CN113234788A - 一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法 - Google Patents

一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法 Download PDF

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Abstract

一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法以及筛选出的菌群，筛选步骤如下：收集富含微生物的鸡粪堆肥、两种菜田土壤和柠条作为混合菌源，并添加微生物活化剂生物炭和蚯蚓粪；利用微生物活性保持型的磷酸盐缓冲液制备混合菌源的悬浮液，收集混合菌源中的微生物；利用专化缺碳液体选择培养基，分别加入番茄、辣椒、茄子、黄瓜秸秆作为唯一碳源，进行限制性继代培养，筛选出能够特异性降解果菜类蔬菜秸秆的四种高效协同菌群。本发明能够有效筛选出特异性降解四种果菜类蔬菜秸秆的高效协同菌群，加快秸秆还田腐熟的进度，显著提高废弃秸秆资源的利用率，并以绿色环保的方式增加土壤有机质，提高土壤肥力。

Description

一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法
技术领域
本发明涉及微生物和农业废料处理技术领域，具体地，本申请提供了一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法及应用。
背景技术
我国是一个农业大国，在农业生产中会产生大量的秸秆，包括作物秸秆和蔬菜秸秆。我国蔬菜产业迅速发展，其中尤以番茄、辣椒、茄子和黄瓜为主要栽培园艺作物，相比粮食作物秸秆，这些蔬菜作物的蔬菜秸秆的含水量极高，不易燃烧，极容易腐烂，容易爆发病虫害，所以蔬菜秸秆的处理是目前设施生产中一个大问题。
在我国，大量秸秆被直接丢弃或者露天焚烧，既浪费了资源，又造成环境污染。秸秆还田腐熟是一种比较经济合理的利用方式，腐熟之后产生的养分可以归还到土壤，增加土壤有机质，改善土壤质量，提高作物产量。但是秸秆富含的木质纤维素结构复杂，直接还田的秸秆腐解缓慢并会影响下茬作物的正常生长。这就阻碍了秸秆还田腐熟的推广和普及。
降解秸秆的微生物菌剂可以加快秸秆还田腐熟的进度，降解秸秆的细菌、真菌或放线菌通过产生的纤维素降解酶可以加快秸秆的降解。大量研究表明由单菌株复配而成的复合菌系降解效果明显优于单菌株，多个菌株发挥协同作用，对秸秆的降解由明显的促进作用。市场上的微生物菌剂多是由几种纯培养的单菌株复配而成的复合菌系，由于原始菌种来源不同且是由人为复配而成，菌种之间的协同作用效果欠佳，腐熟还田后容易与土著菌发生拮抗作用，影响降解效果。近年来，许多研究以秸秆、动物粪便、堆肥、生物炭、麦田土、树林土、菜园土、草原土等多种样品为菌源，以秸秆为降解底物，通过多代的驯化和富集培养得到了多组秸秆降解菌系，这类复合菌系来自同一个自然环境，且经长期的自然选择和进化，菌种间已能相互适应，协同进化，也能协同发挥秸秆降解作用，降降效果明显好于人为复配的菌剂。
目前很多研究都集中在作物秸秆降解方面，对蔬菜秸秆降解的研究甚少。且多数研究的继代培养以滤纸条的降解程度作为指示，但是秸秆有着更为复杂稳定的木质纤维素结构，滤纸条无法准确地反映秸秆降解的情况和程度。
发明内容
一方面，本申请提供了一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)收集富含微生物的鸡粪堆肥、两种菜田土壤和柠条作为混合菌源，并添加微生物活化剂生物炭和蚯蚓粪；
2)利用微生物活性保持型的磷酸盐缓冲液制备混合菌源的悬浮液。收集混合菌源中的微生物；
3)利用专化缺碳液体选择培养基，分别加入番茄、辣椒、茄子、黄瓜秸秆作为唯一碳源，进行限制性继代培养，筛选出能够特异性降解果菜类蔬菜秸秆的高效协同菌群；
4)利用高通量测序技术进一步确定番茄、辣椒、茄子、黄瓜秸秆的协同降解菌群中细菌和真菌组成和丰度，从而构建出果菜类蔬菜秸秆的高效协同降解菌群。
进一步地，所述混合菌源配方为温室菜田土壤1、温室菜田土壤2、柠条和鸡粪堆肥、生物炭、蚯蚓粪，按照1:1:1:1:1的比例配置成10g的混合物；两种温室菜田土壤均是秸秆还田腐熟后的土壤；鸡粪堆肥、菜田土壤和柠条提供丰富的微生物组分，生物炭和蚯蚓粪可以活化微生物，促进微生物的生长繁殖。
进一步地，所述微生物活性保持型的磷酸盐缓冲液的具体配方为每升缓冲液中含有下列成分:K2HPO4 0.6618g，KH2PO4 0.1633g，MgSO4 0.1g,NaCl 6.5g，pH7.0。
进一步地，将10g混合菌源加入到100ml微生物活性保持型的磷酸盐缓冲液，在摇床上震荡培养1小时，制备混合菌源的微生物悬浮液，设置温度28℃，转速200rpm。
进一步地，所述专化缺碳液体选择培养基配方为每升培养基中含有下列成分：MgSO4·7H2O0.4g，K2HPO4 1.3238g，KH2PO4 0.3266g，CaCl2·2H2O 0.05g，FeSO4·7H2O，0.01g，MnSO4·H2O 2.1mg，ZnSO4·7H2O 0.25mg，pH7.0～7.5。
进一步地，所述样品秸秆是从温室收集拉秧期后的番茄、辣椒、茄子和黄瓜秸秆，将四种秸秆用烘箱高温烘干，先115℃杀青30min，再65℃烘干至恒重。把烘干后的秸秆剪成3-4cm小段。
进一步地，将混合菌源的微生物悬浮液按4％的接种量接种在专化缺碳液体选择培养基中，并分别加入番茄、辣椒、茄子和黄瓜小段秸秆作为培养基中的唯一碳源，在有氧条件下进行限制性富集培养，在空气摇床震荡培养15天，设置温度为30℃，转速为200rpm。将培养15天的混合菌液分别接种到对应的新的专化缺碳液体选择培养基中，继续震荡培养15天。如此连续限制性继代培养10代以上得到的混合菌液即为能够特异性降解番茄、辣椒、茄子和黄瓜秸秆的四种高效协同菌群。
进一步地，从继代培养得到的四种协同降解菌群中提取微生物的DNA，进行高通量测序，确定协同菌群中微生物的组成和丰度，比较四种协同菌群共有和独有的微生物种类。
进一步地，对限制性继代培养得到的四种高效协同菌群中的细菌进行高通量测序，测序的区间为原核生物核糖体rRNA的16S rDNA的V4区域，引物为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2；对四种高效协同菌群中的真菌进行测序，测序的区间是真核生物核糖体rRNA的ITS1和ITS2之间的区域，引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
另一方面，本申请提供了使用上述方法筛选出的番茄、辣椒、茄子或黄瓜秸秆的协同降解菌群。
进一步地，所述菌群包含说明书中表1-4中的任一种微生物。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法及应用，相较于其他研究以作物秸秆作为研究对象，本发明创新性地以蔬菜秸秆作为试验材料，即温室大规模种植的番茄、辣椒、茄子和黄瓜，探究了蔬菜秸秆的的协同降解菌群的高效分离方法。根据微生物的生长特性，通过简化秸秆的降解条件，利用专化培养基进行限制性继代培养，从而获得可以特异性降解果菜类蔬菜秸秆的潜在高效协同菌群，多菌株协同促进，加快秸秆的降解速度，有利于秸秆的还田腐熟。
本发明收集了富含多种微生物的鸡粪堆肥、两种秸秆还田后的温室菜田土壤和柠条并加入微生物活化剂生物炭和蚯蚓粪，配置成混合菌源，可最大程度地提高筛选出来的四种协同菌群中微生物的多样性和丰富度，增强菌株间的协同作用。
本发明利用的筛选培养基是一种专化缺碳液体选择培养基，该培养基的特点是可以协助微生物降解结构复杂的化合物，所以利用该培养基可以降解由木质纤维素构成的结构复杂稳定的秸秆。再通过在该缺碳培养基中分别加入烘干的番茄、辣椒、茄子和黄瓜秸秆作为唯一的碳源，可以直接筛选出能利用秸秆为碳源的协同菌群即可以降解秸秆的微生物协同菌群，排除其他干扰的微生物。通过连续多代的限制性培养，最终获得番茄、辣椒、茄子和黄瓜秸秆的四种稳定高效的协同降解菌群。
本发明利用高通量测序技术进一步确定四种协同降解菌群中细菌和真菌组成和丰度，比较四种协同菌群共有和独有的微生物种类，从而构建果菜类蔬菜秸秆的高效协同降解菌群。
附图说明
图1为番茄降解前后对比图；
图2为辣椒降解前后对比图；
图3为茄子降解前后对比图；
图4为黄瓜降解前后对比图；
图5为不同秸秆降解率对比图；
图6为番茄协同降解菌群的进化树；
图7为辣椒协同降解菌群的进化树；
图8为茄子协同降解菌群的进化树；
图9为黄瓜协同降解菌群的进化树。
具体实施方式
实施例1番茄、辣椒、茄子、黄瓜秸秆的协同降解菌群的筛选
1)采集样品
菌源获取：收集温室菜田土壤1、温室菜田土壤2、柠条和鸡粪堆肥、生物炭、蚯蚓粪，两种温室菜田土壤均是秸秆还田腐熟后的土壤。
秸秆获取：从温室收集拉秧期后的番茄、辣椒、茄子和黄瓜秸秆，用烘箱高温烘干，先115℃杀青30min，再65℃烘干至恒重。
2)驯化培养
称取温室菜田土壤1、温室菜田土壤2、柠条和鸡粪堆肥、生物炭、蚯蚓粪，按照1:1:1:1:1的比例配置成10g的混合物(温室菜田土壤1、温室菜田土壤2为不同的两种温室菜田土壤均是秸秆还田腐熟后的土壤)。
将10g混合菌源加入到100ml微生物活性保持型的磷酸盐缓冲液，在摇床上震荡培养1小时，制备混合菌源的微生物悬浮液，设置温度28℃，转速200rpm。
把烘干的番茄、辣椒、茄子和黄瓜秸秆剪成3—4cm小段，每种秸秆称取5g放入含有125ml专化缺碳液体选择培养基的250ml三角瓶中，用封口膜封好放入高压蒸汽灭菌锅，121℃灭菌20分钟。
待含有秸秆的培养基灭菌冷却至室温，按4％的接种量吸取混合菌液的微生物悬浮液5ml接种到125ml的专化缺碳液体选择培养基中，放置在空气摇床震荡培养，设置温度30℃，转速200rpm，驯化培养15天。
吸取培养了15天的混合菌液5ml分别接种到对应的新的125ml专化缺碳液体选择培养基中，其余方法同上，继续震荡培养15天。
如此连续限制性继代培养10代以上得到的混合菌液即为能够特异性降解番茄、辣椒、茄子和黄瓜秸秆的四种高效协同菌群。
其中，微生物活性保持型的磷酸盐缓冲液的具体配方为每升缓冲液中含有下列成分:K2HPO4 0.6618g，KH2PO4 0.1633g，MgSO4 0.1g,NaCl 6.5g，pH7.0。
专化缺碳液体选择培养基配方为每升培养基中含有下列成分：MgSO4·7H2O 0.4g，K2HPO4 1.3238g，KH2PO4 0.3266g，CaCl2·2H2O 0.05g，FeSO4·7H2O，0.01g，MnSO4·H2O2.1mg，ZnSO4·7H2O 0.25mg，pH7.0～7.5。
观察四种果菜类蔬菜秸秆的降解效果，如图1-4所示，驯化培养后瓶内产生大量气泡，瓶壁附有秸秆被降解后的丝状物。对比四种秸秆可知，番茄和黄瓜秸秆产生的气泡最多，丝状物也较多，降解效果较为明显。
3)测定复合菌系的降解率
将每代驯化培养15天后剩余的秸秆收集起来，用自来水冲洗3-4次直至将多余的菌体杂质冲洗干净，烘箱65℃烘干至恒重。计算秸秆降解率。秸秆降解率的测算公式为：
秸秆降解率％＝(W0-Wt)/W0×100％，式中：
W0：样品秸秆的干重；
Wt：培养t时间后秸秆干重。
图5结果表明，第10代继代培养后番茄、辣椒、茄子、黄瓜秸秆降解率分别是79.02％、42.99％、56.36％和76.11％。番茄和黄瓜秸秆的降解率不存在显著性差异，但番茄和黄瓜、辣椒、茄子秸秆间存在显著性差异。番茄和黄瓜秸秆的降解率显著高于辣椒和茄子，辣椒的降解率最低，茄子位于中间。可能的原因是因为番茄和黄瓜的木质化程度低，含有更多的纤维素和半纤维素便于降解，而茄子的木质化程度较高，含有更多的木质素不容易被降解掉。本发明中番茄、辣椒、茄子和黄瓜秸秆的协同降解菌群的降解效果，与其他相关研究相比表现出较高的降解率，特别是番茄和辣椒秸秆的协同降解菌群的降解率可以达到75％以上，显著性高于其他研究协同菌群的降解能力，可以满足后续的生产实践应用。
实施例2番茄、辣椒、茄子、黄瓜秸秆的协同降解菌群的高通量测序
4)提取协同降解菌群的DNA
选用提取DNA的试剂盒QIAGEN
Figure BDA0003015708620000051
DNA Isolation kit，按照实验步骤提取番茄、辣椒、茄子、黄瓜秸秆的协同降解菌群的DNA。
5)协同降解菌群的高通量测序
以提取的DNA为模板对番茄、辣椒、茄子、黄瓜秸秆的协同降解菌群中的细菌和真菌进行高通量测序：对协同降解菌群中的细菌进行高通量测序，测序的序列是原核生物核糖体rRNA的16S rDNA的V4区域，引物为515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'，SEQ ID NO.1)和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'，SEQ ID NO.2)；对协同降解菌群中的真菌进行高通量测序，测序的序列是真核生物核糖体rRNA中的ITS1和ITS2之间的区域，所用引物为ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'，SEQ ID NO.3)和ITS2R(5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'，SEQ ID NO.4)。
高通量测序结果初步展示了番茄、辣椒、茄子、黄瓜秸秆的协同降解菌群中细菌和真菌的种类和占比。将高通量测序结果中细菌的16S rDNA基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对,根据同源性在GenBank中寻找相似性最大的菌株的基因序列。采用MEGA5软件采用邻接法(Neighbor-Joining)进行系统发育进化树的构建,并用Bootstrap对进化树进行1000次可信度分析。
根据BLAST比对的结果，将番茄、辣椒、茄子、黄瓜秸秆的协同降解菌群的细菌高通量测序结果中占比大于1％的菌株的物种信息展示在表1-4，并将菌株的测序结果示于序列表。由表1-4可得，四种协同降解菌群的细菌组成存在显著差异，各自有独有的菌株。但不同的降解菌群中也存在共有的菌株，四种降解菌群都共有的菌株只有一种，为Leadbetterella byssophila(拟杆菌门，噬纤维菌科)。图6-9中的进化树则可以反映番茄、辣椒、茄子、黄瓜秸秆的协同降解菌群中细菌高通量测序结果中占比＞1％的各菌株的亲缘关系。
表1
Figure BDA0003015708620000061
Figure BDA0003015708620000071
表2
Figure BDA0003015708620000072
Figure BDA0003015708620000081
表3
Figure BDA0003015708620000082
表4
Figure BDA0003015708620000083
Figure BDA0003015708620000091
此实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
gctgcgttct tcatcgatgc 20

Claims (11)

1.一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)收集富含微生物的鸡粪堆肥、两种菜田土壤和柠条作为混合菌源，并添加微生物活化剂生物炭和蚯蚓粪；
2)利用微生物活性保持型的磷酸盐缓冲液制备混合菌源的悬浮液，收集混合菌源中的微生物；
3)利用专化缺碳液体选择培养基，分别加入番茄、辣椒、茄子、黄瓜秸秆作为唯一碳源，进行限制性继代培养，筛选出能够特异性降解果菜类蔬菜秸秆的高效协同菌群；
4)利用高通量测序技术进一步确定番茄、辣椒、茄子、黄瓜秸秆的协同降解菌群中细菌和真菌组成和丰度，从而构建出果菜类蔬菜秸秆的高效协同降解菌群。
2.根据权利要求1所述的一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法，其特征在于：所述混合菌源配方为温室菜田土壤1、温室菜田土壤2、柠条和鸡粪堆肥、生物炭、蚯蚓粪，按照1:1:1:1:1的比例配置成10g的混合物；两种温室菜田土壤均是秸秆还田腐熟后的土壤；鸡粪堆肥、菜田土壤和柠条提供丰富的微生物组分，生物炭和蚯蚓粪可以活化微生物，促进微生物的生长繁殖。
3.根据权利要求1所述的一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法，其特征在于：所述微生物活性保持型的磷酸盐缓冲液的具体配方为每升缓冲液中含有下列成分:K2HPO40.6618g，KH2PO4 0.1633g，MgSO4 0.1g,NaCl 6.5g，pH7.0。
4.根据权利要求1所述的一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法，其特征在于：将10g混合菌源加入到100ml微生物活性保持型的磷酸盐缓冲液，在摇床上震荡培养1小时，制备混合菌源的微生物悬浮液，设置温度28℃，转速200rpm。
5.根据权利要求1所述的一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法，其特征在于：所述专化缺碳液体选择培养基配方为每升培养基中含有下列成分：MgSO4·7H2O0.4g，K2HPO41.3238g，KH2PO4 0.3266g，CaCl2·2H2O 0.05g，FeSO4·7H2O，0.01g，MnSO4·H2O2.1mg，ZnSO4·7H2O 0.25mg，pH7.0～7.5。
6.根据权利要求1所述的一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法，其特征在于：所述样品秸秆是从温室收集拉秧期后的番茄、辣椒、茄子和黄瓜秸秆，将四种秸秆用烘箱高温烘干，先115℃杀青30min，再65℃烘干至恒重。把烘干后的秸秆剪成3-4cm小段。
7.根据权利要求1所述的一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法，其特征在于：将混合菌源的微生物悬浮液按4％的接种量接种在专化缺碳液体选择培养基中，并分别加入番茄、辣椒、茄子和黄瓜小段秸秆作为培养基中的唯一碳源，在有氧条件下进行限制性富集培养，在空气摇床震荡培养15天，设置温度为30℃，转速为200rpm。将培养15天的混合菌液分别接种到对应的新的专化缺碳液体选择培养基中，继续震荡培养15天。如此连续限制性继代培养10代以上得到的混合菌液即为能够特异性降解番茄、辣椒、茄子和黄瓜秸秆的四种高效协同菌群。
8.根据权利要求1所述的一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法，其特征在于：从继代培养得到的四种协同降解菌群中提取微生物的DNA，进行高通量测序，确定协同菌群中微生物的组成和丰度，比较四种协同菌群共有和独有的微生物种类。
9.根据权利要求7所述的一种果菜类蔬菜秸秆的协同降解菌群的高效筛选方法，其特征在于：对限制性继代培养得到的四种高效协同菌群中的细菌进行高通量测序，测序的区间为原核生物核糖体rRNA的16S rDNA的V4区域，引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；对四种高效协同菌群中的真菌进行测序，测序的区间是真核生物核糖体rRNA的ITS1和ITS2之间的区域，引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
10.使用根据权利要求1-8任一项所述的方法筛选出的番茄、辣椒、茄子或黄瓜秸秆的协同降解菌群。
11.根据权利要求9所述的菌群，其特征在于，所述菌群包括下面任一组微生物：
Figure FDA0003015708610000021
Figure FDA0003015708610000031
Figure FDA0003015708610000032
门 科 种 疣微菌门 丰佑菌科 Oleiharenicola lentus 放线菌门 谷氨酸杆菌 Glutamicibacter soli 拟杆菌门 甲壳菌科 Niabella hibiscisoli 拟杆菌门 噬纤维菌科 Ravibacter arvi 变形菌门 黄鞭毛杆菌科 Flaviflagellibacter deserti 拟杆菌门 甲壳菌科 Parasegetibacter luojiensis Ignavibacteriae Ignavibacteriaceae Ignavibacterium album 拟杆菌门 甲壳菌科 Terrimonas rubra 拟杆菌门 噬纤维菌科 Ravibacter arvi 变形菌门 丛毛单胞菌科 Comamonas serinivorans 拟杆菌门 红蝽菌科 Cesiribacter roseus 拟杆菌门 黄杆菌科 Flavobacterium qiangtangense 拟杆菌门 噬纤维菌科 Leadbetterella byssophila 拟杆菌门 Lewinellaceae Flavilitoribacter nigricans 变形菌门 罗丹杆菌科 Dokdonella koreensis 装甲菌门 Fimbriimonadaceae Fimbriimonas ginsengisoli 放线菌门 微杆菌科 Microbacterium jejuense
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