CN115820602A - 一种融合蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种融合蛋白及其应用，所述融合蛋白包括dCas9蛋白、激活子和无序区，其中，所述dCas9蛋白为失去内切酶活性的Cas9蛋白，用以在向导RNA的介导下，将所述融合蛋白精准地定位到目的基因转录起始位点前100～300碱基对的位置；所述激活子用以招募共调控因子并激活目的基因的转录；所述无序区为一段柔性蛋白序列，用以介导形成液‑液相分离。本发明通过在CRISPR/Cas9系统中引入相分离机制，利用蛋白无序区介导相分离，使得生物分子快速聚集并在局部形成高浓度，由此来提高CRISPR/Cas9系统的调控效率，能够更高效的激活基因表达，且介导基因激活精准、特异性高，同时使用成本低、操作方法简单。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种融合蛋白及其应用。
背景技术
基因调控对维持细胞稳态和正常的生理过程至关重要，随着后基因时代对基因调控的多层面和多维度解析，人们发现特定基因或者基因网络的调控紊乱与肿瘤发生发展、神经系统疾病等复杂疾病密切相关。为了研究基因调控网络在细胞活动中发挥的功能，对病理过程中的失调基因进行精准操控非常重要。虽然降低基因表达的技术已经较为成熟，但是基因表达上调通常只能通过外源导入cDNA的方法。然而，将长的cDNA进行病毒包装以及同时上调多个基因异构体是很困难的，而且大规模的cDNA文库构建成本也很高。
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，成簇的规律间隔的短回文重复序列)基因激活是基于CRISPR/Cas9的新型基于转录激活方法，通过将内切酶活性丢失的dCas9蛋白与转录激活调控元件(如VP64)融合，特异性地介导反式激活因子作用于目的基因的启动子，从而精准地激活其转录表达。因此，CRISPR基因激活的方法很好的克服了cDNA方法的问题，同时显著地降低了大规模基因表达上调的成本。
CRISPR/Cas9系统的发现及应用，极大地促进了现代生命科学的发展。失活的Cas9蛋白(dCas9)连接不同的调控单元，并通过sgRNA靶向到特定的DNA，可以实现转录以及表观等水平的调控，但现有的系统效率比较低，无法模拟特定基因在生理或者病理过程中的表达水平，其中一个重要的原因是特定位点的调控蛋白浓度不高。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种融合蛋白及其应用，旨在解决现有CRISPR/Cas9系统效率比较低的问题。
为实现上述目的，本发明提出一种融合蛋白，用于CRISPR/dCas9介导的基因转录激活，所述融合蛋白包括dCas9蛋白、激活子和无序区，其中，
所述dCas9蛋白为失去内切酶活性的Cas9蛋白，用以在向导RNA的介导下，将所述融合蛋白精准地定位到目的基因转录起始位点前100～300碱基对的位置；
所述激活子用以招募共调控因子并激活目的基因的转录；
所述无序区为一段柔性蛋白序列，用以介导形成液-液相分离。
可选地，所述融合蛋白的激活子为VP64，蛋白序列如SEQ ID NO：1所示。
可选地，所述融合蛋白的激活子为VPR，蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。
可选地，所述无序区为人FUS蛋白无序区，蛋白序列如SEQ ID NO：3所示。
可选地，述无序区为人EWS蛋白无序区，蛋白序列如SEQ ID NO：4所示。
可选地，所述无序区为人TAF15蛋白无序区，蛋白序列如SEQ ID NO：5所示。
进一步地，本发明还提出一种增强CRISPR/dCas9介导的基因转录激活的方法，包括以下步骤：
将如上所述的融合蛋白转入至细胞中，利用所述融合蛋白激活所述细胞中的目的基因转录表达。
可选地，所述融合蛋白通过连接核定位信号肽翻译后被运输至细胞核内，所述核定位信号肽的序列如SEQ ID NO：6所示。
可选地，所述目的基因为NTF3基因和/或ASCL1基因；和/或，所述细胞为HEK293T细胞。
更进一步地，本发明还提出一种如上所述的融合蛋白在制备基因治疗试剂中的应用。
本发明提供的技术方案中，融合蛋白包括dCas9蛋白、激活子和无序区，其中，所述dCas9蛋白为失去内切酶活性的Cas9蛋白，用以在向导RNA的介导下，将所述融合蛋白精准地定位到目的基因转录起始位点前100～300碱基对的位置，所述激活子用以招募共调控因子并激活目的基因的转录，所述无序区为一段低复杂度的柔性蛋白序列，用以介导形成液-液相分离，使得所述融合蛋白的局部浓度增加，以招募共调控因子，大幅增强目的基因的转录水平；如此，通过在CRISPR/Cas9系统中引入相分离机制，利用蛋白无序区介导相分离，使得生物分子快速聚集并在局部形成高浓度，由此来提高CRISPR/Cas9系统的调控效率，能够更高效的激活基因表达，且介导基因激活精准、特异性高，同时使用成本低、操作方法简单。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的融合蛋白的设计图；
图2为本发明提供的融合蛋白dCas9-VP64-FUS、融合蛋白dCas9-VP64-EWS和融合蛋白dCas9-VP64-TAF15对NTF3基因的激活效果测试图；
图3为本发明提供的融合蛋白dCas9-VP64-FUS、融合蛋白dCas9-VP64-EWS和融合蛋白dCas9-VP64-TAF15对ASCL1基因的激活效果测试图；
图4为对比融合蛋白dCas9-VP64-FUS-mut对NTF3基因的激活效果测试图；
图5为对比融合蛋白dCas9-VP64-FUS-mut对ASCL1基因的激活效果测试图；
图6为为本发明提供的融合蛋白dCas9-VPR-FUS对NTF3基因的激活效果测试图；
图7为本发明提供的融合蛋白dCas9-VPR-FUS对ASCL1基因的激活效果测试图；
图8为本发明提供的融合蛋白dCas9-VPR-FUS的脱靶效应分析结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
CRISPR/Cas9系统的发现及应用，极大地促进了现代生命科学的发展。失活的Cas9蛋白(dCas9)连接不同的调控单元，并通过sgRNA靶向到特定的DNA，可以实现转录以及表观等水平的调控，但现有的系统效率比较低，无法模拟特定基因在生理或者病理过程中的表达水平，其中一个重要的原因是特定位点的调控蛋白浓度不高。
鉴于此，本发明经研究发现，液-液相分离在染色体重塑和DNA转录等基因调控过程中发挥着重要的作用，通常，相分离由蛋白无序区介导，使得生物分子快速聚集并在局部形成高浓度，因此，基于蛋白的无序区可以在细胞内介导液-液相分离的特性，本发明提出一种用于CRISPR/dCas9介导的基因转录激活的融合蛋白，该融合蛋白的设计如图1所示。具体地，所述融合蛋白包括dCas9蛋白、激活子和无序区，其中，所述dCas9蛋白为失去内切酶活性的Cas9蛋白，用以在向导RNA的介导下，将所述融合蛋白精准地定位到目的基因转录起始位点前100～300碱基对的位置；所述激活子用以招募共调控因子并激活目的基因的转录；所述无序区为一段柔性蛋白序列，用以介导形成液-液相分离。
本发明提供的技术方案中，融合蛋白包括dCas9蛋白、激活子和无序区，其中，所述dCas9蛋白为失去内切酶活性的Cas9蛋白，用以在向导RNA的介导下，将所述融合蛋白精准地定位到目的基因转录起始位点前100～300碱基对的位置，所述激活子用以招募共调控因子并激活目的基因的转录，所述无序区为一段低复杂度的柔性蛋白序列，用以介导形成液-液相分离，使得所述融合蛋白的局部浓度增加，以招募共调控因子，大幅增强目的基因的转录水平；如此，通过在CRISPR/Cas9系统中引入相分离机制，利用蛋白无序区介导相分离，使得生物分子快速聚集并在局部形成高浓度，由此来提高CRISPR/Cas9系统的调控效率，能够更高效的激活基因表达，且介导基因激活精准、特异性高，同时使用成本低、操作方法简单。
具体地，在本发明的一些实施例中，所述融合蛋白的激活子为VP64，蛋白序列如SEQ ID NO：1所示。
在本发明的另一些实施例中，所述融合蛋白的激活子为VPR，所述VRP指VP64、p65和Rta，为三个转录激活子，其蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步地，在本发明的一些实施例中，所述无序区为人FUS蛋白(FUS RNA bindingprotein)无序区(第1至214号氨基酸)，蛋白序列如SEQ ID NO：3所示。
在本发明的另一些实施例中，所述无序区为人EWS蛋白(EWS RNA bindingprotein)无序区(第47至第266号氨基酸)，蛋白序列如SEQ ID NO：4所示。
在本发明的又一些实施中，所述无序区为人TAF15蛋白(TATA-Box BindingProtein Associated Factor 15)无序区(第1至208号氨基酸)，蛋白序列如SEQ ID NO：5所示。
也即，在本发明提供的所述融合蛋白的具体实施例至少包括以下6种融合蛋白：(1)激活子为VP64、无序区为人FUS蛋白无序区所得的融合蛋白dCas9-VP64-FUS；(2)激活子为VP64、无序区为人EWS蛋白无序区所得融合蛋白dCas9-VP64-EWS；(3)激活子为VP64、无序区为人TAF15蛋白无序区所得融合蛋白dCas9-VP64-TAF15；(4)激活子为VPR、无序区为人FUS蛋白无序区所得的融合蛋白dCas9-VPR-FUS；(5)激活子为VPR、无序区为人EWS蛋白无序区所得融合蛋白dCas9-VPR-EWS；(6)激活子为VPR、无序区为人TAF15蛋白无序区所得融合蛋白dCas9-VPR-TAF15。
基于本发明上述提供的融合蛋白，本发明还提出一种增强CRISPR/dCas9介导的基因转录激活的方法，包括以下步骤：将融合蛋白转入至细胞中，利用所述融合蛋白激活所述细胞中的目的基因转录表达，所述融合蛋白的构成参照上述实施例。具体地，在本发明提供的一些实施例中，所述融合蛋白通过连接核定位信号肽(NLS)翻译后被运输至细胞核内，所述核定位信号肽(NLS)的序列如SEQ ID NO：6所示。由于本发明上述实施例提供的所述融合蛋白通过在CRISPR/Cas9系统中引入相分离机制，从而介导形成液-液相分离，使得所述融合蛋白的局部浓度增加，以招募共调控因子，大幅增强目的基因的转录水平，因此本发明提供的增强CRISPR/dCas9介导的基因转录激活的方法相较于传统CRISPR/Cas9系统具有更高的调控效率，能够更高效的激活基因表达，且介导基因激活精准、特异性高，同时使用成本低、操作方法简单。
本发明提供的增强CRISPR/dCas9介导的基因转录激活的方法在理论上适用于所有的基因，具体地，在本发明的具体实施例中，所述目的基因为NTF3基因和/或ASCL1基因。也即，本发明提供的增强CRISPR/dCas9介导的基因转录激活的方法，至少可以实现增强NTF3(神经营养因子3)基因和/或ASCL1(Achartr-Scute家族bHLH转录因子1)基因的表达转录。
进一步地，本发明提供的增强CRISPR/dCas9介导的基因转录激活的方法也适用于所有细胞系，包括但不限于为人体细胞系、动物细胞系(例如试验小鼠细胞)，具体地，在本发明的具体实施例中，所述细胞为HEK293T细胞(人胚肾293细胞)，也即，本发明提供的利用所述融合蛋白增强NTF3基因和/或ASCL1基因表达转录的效果至少在HEK293T细胞中得到有效验证。
以下提供了以NTF3基因和ASCL1基因作为靶向激活基因，以HEK293T细胞作为载体细胞，对融合蛋白dCas9-VP64-FUS、融合蛋白dCas9-VP64-EWS和融合蛋白dCas9-VP64-TAF15增强激活基因表达转录的效果进行验证的具体方法及结论：
(1)分别构建表达融合蛋白dCas9-VP64、融合蛋白dCas9-VP64-FUS、融合蛋白dCas9-VP64-EWS和融合蛋白dCas9-VP64-TAF15的载体。
(2)以NTF3基因和ASCL1基因作为靶向激活基因，其中，靶向NTF3基因的向导RNA目标序列为GCGCGGCGCGGAAGGGGTTA，靶向ASCL1基因的向导RNA目标序列为TGGAGAGTTTGCAAGGAGC。目标序列对应的两条互补寡核苷酸链通过化学合成并同时在5’末端加入与酶切位点互补的4碱基对悬臂。两对互补的寡核苷酸链经过退火后，通过T4连接酶插入到BsmBI酶切的LentiGuide-Puro载体上。构成的载体通过U6启动子介导表达向导RNA，并表达嘌呤霉素抗性基因。同时，表达无靶点的对照向导RNA(AACCCCTGATTGTATCCGCA)的载体也通过同样的方式进行构建。
(3)在HEK293T细胞中比较上述融合蛋白对于NTF3和ASCL1基因的激活效果，表达融合蛋白dCas9-VP64、融合蛋白dCas9-VP64-FUS、融合蛋白dCas9-VP64-EWS和融合蛋白dCas9-VP64-TAF15的载体和仅表达dCas9蛋白的阴性对照载体，分别与表达靶向NTF3和ASCL1基因向导RNA载体以及无靶点向导RNA载体两两组合，通过PEI转染到HEK293T细胞中。经过24小时的细胞培养后，移除原有的DMEM培养基并加入新的带有嘌呤霉素的DMEM培养基进行筛选。经过48小时的嘌呤霉素筛选，剩余活细胞通过Trizol法进行RNA提取，后通过逆转录与实时荧光定量PCR的方法进行基因表达水平检验。
NTF3和ASCL1基因表达水平的检验结果分别如图2和图3所示。由图2和图3可以看出，接入FUS、EWS以及TAF15蛋白无序区的融合蛋白表现出比融合蛋白dCas9-VP64更高的NTF3以及ASCL1基因激活水平，而无靶点向导RNA与仅表达dCas9蛋白的对照组均未表现出明显的基因激活现象，说明本发明提供的以蛋白无序区增强基因激活表达的方法对dCas9-VP64系统有增强作用。
作为对比，本发明对表达融合蛋白dCas9-VP64-FUS的载体，通过在FUS蛋白无序区进行突变构建融合蛋白dCas9-VP64-FUS-mut载体，使FUS蛋白无序区不能介导液-液相分离，其中，突变后的FUS蛋白无序区(FUS-mut)的蛋白序列如SEQ ID NO：7所示。然后，将表达融合蛋白dCas9-VP64、融合蛋白dCas9-VP64-FUS和融合蛋白dCas9-VP64-FUS-mut的载体和仅表达dCas9蛋白的阴性对照载体，分别与表达靶向NTF3和ASCL1基因向导RNA载体以及无靶点向导RNA载体两两组合，共转入HEK293T细胞中，之后提取RNA并通过实时荧光PCR进行基因表达水平检测。
NTF3和ASCL1基因表达水平的检验结果分别如图4和图5所示。由图4和图5可以看出，融合蛋白dCas9-VP64-FUS依然可以增强dCas9-VP64基因激活系统，而突变的FUS无序区则失去了增强的作用，融合蛋白dCas9-VP64-FUS-mut仅表现出与融合蛋白dCas9-VP64类似的基因激活水平，而无靶点向导RNA与仅表达dCas9蛋白的对照组均未表现出明显的基因激活现象。
以下提供了以NTF3基因和ASCL1基因作为靶向激活基因，以HEK293T细胞作为载体细胞，对融合蛋白dCas9-VPR-FUS增强激活基因表达转录的效果进行验证的具体方法及结论：
(1)构建表达融合蛋白dCas9-VPR和融合蛋白dCas9-VPR-FUS的载体。
(2)在HEK293T细胞中比较上述融合蛋白对于NTF3和ASCL1基因的激活效果。表达融合蛋白dCas9-VPR和融合蛋白dCas9-VPR-FUS的载体和仅表达dCas9蛋白的阴性对照载体，分别与表达靶向NTF3和ASCL1基因向导RNA载体以及无靶点向导RNA载体两两组合，共转入HEK293T细胞，后通过上述同样的实验方法进行基因表达水平检测。
NTF3和ASCL1基因表达水平的检验结果分别如图6和图7所示。由图6和图7可以看出，接入FUS蛋白无序区的基于VPR的CRISPR基因激活系统表现出比融合蛋白dCas9-VP64更高的NTF3以及ASCL1基因激活水平，而无靶点向导RNA与仅表达dCas9蛋白的对照组均未表现出明显的基因激活现象，说明本发明提供的以蛋白无序区增强基因激活表达的方法对dCas9-VPR系统有增强作用。
另外，以下还提供了验证本发明提供的融合蛋白是否能准确的靶向目的基因的方法及结果，利用RNA-seq技术在HEK293T细胞中对融合蛋白dCas9-VP64-FUS进行了脱靶效应分析，方法如下：
(1)构建表达融合蛋白dCas9-VP64-FUS的载体。
(2)将表达融合蛋白dCas9-VP64-FUS的载体分别与表达靶向NTF3向导RNA的载体以及表达无靶点向导RNA载体组合，被共转入HEK293T细胞，通过与上述方法中相同的筛选、RNA提取后，RNA被用于mRNA测序文库构建，并通过Illumina双端150碱基对测序平台进行高通量转录组测序。测序数据通过Hisat2进行比对，FeatureCount进行定量，最后通过EdgeR进行差异表达基因分析。
分析结果如图8所示。从图8可以看出，相对于导入没有靶向基因的向导RNA的细胞，导入靶向NTF3基因的细胞表现出显著地NTF3基因表达上调，而在整个转录组水平上，导入两种向导RNA的细胞没有明显区别，说明本发明提供的融合蛋白dCas9-VP64-FUS能够准确地上调目的基因的转录而不会存在脱靶效应。
此外，本发明还提出一种融合蛋白在制备基因治疗试剂中的应用，所述融合蛋白的构成参照上述实施例，所述基因治疗试剂包括但不限于为含有所述融合蛋白的表达载体、表达细胞或者是药物组合物等等。利用本发明上述实施例提供的所述融合蛋白制成的基因治疗试剂更够更高效的激活基因表达，且介导基因激活精准、特异性高。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种融合蛋白，用于CRISPR/dCas9介导的基因转录激活，其特征在于，所述融合蛋白包括dCas9蛋白、激活子和无序区，其中，
所述dCas9蛋白为失去内切酶活性的Cas9蛋白，用以在向导RNA的介导下，将所述融合蛋白精准地定位到目的基因转录起始位点前100～300碱基对的位置；
所述激活子用以招募共调控因子并激活目的基因的转录；
所述无序区为一段柔性蛋白序列，用以介导形成液-液相分离。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的激活子为VP64，蛋白序列如SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的激活子为VPR，蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述无序区为人FUS蛋白无序区，蛋白序列如SEQ ID NO：3所示。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述无序区为人EWS蛋白无序区，蛋白序列如SEQ ID NO：4所示。
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述无序区为人TAF15蛋白无序区，蛋白序列如SEQ ID NO：5所示。
7.一种增强CRISPR/dCas9介导的基因转录激活的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将如权利要求1至6中任意一项所述的融合蛋白转入至细胞中，利用所述融合蛋白激活所述细胞中的目的基因转录表达。
8.如权利要求7所述的增强CRISPR/dCas9介导的基因转录激活的方法，其特征在于，所述融合蛋白通过连接核定位信号肽翻译后被运输至细胞核内，所述核定位信号肽的序列如SEQ ID NO：6所示。
9.如权利要求7所述的增强CRISPR/dCas9介导的基因转录激活的方法，其特征在于，所述目的基因为NTF3基因和/或ASCL1基因；和/或，
所述细胞为HEK293T细胞。
10.一种如权利要求1至6中任意一项所述的融合蛋白在制备基因治疗试剂中的应用。
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