离，提高离子化效率，也有利于后期进行质谱分析方法的开发。

检测波长选择：采用紫外检测器，对14非法添加物质的标准溶液分别进行全波长扫描，光谱波长范围：190nm～400nm；得到14种非法添加物质的全波长扫描图，参照图2。由图2可知，210nm处为巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、氯硝西泮的最大吸收波长，220nm处为马来酸咪达唑仑、硝西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑的最大波长，230nm处为奥沙西泮、劳拉西泮、地西泮的最大波长，246nm处为氯氮卓的最大吸收波长，其实各组分在以上波长均有吸收，只是灵敏度有所不同，在比较了14种化合物在以上几个波长的检测灵敏度后，综合考虑检测灵敏度及效率值(无需切换波长)，方便定量，选用210nm作为14种化合物的检测波长。

(4)含量测定

实施例2

实施例1的方法按照GB/T 27417-2017的规定进行验证和确认，具体如下：

一、检出限、定量限及线性关系的考察

取50μg/mL的14种非法添加物的混合标准溶液贮备液，用甲醇稀释成浓度梯度为2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL的标准工作液，以各组分的质量浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，进行回归分析，绘制标准校正曲线；以3倍基线噪声(S/N＝3)所对应的浓度作为测定方法的检出限(LOD)浓度、10倍基线噪声(S/N＝10)对应的浓度作为定量限(LOQ)浓度，计算14种非法添加物的检出限和定量限。结果如表2所示。

表2 14种非法添加物质的线性关系、检出限和定量限

由表2可以看出，14种非法添加物的线性关系良好，线性相关系数(r)均大于0.9990，方法的检出限为0.06mg/kg～0.6mg/kg，定量限为0.2mg/kg～1.8mg/kg，说明该试验方法灵敏度好，准确度高。

二、精密度和稳定性试验

精密度和稳定性：取6个平行空白样品，加入14种混合标准品溶液，使每个空白样品最终的质量浓度为10mg/kg，按照1.3.4的方法进行前处理，上机，测定峰面积和保留时间；另外分别在0、2、4、8、24h各进样一次，记录不同时间点14种非法添加物的峰面积，计算相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)，结果见表3。

表3 14种非法添加物的精密度和稳定性

三、回收率试验

为考察该方法的准确性和可行性，实验选取某镇静安神类胶囊(阴性样品)，并向其中添加2.0mg/kg、4.0mg/kg和8.0mg/kg三个水平浓度的14种非法化学添加物的混合标准溶液，每组做3个平行实验，计算各成分的回收率及RSD，结果见表4，各成分的平均回收率为80.0％～101.5％，RSD＜10％，进一步说明本实验所建立的方法准确度高、精密度好，满足多种非法添加物分析的要求。

表4 14种非法化学添加物质的回收率实验结果(n＝3)

四、专属性实验

取模拟阳性样品及褪黑素维生素B6胶囊(空白样)，按照本试验方法进行提取、上机分析，褪黑素维生素B6胶囊HPLC色谱图见图3，模拟阳性样品色谱图见图4(波长均为210nm)。由图3、图4与图1对比可以看出，在与14种混合标准溶液相同的保留时间处，模拟阳性样品均检出光谱特征一致的色谱峰，说明本方法可以很好的排除保健食品种其他组分的干扰，可减少检测中假阳性的出现，方法专属性较好。

本发明的方法可适用于在上述14种非法添加物质同时检出，也可适用于在上述中14种非法添加物质减少一种或多种物质的检测。检测速度快、检测准确度高、精密度好、专属性较好，能满足多种非法添加物分析的要求。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。

Claims

1.一种保健食品中14种镇静安神类非法添加物的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）标准溶液的配制

标准品：浓度为1.0 mg/mL且纯度大于98.0%的氯氮卓、马来酸咪达唑仑、硝西泮、艾司唑仑、奥沙西泮、阿普唑仑、劳拉西泮、氯硝西泮、三唑仑、地西泮、苯巴比妥、司可巴比妥、异戊巴比妥溶液和纯度大于98.0%的固体巴比妥；

准确称取巴比妥固体标准品0.0100g于10mL的容量瓶中，加入色谱甲醇溶解后，定容至刻度，制得1.0 mg/mL的巴比妥标准溶液；

准确移取14种质量浓度为1.0 mg/mL的标准品溶液各0.25mL，色谱甲醇定容至5mL，摇匀，配制成50μg/mL的混合标准溶液；

（2）样品前处理

样品粉碎后混匀，胶囊样品取内容物，准确称取供试样品5.00 g，加入30 mL三氯甲烷中，超声处理20 min，再放至室温，减压浓缩至近干，准确加入5 mL色谱甲醇进行溶解后，过0.22μm有机膜得到待测试样；

（3）建立标准校正曲线

取50μg/mL混合标准溶液,用甲醇稀释成浓度梯度为2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL的标准工作液，高效液相色谱仪对其进行分析，流动相A采用0.2%乙酸溶液，流动相B采用乙腈，以流速2.0 mL/min、柱温35℃进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下表：

采用紫外检测器进行光谱检测，以各组分浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准校正曲线；

（4）含量测定

将待测试样加入高效液相色谱仪，采用与步骤（3）相同条件进行检测，并通过标准校正曲线定量，得到检测结果；

所述步骤（3）中的高效液相色谱仪采用Agilent Poroshell 120 EC-C₁₈色谱柱，所述色谱柱规格为100 mm×4.6 mm×2.7μm。

2.根据权利要求1所述的保健食品中14种镇静安神类非法添加物的测定方法，所述步骤（3）中光谱检测的检测波长为210nm。