CN113215026A - 具有杀藻活性的特基拉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了具有杀藻活性的特基拉芽孢杆菌及其应用。本公开分离获得一株具有杀藻活性的特基拉芽孢杆菌，并从其代谢产物中分离并鉴定出杀藻活性物质为表面活性素，具体为表面活性素‑C13、表面活性素‑C14或表面活性素‑C15。其中，表面活性素‑C13、表面活性素‑C14对赤潮异弯藻、中肋骨条藻和东海原甲藻具有抑杀活性，表面活性素‑C15对赤潮异弯藻和中肋骨条藻具有抑杀活性，这三种活性物质可用于新型微生物杀藻剂的开发和应用，有望应用于赤潮的治理。

Description

具有杀藻活性的特基拉芽孢杆菌及其应用
技术领域
本公开涉及一种特基拉芽孢杆菌，具体涉及具有杀藻活性的特基拉芽孢杆菌。属于赤潮治理技术领域。
背景技术
赤潮的爆发严重破坏了海洋生态系统的平衡，导致水质环境的恶化，已经成为世界各国面临的重大的生态问题之一。目前赤潮的治理方法主要分为物理法、化学法和生物法[1,2]，前面两者普遍存在着成本高和产生二次污染的问题，相比而言生物法是目前比较高效、安全的防治方法。
微生物防治法是指微生物能够通过直接接触或者间接分泌活性物质来破坏细胞的结构，从而杀死藻细胞。其中直接杀藻微生物种类少，研究也较少，发现具有杀藻活性的微生物主要采用间接方式杀藻。间接杀藻主要是指杀藻细菌通过向环境中分泌杀藻活性物质达到抑制或者杀死藻细胞的目的。
目前已经发现杀藻活性物质包括氨基酸[3]、生物表面活性剂[4]、多肽[5]、蛋白质[6]、色素[7]等。生物表面活性剂主要包括糖脂、磷脂和脂肽，目前研究比较多的是糖脂中的鼠李糖脂和槐糖脂，磷脂和脂肽相关的杀藻研究几乎没有。而surfactin类物质是脂肽中具有最强表面活性剂能力的一类，表面活性素surfactin一般是由芽孢杆菌所产生的环状脂肽，又称表面活性肽。表面活性素是目前最高效的脂肽类表面活性剂之一，其大多由枯草芽孢杆菌产生，能够将水的界面张力从72mN/m降至27mN/m。表面活性素一般由七个氨基酸与β-羟基脂肪酸相连形成环状的内酯结构，脂肪酸的碳原子一般为13-16个[8]。脂肽类化合物具有多种用途，其在抗细菌、抗病毒、抗支原体、抗肿瘤和石油降解等方面发挥着重要的作用[9]。
由于surfactin类物质具有优良的热稳定性、高生物降解性、无二次污染和低毒性等优点，为其日后发展为一种绿色、安全的杀藻剂奠定了坚实的基础，在赤潮防治方面很可能会发挥重要价值。
发明内容
本公开的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一株具有杀藻活性的特基拉芽孢杆菌及其应用，在赤潮治理方面具有极好的推广应用价值。
为实现上述目的，本公开采用下述技术方案：
一株具有杀藻活性的特基拉芽孢杆菌，所述特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)D8于2021年2月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO.61464。
上述特基拉芽孢杆菌的代谢产物作为杀藻剂的应用。
优选的，所述杀藻剂的杀藻种类包括：赤潮异弯藻、中肋骨条藻和东海原甲藻。
上述特基拉芽孢杆菌的代谢产物在赤潮治理中的应用。
从上述特基拉芽孢杆菌的代谢产物中提取杀藻活性物质的方法，具体步骤如下：
(1)先将特基拉芽孢杆菌D8接种于STA培养基中进行培养，离心取上清；
(2)然后将上清经酸沉淀，冷冻干燥，抽提，得到粗提物；
(3)再将粗提物经柱层析分离，得到Surfactin-C13(表面活性素-C 13)、Surfactin-C14(表面活性素-C 13)或Surfactin-C15(表面活性素-C 13)；
其中，在柱层析分离时，流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.05％三氟乙酸水溶液，粗提物经甲醇溶解后湿法上样，先用体积比4：1的流动相A和流动相B的混合液洗脱，再用流动相A洗脱，收集分子量1008的洗脱物，得到表面活性素-C13，收集分子量1022的洗脱物，得到表面活性素-C14，收集分子量1036的洗脱物，得到表面活性素-C15。
优选的，步骤(1)的具体方法为：将特基拉芽孢杆菌D8接种于100mL STA培养基中，25～30℃150～200rpm培养24小时，再按1～5％(v/v)比例转接至500mL STA培养基中，25～30℃150～200rpm培养48～72小时；8000～10000g，10～15分钟离心取上清。
进一步优选的，步骤(1)的具体方法为：将特基拉芽孢杆菌D8接种于100mL STA培养基中，30℃150rpm培养24小时，再按1％(v/v)比例转接至500mL STA培养基中，30℃150rpm培养72小时；8000g，10分钟离心取上清。
优选的，步骤(2)中酸沉淀的具体方法为：将上清用4～6mol/L HCl调节pH＝2～3，0～4℃过夜沉淀；8000～10000g，0～4℃离心10～15分钟获得沉淀。
进一步优选的，步骤(2)中酸沉淀的具体方法为：将上清用6mol/L HCl调节pH＝2，4℃过夜沉淀；8000g，4℃离心10分钟获得沉淀。
优选的，步骤(2)中，抽提的具体方法为：先将冷冻干燥所得粉末加入混合液中，抽提一次，再用甲醇抽提两次，8000g 4℃离心10min取上清，上清置于旋转蒸发仪悬干，旋蒸温度为45℃，即可获得粗提物；其中，粉末、混合液、甲醇的配比为10mg：1mL：1mL，所述混合液为氯仿和甲醇以体积比2：1混合而得。
表面活性素-C13或表面活性素-C14作为杀藻剂的应用。
优选的，所述杀藻剂的杀藻种类包括：赤潮异弯藻、中肋骨条藻和东海原甲藻。
表面活性素-C15作为杀藻剂的应用。
优选的，所述杀藻剂的杀藻种类包括：赤潮异弯藻、中肋骨条藻。
Surfactin-C13(表面活性素-C 13)、Surfactin-C14(表面活性素-C 14)或Surfactin-C15(表面活性素-C15)在赤潮治理中的应用。
本公开的有益效果：
本公开分离获得一株具有杀藻活性的特基拉芽孢杆菌，并从其代谢产物中分离并鉴定出杀藻活性物质为表面活性素，具体为表面活性素-C13、表面活性素-C14或表面活性素-C15。其中，Surfactin-C13对赤潮异弯藻、中肋骨条藻和东海原甲藻24h的半致死浓度分别为1.22μg/mL、2.35μg/mL和2.35μg/mL；Surfactin-C14对赤潮异弯藻、中肋骨条藻和东海原甲藻24h的半致死浓度分别为1.20μg/mL、1.52μg/mL和5.31μg/mL；Surfactin-C15对赤潮异弯藻和中肋骨条藻的24h半致死浓度别为89.11μg/mL和1.71μg/mL，对东海原甲藻无抑杀活性。这三种活性物质可用于新型微生物杀藻剂的开发和应用，有望应用于赤潮的治理。
附图说明
图1为菌株Bacillus tequilensis D8上清对赤潮异弯藻(A)、中肋骨条藻(B)和东海原甲藻(C)的杀藻效果。
图2为菌株Bacillus tequilensis D8的形态图。其中(A)、(B)为平板菌落形态，(C)、(D)为菌株Bacillus tequilensis D8扫描电镜图。
图3菌株Bacillus tequilensis D8基于16S rRNA基因序列构建的系统发育进化树。
图4为表面活性素-C15经反相硅胶柱分离后的分析型液相色谱图(A)和一级质谱图(B)。由(B)可知，其核质比([M+H]+)为1037.42，分子量为1036。
图5为Surfactin-C13的制备液相色谱图和纯品的质谱图，由(A)可知，表面活性素-C13的液相色谱出峰时间为7.5-9.5min，(B)和(C)分别为表面活性素-C13的分析型液相色谱图和一级质谱图。由(C)可知，其核质比([M+H]+)为1009.41，分子量为1008。
图6为表面活性素-C14的制备液相色谱图和纯品的质谱图，由图(A)可知，Surfactin-C14的制备液相色谱出峰时间为29-31min，(B)和(C)分别为表面活性素-C14的分析型液相色谱图和一级质谱图。由图6C可知，其核质比([M+H]+)为1023.28，分子量为1022。
图7分别为本公开所述的杀藻活性物质表面活性素-C13(A)、表面活性素-C14(B)和表面活性素-C15(C)的核磁共振氢谱图。在图7中，横坐标表示化学位移，纵坐标代表各个峰的相对强度。
图8分别为本公开所述的杀藻活性物质表面活性素-C13(A)、表面活性素-C14(B)和表面活性素-C15(C)的核磁共振碳谱图。在图8中，横坐标表示化学位移，纵坐标代表各个峰的相对强度。
图9为表面活性素-C13、表面活性素-C14和表面活性素-C15的结构式。
图10为本公开所述杀藻活性物质表面活性素-C13(A)、表面活性素-C14(B)和表面活性素-C15(C)对赤潮异弯藻的杀藻效果图。
图11为本公开所述杀藻活性物质表面活性素-C13(A)、表面活性素-C14(B)和表面活性素-C15(C)对中肋骨条藻的杀藻效果图。
图12为本公开所述杀藻活性物质表面活性素-C13(A)和表面活性素-C14(B)对东海原甲藻的杀藻效果图。
保藏信息
分类名词：特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)
保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心
保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼
保藏日期：2021年2月20日
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本公开进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本公开，并不对其内容进行限定。
一、菌株的分离与鉴定
(1)取福建省厦门市第一码头的水样按照10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀释，每个梯度稀释液取100μL涂布于STA固体培养基平板上，在30℃恒温培养箱培养72h(STA固体培养基：胰蛋白胨4g，细菌蛋白胨2g，酵母提取物0.5g，大豆蛋白胨0.5g，硫酸铵0.5g，葡萄糖1g，可溶性淀粉1g，硫酸亚铁0.139mg，硫酸铁2mg，磷酸二氢钾6.8mg，磷酸氢二钾3.72mg，陈海水800mL，蒸馏水200mL，琼脂粉15g，定容至1L，pH 7.2)。
(2)根据形态、颜色、大小差异挑取单菌落接种于20mL STA液体培养基(配方中略去琼脂粉，其余同STA固体培养基)中，30℃，150rpm培养12h后，在STA固体培养基平板上划线。
(3)将纯化后的单菌落接种于20mL STA液体培养基中，置于30℃摇床，150rpm震荡培养72h。
(4)取100μL发酵液加入到2mL对数生长中期的赤潮异弯藻、中肋骨条藻和东海原甲藻藻液中，置于养藻架上培养，以加入5％(v/v)STA培养基的藻液作为对照组，每组设置3个平行。每隔24h用酶标仪测定叶绿素自发荧光值或者用细胞计数仪测定细胞数，并计算杀藻率，从而筛选出具有杀藻活性的菌株。其中赤潮异弯藻和东海原甲藻用细胞数计算杀藻率，中肋骨条藻用叶绿素自发荧光计算杀藻率(杀藻率(％)＝(Nt-N0)/N0×100％，其中N0为0h藻细胞叶绿素自发荧光值或细胞数；Nt为对应处理时间的藻细胞叶绿素自发荧光值或细胞数。
(5)由图1可知，分离到一株菌D8具有比较好的杀藻效果，其上清处理赤潮异弯藻12h的杀藻率为24.97％，当处理时间延长至24h，其能使87.62％藻细胞裂解；其上清处理中肋骨条藻12h的杀藻率为75.81％，24h的杀藻率81.11％；其上清处理东海原甲藻12h的杀藻率为44.42％，24h的杀藻率70.51％。
由图1(A)可知，菌株D8的发酵液和上清的对赤潮异弯藻的杀藻效果基本一致，而菌体几乎没有杀藻能力，说明菌株D8的杀藻方式为间接杀藻。由图1(B)和(C)可知，菌株D8的上清对中肋骨条藻和东海原甲藻也有很好的杀藻效果。
(6)菌株D8的平板和扫描电镜形态图见图2。由图2可知，菌株Bacillus tequilensis D8在平板上生长的菌落白色湿润，不透明，形状不规则，中间有凹陷。通过扫描显微镜观察，可以发现菌株成短杆状，无鞭毛，表面光滑，菌体之间有丝状的连接物。
对菌株D8进行基因组提取并进行16S rRNA基因扩增，PCR产物经T载体连接后送至厦门铂瑞生物科技测序。序列用DNAstar去除引物后上传至韩国EzBioCl oud网站(https://www.ezbiocloud.net/)进行比对分析，采用MEGA7.0软件的Neig hbor-Joining法构建系统发育树，结果见图3。经比对发现菌株D8和Bacillus tequi lensis KCTC13622T的相似率高达99.86％，可以判定其为芽孢杆菌属，将其命名为Bacilllustequilensis D8。其16S rRNA序列上传至NCBI数据库，GenBank登录号为MW479447。
二、杀藻活性物质Surfactin的制备方法，包括以下步骤：
(1)培养菌株：将Bacilllus tequilensis D8接种于100mL STA培养基中，30℃150rpm培养24h，再按1％(v/v)比例转接至500mL STA培养基中，30℃150rpm培养72h。8000g，10min离心取上清。
(2)酸沉淀：将步骤(1)中的上清用6mol/L HCl调pH至2，4℃过夜沉淀。8000g 4℃离心10min获得沉淀，沉淀经冷冻干燥后称重。
(3)氯仿甲醇抽提：称取200mg冻干的粉末，加入20mL氯仿和甲醇(体积比2：1)抽提一次，再用20mL甲醇抽提两次，8000g 4℃离心10min取上清，上清置于旋转蒸发仪悬干，旋蒸温度为45℃，即可获得D8粗提物。
(4)装柱：称取25g反相硅胶(C18硅胶填料，粒径50μm)，甲醇浸泡过夜。用玻璃棒搅匀后倒入具活塞玻璃层析柱(直径3cm×柱高30cm)中，加入约100mL甲醇，使柱子压实后柱高大约10cm。流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.05％三氟乙酸水溶液。先用初始流动相(80％流动相A+20％流动性B)洗脱一个柱体积，然后再上样。
(5)层析柱初步分离：称取步骤(3)中D8粗提物200mg溶于2mL甲醇中，采用湿法上样，待样品吸附在柱头后，先用200mL初始流动相洗脱，每25mL收集于1支试管中，从第8管开始换成用100％流动相A洗脱，总共收集15管。将收集的第6管至12管的样品用自动纯化系统(Waters，USA)进行检测。根据检测结果，将分子量为1008的几管样品合并后可得表面活性素-C13粗提物，将分子量为1022的几管样品合并后可得表面活性素-C14粗提物，将分子量为1036的几管样品合并后可得表面活性素-C15粗提物。由图4可知，表面活性素-C15的粗提物样品纯度高，不用进一步纯化。图4中(A)和(B)为Surfactin-C15经反相硅胶柱分离后的分析型液相色谱图和一级质谱图。由(B)可知，其核质比([M+H]+)为1037.42，分子量为1036。
表面活性素-C13和表面活性素-C14还有部分杂质，需要进一步纯化。
(6)制备柱纯化表面活性素-C13：将表面活性素-C13溶解于1mL色谱级甲醇中，利用制备型液相色谱仪(SHIMADZU,SIL-AP20,Japan)进一步纯化。其中，(a)制备柱：
Figure BDA0002989047770000071
Prep OBDTM C18色谱柱(10mm×100mm，5.0μm)；(b)流动相：80％乙腈溶液(乙腈：ddH2O＝80：20,v/v,0.05％三氟乙酸)；(c)流速：4.5mL/min；(d)检测波长：205nm；收集液相色谱保留时间为7.5-9.5min处的样品(结果见图5中(A))，45℃下旋转蒸干溶液中的乙腈，剩余水相经过冻干获得表面活性素-C13纯品(结果见图5中(B)和(C)，分别为表面活性素-C13的分析型液相色谱图和一级质谱图，由(C)可知，其核质比([M+H]+)为1009.41，分子量为1008)。
(7)制备柱纯化表面活性素-C14：将表面活性素-C14溶解于1mL色谱级甲醇中，利用制备型液相色谱仪(SHIMADZU,SIL-AP20,Japan)进一步纯化。其中，(a)制备柱：SilGreenC18色谱柱(10mm×250mm，5.0μm)；(b)流动相：85％乙腈溶液(乙腈:ddH2O＝85:15,v/v,0.05％三氟乙酸)；(c)流速：3mL/min；(d)检测波长：205nm；收集保留时间为29-31min处的样品(结果见图6中(A))，45℃下旋转蒸干溶液中的乙腈，剩余水相经过冻干获得表面活性素-C14纯品(结果见图6中(B)和(C)，分别为表面活性素-C14的分析型液相色谱图和一级质谱图。由图6C可知，其核质比([M+H]+)为1023.28，分子量为1022)。
(8)核磁共振鉴定：分别称取10mg表面活性素-C13、表面活性素-C14和表面活性素-C15的纯品溶解于500μL氘代DMSO中，用核磁共振波谱仪(Bruker AV600,Switzerland)对样品进行分析，核磁共振氢谱结果见图7，核磁共振碳谱结果图8，可以确定(A)为表面活性素-C13、(B)为表面活性素-C14，(C)为表面活性素-C15，其结构如图9所示。
三、3种活性物质的杀藻活性验证
赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)和东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)由厦门大学海洋与地球学院藻种管理中心提供。藻株所用培养基为f/2培养基(表1)。藻类置于玻璃三角瓶中培养，温度为20℃，光照条件是12h光照:12h黑暗，光照强度是50μmol photons·m-2·s-1。
表1.f/2培养基主要成分
Figure BDA0002989047770000081
杀藻率(％)＝(Nt-N0)/N0×100％，其中N0为0h藻细胞叶绿素自发荧光值或细胞数；Nt为对应处理时间的藻细胞叶绿素自发荧光值或细胞数。赤潮异弯藻和东海原甲藻用细胞数计算杀藻率，中肋骨条藻用叶绿素自发荧光值计算杀藻率。
半致死浓度的计算方法：活性物质的浓度值作为A列，0h的藻细胞数作为为B列，12h或者24h的藻细胞死亡数作为C列。将A、B、C列数值复制到SPSS软件中，其中A列选入为协变量，B列选入为实测值总数，C列选入为响应频率，并选择以10为底的对数转换模式。选中数据，通过Analysis中的probit回归模型进行拟合，便可以计算出每个时间点的半致死浓度。
1、3种活性物质对赤潮异弯藻的杀藻效果
(1)将培养至对数期中期的赤潮异弯藻(细胞数约1.0×105cells/mL)分装至48孔板，每个孔1mL，暗周期置于养藻架培养12h。
(2)在藻液中进行以下处理，分别加入母液浓度为0.5、1、2、3、4、5mg/mL表面活性素-C13 1μL，以加入1μL DMSO的藻液作为对照组，总共7个组，每组5个平行；
(3)在藻液中进行以下处理，分别加入母液浓度为0.5、1、1.5、2、3、4、5mg/mL表面活性素-C14 1μL，以加入1μL DMSO的藻液作为对照组，共8个组别，每组5个平行；
(4)在藻液中进行以下处理，分别加入母液浓度为5、10、15、20、25、30mg/mL表面活性素-C15 1μL，以加入1μL DMSO的藻液作为对照组，共7个组别，每组5个平行；
(5)每12h用细胞计数仪测定各个孔的细胞数，并计算杀藻率和各个时间点的半致死浓度。由图10(表面活性素-C13(A)、表面活性素-C14(B)和表面活性素-C15(C))和表2可知，表面活性素-C13对赤潮异弯藻的杀藻效果存在浓度梯度效应，随着浓度的升高，杀藻效果越强。其处理赤潮异弯藻12h和24h的半致死浓度分别为1.68μg/mL和1.22μg/mL。表面活性素-C14对赤潮异弯藻的杀藻能力与表面活性素-C13基本一致，其处理赤潮异弯藻12h和24h的半致死浓度分别为1.53μg/mL和1.20μg/mL。而表面活性素-C15显然对赤潮异弯藻的杀藻效果不如前面两种同系物，其在12h和24h的半致死浓度分别为57.24μg/mL和89.11μg/mL。
表2.Surfactin同系物对赤潮异弯藻、中肋骨条藻和东海原甲藻的半致死浓度LC50(μg/mL)比较
Figure BDA0002989047770000091
2、3种活性物质对中肋骨条藻的杀藻效果
(1)将培养至对数期中期的中肋骨条藻(叶绿素自发荧光值7000左右)分装至48孔板，每个孔1mL，暗周期置于养藻架培养12h。
(2)在藻液中进行以下处理，分别加入母液浓度为1、2、3、4、5、8、10mg/mL表面活性素-C13 1μL，以加入1μL DMSO的组别作为对照组，总共8个组，每组5个平行；
(3)在藻液中进行以下处理，分别加入母液浓度为1、2、3、4、5、8、10mg/mL表面活性素-C14 1μL，以加入1μL DMSO的组别作为对照组，共8个组别，每组5个平行；
(4)在藻液中进行以下处理，分别加入母液浓度为0.5、1、1.5、2、2.5、3、5mg/mL表面活性素-C15 1μL，以加入1μL DMSO的组别作为对照组，共8个组别，每组5个平行；
(5)每12h用酶标仪测定各个孔的叶绿素自发荧光，并计算杀藻率和各个时间点的半致死浓度；由图11(表面活性素-C13(A)、表面活性素-C14(B)和表面活性素-C15(C))和表2可知，表面活性素-C13、表面活性素-C14和表面活性素-C15对中肋骨条藻均有比较强的杀藻效果，表面活性素-C13处理中肋骨条藻12h和24h的半致死浓度分别为2.62μg/mL和2.35μg/mL，表面活性素-C14处理中肋骨条藻12h和24h的半致死浓度分别为2.66μg/mL和1.52μg/mL，表面活性素-C15处理中肋骨条藻12h和24h的半致死浓度分别为3.60μg/mL和1.71μg/mL。
3、3种活性物质对东海原甲藻的杀藻效果
(1)将培养至对数期的东海原甲藻(细胞数大约1.5×105cells/mL)分装至48孔板，每个孔1mL，暗周期置于养藻架培养12h。
(2)在藻液中进行以下处理，分别加入母液浓度为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4mg/mL表面活性素-C13 1μL，以加入1μL DMSO的组别作为对照组，总共8个组，每组5个平行；
(3)在藻液中进行以下处理，分别加入母液浓度为2、3、4、6、8、10、12mg/mL表面活性素-C14 1μL，以加入1μL DMSO的组别作为对照组，共8个组别，每组5个平行；
(4)每12h测定各个孔的细胞数，并计算杀藻率和各个时间点的半致死浓度。由图12(表面活性素-C13(A)、表面活性素-C14(B))和表2可知，表面活性素-C13处理东海原甲藻的12h和24h的半致死浓度分别为2.34μg/mL和2.35μg/mL，表面活性素-C14处理东海原甲藻的12h和24h的半致死浓度分别为14.82μg/mL和5.31μg/mL。说明表面活性素-C13对东海原甲藻的杀藻效果更强，这应该与其脂肪酸部分链的长短有关。
上述虽然结合附图对本公开的具体实施方式进行了描述，但并非对本公开保护范围的限制，在本公开的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本公开的保护范围以内。
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Claims (10)

1.一株具有杀藻活性的特基拉芽孢杆菌，其特征在于，所述特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)D8于2021年2月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO.61464。
2.权利要求1所述特基拉芽孢杆菌的代谢产物作为杀藻剂的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述杀藻剂的杀藻种类包括：赤潮异弯藻、中肋骨条藻和东海原甲藻。
4.权利要求1所述特基拉芽孢杆菌的代谢产物在赤潮治理中的应用。
5.从权利要求1所述特基拉芽孢杆菌的代谢产物中提取杀藻活性物质的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)先将特基拉芽孢杆菌D8接种于STA培养基中进行培养，离心取上清；
(2)然后将上清经酸沉淀，冷冻干燥，抽提，得到粗提物；
(3)再将粗提物经柱层析分离，得到表面活性素-C13、表面活性素-C14或表面活性素-C15；
其中，在柱层析分离时，流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.05％三氟乙酸水溶液，粗提物经甲醇溶解后湿法上样，先用体积比4：1的流动相A和流动相B的混合液洗脱，再用流动相A洗脱，收集分子量1008的洗脱物，得到表面活性素-C13，收集分子量1022的洗脱物，得到表面活性素-C14，收集分子量1036的洗脱物，得到表面活性素-C15。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法为：将特基拉芽孢杆菌D8接种于100mL STA培养基中，25～30℃150～200rpm培养24小时，再按1～5％比例转接至500mL STA培养基中，25～30℃150～200rpm培养48～72小时；8000～10000g，10～15分钟离心取上清。
7.根据权利要求5所述的方法，步骤(2)中酸沉淀的具体方法为：将上清用4～6mol/LHCl调节pH＝2～3，0～4℃过夜沉淀；8000～10000g，0～4℃离心10～15分钟获得沉淀。
8.表面活性素-C13或表面活性素-C14作为杀藻剂的应用。
9.表面活性素-C15作为杀藻剂的应用。
10.表面活性素-C13、表面活性素-C14或表面活性素-C15在赤潮治理中的应用。
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