CN113234141B - 一种多肽的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及一种多肽Ahf‑caltide的新用途，即多肽Ahf‑caltide作为制备治疗增龄性缓慢型心律失常药物中的用途。多肽Ahf‑caltide能够改善小鼠增龄性缓慢型心律失常症状，恢复窦房结起搏功能，恢复心率，缩短延长的PR间期，通过与CaMKII蛋白的结合而上调CaMKII蛋白表达，对增龄性缓慢型心律失常症状具有显著的治疗作用。

Description

一种多肽的新用途

技术领域

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及一种多肽Ahf-caltide的新用途，即多肽Ahf-caltide作为制备治疗增龄性缓慢型心律失常药物中的用途。

背景技术

衰老是生命的自然规律，随着年龄的增长常伴随各个系统及脏器功能的衰退。在衰老状态下，由于心肌纤维逐渐萎缩，窦房结（Sinoatrial Node，SAN）纤维化，而易出现缓慢型心律失常等老年性心脏疾病。

SAN位于右心房的间隙区域（即上腔静脉和下腔静脉之间），毗邻CristaTerminalis末端，是心脏的起搏起点。它通过自主电活动来维持心脏的跳动，以产生正常的窦性心律。缓慢型心律失常是窦房结功能障碍（Sinus Node Dysfunction，SND）的一种表型，常出现在老年自发性窦房结病态综合征中。老年性窦房结病态综合征患者伴随与年龄相关的SAN及其周围组织纤维化、细胞萎缩及缺血，SAN冲动传导和起搏障碍，而表现为固有心率减慢和SAN传导延长。SAN４相自动化除极是其自律性形成的基础，该过程是SAN细胞内多个离子通道和离子流共同作用的结果。其中，膜结合的离子通道在心肌细胞动作电位4相早期激活，介导Na⁺和K⁺混合内向电流通过，产生舒张期早期去极化。“膜时钟”触发膜电位升高后，引发T型钙通道（Ca_V3.1/3.2）及Na⁺-Ca²⁺交换体（NCX）激活，导致细胞膜达到阈值电位，此时触发0相，L型电压门控Ca²⁺通道（Ca_V1.2/1.3）打开，Ca²⁺流入使细胞发生大范围的去极化。肌浆网上的“钙时钟”被激活，RyRs自发的LCR瞬时扫过整个SAN细胞并发生肌丝收缩。“膜时钟”和“钙时钟”结合在一起产生强大且具有周期性的舒张期去极化，这是SAN产生自主节律性的关键。

增龄性SAN功能减退，常常存在特定位点的基因突变和相关的电生理重构。钙/钙调素依赖性蛋白激酶II（Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）是一种Ser/Thr蛋白激酶，是多种细胞中Ca²⁺信号传导的主要下游靶点之一。在心脏中，δ亚型（CaMKIIδ）占主导地位。当细胞内Ca²⁺浓度升高时，Ca²⁺与CaM结合，Ca²⁺/CaM复合物与CaMKII结合，导致CaMKII磷酸化和自身磷酸化。活化的CaMKII通过调节细胞膜分子功能增加Ca²⁺内流，并加速SR- Ca²⁺循环。Ca²⁺/CaMKII依赖性磷酸化在SAN表面膜蛋白中的关键作用是促进I_CaL波幅和加速I_CaL失活的去除。肌浆网Ca²⁺/三磷酸腺苷酶（Sarco-/endoplasmicreticulum Ca²⁺/ATPase，SERCA）的Ca²⁺/CaMKII依赖性磷酸化刺激Ca²⁺内流。在离体兔SAN中，激活的CaMKII定位在细胞膜下，而总的CaMKII均匀地存在于整个细胞中。活性CaMKII主要存在于 SAN细胞的膜下微区，CaMKII活性可能受膜下微区局部Ca²⁺梯度的调节。Ca²⁺释放可以激活AC-cAMP依赖性PKA活性和CaMKII活性而进一步引发Ca²⁺释放，因此，不论对于SAN的膜时钟还是细胞内钙循环，CaMKII都发挥了很大的作用。

小鼠在衰老过程中呈现的一系列生理和病理变化与人类具有高度可比性，因此可以通过自然衰老小鼠模型来模拟人的老年状态，进而来表征增龄性缓慢型心律失常的潜在发病机制和治疗手段。现阶段增龄性缓慢型心律失常的常见临床治疗手段为药物治疗或植入式电子心脏起搏器。药物治疗常常存在不良反应，因此在临床上常常以植入式电子心脏起搏器代替药物治疗，但这种治疗方法不仅技术复杂、价格昂贵而且患者顺应性差，因此对于增龄性缓慢型心律失常的治疗手段仍需要进一步的研究。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种多肽Ahf-caltide的新用途。通过计算机模拟证实自主研发的新型多肽药物Ahf-caltide（专利号：CN201810863713.9）可以与CaMKII结合，对增龄性缓慢型心律失常小鼠个体给予多肽药物Ahf-caltide治疗，观察到多肽Ahf-caltide能够使小鼠心电图心率回升、PR间期缩短，改善小鼠增龄性缓慢型心律失常症状；并可通过与CaMKII蛋白结合上调CaMKII蛋白表达，恢复窦房结起搏功能。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：多肽Ahf-caltide作为制备治疗增龄性缓慢型心律失常药物中的用途。

一种治疗小鼠增龄性缓慢型心律失常的多肽，该多肽氨基酸序列为：EGKPKEHTEPK，来源于细胞内因子钙蛋白酶抑素（calpastatin，CS）的结构域L。

所述多肽为一种生物活性片段或衍生物，包含所述的多肽序列为核心序列，包括共价键连接的化合物、有核心序列组成的多聚体混合物及以核心序列为基础的氨基酸突变体。

所述治疗小鼠增龄性缓慢型心律失常的多肽，通过固相合成法制备。

所述治疗小鼠增龄性缓慢型心律失常的多肽及所述的生物活性片段或衍生物在治疗小鼠增龄性缓慢型心律失常中的用途。

进一步地，所述小鼠增龄性缓慢型心律失常的治疗方法为多肽Ahf-caltide给予动物，改善增龄性缓慢型心律失常症状。

所述增龄性缓慢型心律失常小鼠模型，包括无任何药物干预的自然条件下饲喂的衰老小鼠，心电图特征包括心率变缓，PR间期延长。

所述给予多肽的方式为任何药物治疗学上可接受的药物剂量和给药方式，给药方式包括但不限于腹腔注射、皮下注射或静脉注射。

所述腹腔注射药液是将Ahf-caltide溶解于生理盐水中配置的。

多肽Ahf-caltide作为制备治疗增龄性缓慢型心律失常药物中的用途。

所述多肽包含多肽Ahf-caltide及各种药学辅料，所述药物为任何药物治疗学上可接受的剂型，首选粉针剂。

所述增龄性缓慢型心律失常包含由于衰老状态下窦房结退行性改变、窦房结CaMKII缺失或下调而引起的窦性心率变缓，PR间期延长等缓慢型心律失常。

所述药物可以在衰老窦房结中与CaMKII相互作用，上调CaMKII表达，恢复窦房结起搏功能，恢复心率，缩短延长的PR间期，改善增龄性缓慢型心律失常症状。

所述药物作为制备基于其与CaMKII蛋白结合但不限于与CaMKII蛋白结合的原理的任何疾病治疗药物中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下。

本发明的多肽具有分子量小，易于人工合成，利于吸收，具有一定靶向性，是一种安全、高效、理想、可靠的药物。所述的多肽药物主要通过在衰老窦房结中与CaMKII蛋白结合，上调CaMKII蛋白表达，恢复窦房结起搏功能，进而发挥改善小鼠增龄性慢型心律失常的作用。

附图说明

图1 Ahf-caltide与CAMKII结合作用的三维结构图（A为CAMKII；B为Ahf-caltide；C为二者结合）。

图2 Ahf-caltide与CAMKII结合位点。

图3 多肽Ahf-caltide改善增龄性缓慢型心律失常的心电图结果。

图4 多肽Ahf-caltide改善增龄性缓慢型心律失常的心电图参数分析结果。

图5 多肽Ahf-caltide对增龄性缓慢型心律失常小鼠离体窦房结心电图影响结果。

图6多肽Ahf-caltide对衰老SAN组织起搏相关蛋白的调节作用结果。

具体实施方式

为了便于理解，以下通过具体的附图和实施例对本发明一种多肽Ahf-caltide的新用途进行详细描述。需要特别指出的是，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实例1。

MOE计算机模拟多肽Ahf-caltide与CaMKII的结合情况。

通过MOE软件模拟体内多肽Ahf-caltide与CaMKII的相互作用，以大分子CaMKII为受体，多肽Ahf-caltide为配体，进行分子对接。根据软件自动筛选的受体的虚拟口袋进行模拟结合，并使用London G打分函数将结合结果进行打分。得分最高的多肽Ahf-caltide与CaMKII的结合构像与结合参数如图1、2所示，最终可确定多肽Ahf-caltide与CaMKII有较多结合位点。

实例2。

采用固相合成法合成多肽法合成了多肽Ahf-caltide，序列为EGKPKEHTEPK。高效液相色谱法（HPLC）纯化，质谱对合成多肽纯度、氨基酸残基组成及分子量进行测定证实合成产物是目的肽，MW=1279.39，纯化纯度为98.53%。

1.动物模型的制备与给药分组。

18只健康昆明小鼠40-50g（购自辽宁长生生物有限公司），保证充足光照和食物的自然条件下，由年轻状态（8-10 w）饲养至衰老状态（65-80 w），期间采集不同年龄段心电图并统计各参数变化，通过心电图表型筛选增龄性缓慢型心律失常个体。将增龄性缓慢型心律失常个体随机分为三组与年轻组作对照。

（1）年轻组（n=6）：腹腔注射等剂量的0.9％生理盐水，连续16天；在附图中以Young表示。

（1）Control模型组（n=6）：腹腔注射等剂量的0.9％生理盐水，连续16天；在附图中以D_Aged表示。

（2）中剂量治疗组（n=6）：给予腹腔注射多肽Ahf-caltide 10.5 mg/kg，每日2次，给药间隔10 h，连续16天；在附图中以D_Aged+AHF-t(M)表示。

（3）高剂量治疗组（n=6）：给予腹腔注射多肽Ahf-caltide 21 mg/kg，每日2次，给药间隔10 h，连续给药16天；在附图中以D_Aged+AHF-t(H)表示。

多肽Ahf-caltide以0.9%生理盐水溶解，采用腹腔注射，浓度为5 mg/mL，给药量为：中剂量10.5 mg/kg，高剂量21 mg/kg，16天后给药结束。

2.给药后体表II导联心电图观察。

给药16天后，采集老年模型对照组、老年中剂量治疗组和老年高剂量治疗组体表II导联心电图数据。小鼠于小动物麻醉机中进行异氟烷气体麻醉，在持续麻醉状态下将其头部及四肢固定于手术台，小鼠四肢经银片电极连接心电图电极，记录标准II导联心电图。

与对照组相比，中剂量组HR缓慢与PR间期延长有所缓解，高剂量组表现为明显的RR间期缩短、PR间期缩短（图3）。与老年模型组相比，中剂量和高剂量治疗组RR间期均出现不同程度的缩短，高剂量组相较中剂量组增幅更加明显，可恢复至年轻状态（P<0.05，n=6）。与老年模型组相比，中剂量和高剂量治疗组PR间期均出现不同程度的缩短，高剂量组相较中剂量组增幅更加明显（P<0.05，n=6）。其他波段和振幅无显著性变化（图4）。以上结果显示，经多肽Ahf-caltide治疗后增龄性心率缓慢小鼠的RR间期缩短，PR间期延长在一定程度上得到改善。

3.多肽Ahf-caltide治疗后离体窦房结心电图分析。

与对照组比，多肽Ahf-caltide治疗组SAN起搏频率有所提升且跳动呈现规律性，但其起搏频率仍较年轻组较低。该结果表明，多肽能够在一定程度上增强SAN的起搏功能使其起搏频率加快，并具有剂量依赖性，但无法完全恢复至年轻状态（图5）。

4. 多肽Ahf-caltide治疗后SAN组织CaMKII、CaM蛋白表达情况。

CaMKII在老年心率缓慢组中表达显著下调（P<0.05），多肽治疗后表达增加，相较于中剂量组，高剂量组上调CaMKII更加显著（P<0.05，n=6）。CaM在老年心率缓慢组中表达显著下调（P<0.05，n=6），多肽治疗后其表达增加，相较于中剂量组，高剂量组上调CaM更加显著（P<0.05，n=6）（图6）。

综上，多肽Ahf-caltide可以在一定程度上缓解小鼠的增龄性缓慢型心律失常，其机制可能是多肽通过与SAN中的CaMKII结合相互作用，上调SAN中CaMKII表达，恢复SAN起搏功能，并具有一定的剂量依赖性。

<110> 中国医科大学

<120> 一种多肽的新用途

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 未知

<400> 1

Glu-Gly-Lys-Pro-Lys-Glu-His-Thr-Glu-Pro-Lys

Claims (3)

1.一种多肽Ahf-caltide在制备治疗增龄性缓慢型心律失常药物中的用途，其特征在于，所述增龄性缓慢型心律失常为窦房结退行性改变引起的缓慢型心律失常，所述Ahf-caltide多肽的氨基酸序列为SEQ ID：EGKPKEHTEPK，来源于细胞内因子钙蛋白酶抑素（calpastatin，CS）的结构域L。

2.根据权利要求1所述的多肽Ahf-caltide在制备治疗增龄性缓慢型心律失常药物中的用途，其特征在于，药物在衰老窦房结中与CaMKII相互作用，上调CaMKII表达，恢复窦房结起搏功能，恢复心率，缩短延长的PR间期，改善增龄性缓慢型心律失常症状。

3.根据权利要求1所述的多肽Ahf-caltide在制备治疗增龄性缓慢型心律失常药物中的用途，其特征在于，所述药物包含多肽Ahf-caltide及各种药学辅料，所述药物为药物治疗学上接受的剂型。

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