CN113214381A - 酰化的glp-1衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了GLP‑1(7‑37)多肽类似物、该类似物的脂肪酸修饰的衍生物和包含该衍生物的药物。另外，本发明还提供了该衍生物的制备方法以及该衍生物在制备药物中的用途。
Description
本申请是申请号为201910317953.3、发明名称为“酰化的GLP-1衍生物”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于多肽技术领域。具体而言，本发明涉及GLP-1(7-37)多肽类似物的脂肪酸修饰的衍生物。另外，本发明还涉及该肽衍生物的制备方法、含该肽衍生物的药物以及在制备药物中的用途等。
背景技术
糖尿病是一种由遗传和环境等多种因素引起的糖代谢紊乱疾病，现已成为继肿瘤、心脑血管疾病之后威胁人类健康和生命安全的第三位重大疾病。糖尿病本身不一定造成危害，但长期血糖增高，大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等，据世界卫生组织统计，糖尿病并发症高达100多种，是目前已知并发症最多的一种疾病。因糖尿病死亡者有一半以上是心脑血管所致，10％是肾病变所致。因糖尿病截肢是非糖尿病的10～20倍。为此治疗糖尿病进而预防其并发症是至关重要的社会问题。
糖尿病由于患病机理不同可分为几种类型。其中绝大部分属于二型糖尿病(约90％)，主要是因体重过重和缺乏身体活动所致。II型糖尿病患者多存在胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足两方面异常，在发病的中晚期往往出现胰岛β细胞凋亡。目前，临床使用的口服降糖药的作用机理多为增强胰岛素敏感性，或促进胰岛素分泌以稳定血糖，均无法解决β细胞凋亡这一难题。而胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其类似物药物由于具有减缓β细胞凋亡，增进其再生，促使胰岛β细胞分化和增殖的作用，使其成为治疗II型糖尿病的研究重点。
1983年，BELL等在分析胰高血糖素原(proglucagon，PG)的基因序列时发现了胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1)即GLP-1(BELL G I，SANCHEZ-PESCADOR R，LAYBOURN P J，et al.Exon duplication and divergence in the humanpreproglucagon gene[J].Nature，1983，304(5924):368-371)。PG基因序列由6个外显子和5个内含子组成，包含3个主要的结构域：胰高血糖素(33～61)、GLP-1(72～108)和GLP-2(126～158)。PG的mRNA在胰腺A细胞、肠道L细胞和脑中均有表达，在这些组织细胞中进行特异性的翻译修饰，最终形成不同的终产物。
GLP有两种亚型，GLP-1类似物和GLP-2类似物，它们和胰高血糖素的氨基酸序列有近一半相同，二者之间也有约35％的同源性。GLP-1类似物是由末端空肠、回肠和结肠的朗格汉斯细胞(Langerhans’scell)分泌的一种多肽激素，具有葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌和生物合成、抑制胰高血糖素分泌及抑制胃排空等多种功能。GLP-2类似物在肠道组织和中枢神经系统的脑干和视丘下部神经原细胞均有合成，主要促进正常小肠的生长和肠黏膜损伤的修复(付刚，龚珉，徐为人.胰高血糖素样肽1及其受体激动剂研究进展[J].天津医药，2012，40(2):181-184.)。
GLP-1是一种内源性促进胰岛素分泌的激素，主要是由肠内L-细胞分泌，在平衡胰岛素和葡萄糖水平中发挥作用。
GLP-1的一级结构为：组氨酸(His)-丙氨酸(Ala)-谷氨酸(Glu)-苯丙氨酸(Phe)-谷氨酸(Glu)-精氨酸(Arg)-组氨酸(His)-丙氨酸(Ala)-谷氨酸(Glu)-甘氨酸(Gly)-苏氨酸(Thr)-苯丙氨酸(Phe)-苏氨酸(Thr)-丝氨酸(Ser)-天冬氨酸(Asp)-缬氨酸(Val)-丝氨酸(Ser)-丝氨酸(Ser)-酪氨酸(Tyr)-亮氨酸(Leu)-谷氨酸(Glu)-甘氨酸(Gly)-谷氨酰胺(Gln)-丙氨酸(Ala)-丙氨酸(Ala)-赖氨酸(Lys)-谷氨酸(Glu)-苯丙氨酸(Phe)-异亮氨酸(Ile)-丙氨酸(Ala)-色氨酸(Trp)-亮氨酸(Leu)-缬氨酸(Val)-赖氨酸(Lys)-甘氨酸(Gly)-精氨酸(Arg)-甘氨酸(Gly)。DDP-IV能够快速降解N端7～8位上的组氨酸(H)-丙氨酸(A)，DDP-Ⅳ主要起肽链端水解酶作用，凡是第8位是丙氨酸或脯氨酸，该酶就会发挥降解作用，使GLP-1快速失去活性(AERTGEERTS K，YE S，TENNANT M G，et al.Crystal structureof human dipeptidyl peptidase IV in complex with a dipeptide peptidasereveals details on substrate specificity and tetrahedral intermediate[J].Protein Sci，2004，13(2):412-421)。SARRAUSTE DE MENTHIERE等建GLP-1模型，通过氨基酸替换后观察GLP-1类似物与受体亲和力和内在活性的变化，第7位上的组氨酸是亲和力和内在活性的决定因素，其上面芳环比色氨酸小，而且没有任何极性取代基；第8位上的丙氨酸侧链有极性基团会影响GLP-1的活性，侧链的体积不能过大，超过一定限度时，活性就会下降；第9位上的谷氨酸被某些氨基酸，如酸性、极性和疏水性氨基酸替换时，活性不发生变化，被碱性氨基酸替换时活性下降甚至失活；GLP-1与受体呈结合状态，如果其中的氨基酸残基有离子键作用，那么就发生在7～15位氨基酸之间，形成环结构，Ala8-Glu9-Gly10-Thr11会形成β转角，使得第7位上的组氨酸、第12位上的苯丙氨酸和第19位上的酪氨酸等3个芳香核发生相互作用，与受体上存在的芳香簇疏水口袋相对应，推测它们起到激活受体的作用；第22位上的甘氨酸为柔性氨基酸，起到柔性连接作用，维持螺旋卷曲状。破坏甘氨酸会使所有的芳香氨基酸簇集，但是与受体的亲和力却减少1/40(SARAUSTE DEMENTHIEREC，CHAVANIEUA，GRASSYG，et al.Structural requirements of the N-terminalregion of GLP-1-[7-37]-NH2 for receptor interaction and cAMP production[J].Eur J Med Chem，2004，39(6):473-480)。
GLP-1包括GLP-1(1-37)、GLP-1(1-36)、GLP-1(7-37)甘氨酸衍生物和GLP-1(7-36)NH2等分子形式。一般认为，后两者具有相同的生物活性。肠粘膜L细胞分泌的GLP-1(1-37)无活性，需要进一步水解切除N端6个氨基酸，成为有活性的GLP-1(7-37)。GLP-1(7-37)在体内存在的时间较短，很快就被降解。因此，人们进行了各种关于具有抗DPP IV的GLP-1类似物的研究，例如，美国专利第5545618号描述了用烷基或酰基修饰N末端，并且Gallwitz等描述了第7位His进行N甲基化或a甲基化，或者用整个His用咪唑取代来增加对DPP–IV的抗性并保持生理活性。
除了这些修饰，从希拉毒蜥蜴的唾液腺纯化的GLP-1类似物艾塞那肽-4(exendin-4)(美国专利第5424686号)具有对DPP IV的抗性并比GLP-1具有更高的生理活性。因此，它具有比GLP-1的半衰期更长的2至4小时的体内半衰期。然而，仅适用增加DPP IV抗性的方法，生理活性不能被充分地保持，并且在使用商业可获得的艾塞那肽-4(exenatide)的情况下，它需要一天两次注射给病人，这对病人仍然是很痛苦的。
这些促胰岛素肽分子量很小，因此被很快从肾脏排出体外。有科学家使用化学方法在肽的表面添加高溶解度的聚合物例如聚乙二醇来抑制其在肾中的损失。例如美国专利第692464号描述了PEG结合到艾塞那肽-4的赖氨酸残基来增加其体内停留时间，然而，这种方法尽管增加了肽类药物在体内的停留时间，但同时随着分子量的增加，该肽类药物的浓度显著减少，对肽的反应性也降低了。
此外，还有一系列其它方法用于修饰胰高血糖素样肽-1化合物的结构试图延长其作用持续时间。例如WO96/29342公开了在亲本肽激素C-端氨基酸残基处或在N-端氨基酸残基处引入亲脂性取代物而修饰的肽激素衍生物。WO98/08871公开了其中亲本肽的至少一个氨基酸残基连接有亲脂性取代物的GLP-1衍生物(liraglutide)。WO99/43708公开了具有连接至C-端氨基酸残基的亲脂性取代物GLP-1(7-35)和GLP-1(7-36)衍生物。WO00/34331公开了双酰化的GLP-1类似物。WO 00/69911公开了用于注射的活化的促胰岛素肽，据认为在患者体内，它们与血液成分反应形成缀合物，延长了体内作用持续时间。
WO2006/097537公开了另一种酰化的GLP-1类似物(semaglutide)，通过将第8位氨基酸突变为非天然氨基酸，与WO98/08871的酰化的GLP-1(liraglutide)相比，具有更长的半衰期。
WO02/046227公开了使用基因重组技术通过将GLP-1，艾塞那肽-4或其类似物与人血清白蛋白或免疫球蛋白区(Fc)结合来制备融合蛋白，这可以解决如聚乙二醇化产量低和非特异性的问题，但是它们增加血液中半衰期的效果仍然不像期待中的那么显著，在综合的降糖效果上，并没有达到预期的效果，甚至不如索玛鲁肽。为了使增加血液中半衰期的效果最大化，人们试图使用各种类型的肽连接器，但是这种方法面临的问题是可能引起免疫反应。
CN107033234A公开了GLP-1类似物的脂肪酸修饰的缀合物，脂肪酸修饰位点是在Lys26上，前期动物实验表明其在降糖效果上优于索玛鲁肽，该方式可以适当地延长GLP-1类似物的体内作用时间，但延长的时间仍然不理想。
目前市场上获批的GLP-1药物主要有从蜥蜴唾液中分离出的艾塞那肽-4(Exenatide-4)，以及采用脂肪酸，抗体Fc段或血清白蛋白修饰的人源GLP-1类似物。艾塞那肽-4半衰期太短，仅2-4小时，一天需要至少两次注射。诺和诺德公司的脂肪酸修饰的利拉鲁肽在降血红蛋白糖基化方面最有效且副作用较少，但其不足之处在于体内半衰期只有13小时，需要每天给药。为了进一步延长体内半衰期，减少给药频率，近年来陆续开发了氨基酸序列突变体和FC、脂肪酸或白蛋白等修饰的长效GLP-1类似物。如礼来公司的杜拉鲁肽和诺和诺德公司的索玛鲁肽(Semaglutide)。这些长效化的GLP-1类似物在人体内的半衰期可被不同程度地延长，最长可实现每周给药一次的给药频率。
本申请的发明人经过长期研究，开发了一种新的GLP-1类似物及其衍生物，在相同实验条件下，与现有公认的最好的药物索玛鲁肽相比，体外活力与索玛鲁肽相当；在普通小鼠及糖尿病小鼠模型上，其体内降糖活性持续时间可提高1倍左右，意味着在人体内可实现至少每周间隔给药、甚至每两周间隔或更长时间间隔给药的给药频率。并且在剂量为索玛鲁肽1/10用量时，其降糖效果也不低于索玛鲁肽，具有更好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的GLP-1(7-37)类似物、该类似物的酰化衍生物。另外，本发明还提供了该类似物或衍生物的制备方法、包含该类似物或衍生物的药物组合物、制品以及它们在预防和治疗疾病中的用途。
具体而言，一方面，本发明提供了一种GLP-1(7-37)类似物的衍生物或其药学上可接受的盐，其中所述GLP-1类似物包含以下式氨基酸序列组成的多肽：
HX8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37
其中X8选自V、T、I、L、G或S，X19为Y或K，X23为Q或K，X27为E或K，X30为A或K，X34为R或K，X36为R或K，X37为G或K，
条件是，在X19、X23、X27、X30、X34、X36或X37中只有一个是K残基，
所述衍生物包含与所述K残基连接的延长部分，其中所述延长部分为
其中x是4-38的整数。
其中，延长部分优选为：HOOC(CH2)14CO-、HOOC(CH2)15CO-、HOOC(CH2)16CO-、HOOC(CH2)17CO-、HOOC(CH2)18CO-、HOOC(CH2)19CO-、HOOC(CH2)20CO-、HOOC(CH2)21CO-和HOOC(CH2)22CO-，更优选为HOOC(CH2)16CO-。
在优选实施方案中，本发明所述GLP-1类似物的衍生物或其药学上可接受的盐的延长部分经一接头与GLP-1的K残基连接。所述接头可以是如下结构：
优选地，接头为：
其中m是1或2；n是1或2；p是1-5的任意整数。
更优选：接头为：
本发明也涉及GLP-1(7-37)类似物，该类似物包含
H X8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37序列，该序列包含选自如下一个或多个位点的突变：
第8位、第19位、23位、27位、30位、34位、36位和37位。在一个优选的实施方案中，第8位氨基酸残基选自V、T、I、L、G或S，第19位氨基酸残基为Y或K，第23位氨基酸残基为Q或K，第27位氨基酸残基为E或K，第30位氨基酸残基为A或K，第34位氨基酸残基为R或K，第36位氨基酸残基为R或K，第37位氨基酸残基为G或K，条件是，第19位、23位、27位、30位、34位、36位或37位只能有一位为K残基。
上述GLP-1类似物经过酰化后的衍生物，体外结合活性表明，与GLP-1R受体结合亲和力大于索玛鲁肽或M0(26位为Lys，CN107033234A中公开)。体内降糖实验也证明，与同样为酰化的GLP-1产品索玛鲁肽相比，上述GLP-1类似物经过酰化后的衍生物在正常小鼠体内可以获得更长的降糖活性持续时间；在糖尿病鼠体内，上述衍生物的降糖和提高糖耐量的效果显著优于索玛鲁肽，并且，在剂量仅为索玛鲁肽或M0的1/10剂量时，其降糖效果也不低于索玛鲁肽或M0。同时，本发明的研究证明上述GLP-1(7-37)类似物的衍生物与市售索玛鲁肽相比，有更好的抗酶降解特性。
具体地，本发明涉及：
1、一种GLP-1(7-37)类似物的衍生物或其药学上可接受的盐，其中GLP-1(7-37)类似物包含下式的氨基酸序列：
HX8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37
其中X8选自V、T、I、L、G或S，X19为Y或K，X23为Q或K，X27为E或K，X30为A或K，X34为R或K，X36为R或K，X37为G或K，
条件是，在X19、X23、X27、X30、X34、X36或X37中只有一个是K残基，
所述衍生物包含与所述GLP-1(7-37)类似物的K残基连接的延长部分，其中所述延长部分为
其中x是4-38的整数。
2、根据权利要求1所述的衍生物或其药学上可接受的盐，其中所述延长部分选自：
HOOC(CH2)14CO-、HOOC(CH2)15CO-、HOOC(CH2)16CO-、HOOC(CH2)17CO-、HOOC(CH2)18CO-、HOOC(CH2)19CO-、HOOC(CH2)20CO-、HOOC(CH2)21CO-和HOOC(CH2)22CO-。
3、根据权利要求1或2所述的衍生物或其药学上可接受的盐，其中所述延长部分通过接头与GLP-1(7-37)类似物的K残基连接。
4、根据权利要求3所述的衍生物或其药学上可接受的盐，其中接头为：
优选地，接头为：
其中m是1或2；n是1或2；p是1-5的任意整数。
5、根据权利要求4所述的衍生物或其药学上可接受的盐，其中接头为：
7、制备权利要求1-6中任意一项所述的衍生物或其药学上可接受的盐的方法，包括：
(1)将溶解有上述权利要求任一项中所述的GLP-1类似物的溶液与溶解有上述权利要求任一项所述的延长部分的溶液混合；
(2)调节pH至4-5终止反应，静置，至沉淀产生，取沉淀；和
(3)向沉淀中加入TFA，调节pH至7.5-8.5终止反应。
8、权利要求7的方法，还包括在与溶解有上述权利要求任一项所述延长部分的溶液混合前，向溶解有GLP-1类似物的溶液中加入三乙胺。
9、权利要求7或8的方法，其中上述权利要求任一项所述的延长部分的溶液是乙腈溶解的。
10、一种药物组合物，其包括权利要求1-6中任意一项权利要求所述的衍生物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。
11、权利要求1-6中任意一项权利要求所述的衍生物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗糖尿病(包括I型糖尿病和II型糖尿病)或糖尿病并发症的药物中的用途。
12、权利要求11的用途，其中所述糖尿病并发症为糖尿病性肾病。
13、权利要求1-6中任意一项权利要求所述的衍生物或其药学上可接受的盐在制备减低血糖、提高糖耐量、减少胰岛β-细胞凋亡、增强胰岛β-细胞功能、增加胰岛β-细胞数量和/或恢复胰岛β-细胞的葡萄糖敏感性的药物中的用途。
14、权利要求13的用途，其中所述降低血糖包括降低空腹血糖和/或餐后血糖。
15、一种预防和/或治疗糖尿病(包括I型糖尿病和II型糖尿病)或糖尿病并发症的方法，包括给药受试者预防或治疗有效量的权利要求1-6中任意一项所述的衍生物或其药学上可接受的盐。
16、权利要求15的方法，其中所述糖尿病并发症为糖尿病性肾病。
17、一种降低血糖、提高糖耐量、减少胰岛β-细胞凋亡、增强胰岛β-细胞功能、增加胰岛β-细胞数量和/或恢复胰岛β-细胞的葡萄糖敏感性的方法，包括给药受试者治疗有效量的权利要求1-6中任意一项权利要求所述的衍生物或其药学上可接受的盐。
18、权利要求17的用途，其中所述降低血糖包括降低空腹血糖和/或餐后血糖。
19、一种GLP-1(7-37)类似物，包含由如下氨基酸序列组成的多肽：
H X8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37
其中X8选自V、T、I、L、G或S，X19为Y或K，X23为Q或K，X27为E或K，X30为A或K，X34为R或K，X36为R或K，X37为G或K，并且，在X19、X23、X26、X27、X30、X34、X36或X37中只有一个是K。
20、包含权利要求19的类似物的药物组合物。
21、权利要求19的类似物在制备预防或治疗糖尿病、糖尿病并发症的药物中的用途。
22、一种制品，包括其中装有权利要求10或权利要求20的药物组合物的容器和包装插页，其中该包装插页载有所述药物组合物的使用说明。
23、权利要求22的制品，还包含装有一种或多种其它药物的容器。
24、权利要求23的制品，其中所述一种或多种其它药物为治疗糖尿病或糖尿病并发症的其它药物。
“空腹血糖”指受试者(例如人)空腹时测定的血糖值，例如隔夜空腹、禁食(未进任何食物，饮水除外)至少6个小时，例如6-8小时、8～10小时后检测的血糖值。
“餐后血糖”指进餐之后测定的血糖值，例如进餐后15分钟-2小时、30分钟-2小时、1小时-2小时、2小时测定的血糖值。
本发明一个方面涉及GLP-1(7-37)类似物的制备方法，包括在允许肽表达的条件下，在宿主细胞中表达编码该多肽的DNA序列，然后回收产生的肽。
用来培养细胞的培养基可以是用于培养该宿主细胞的任何常规培养基，如基本培养基或含有适宜添加物的复合培养基。可以通过市售得到适宜的培养基，或根据已公开的制法制备适宜的培养基。然后可以通过常规方法从培养基中回收由所述宿主细胞产生的多肽，例如用盐如硫酸铵沉淀上清液或滤液中的蛋白质成分，根据目的肽的种类而选用各种层析方法如例子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等进行进一步纯化。
可以将上述编码DNA序列插入任何适当的载体中。通常，载体的选择常常取决于该载体将要被引入的宿主细胞，因此，载体可以是一种自主复制型载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，如质粒。或者，载体可以是这样一种类型，当将其引入宿主细胞时，它将整合到宿主细胞基因组中，并与它所整合入的染色体一起复制。
载体优选是一种表达载体，其内编码所述肽的DNA序列与该DNA转录所需的其它区段(如启动子)有效相连。本领域熟知适合于在多种宿主细胞中指导编码本发明肽的DNA进行转录的启动子例子，参见例如Sambrook，J，Fritsch，EF和Maniatis，T，分子克隆：实验操作指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约，1989中所述。
载体还可以含有选择标记，如可以是这样的一种基因，其基因产物将弥补宿主细胞内的一个缺陷，或者能赋予对药物如氨苄青霉素、阿霉素、四环素、氯霉素、新霉素、链霉素或氨甲喋呤等的抗性。
为将本发明表达的肽引入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称之为前导序列)。分泌信号序列以正确读框与编码该肽的DNA序列连接。分泌信号序列通常位于编码该肽的DNA序列的5’侧。分泌信号序列可以是正常地与该肽连接的分泌信号序列，或可以源于编码另一种分泌蛋白质的基因。
用于分别连接编码本发明肽的DNA序列，启动子和可选择的终止子和/或分泌信号肽序列，并将其插入到适宜的含有复制所必需的信息的载体中的方法，对本领域的技术人员是已知的。
将导入DNA序列或重组载体的宿主细胞可以是能够产生本发明肽的任何细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核生物细胞。本领域技术人员熟知并使用的适宜的宿主细胞的例子包括但不限于：大肠杆菌、酿酒酵母、或哺乳动物BHK或CHO细胞系。
本发明涉及包含上述GLP-1(7-37)类似物的药物或药物组合物，还涉及该类似物在制备药物中的用途，例如在制备预防或治疗糖尿病(优选2型糖尿病)、糖尿病并发症(例如糖尿病肾病，糖尿病心脏病)、降低血糖或提高糖耐量的药物中的用途。
另一方面，本发明也涉及通过给药受试者上述GLP-1(7-37)类似物或上述GLP-1(7-37)类似物的衍生物预防或治疗糖尿病(例如I型和II型糖尿病)、糖尿病并发症(例如糖尿病血管病变、糖尿病神经病变、糖尿病眼病、糖尿病肾病，糖尿病心脏病)、降低血糖(例如空腹血糖和餐后血糖)或提高糖耐量的方法。另一方面，本发明也涉及上述GLP-1(7-37)类似物或上述GLP-1(7-37)类似物的衍生物在制备预防或治疗糖尿病(例如I型和II型糖尿病)、糖尿病并发症(例如糖尿病血管病变、糖尿病神经病变、糖尿病眼病、糖尿病肾病，糖尿病心脏病)、降低血糖或提高糖耐量的药物中的用途。
另一方面，本发明涉及包含上述GLP-1(7-37)类似物的药物组合物，制品或试剂盒。
本发明还涉及包含上述GLP-1(7-37)类似物的衍生物的药物组合物，制品或试剂盒。
本发明所述的药物组合物除包含活性成分GLP-1(7-37)类似物或GLP-1(7-37)类似物的衍生物或其盐外，还包含药学上可接受的辅料。本领域技术人员熟知药学上可接受的辅料，例如无毒的填充剂、稳定剂、稀释剂、载体、溶剂或其他制剂辅料。例如，稀释剂、赋形剂，如微晶纤维素、甘露醇等；填充剂，如淀粉、蔗糖等；粘合剂，如淀粉、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，如碳酸钙和/或碳酸氢钠；吸收促进剂，如季铵化合物；表面活性剂，如十六烷醇；载体、溶剂，如水、生理盐水、高岭土、皂粘土等；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外，本发明的药物组合物优选为注射剂。
本发明还涉及一种减少胰岛β-细胞凋亡、增强胰岛β-细胞功能、增加胰岛β-细胞数量和/或恢复胰岛β-细胞的葡萄糖敏感性的方法，包括给药有需要的受试者有效量的上述类似物、衍生物或药物、药物组合物。
本发明还涉及上述类似物、衍生物或药物、药物组合物在制备减少胰岛β-细胞凋亡、增强胰岛β-细胞功能、增加胰岛β-细胞数量和/或恢复胰岛β-细胞的葡萄糖敏感性的药物中的用途。
在本发明中，GLP-1(7-37)多肽、GLP-1(7-37)多肽类似物、GLP-1(7-37)类似物可以互换使用，表示含有氨基酸序列：H X8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37的多肽，其中X8选自V、T、I、L、G或S，X19为Y或K，X23为Q或K，X27为E或K，X30为A或K，X34为R或K，X36为R或K，X37为G或K。该GLP-1(7-37)多肽类似物通过与延长部分连接，形成该GLP-1(7-37)多肽类似物的衍生物。具体地，本发明涉及GLP-1(7-37)类似物的酰化衍生物。该酰化衍生物不但具有显著的治疗效果，而且与现有公认的最好的药物索玛鲁肽相比，其体内活性持续时间可提高1倍左右，意味着在人体内可实现至少每周间隔给药、甚至每两周间隔或更长时间间隔给药的给药频率。
本发明GLP-1(7-37)类似物的衍生物、GLP-1(7-37)类似物的酰化衍生物，GLP-1(7-37)衍生物、GLP-1衍生物可以互换使用。
另一方面，本发明还涉及制备上述衍生物或其药学上可接受的盐的方法，包括：
(1)将溶解有上述的GLP-1类似物的溶液与溶解有延长部分(例如脂肪酸)的溶液混合；
(2)调节pH至4-5终止反应，静置，至沉淀产生，取沉淀；和
(3)向沉淀中加入TFA，调节pH至7.5-8.5终止反应。
在一个优选实施方案中，上述方法包括向GLP-1类似物的溶液中加入三乙胺。
在一个优选实施方案中，上述延长部分(例如脂肪酸)是乙腈溶解的溶液。
本发明例示性的制备方法包括(1)提供GLP-1(7-37)类似物溶液，调整pH至9-12；
(2)然后向步骤(1)获得的溶液中加入三乙胺；
(3)称取不低于该GLP-1类似物2倍量(摩尔比)的如下结构的脂肪酸，优选为不低于3倍量的GLP-1类似物，溶于乙腈中；
(4)将步骤(2)获得的GLP-1类似物溶液与步骤(3)获得的脂肪酸溶液混合，低温静置，例如一小时；
(5)调节pH至4-5终止反应，低温静置酸沉，收取沉淀；
(6)向步骤(5)获得的酸沉样品中加入TFA至多肽终浓度5-15mg/ml，静置0.5-2小时，向反应液中滴入碱性溶液，例如NaOH，调节pH至7.5-8.5终止反应；
(7)分离纯化所得产物。
本发明涉及包含GLP-1(7-37)类似物的衍生物或其药学上可接受的盐的药物组合物的制剂。在一些实施方案中，本发明的包含GLP-1(7-37)类似物的衍生物或其药学上可接受的盐以0.1mg/ml至25mg/ml的浓度存在，优选以0.1mg/ml至10.0mg/ml的浓度存在。在优选实施方案中，所述药物组合物具有3.0至9.0的pH。在优选实施方案中，所述药物组合物可进一步包含缓冲系统、防腐剂、表面张力剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在一些实施方案中，本发明所述的药物或制剂是含水药物或制剂，例如，他们通常可以是溶液或悬浮液。在本发明的具体实施方案中，所述的药物或制剂是稳定的含水溶液。在本发明的另一些具体实施方案中，所述药物或制剂是一种冻干制剂，在使用前将溶剂和/或稀释液加入其中。
本发明还涉及包含上述药物组合物、制剂、药物的药盒或试剂盒。在该药盒或试剂盒中，除包含上述药物或制剂外，还包括可以与该药物组合物、制剂、药物联合使用的其它药物、药物化合物或组合物，例如，所述其它药物、药物化合物或组合物可以选自抗糖尿病药物、用于治疗和/或预防由糖尿病引发或与其相关的并发症的药物。这些药物的实例包括：胰岛素、磺脲类、双胍、氯茴苯酸类、葡萄糖苷酶抑制剂、胰高血糖素拮抗剂、涉及刺激糖异生和/或糖原分解的肝脏酶的抑制剂、葡萄糖摄取调节剂、NPY拮抗剂、PYY激动剂、PYY2激动剂、PYY4激动剂、TNF激动剂、促皮质素释放因子激动剂、5HT、蛙皮素激动剂、神经节肽拮抗剂、生长激素、促甲状腺激素释放激素激动剂、TRβ激动剂；组胺H3拮抗剂、脂肪酶/淀粉酶抑制剂、胃抑制性多肽激动剂或拮抗剂、胃泌素和胃泌素类似物等。在一些实施方案中，本发明所述的药物组合物、制剂、药物与其它的药物、药物化合物或组合物分别放置在不同的容器中。
本发明也涉及一种预防或治疗糖尿病(例如I型和II型糖尿病)、糖尿病并发症(例如糖尿病血管病变、糖尿病神经病变、糖尿病眼病、糖尿病肾病，糖尿病心脏病)、降低血糖(例如空腹血糖和餐后血糖)、的方法，包括给药有需要的受试者上述类似物、衍生物或药物、药物组合物，其中所述类似物、衍生物或药物、药物组合物与其它药物、药物化合物或组合物联合使用，例如，所述其它药物、药物化合物或组合物可以选自抗糖尿病药物、用于治疗和/或预防由糖尿病引发或与其相关的并发症的药物。这些药物的实例包括：胰岛素、磺脲类、双胍、氯茴苯酸类、葡萄糖苷酶抑制剂、胰高血糖素拮抗剂、涉及刺激糖异生和/或糖原分解的肝脏酶的抑制剂、葡萄糖摄取调节剂；CART激动剂、NPY拮抗剂、PYY激动剂、PYY2激动剂、PYY4激动剂、TNF激动剂、促皮质素释放因子激动剂、5HT、蛙皮素激动剂、神经节肽拮抗剂、生长激素、促甲状腺激素释放激素激动剂、TRβ激动剂；组胺H3拮抗剂、脂肪酶/淀粉酶抑制剂、胃抑制性多肽激动剂或拮抗剂、胃泌素和胃泌素类似物等。在优选实施方案中，所述糖尿病为2型糖尿病或糖尿病肾病。
本发明所述的“糖尿病并发症”是指由糖尿病过程中血糖控制不良导致的身体其他器官或组织的损害或功能障碍性疾病，其中包括肝脏、肾脏、心脏、视网膜、神经系统的损害或功能障碍等。糖尿病的并发症可分为五个方面：1.心血管病变：包括心脏和大血管上的微血管病变、心肌病变、心脏自主神经病变，引起糖尿病患者死亡的首要病因。2.脑血管病变：是指由糖尿病所引起的颅内大血管和微血管病变，主要表现为脑动脉硬化、缺血性脑血管病、脑出血、脑萎缩等。3.肾血管病变：主要表为糖尿病肾病，是糖尿病患者最重要的合并症之一。4.下肢动脉病变：主要表现为糖尿病足。5.眼底微血管病变：主要表现为糖尿病性视网膜病变。
本发明通过下面实施例来进一步阐述，然而，所述的实施例不应理解为限制本专利的保护范围，在前面描述和下列实施例中公开的特征(个别地和它们的任何组合)，可以是用于以基本不同形式实现本发明的材料，他们可以任意组合。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
附图简述
图1显示不同酰化的GLP-1衍生物分子对II型糖尿病db/db小鼠的降糖效果。
图2显示不同剂量的M0、M4和索玛鲁肽对糖尿病小鼠空腹血糖影响的趋势图。
图3显示不同剂量的M0、M4和索玛鲁肽对糖尿病小鼠随机血糖的影响。
图4显示不同剂量的M0、M4和索玛鲁肽对糖尿病小鼠血糖曲线下面积的影响。
图5显示M4及索玛鲁肽分子抗胃蛋白酶降解的趋势图。
图6显示M4及索玛鲁肽分子抗胰蛋白酶降解的趋势图。
实施例
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》、《细胞实验指南》等实验手册以及CFDA的试验指引等所列方法来实施。其中，所用的试剂原料均为市售品，可以通过公开渠道购买获得。
实施例1 GLP-1类似物表达质粒的构建
构建Val8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37)的DNA
将6-His标签、SUMO标签和Val8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37)编码基因序列(SEQID NO:7)依次串联融合，并使用化学合成的方式获得基因片段(SEQ ID NO：18)。通过BamHI和XhoI位点，将上述片段插入原核表达质粒pET-24(+)中并测序验证。得到的用于转化测定的表达质粒，称作pET-24(+)-His-SUMO-Val8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37)。
依据上述方法，依次构建Val8Glu22Lys26Arg34-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ IDNO：3)、Val8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:11)、Val8Glu22Lys19Arg26,34-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:5)、Val8Glu22Lys27Arg26,34-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:9)、Val8Glu22Lys34Arg26-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:13)、Val8Glu22Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:15)、Val8Glu22Arg26,34Lys37-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:17)、Thr8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:20)、Ile8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:22)、Leu8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:24)、Gly8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:26)、Ser8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:28)、Thr8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:30)、Ile8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:32)、Leu8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:34)、Gly8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:36)、Ser8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37)(编码基因为SEQ ID NO:38)的相应表达质粒。
实施例2融合蛋白表达
使用实施例1中所述DNA构建进行融合蛋白的表达，通过表达细胞BL21(TrabsGenBiotech.，catalog#CD601)获得目的蛋白。将BL21感受态细胞50μl置于冰浴上融化，加入目的DNA，轻轻摇匀，并在冰浴中放置30分钟。继而42℃水浴热激30秒，然后快速将离心管转移到冰浴中放置2分钟，该过程不要摇动离心管。向离心管中加入500μl无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，180rpm培养1小时，使细菌复苏。吸取200μl已转化的感受态细胞加到含有卡那霉素抗性的LB琼脂培养基平板上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。次日，使用接种环挑取转化平皿中的单克隆菌落，并接种于15ml的无菌LB培养基(含抗生素)，30℃过夜培养。
实施例3重组GLP-1类似物的发酵
向50ml的LB培养基中加入50μl菌液(表达GLP-1菌液)，同时加入50μl卡那霉素，混匀后放30℃恒温振荡器中，接种过夜。取过夜接种的菌液10ml加入1000ml的LB培养基中，同时加入1000μl卡那霉素。摇匀后放于37℃摇床内，200rpm，接种4h后向培养基中接入终浓度为0.1mol/L的IPTG，摇匀后放于30℃摇床内，180rpm，过夜诱导表达。将过夜表达的菌液以13000g离心60min。菌体收率约为4g菌/L发酵液，SDS-PAGE测定目的蛋白表达量约可达40％。
实施例4重组GLP-1类似物的纯化
称取100g细胞浆重悬于500ml的50mM Tris-HCl、pH8.0，50mM NaCl中，用超声波细胞粉碎机中超声30min，以使细胞破碎。所述匀浆在4℃下以13000g离心60min，离心完成后收集上清即为Ni柱层析样品。
将所得上清液经事先用50mM Tris-HCl、pH8.0，500mM NaCl，10mM咪唑(平衡液1)平衡过的Chelating Sepharose FF浓缩。平衡液1淋洗后，再用50mM Tris-HCl、pH8.0，50mMNaCl，0.3M咪唑(洗脱液)洗脱。经SDS-PAGE分析，由上述纯化过程生成GLP-1中间产物纯度高于70％。
使用ULP酶将Sumo标签序列切除：中间产物中加入20mM PB、pH7.4缓冲液使其稀释三倍，4℃条件下按照ULP酶：中间产物为1:150加入ULP混匀后酶切过夜。经SDS-PAGE分析酶切率近100％。
GLP-1类似物的精纯：将酶切后所得产物经事先用20mM Na2HPO4，0.7M NaCl(平衡液2)平衡过的东曹Butyl 550C介质浓缩。平衡液2淋洗后，再用20％乙醇洗脱，经SDS-PAGE纯度约为90％。
洗脱样品中加入0.2M Na2HPO4使其终浓度为20mM Na2HPO4，用1M柠檬酸调节pH至4.8-5.0，4℃酸沉过夜。SDS-PAGE检测收率90％以上。4℃下以13000g离心30min，收取沉淀放于-20℃保存。
实施例5 GLP-1类似物的衍生物的制备
如下所示的GLP-1类似物的衍生物，N-ε23-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Val8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(简称M2)的制备
1.脂肪酸修饰：向上述实施例制备、收集的Val8Glu22Lys23Arg26，34-GLP-1(7-37)沉淀中加水，配制为4～6mg/ml溶解液，加入1M氢氧化钠调整pH至11.0-11.5，摇匀使蛋白完全溶解，HPLC定量多肽浓度。按多肽与脂肪酸(结构如下)摩尔比1:4称取脂肪酸粉末溶于乙腈中。向该多肽溶液中加入体积为千分之二的三乙胺，并与脂肪酸溶液混合，将混合液于4℃静置一小时。
样品加水稀释5倍，用1M柠檬酸(或10％乙酸)调pH至4.8终止反应，放于4度静置酸沉10min，酸沉后离心13000g，4℃离心30min，将沉淀放于-80℃保存。
2.脂肪酸脱保护与纯化：向酸沉样品中加入TFA至多肽终浓度约10mg/ml，震荡使沉淀溶解，置于室温静置脱保护30min，向反应液中滴入4M NaOH调节pH至7.5-8.5终止反应。
用制备液相仪(岛津LC-8A)将终止后反应液按4ml/min流速，泵入事先用10mM乙酸铵，20％乙醇(平衡液3)平衡过的UniSil 10-120C18(购自苏州纳微科技有限公司)进行浓缩。平衡液3淋洗后，再按0-100％洗脱液(10mM乙酸铵，80％乙醇)梯度洗脱，收集洗脱峰经RP-HPLC检测纯度约为90％。
洗脱峰用水稀释3倍，酸沉调整pH至4.80，4℃酸沉30min。离心后沉淀中加入PBST缓冲液(pH7.0)复溶后-80℃冻存。
依据上述方法，依次制备N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基]Val8Glu22Lys26Arg34-GLP-1(7-37)(M0)肽，N-ε30-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Val8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M4)、N-ε19-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Val8Lys19Glu22Arg26，34-GLP-1(7-37))肽(M1)、N-ε27-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Val8Glu22Lys27Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M3)、N-ε34-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Val8Glu22Arg26Lys34-GLP-1(7-37))肽(M5)、N-ε36-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Val8Glu22Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37))肽(M6)、N-ε37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Val8Glu22Arg26,34Lys37-GLP-1(7-37))肽(M7)；N-ε23-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Thr8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M8)、N-ε23-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Ile8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M9)、N-ε23-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Leu8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M10)、N-ε23-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Gly8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M11)、N-ε23-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Ser8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M12)；N-ε30-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Thr8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M13)、N-ε30-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Ile8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M14)、N-ε30-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Leu8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M15)、N-ε30-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Gly8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M16)、N-ε30-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Ser8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M17)。
表1 GLP-1(7-37)类似物及其相应衍生物对照表
实施例6 RIN-m5F细胞中GLP-1类似物的衍生物体外活性测定
选取培养状态良好的RIN-m5F细胞。收集细胞，计数，用RPMI1640基础培养液配成1×105个细胞/ml的细胞悬液。接种细胞悬液于96孔细胞培养板中，每孔100μl，37℃、5％CO2条件下培养过夜。利用cAMP检测试剂盒(Promega)检测GLP-1类似物的衍生物的体外活性：配制测定培养液稀释样品(Aib、M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7)至300ng/ml，之后在96孔板中进行3倍梯度稀释，共8个浓度，每个稀释度做2个复孔，其中M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7如上所述制备，Aib为
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)肽(参见CN101133082B实施例4)，商品名为索玛鲁肽，依据专利CN101133082B所公开的方法制备。
取出已制备好的细胞板，弃掉培养基，滤纸上吸干。将样品溶液对应移入细胞板中，40μl/孔。于37℃、5％CO2条件下开盖处理15min。从培养箱内取出细胞培养板，在各孔加入10μl CD溶液(cAMP检测试剂盒(Promega))，将细胞板放在22℃-25℃、500rpm水平振荡放置20min。各孔加入50μl KG溶液(cAMP检测试剂盒(Promega))，22℃-25℃、500rpm水平振荡避光放置10min。用Molecular Devices SpectraMax L化学发光仪读取化学发光数值，30min完成检测。利用softmax Pro software软件中的四参数回归计算样品EC50。
表2体外活性实验结果
| 样品 | Aib | M0 | M1 | M2 | M3 | M4 | M5 | M6 | M7 |
| EC50 | 2.437 | 10.68 | 5.386 | 1.996 | 5.387 | 2.322 | 3.043 | 7.650 | 3.208 |
RIN-m5F细胞体外药效学表明，索玛鲁肽、M2、M4、M5和M7的体外活性相当，总体上略高于M0、M1、M3和M6。
实施例7 HEK293/CRE-Luc/GLP1R细胞中GLP-1类似物的衍生物体外活性测定
根据GLP-1可与细胞膜上的受体结合，构建了HEK293/CRE-Luc/GLP1R细胞系，通过一系列信号转导，激活cAMP反应元件(CRE)，启动下游荧光素酶的表达，表达量与GLP-1的生物学活性成正相关，加入荧光素酶底物后，进行化学发光检测测定其发光强度，以此测定GLP-1生物学活性。
实验材料
96孔细胞培养板(白色不透明)、DMEM培养基(GIBCO)、0.05％TRYPSIN-EDTA(GIBCO)、胎牛血清(GIBCO)、G418、潮霉素B、Bright-GloTM Luciferase Assay System试剂盒(Promega)、HEK293/CRE-luc/GLP1R细胞。
实验操作
(1)细胞制备：细胞培养至生长状态旺盛，且足够量。弃去培养瓶中的培养液，加入3ml Versene液摇洗1次，加入0.05％TRYPSIN-EDTA消化液2ml，盖上瓶盖平放静置1分钟，然后加入6ml测定培养液终止消化，1000r/min离心3min后，倒掉上清，用5ml测定培养基重悬细胞并用血球计数板计数。用DMEM测定培养液调整细胞密度到合适范围后，待用。
(2)样品制备：将表1不同GLP-1类似物的衍生物用测定培养液稀释至20ng/ml，之后在96孔板中梯度稀释8个浓度，并用测定培养液代替样品作为细胞空白对照，每个稀释浓度做2个复孔。
(3)加样培养：将制备好的对照品和供试品溶液移入96孔细胞培养板(白板)中，每孔加入50μl，再加入配制好的细胞悬液，每孔加入50μl，置于37℃、5％CO2条件下培养一定时间。
(4)化学发光检测：加入底物，取出96孔细胞培养板，每孔加入100μl Bright Glo试剂，避光放置3min。
(5)读数：用化学发光酶标仪SpectraMax L进行测定，30min内读板，记录测定结果。
表3 HEK293/CRE-Luc/GLP1R细胞体外活性实验结果
HEK293/CRE-Luc/GLP1R细胞药效学表明，索玛鲁肽、M2、M4、M9、M11、M14、M16和M17的体外活性相当，总体上略高于M13。
实施例8 GLP-1类似物的脂肪酸修饰的衍生物在正常小鼠体内的降糖研究
选用28只周龄4～6周的健康CD-1雌性小鼠，分为4组，分别皮下注射M2、M4、M0和索玛鲁肽(Aib)，剂量分别为0.15mg/kg体重。按照给药前，给药后6h、1天、2天、3天、4天的时间间隔灌胃20％葡萄糖，剂量为2g/kg体重，给糖前禁食6h，并在给糖后0、0.5、1、2h分别尾尖取血并使用罗氏血糖试纸实时检测血糖值，并计算出0～120分钟内的血糖AUC(血糖～时间曲线下面积)，算出血糖抑制率(表4)。
表4正常小鼠体内降糖效果比较
P值：与给药前血糖比较
从表4中可以看出，索玛鲁肽在正常小鼠体内的降糖活性持续大约2天，M0在正常小鼠体内的降糖活性持续大约3天，而M2及M4在正常小鼠体内的降糖活性在第4天仍然表现出明显活性，体内维持持续降糖活性的时间明显长于索玛鲁肽或M0，并且在给药第3天后的各个时间点，M2及M4的降糖效果也都明显强于索玛鲁肽或M0。
选用28只周龄4～6周的健康CD-1雌性小鼠，分为4组，分别皮下注射M4、M5、M7和M0，剂量分别为0.15mg/kg体重。按照给药前，给药后6h、1天、2天、3天、4天的时间间隔灌胃20％葡萄糖，剂量为2g/kg体重，灌胃20％葡萄糖前禁食6h，并在给糖后0、0.5、1、2h分别尾尖取血并使用罗氏血糖试纸实时检测血糖值，并计算出0～120分钟内的血糖AUC(血糖～时间曲线下面积)，算出血糖抑制率(表5)。
表5正常小鼠体内降糖效果比较
从表4和表5结果看，M2、M4效果优于M0及索玛鲁肽，M2、M4、M5、M7之间效果相当，无显著差异。
实施例9使用ICR小鼠的降糖效果研究
ICR小鼠OGTT试验：选用30只周龄4～6周的ICR小鼠，分为6组，5只/组，分别皮下注射M0、索玛鲁肽、M2、M4、M5和M7，剂量分别为0.15mg/kg体重，单次给药。按照4h、1d、2d、3d、4d、5d的时间，每天灌胃20％葡萄糖，剂量为2g/kg体重，给糖前禁食6h，并在灌胃20％葡萄糖后0、0.5、1、2小时分别尾尖取血并使用罗氏血糖试纸实时检测血糖值。尾尖取血并使用罗氏血糖试纸实时检测血糖值，并计算出0～120分钟内的血糖AUC(血糖～时间曲线下面积)，算出血糖抑制率(表6)。
表6ICR小鼠体内降糖效果比较
从表6结果可以看出，降糖维持作用：M4、M5、M2、M7的降糖作用均可维持至少4天，远优于M0(仅维持3天)和索玛鲁肽(仅维持2天)，均有统计学意义。
实施例10对II型糖尿病db/db小鼠降糖药效试验
50只db/db小鼠，雌性，8-9周龄，根据给药前体重、空腹血糖值(FBG)平均分为10组，5只/组，分别单次皮下注射溶媒，M2、M4、索玛鲁肽、M9、M11、M13、M14、M16和M17，按照10ml/kg给药，给药剂量均为0.05mg/kg，给药时间定为0h。小鼠每天禁食6-8h后检测空腹血糖，给药后每天均检测空腹血糖，直至各受试组动物空腹血糖恢复至给药前结束。给药前检测的血糖值称为基础血糖值，设定为0。
空腹血糖变化值(Δ：delta)＝给药后血糖值-给药前基础血糖值。
结果如图1所示，从第4天和第5天可以看出，M9，M13，M14，降糖效果优于索玛鲁肽，也不低于M2，而M11，M16及M17在第2天表现出低于索玛鲁肽的降糖效果。
实施例11不同剂量索玛鲁肽、M0及M4对II型糖尿病db/db小鼠的降糖效果
35只db/db小鼠，雌性，8-9周龄，根据给药前体重、血糖曲线下面积(G-AUC)平均分为7组，5只/组，分别单次皮下注射溶媒、M4(0.15、0.015mg/kg)、索玛鲁肽(0.15、0.015mg/kg)和M0(0.15、0.015mg/kg)，按照10ml/kg给药。给药时间定为0h，小鼠每天禁食7-8h后，测定空腹血糖和OGTT(口服糖耐量测定)，之后以1g/kg体重的量灌胃10％葡萄糖，然后于糖负荷后0、0.5、1、2h分别尾尖取血实时检测血糖值。给药后每天禁食前测量血糖称随机血糖，直至各受试组动物血糖恢复至给药前水平结束。给药前测定的基础血糖值、随机血糖值和血糖曲线下面积(G-AUC)值均为衡量药效的基数，均设定为0。
血糖变化量(Δ：delta)＝给药后血糖值-给药前基础血糖值；
血糖曲线下面积变化量(Δ：delta)＝给药后血糖曲线下面积-给药前血糖曲线下面积。
结果见表7、8和9及图2、3和4。
表7各供试组小鼠空腹血糖变化表
注：“-21h”代表给药前空腹血糖基数。
表8各供试组小鼠平均随机血糖变化表
注：“-5h”代表给药前5h的随机血糖基数。
表9各供试组小鼠血糖曲线下面积(G-AUC)变化表
注：“-21h”代表给药前血糖曲线下面积基数。
表7-9及图2-4的结果表明：
空腹血糖：M4 0.15mg/kg剂量组在给药后123h恢复至给药前基础血糖基数，0.015mg/kg剂量组在给药后99h恢复至给药前基础血糖基数；索玛鲁肽0.15mg/kg剂量组在给药后51h恢复至给药前基础血糖基数，0.015mg/kg剂量组在给药后27h恢复至给药前基础血糖基数；M0 0.15mg/kg剂量组在给药后75h恢复至给药前基础血糖基数，0.015mg/kg剂量组在给药后51h恢复至给药前基础血糖基数；其中，M4的0.015mg/kg剂量组各检测时间点空腹血糖降低值均不低于索玛鲁肽或M0的0.15kg/kg剂量组。
随机血糖：M4 0.15mg/kg剂量组在给药后115h恢复至给药前随机血糖基数，0.015mg/kg剂量组在给药后115h恢复至给药前随机血糖基数；索玛鲁肽0.15mg/kg剂量组在给药后67h恢复至给药前随机血糖基数，0.015mg/kg剂量组在给药后67h恢复至给药前随机血糖基数；M0 0.15mg/kg剂量组在给药后67h恢复至给药前随机血糖基数，0.015mg/kg剂量组在给药后67h恢复至给药前随机血糖基数；其中，M4的0.015mg/kg剂量组各检测时间点对随机血糖的抑制作用均不低于索玛鲁肽或M0的0.15kg/kg剂量组。
血糖曲线下面积(G-AUC)：M4 0.15mg/kg剂量组在给药后99h恢复给药前血糖曲线下面积基数，0.015mg/kg剂量组在给药后99h恢复给药前血糖曲线下面积基数；索玛鲁肽0.15mg/kg剂量组在给药后51h恢复给药前血糖曲线下面积基数，0.015mg/kg剂量组在给药后51h恢复给药前血糖曲线下面积基数；M0 0.15mg/kg剂量组在给药后51h恢复给药前血糖曲线下面积基数，0.015mg/kg剂量组在给药后27h恢复给药前血糖曲线下面积基数；其中，M4的0.015mg/kg剂量组各检测时间点血糖曲线下面积均不低于索玛鲁肽或M0的0.15kg/kg剂量组。
这些降糖方面的结果说明，单次皮下注射M4或索玛鲁肽或M0后，各组均显示出明显的降糖作用，但M4降糖效果最好。M4的0.015mg/kg剂量降糖效果相当于索玛鲁肽的0.15mg/kg剂量或M0的0.15mg/kg剂量的降糖效果。
实施例12 M4及索玛鲁肽的抗酶降解稳定性研究
胃蛋白酶(3200-4500U/mg蛋白，来源于sigma，货号P6887)，胰蛋白酶(约10000AEEU/mg蛋白，来源Sigma，货号T8003)。
(1)反应溶液
A：胃蛋白酶反应缓存液：配制三个不同pH(2.6、4.0、7.4)的20mM柠檬酸-磷酸盐缓存液，并加入0.005％Tween 20及0.001％BSA作为胃蛋白酶反应缓冲液。
B：胰蛋白酶反应缓存液：配置三个不同pH(4.0、6.8、8.0)的20mM柠檬酸-磷酸盐缓存液，并加入0.005％Tween 20及0.001％BSA作为胃蛋白酶反应缓冲液。
C：含胃蛋白酶模拟胃液(SGF)：取0.1M盐酸5ml，加入0.019g胃蛋白酶使之溶解即得。
D：含有胰蛋白酶的模拟肠液(SIF)：取磷酸二氢钾0.0684g，加水2.5ml使其溶解，加0.2M氢氧化钠溶液0.77ml和水5ml，再加胰蛋白酶0.1001g使其溶解后，测pH为6.82，再加水稀释至10ml，即得。
(2)样品配置
取M4及索玛鲁肽样品，用pH7.4的PB缓冲液稀释到1.33mg/ml，作为供试品母液。
(3)胃蛋白酶降解实验
分别取适量供试品母液，用不同pH胃蛋白酶反应缓存液稀释至0.06mg/ml，将每组反应溶液分成1ml/管，总共7管，混匀后置于37℃水浴孵育30min。取出1管不加SGF作为无酶反应0点(记为-5min点)，再取出6管分别加入SGF混匀，其中一管立即加入适量体积的1MNaOH终止反应，作为加酶后的0点(记为0min点)，其余5管继续置于37℃反应，并分别于5min、10min、20min、35min、50min各取出一组加适量体积的1M NaOH终止反应。所有实验组各管保证终止反应后的总体积一致。
(4)胰蛋白酶降解实验
分别取适量供试品母液，用不同pH胰蛋白酶反应缓存液稀释至0.06mg/ml，将每组反应溶液分成1ml/管，总共7管，混匀后置于37℃水浴孵育30min。取出1管不加SIF作为无酶反应0点(记为-5min点)，再取出6管分别加入SIF混匀，其中一管立即加入适量体积的6MHCl终止反应，作为加酶后的0点(记为0min点)，其余5管继续置于37℃反应，并分别于5min、10min、20min、35min、50min各取出一组加适量体积的6M HCl终止反应。所有实验组各管保证终止反应后的总体积一致。
对酶降解实验取样进行HPLC检测，以无酶反应0点(记为-5min点)的样品主峰峰面积为基础峰面积，计算加酶后获得的不同时间点的主峰峰面积剩余的百分比。
胃蛋白酶降解实验数据(n＝3)显示(图5)，M4及索玛鲁肽分子在酸性条件下(pH2.6)的降解速率相当，这是由于在该pH下胃蛋白酶活性最高；在中性pH7.4时，两个分子基本都未被降解，此时胃蛋白活性最低；而在pH4.0时，索玛鲁肽被降解的速率明显高于M4，前者的t1/2约为10min，后者t1/2约为45min，说明M4抵抗胃蛋白酶降解的能力明显优于索玛鲁肽。
胰蛋白酶降解实验数据(n＝4)显示(图6)，pH6.8及8.0条件下两者降解的速率基本一致，原因是该pH范围为胰蛋白酶的最高活性范围；在pH4.0条件下，M4及索玛鲁肽也表现出了抵抗胰蛋白酶降解的能力，两者也基本无差异。
序列表
<110> 杭州先为达生物科技有限公司
<120> 酰化的GLP-1衍生物
<130> PC00515D3
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<170> PatentIn version 3.5
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attttgttta actttaataa ggagatatac catgcatcac catcatcacc acgctaaacc 60
ggaagttaaa ccggaagtta aaccggaaac ccacatcaac ctgaaagttt ctgacggttc 120
ttctgaaatc ttcttcaaaa tcaaaaaaac caccccgctg cgtcgtctga tggaagcttt 180
cgctaaacgt cagggtaaag aaatggactc tctgcgtttc ctgtacgacg gtatccgtat 240
ccaggctgac cagaccccgg aagacctgga catggaagac aacgacatca tcgaagctca 300
ccgtgaacag atcggtggtc acgttgaagg taccttcacc tctgacgttt cttcttacct 360
ggaagaaaaa gctgctcgtg aattcatcgc ttggctggtt cgtggtcgtg gttaataata 420
a 421
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cacagcgaag gtaccttcac ctctgacgtt tcttcttacc tggaagaaca ggctgctcgt 60
gaattcatca aatggctggt tcgtggtcgt ggt 93
Claims (10)
1.一种GLP-1(7-37)类似物的衍生物或其药学上可接受的盐，其中GLP-1(7-37)类似物包含下式的氨基酸序列：
HX8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37，
其中X8选自V、T、I、L、G或S，X19为Y或K，X23为Q或K，X27为E或K，X30为A或K，X34为R或K，X36为R或K，X37为G或K，
条件是，在X19、X23、X27、X30、X34、X36或X37中只有一个是K残基，
所述衍生物包含与所述GLP-1(7-37)类似物的K残基连接的延长部分，其中所述延长部分为
其中x是4-38的整数。
2.根据权利要求1所述的衍生物或其药学上可接受的盐，其中所述延长部分选自：
HOOC(CH2)14CO-、HOOC(CH2)15CO-、HOOC(CH2)16CO-、HOOC(CH2)17CO-、HOOC(CH2)18CO-、HOOC(CH2)19CO-、HOOC(CH2)20CO-、HOOC(CH2)21CO-和HOOC(CH2)22CO-。
3.根据权利要求1或2所述的衍生物或其药学上可接受的盐，其中所述延长部分通过接头与GLP-1(7-37)类似物的K残基连接。
4.根据权利要求3所述的衍生物或其药学上可接受的盐，其中接头为：
优选地，接头为：
其中m是1或2；n是1或2；p是1-5的任意整数。
5.根据权利要求4所述的衍生物或其药学上可接受的盐，其中接头为：
6.权利要求1-5任一项所述的衍生物或其药学上可接受的盐，其为选自如下的任一衍生物或其药学上可接受的盐：N-ε23-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Val8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M2)、N-ε30-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Val8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M4)、N-ε34-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Val8Glu22Arg26Lys34-GLP-1(7-37))肽(M5)、N-ε37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Val8Glu22Arg26,34Lys37-GLP-1(7-37))肽(M7)、N-ε23-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Ile8Glu22Lys23Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M9)\N-ε30-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Thr8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M13)\N-ε30-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基](Ile8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37))肽(M14)。
7.制备权利要求1-6中任意一项所述的衍生物或其药学上可接受的盐的方法，包括：
(1)将溶解有上述权利要求任一项中所述的GLP-1类似物的溶液与溶解有上述权利要求任一项所述的延长部分的溶液混合；
(2)调节pH至4-5终止反应，静置，至沉淀产生，取沉淀；和
(3)向沉淀中加入TFA，调节pH至7.5-8.5终止反应。
8.权利要求7的方法，还包括在与溶解有上述权利要求任一项所述延长部分的溶液混合前，向溶解有GLP-1类似物的溶液中加入三乙胺。
9.权利要求7或8的方法，其中上述权利要求任一项所述的延长部分的溶液是乙腈溶解的。
10.一种药物组合物，其包括权利要求1-6中任意一项权利要求所述的衍生物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。
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