CN113278606A - 在样品清理中再利用珠粒 - Google Patents

Abstract

本申请涉及在样品清理中再利用珠粒。本发明提供了通过使用表面活性剂而在不损失结合能力的情况下再利用珠粒和其它固体载体来分别捕获RNA和DNA的方法。

Description

在样品清理中再利用珠粒

技术领域

本发明涉及捕获核酸的方法。

背景技术

DNA和RNA鉴定和分析的方法已变得司空见惯。在分析之前，必须经常从制备核酸的复杂混合物中分离或捕获核酸。例如，分离mRNA是基因表达和基因调节分析中的重要步骤，且可在早期疾病检测和药物开发中具有不可估量的价值。

用于DNA和RNA捕获的常用方法使用磁性固体载体，例如磁珠。这些方法通过在珠粒表面使用一或多种配体将DNA或RNA结合到珠粒上。可获得多种对特定颗粒具有亲和力的配体。例如，经常使用涂布有对在mRNA分子一端处的腺苷(poly(A)+尾)均聚物具有亲和力的配体的珠粒来捕获mRNA。一种这样的用于mRNA捕获的珠粒涂布有脱氧胸苷(oligo dT)的均聚物。一旦将mRNA捕获在磁珠上，便可收集珠粒，可去除未结合的物质，可释放mRNA，可从RNA合成cDNA，且接着可分析cDNA。

不幸的是，一旦用于捕获特定核酸，固体载体可能会随着时间的流逝而开始显著丧失其结合能力。因此，一旦mRNA被捕获、释放且合成了cDNA，接着便必须使用一组新的珠粒来捕获cDNA。以这种方式使用两组不同的珠粒会限制RNA和DNA分析的自动化，且极大地增加与早期疾病检测和药物开发相关的成本。这使数百万罹患可治疗疾病的人们无法获得适当的治疗。

发明内容

本发明提供在不显著损失结合能力的情况下再利用珠粒和其它固体载体来捕获RNA和DNA的方法。这允许将单组珠粒重复用于捕获RNA和DNA，且允许简化RNA和DNA分析的自动化。这极大地降低了与RNA和DNA分析、疾病早期检测和药物开发相关的成本，从而确保可将此类分析用于推动治疗选择。

本发明通过使用表面活性剂实现了珠粒和固体载体的再利用。例如，可如下地使用单一固体载体来捕获RNA和DNA：通过首先在涂布有oligo dT的固体载体上捕获RNA，接着可释放捕获的RNA，且接着在表面活性剂存在下在固体载体上捕获DNA，而不损失结合能力。表面活性剂可为十二烷基硫酸钠(SDS)。有利地，使用的固体载体可为珠粒，例如磁珠。

本发明的特定优势为其在mRNA测序中的用途。例如，一旦捕获了mRNA，接着便可释放捕获的RNA，且从释放的RNA合成cDNA。接着可利用相同的珠粒来捕获从RNA合成的cDNA。接着可例如通过测序来分析捕获的DNA。使用单组珠粒允许通过装置自动执行核酸分析，而无需持续的用户输入。

附图说明

图1图示了再利用珠粒以捕获RNA和DNA的方法。

图2图示了再利用珠粒以捕获RNA和合成的cDNA的方法。

具体实施方式

本发明提供了通过使用表面活性剂而在不损失结合能力的情况下再利用珠粒和其它固体载体来分别捕获RNA和DNA的方法。对用于核酸选择和/或清理应用的功能化珠粒和其对应缓冲液进行表面处理，以发挥特定作用。在多步酶促工艺中，通常的做法是改变缓冲液和反应组分，以专门满足不同酶的需求。这通常是通过将核酸与固体载体结合且去除未结合的组分来完成的。磁珠是最常见的载体，其中一种这样的珠粒涂布有脱氧胸苷(oligo dT)的均聚物。此珠粒用于捕获在一端具有腺苷(poly A尾)均聚物的信使RNA分子(mRNA)。可将核酸结合，收集珠粒，去除含有未结合物质的溶液，且将核酸再悬浮于新鲜溶液中。

在本发明中，通过使用表面活性剂，这些珠粒最初用于捕获且富集RNA(例如mRNA)，且接着在不同溶液中重整以用于通用DNA结合。可将表面活性剂提供至含有RNA和/或DNA的样品中的固体载体。

本发明允许oligo dT涂布的珠粒在对DNA序列无偏好的情况下用于结合和纯化DNA的更一般目的。通过使单一珠粒类型能够执行两种不同的功能，所述方法能够以较低的成本执行RNA分离和分析。oligo dT珠粒可用于DNA分离的一般目的，而不会因重复使用而显著降低珠粒的DNA结合能力。在不限于单一理论的情况下，先前曾认为分子以正常加工不可逆的方式与珠粒表面上的oligo dT相互作用。通过本发明，确定了待与少量表面活性剂(例如SDS)结合的样品的预处理最小化或消除了表面的不可逆结垢。

将洗涤剂与oligo dT珠粒一起使用先前已被用来增强珠粒对含poly A的片段的选择性，但无法最小化或消除表面结垢，以用于后续DNA捕获。相反，先前必须使用两种不同类型的珠粒进行RNA和DNA捕获，且在每次使用后替换这些珠粒，例如通过使用oligo dT涂布的珠粒进行RNA捕获，且用SPRI珠粒替换这些珠粒以进行DNA捕获。通过本发明，在不同的缓冲条件下，发现SDS总体上提高了所有核酸物种的结合效率。因此，本发明允许将这些珠粒用作DNA分离中更典型的SPRI珠粒的直接替代物。这进一步使得能够使用单一珠粒类型，其中在一些缓冲条件下，所述珠粒用于选择/富集含poly A的RNA物种，且在不同的缓冲和结合条件下，依次结合双股DNA。

在整个本发明的捕获方法中，包括在核酸捕获和洗脱以及洗涤和珠粒重整步骤中，都可使用低离子强度缓冲液。低离子强度通常是指含有小于50mM盐(例如NaCL)，且优选小于10mM或不含除了缓冲液本身中存在的离子以外的其它盐的溶液。示例性的低离子强度溶液可包含以下中的一或多种：10mM或更低的Tris-Cl、0.1mM或更低的EDTA或4mM或更低的MgCl₂。

通过本发明的方法捕获的核酸可来自任何样品物质，例如生物样品。生物样品可含有病毒或细胞物质，例如原核细胞和真核细胞。生物样品可包含非哺乳动物细胞或哺乳动物细胞，例如人类细胞。核酸还可来自经历了一或多个处理步骤，例如PCR和/或核酸分离的样品。

本发明的方法可分别在用于RNA和DNA捕获的任何已知组合物中进行。可将组合物的组分作为单一溶液添加至样品中，或可将组合物的组分分别添加至样品和/或固体载体中。当首先捕获RNA时，样品组合物可包含表面活性剂。组合物可进一步包含拥挤剂(crowding agent)，例如聚乙二醇(PEG)和/或盐。

可利用一或多个洗涤步骤从珠粒中释放RNA和DNA。可使用任何已知的洗涤缓冲液。RNA和DNA也可通过加热珠粒和/或核酸来释放。用于再利用珠粒的表面活性剂可以是任何已知的表面活性剂。有利地，表面活性剂可以是阴离子去污剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)或其它碱金属烷基硫酸盐。

固体载体可以是可涂布有oligo dT且对DNA具有亲和力的任何已知的固体载体。例如，有利地，固体载体可具有弱或强带正电或疏水的功能性表面。固体载体可以是珠粒、颗粒、薄片、凝胶、过滤器、毛细管、管、板或孔。固体载体可以是磁性或顺磁的。磁性固体载体的优点是使用磁场易于分离，而无需利用更费力的方法，例如离心分离。例如，固体载体可以是由被磁铁矿和/或羧基分子层包围的聚苯乙烯制成的顺磁珠粒，例如具有与SPRI珠类似的表面特征的珠粒。SPRI珠粒可如以引用的方式并入的丹吉利斯(Deangelis)等人(1995)“用于分离PCR产物的固相可逆固定化(Solid-phase reversible immobilizationfor the isolation of PCR products)”,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》23(22):4742-3中所述。

可如下地使用单一固体载体来捕获RNA和DNA：通过首先在表面活性剂存在下在涂布有oligo dT的固体载体上捕获RNA，接着可释放捕获的RNA，且接着在固体载体上捕获DNA，而不损失结合能力。表面活性剂可为十二烷基硫酸钠(SDS)。有利地，使用的固体载体可为珠粒，例如磁珠。

图1图示了再利用珠粒以分别从单一样品捕获RNA和DNA的示例性方法。将包含RNA、DNA和表面活性剂(例如SDS)的样品103引入至oligo dT涂布的珠粒109。基于oligo dT对RNA poly A拖尾的亲和力，将样品中的RNA与oligo dT涂布的珠粒结合。珠粒与样品分离，且从珠粒中释放出RNA。接着将现在不含RNA的样品103重新引入至珠粒109中，且例如通过珠粒与DNA之间的电荷相互作用将DNA结合至珠子。接着从珠粒中释放出DNA，且可分析RNA和DNA中的每一个。

图2图示了再利用珠粒以捕获从样品中的RNA合成的cDNA的示例性方法。将包含RNA和表面活性剂(例如SDS)的样品203引入至oligo dT涂布的珠粒109。基于oligo dT对RNA poly A拖尾的亲和力，将样品中的RNA与oligo dT涂布的珠粒结合。珠粒与样品分离，且从珠粒中释放出RNA。接着从RNA合成cDNA，且将其引入至新样品中。将cDNA样品与含有SDS的结合缓冲液混合，接着引入至珠粒109，且将cDNA结合至珠粒。然后从珠粒释放出cDNA，且可例如通过测序来分析cDNA。

可通过任何已知方法从RNA合成cDNA。例如，在一个有利实施例中，可用oligo dT引发cDNA合成，且可在释放RNA之前在珠粒上进行cDNA合成。也可通过任何已知方法对DNA进行测序，例如使用下一代测序(NGS)平台。DNA可在分析之前被扩增，例如通过PCR。DNA可能会扩增，同时仍与固体载体结合。

通过利用单个固体载体或一组珠粒，本发明允许由装置自动执行RNA和DNA的分离，而无需用户输入或每次分离输入新的珠粒。例如，珠粒可在装置内。因此，一旦将样品103或203引入105或205至装置中，所述装置可在没有用户输入或具有有限的用户输入的情况下自动进行101或201的方法。本发明的方法可在没有大量的用户输入的情况下由装置执行，例如仅需单个用户输入即可从提供至装置的样品中分离RNA且对其进行测序，从而进一步降低了与核酸分离相关的成本。

实例

实例1：台式方法。

生成RNA-Seq库，其中所有纯化步骤均使用单组oligo dT磁珠(通用电气医疗(GEHealth Care)，Ser-Mag oligo dT珠)来执行。按照供应商的建议，将100ng衍生自K562细胞系的总RNA与35μl的Oligo dT珠粒混合。退火后，将珠粒牵拉到管的侧面，且丢弃含有任何未结合RNA的溶液。按照供应商的建议，将珠粒再悬浮且洗涤。收集珠粒且丢弃洗涤缓冲液。将结合的RNA在20μl的RNA片段化缓冲液(帝肯集团有限公司(Tecan Group Ltd.)，通用RNA-Seq)中洗脱，且根据建议在94℃下培育7分钟。收集珠粒，且将片段化的RNA转移至新管中。

将oligo dT珠粒再悬浮于40μl含有21％PEG 4000、2.5M NaCl、50mM Tris、0.1mMEDTA和0.03％SDS的重整溶液(珠粒结合缓冲液)中。

将来自通用RNA-Seq试剂盒(帝肯集团有限公司)的逆转录酶预混液(5μl)添加至片段化的RNA中，混合且按照建议在25℃下培育5分钟，在42℃下培育15分钟且在70℃下培育15分钟。培育后，添加50μl的第二链预混液(帝肯集团有限公司，通用RNA-Seq)，混合且在16℃下培育60分钟。反应混合物没有热变性，而是仅与重整的oligo dT珠粒(上文)混合。将珠粒在室温下培育，收集且丢弃溶液。这些珠粒用180μl的珠粒洗涤溶液冲洗，所述珠粒洗涤溶液含有13％PEG 8000、50mM LiCl、50mM Tris、0.1mM EDTA和0.01％Tween 20。洗涤后，在20μl的10mM Tris、1mM EDTA中将ds cDNA从珠粒洗脱，且转移至新管中。

将珠粒再悬浮于50μl上文所述的重整缓冲液(珠粒结合缓冲液)中，且保持在室温下直至需要。

将包括测序衔接子的连接预混液(帝肯集团有限公司，通用RNA-Seq)添加至dscDNA，且按照供应商的建议进行培育。连接后，将反应混合物直接添加至重整的oligo dT珠粒中，混合且保持在室温下。珠粒经洗涤(珠粒洗涤溶液)，且在20μl的10mM Tris，0.1mMEDTA中洗脱DNA。将洗脱的DNA转移至新管中，在其中按照建议执行股选择和PCR扩增(17个循环)。

像之前一样，将oligo dT珠粒再悬浮于50μl珠粒结合缓冲液中。

扩增后，将反应混合物与珠粒混合，保持在室温下，收集且冲洗，如先前所述。将DNA库从30μl TE缓冲液中的珠粒洗脱，定量，且确定片段长度分布(片段分析仪(FragmentAnalyzer)，安捷伦技术(Agilent Technologies))。产量(约300ng)和片段长度分布与在每个DNA纯化步骤中使用新鲜SPRI珠粒时通常所获得的一致。将这些库稀释且测序(MiSeq，伊鲁米那(Illumina))。对测序数据的分析证实，当在每个DNA纯化步骤中使用新鲜的SPRI珠粒时，检测到的基因数目与先前的经验一致，从而证实了本发明的珠粒重复使用方法的适用性。

以引用的方式并入

贯穿本发明已经参考且引用了其它文献，如专利、专利申请、专利公开案、期刊、书籍、论文、网络内容。所有此类文献在此出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

等效物

可在不脱离本发明的精神或本质特征的情况下，以其它特定形式体现本发明。因此，前述实施例被视为在所有方面都是说明性的，而不是对本文所述的本发明进行限制。因此，本发明的范围是由所附的权利要求书而不是由前述描述来指明的，并且在所述权利要求书的等效性的含义和范围之内的所有变化因此均打算涵盖于其中。

Claims (15)

1.一种使用固体载体来捕获RNA和DNA的方法，所述方法包含：

在低离子强度缓冲液中在涂布有oligo dT的固体载体上捕获mRNA；

释放所述捕获的mRNA；

添加表面活性剂、盐和拥挤剂，接着在所述固体载体上捕获DNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面活性剂是十二烷基硫酸钠SDS。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述固体载体是珠粒。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述珠粒是磁珠。

5.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含从所述释放的mRNA合成cDNA的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述捕获的DNA是从所述mRNA合成的cDNA。

7.根据权利要求6所述的方法，其进一步包含对所述DNA进行测序的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法由装置在无用户输入的情况下自动执行。

9.一种在固体载体上捕获核酸的方法，所述方法包含在固体载体上反复地捕获和释放核酸，而不在捕获之间使蛋白质变性或去除蛋白质。

10.根据权利要求9所述的方法，其进一步包含在捕获之前将表面活性剂引入至包含所述核酸的样品。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述表面活性剂是十二烷基硫酸钠SDS。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述固体载体是珠粒。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述珠粒是磁珠。

14.根据权利要求9所述的方法，其中所述核酸包含mRNA和cDNA。

15.根据权利要求10所述的方法，其中所述cDNA是在捕获之间从所述mRNA合成。

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