CN113237936A - 基于邻位触及催化发卡探针自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于邻位触及催化发卡探针自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法，属于分子诊断技术领域，包含：针对靶序列lncARSR，程序化设计并化学合成检测探针H1和H2作为识别元件和放大元件，将检测探针H1滴加于金电极表面并在4℃冰箱孵育；将检测探针H2和靶序列lncARSR滴加于金电极表面共孵育40 min后用Tris‑Hcl溶液和Tris‑Hcl吐温溶液分别冲洗电极表面，后加入负载链霉亲和素标记的碱性磷酸酶的金属有机框架并孵育40min；用DEA溶液和DEA‑吐温溶液分别冲洗电极表面后再将金电极置于DEA溶液中2 min；在进行电化学信号检测；本发明的检测方法，可实现对靶序列lncARSR进行快速、灵敏和特异的电化学传感检测。

Description

基于邻位触及催化发卡探针自组装和金属有机框架的靶序列 lncARSR电化学检测方法
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，具体为一种基于邻位触及催化发卡探针自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法。
背景技术
据估计，2012年全球有33.8万名患者被诊断出患有肾癌，占人类癌症总负担的2-3%，这使得肾脏癌症成为第七大常见癌症；自20世纪90年代以来，肾脏的发病率癌症一直在稳步上升；因而，肾癌的新型检测技术开发具有重要临床价值。
研究显示，lncARSR除在肾癌的发生和发展扮演重要角色外，亦具有肾癌的组织特异性和癌症特异性，是重要的、特异性的肾癌诊断生物标志物；传统lncARSR检测方法，存在缺乏灵敏度、多步操作导致检测效率低，在实际应用中检测不便的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述背景技术困难，提供一种基于邻位触及催化发卡自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种基于邻位触及催化发卡自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法，包括以下步骤：
针对靶序列lncARSR，程序化设计和合成检测探针H1和H2作为识别元件，和放大元件；
将检测探针H1滴加于金电极表面，并在4℃冰箱过夜孵育，以制备检测探针H1锚定的电化学传感界面；
将检测探针H2和靶序列lncARSR滴加于金电极表面共孵育40 min，反应后用Tris-Hcl溶液和Tris-Hcl吐温溶液分别冲洗电极表面，后加入负载链霉亲和素标记的碱性磷酸酶的金属有机框架并孵育40分钟；
然后用DEA溶液和DEA吐温溶液分别冲洗电极表面分后，将金电极置于含α-萘酚底物的DEA溶液中2 min；在扫描电压-0.1-0. 5 V间进行电化学信号检测；观察50-150bp范围是否出现目的条带；
所述靶序列lncARSR的序列为：gucuggaucucagccagcccuaagagugug；
所述探针H1的序列为：
HS-(C12)TTTTTTGTCAGCTACCATCAACCACACTCTTAG/GGCTGGCTGAGATGTTGATGGTAGCTGACG；
所述探针H2的序列为：
Biotin-GGCTGGCTGAG/CGTCAGCTACCATCAACATCTCAGCCAGCC。
进一步，所述检测探针H1环部设计靶序列lncARSR互补序列，茎部设计一段含16bp碱基的互补序列，以形成稳定的双链结构。
进一步，所述H1探针的5’端进行巯基化修饰，以使检测探针H1通过金硫键锚定于金电极表面，从而形成检测探针H1锚定的电化学传感界面。
进一步，所述检测探针H2是用检测探针H1互补对应物设计。
本发明提供的一种基于邻位触及催化发卡探针自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法，具备以下有益效果：
本发明通过设计了检测探针H1、H2，在不存在靶序列lncARSR的情况下，检测探针H2环部设计检测探针H1茎部互补序列，其茎部设计一段检测探针H1环部序列，以执行程序化的邻位触及催化发卡结构自组装，从而作为信号放大元件；当存在靶序列lncARSR的情况下，检测探针H1作为识别元件通过环部互补序列与靶序列lncARSR进行识别和组装，形成双链结构，检测探针H2通过环部序列与检测探针H1茎部序列互补结合并组装成双链结构，此时检测探针H2茎环结构被打开，检测探针H2通过茎部序列与检测探针H1环部互补的序列进行杂交结合，从而形成稳定的H1- H2杂交组装体，并将lncARSR从检测探针H1上部分挤脱下来，而未挤脱下来部分作为铰链锚定在H1探针；所述lncARSR从检测探针H1上挤脱下来的序列能够与邻近的金电极上锚定的H1探针的环部进行识别杂交，并逐步从原先的检测探针H1上脱离下来，从而与邻近的检测探针H1形成新的lncARSR-H1双链结构；从而构成邻位触及发卡结构自组装反应，该反应逐步将形成大量H1- H2组装体，整个过程即为所构建的自组装信号放大元件；所述H1- H2组装体的H2上标记有生物素，可通过生物素-亲和素反应将负载碱性磷酸酶标记链霉亲和素的金属有机框架捕获于金电极表面，进而催化萘酚底物发生氧化还原反应，输出放大的电流信号；本发明提供的检测方法，可以实现对靶序列lncARSR进行简便、快速、灵敏和特异检测。
附图说明
图1为本发明实施例1中基于邻位触及催化发卡探针自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法的原理设计图。
图2为本发明实施例1中检测探针H1设计注释图。
图3为本发明实施例1中检测探针H2设计注释图。
图4为本发明实施例2中邻位催化发卡探针自组装电泳验证图。
图5为本发明实施例2中电极表面制备过程和电极表面分子组装反应过程阻抗表征图。
图6为本发明实施例2中有机金属框架制备及修饰的表征图。
图7为本发明实施例2中靶lncARSR浓度的电化学信号验证的曲线图。
图8为本发明实施例2中不同lncARSR浓度对数与电化学信号值所对应的模拟线性方程线图。
图9为本发明实施例2中检测新技术通过同源性序列电化学信号响应比对进行特异性分析图。
具体实施方式
下面结合本发明的具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述；所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部；基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种基于邻位触及催化发卡探针自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法，并非为了诊断检测疾病，本发明包括以下步骤：
针对靶序列lncARSR，程序化设计和合成检测探针H1和H2作为识别元件和放大元件；
将H1探针1μM，5 μL滴加于电极表面，并在4℃冰箱过夜孵育，以制备H1探针锚定的电化学传感界面；
将300 nM浓度的探针H2和浓度为10-15至10-9mol/L的靶lncARSR滴加于金电极表面共孵育40 min，反应后Tris-Hcl溶液和Tris-Hcl吐温溶液分别冲洗电极表面，后加入负载链霉亲和素标记的碱性磷酸酶的金属有机框架并孵育40分钟；
然后用DEA溶液和DEA吐温溶液分别冲洗电极表面分后，金电极置于含α-萘酚底物的DEA溶液中2 min；在扫描电压-0.1-0. 5 V间进行电化学信号检测；通过琼脂糖凝胶电泳进一步观察50-150bp范围是否出现目的条带，以验证检测过程按技术设计原理进行；
所述lncARSR的序列为：gucuggaucucagccagcccuaagagugug；
所述检测探针H1的序列为：
HS-(C12)TTTTTTGTCAGCTACCATCAACCACACTCTTAG/GGCTGGCTGAGATGTTGATGGTAGCTGACG；
所述检测探针H2的序列为：
Biotin-GGCTGGCTGAG/CGTCAGCTACCATCAACATCTCAGCCAGCC。
本发明检测探针H1环部设计靶序列lncARSR互补序列，茎部设计一段含16 bp碱基的互补序列，以形成稳定的双链结构；所述检测探针H1的5’端进行巯基化修饰，以使检测探针H1通过金硫键锚定于金电极表面，从而形成检测探针H1锚定的电化学传感界面，本发明所述检测探针H2是用检测探针H1互补对应物设计，所述检测探针H2环部设计检测探针H1茎部互补序列，其茎部设计一段检测探针H1环部序列，以执行程序化的邻位触及催化发卡结构自组装，从而作为信号放大元件。
本发明所述检测探针H1、H2，在靶序列lncARSR存在的情况下，检测探针H1作为识别元件通过环部互补序列与靶序列lncARSR进行识别和组装，形成双链结构，检测探针H2通过环部序列与检测探针H1茎部序列互补结合并组装成双链结构，此时检测探针H2茎环结构被打开，检测探针H2通过茎部序列与检测探针H1环部互补的序列进行杂交结合，从而形成稳定的H1- H2杂交组装体，并将lncARSR从检测探针H1上部分挤脱下来，而未挤脱下来部分作为铰链锚定在H1探针；所述lncARSR从检测探针H1上挤脱下来的序列能够与邻近的金电极上锚定的H1探针的环部进行识别杂交，并逐步从原先的检测探针H1上脱离下来，从而与邻近的检测探针H1形成新的lncARSR-H1双链结构。从而构成邻位触及发卡结构自组装反应，该反应逐步将形成大量H1- H2组装体，整个过程即为所构建的自组装信号放大元件；所述H1- H2组装体的H2上标记有生物素，可通过生物素-亲和素反应将负载碱性磷酸酶标记链霉亲和素的金属有机框架捕获于金电极表面，进而催化萘酚底物发生氧化还原反应，输出放大的电流信号。
实施例1
如图1为本发明基于邻位触及催化发卡探针自组装和金属有机框架的肾癌相关外泌体lncARSR电化学检测方法的原理设计图。
（1）本实施例中所用的生物探针的具体序列如表1所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（2）试剂及仪器
北京六一电泳分析仪（PowerPac Basic）用于电泳分析。上海辰华有限公司电化学工作站购660D用于电化学检测。ChemiDocTMMP用于凝胶电泳和凝胶成像（美国 Bio-Rad）。
（3）生物探针制备金电极界面制备
金电极先用水虎鱼溶液（H2SO4:H2O2=3:1）处理2次，每次5min。后用0.3 μM和0.05μM的铝粉在鹿皮上打磨，时长均为5 min。超声清洗金电极表面，再用水虎鱼溶液处理金电极5 min。金电极表面经去离子水清洗2次，随后用氮气将金电极表面吹干。H1报告探针（1μM，5 μL）滴加于电极表面，并于4°C冰箱过夜，以制备H1探针锚定的电化学传感界面。
（4）电泳表征
称取1.5克琼脂糖粉，并加至锥形瓶。后50 mL 0.5×TBE缓冲液加入至锥形瓶，经微波炉加热溶解，后加入goldview核酸染料，以配制成3%琼脂糖凝胶。凝胶每孔上样量为6μL反应体系溶液，之后在电压125 V恒压电泳25 min。在凝胶成像系统下进行结果拍照并保存。
（5）电化学检测
H2探针浓度均为300 nM，靶lncARSR浓度分别为1×10-15、1×10-14、1×10-13、1×10-12、1×10-11、1×10-10、1×10-9摩尔每升（mol/L）滴加于金电极表面共孵育40 min。反应后Tris-Hcl溶液和Tris-Hcl吐温溶液分别冲洗电极表面，后加入负载链霉亲和素标记的碱性磷酸酶的金属有机框架并孵育40分钟。DEA溶液和DEA吐温溶液分别冲洗电极表面分后，金电极置于含α-萘酚底物的DEA溶液中2 min。在扫描电压-0.1-0. 5 V间进行电化学信号检测。
实施例2
（1）可行性验证结果
琼脂糖凝胶（3%）电泳验证邻位催化发卡自组装反应，结果如图4所示。泳道1为500bp DNA marker（Takara），以作为电泳的分子量参考对照。泳道2、3和4分别为lncARSR、H1探针和H2探针单独存在体系对应条带。泳道5为lncARSR+H1反应体系电泳条带，可见一条相对于泳道2、3的一个滞后条带，这是由于lncARSR+H1组装形成大分子量DNA杂交体，从而导致电泳移动速率减慢。泳道6为组装链lncARSR+H1+H2反应体系电泳条带，与lncARSR+H1组装杂交体相比，条带进一步后置，这是由于lncARSR+H1+H2组装形成更大分子量DNA杂交体，从而导致电泳移动速率进一步减慢。该结果提示，邻位触及催化发卡自组装程序化反应按照设计原理图进行。
（2）电极制备和邻位催化发卡探针自组装过程表征结果
通过阻抗表征电极表面制备和邻位催化发卡自组装反应。阻抗结果如图5a-5c所示。步骤1为金电极经过水虎鱼处理和铝粉打磨清洗后所制备裸金电极（a）、步骤2为将巯基化H1探针滴加于金电极表面并经孵育12h后锚定于金电极表面（b）、制备步骤3为将lncARSR和H2探针同时滴加于金电极表面经反应后形成H1-H2探针杂交体（c）。阻抗图谱显示电阻逐步增大（a至c），这是由于随电极表面的核酸分子组装逐步阻碍了金电极表面电子传递，从而促使阻抗增加。该结果表明电化学传感界面制备成功且邻位催化发卡自组装反应按实验设计工作。
（3）有机金属框架电化学报告探针制备表征结果
有机金属框架（Metal-Organic Frameworks，MOF）中的UiO-66具有高稳定性，参照其制备文献（JAm Chem Soc.2008,130(42):13850-1; J Am Chem Soc.,2016,138(12):4178-85.）进行制备。在50 ml水热反应釜中分别加入5 ml水和9 ml甲酸混合后，加入955mg氨基对苯二甲酸配体，加热后超声3 min完全溶解配体。随后反应体系加入1.21g八水氧氯化锆，高温水热反应24小时；反应结束后冷却离心，所得固体经去离子水洗1次和乙醇洗3次后，真空烘箱60度真空干燥过夜，约得1.2g终产物（2COOH-UIO-66(Zr)）。扫描电镜表征产物如图6A所示，直径在160 nm左右。MOF由有机配体和金属离子或簇通过配位键自组装形成的高度有序有机-无机杂化晶态材料，具有多孔隙、高表面积和催化活性等，在生物传感器领用具有广阔应用前景。通过UiO-66表面的羧基与碱性磷酸酶标记链霉亲和素上（streptavidin–alkaline phosphatase，ST-AP）的氨基进行酰胺反应，即EDC-NHS反应（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride）和N-羟基琥珀酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide;1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione）反应），从而将碱性磷酸酶标记霉亲和素修饰在在MOF表面，即MOF@ST-AP。MOF@ST-AP电镜表征图如6B所示，直径在200nm左右。MOF@ST-AP与MOF相比，其直径增大，这是由于ST-AP修饰在MOF表面所致，电镜结果证明MOF的制备和修饰如实验设计。
（4）检测新技术灵敏度和线性范围结果
图7结果分别为lncARSR浓度在0 (a)、1×10-15 (b)、1×10-14(c)、1×10-13(d)、1×10-12(e)、1×10-11(f)、1×10-10(g)、1×10-9(h)、1×10-8(i)摩尔每升（mol/L）下多对应的电化学信号图谱，电化学信号峰值约在0.23 V，且随lncARSR浓度升高，电流值逐步增强。图8结果为靶lncARSR浓度与检测峰电流信号相关性分析。在lncARSR浓度为1×10-15mol/L到1×10-8mol/L范围间，浓度值对数与电流信号值存在线性相关，线性模拟方程为Y=3.81+0.23lgC (R2=0.9951)。根据3次空白实验信号值的均数与3倍标准差之和作为Y值代入线性方程，计算得最低检测为0.55 fM。
（5）检测新技术特异性结果
图9为电化学传感检测新技术通过同源性序列检测方法进行的特异性分析。通过靶lncARSR（a）、单碱基错配（b）、双碱基配对（c）和非完全错配（d）分别进行特异性信号分析。与空白（e）电化学信号相比，在浓度均为100 pM的情况下，不同靶序列所对应的电流曲线c、d电流信号值无显著变化，表明双碱基配对（c）同源序列和非完全错配（d）序列不能引发邻位触及催化发卡自组装，检测新技术具有高特异性。单碱基错配同源序列所对应信号（b）与空白信号（e）相比时，信号略有升高（e），但与靶lncARSR所对应电流信号（a）相比信号显著减小，表明检测新技术具有单碱基错配区分能力。图9结果表明本技术发明所设计构建电化学传感检测新技术具有单碱基错配区分能力，具有高特异性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
本发明的保护范围不仅限于上述公开的具体技术方案，以上所述仅为本实发明的较佳实施方式，并不能以此来限制本发明，凡是依据本发明的技术实质对以上具体技术方案所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于邻位触及催化发卡探针自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法，其特征是，包括以下步骤：
针对靶序列lncARSR，程序化设计并合成检测探针H1和H2作为识别元件和放大元件；
将检测探针H1滴加于金电极表面，并在4℃冰箱过夜孵育，通过探针H1巯基和金电极形成金硫键制备检测探针H1锚定的电化学传感界面；
将检测探针H2和靶序列lncARSR滴加于金电极表面共孵育40 min，反应后用Tris-Hcl溶液和Tris-Hcl吐温溶液分别冲洗电极表面，后加入负载链霉亲和素标记的碱性磷酸酶的金属有机框架并孵育40分钟，此步骤通过生物素-链霉亲和素反应将负载碱性磷酸酶的金属有机框连接于电极表面；
然后用DEA溶液和DEA-吐温溶液分别冲洗电极表面后，将金电极置于含α-萘酚底物的DEA溶液中2 min；碱性磷酸酶催化α-萘酚底物并在扫描电压-0.1-0. 5 V间收集电化学检测信号；
所述靶序列lncARSR的序列为：gucuggaucucagccagcccuaagagugug；
所述检测探针H1的序列为：
HS-(C12)TTTTTTGTCAGCTACCATCAACCACACTCTTAG/GGCTGGCTGAGATGTTGATGGTAGCTGACG；
所述检测探针H2的序列为：
Biotin-GGCTGGCTGAG/CGTCAGCTACCATCAACATCTCAGCCAGCC。
2.根据权利要求1所述的基于邻位触及催化发卡探针自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法，其特征是：所述检测探针H1环部设计靶序列lncARSR互补序列，茎部设计一段含16 bp碱基的互补序列，以形成稳定的双链结构。
3.根据权利要求1所述的基于邻位触及催化发卡自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法，其特征是：所述检测探针H1的5’端进行巯基化修饰，以使检测探针H1通过金硫键锚定于金电极表面，从而形成检测探针H1锚定的电化学传感界面。
4.根据权利要求1所述的基于邻位触及催化发卡探针自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法，其特征是：所述检测探针H1环部区域和lncARSR间特殊设计一段铆钉区促使lncARSR铆钉于探针H1，从而促使探针H2作为燃料链驱动lncARSR在邻位的探针H1上连续行走，构成邻位催化发卡结构自组装的单足分子机器。
5.根据权利要求1所述的基于邻位触及催化发卡探针自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法，其特征是：所述检测探针H2是用检测探针H1互补对应物设计，且通过生物素与负载链霉亲和素标记的碱性磷酸酶的金属有机框架发生连接反应。
6.根据权利要求1所述的基于邻位触及催化发卡探针自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法，其特征是：所述检测探针H2环部设计检测探针H1茎部互补序列，其茎部设计一段检测探针H1环部序列，以执行程序化的邻位触及催化发卡结构自组装，从而作为信号放大元件。
7.根据权利要求1所述的基于邻位触及催化发卡探针自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法，其特征是：所述检测探针H1、H2，在靶序列lncARSR存在的情况下，检测探针H1作为识别元件通过环部互补序列与靶序列lncARSR进行识别和组装，形成双链结构，检测探针H2通过环部序列与检测探针H1茎部序列互补结合并组装成双链结构，此时检测探针H2茎环结构被打开，检测探针H2通过茎部序列与检测探针H1环部互补的序列进行杂交结合，从而形成稳定的H1- H2杂交组装体，并将靶序列lncARSR从检测探针H1上部分挤脱下来，而未挤脱下来部分作为铆钉区结合在H1探针；所述靶序列lncARSR从检测探针H1上挤脱下来的序列能够与邻近的金电极上锚定的H1探针的环部进行识别杂交，并逐步从原先的检测探针H1上脱离下来，从而与邻近的检测探针H1形成新的lncARSR-H1双链结构；从而构成邻位触及发卡结构自组装反应，该反应逐步将形成大量H1- H2组装体，整个过程即为所构建的自组装信号放大元件；所述H1- H2组装体的H2上标记有生物素，可通过生物素-亲和素反应将负载碱性磷酸酶标记链霉亲和素的金属有机框架捕获于金电极表面，进而催化萘酚底物发生氧化还原反应，输出放大的电流信号。
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