CN113203487B - 一种荧光寿命偏差的定量化校正方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光寿命偏差的定量化校正方法及装置，借助蒙特卡洛模拟方法模拟在一个激光脉冲周期内发射不同数量光子时，TCSPC系统的探测情况，获取不同发射光子数所对应的荧光衰减光子数分布直方图；利用最小二乘法对荧光衰减光子数分布直方图进行拟合，得到TCSPC系统对应于不同发射光子数探测时的荧光寿命；统计TCSPC系统采样过程中，多光子探测的荧光寿命与单光子探测的荧光寿命之间的定量关系；基于定量关系，校正TCSPC系统的荧光寿命偏差。通过本发明的实施，利用多光子探测的数据来保证TCSPC系统的高计数效率，缩短光子的采集时间，从而提高了TCSPC荧光寿命的成像速度。

Description

一种荧光寿命偏差的定量化校正方法及装置

技术领域

本发明涉及光电探测与成像领域，尤其涉及一种荧光寿命偏差的定量化校正方法及装置。

背景技术

荧光寿命显微成像技术(florescence lifetime imaging microscopy，FLIM)可以分为时域荧光寿命成像和频域荧光寿命成像两类。时域荧光寿命成像主要有三种类型：时间相关单光子计数技术(time-correlated single photon counting，TCSPC)、门控探测法和基于扫描相机的荧光寿命成像。

其中，TCSPC技术相比于其他技术有着更高的时间分辨率。该技术采用脉冲光作为激发光源，通过检测记录一个激发脉冲周期内的单个光子响应并进行计数来获取荧光寿命信息。在检测的过程中，参考信号(来自激发光源)触发恒比鉴别器CFD之后，就会产生一个起始信号，让时幅转换器TAC开始工作。而这时如果荧光团发射一个荧光光子到达探测器，就会触发探测器(一般采用光电倍增管，即PMT)支路的CFD器件，产生一个结束信号，让TAC停止工作。TAC会把开始和结束脉冲之间的这段时间长度(相当于光子在起激发态的驻留时间)转换为幅度信号，经过偏置放大器AMP到达模数转换器ADC，产生一个数字信号，并送入相应的时间通道(加法器将使该通道的计数加1)，通过大量光子数的累积，形成荧光衰减光子数统计分布，TCSPC系统组成示意图如图1所示。

时幅转换器TAC的工作原理严格要每一个激光脉冲只能有一个光子的响应。当一个计数周期内同时有多个光子到达时，TAC也只能记录一个光子，并且只能记录第一个光子到达的时间。这就是单光子计数的缘由。换言之，TCSPC工作时需要很低的激光功率激发样品以保证单光子探测。否则，激发光功率太高，每个周期有多个光子达到探测器，就会发生经典的堆积效应，信号就会失真，使得形成的荧光衰减曲线向较短时间方向偏移，堆积效应对记录波形的影响示意图如图2所示。这意味着TCSPC的光子计数率极低，需要足够长的荧光光子采集时间才能达到测量精度要求，从而导致荧光寿命测量较为耗时。

发明内容

本发明实施例的主要目的在于提供一种荧光寿命偏差的定量化校正方法及装置，至少能够解决相关技术中的TCSPC系统的计数效率较低、荧光寿命测量较为耗时的问题。

为实现上述目的，本发明实施例第一方面提供了一种荧光寿命偏差的定量化校正方法，该方法包括：

借助蒙特卡洛模拟方法模拟在一个激光脉冲周期内发射不同数量光子时，TCSPC系统的探测情况，获取不同发射光子数所对应的荧光衰减光子数分布直方图；

利用最小二乘法对所述荧光衰减光子数分布直方图进行拟合，得到所述TCSPC系统对应于不同发射光子数探测时的荧光寿命；

统计所述TCSPC系统采样过程中，多光子探测的荧光寿命与单光子探测的荧光寿命之间的定量关系；

基于所述定量关系，校正所述TCSPC系统的荧光寿命偏差。

为实现上述目的，本发明实施例第二方面提供了一种荧光寿命偏差的定量化校正装置，该装置包括：

获取模块，用于借助蒙特卡洛模拟方法模拟在一个激光脉冲周期内发射不同数量光子时，TCSPC系统的探测情况，获取不同发射光子数所对应的荧光衰减光子数分布直方图；

拟合模块，用于利用最小二乘法对所述荧光衰减光子数分布直方图进行拟合，得到所述TCSPC系统对应于不同发射光子数探测时的荧光寿命；

统计模块，用于统计所述TCSPC系统采样过程中，多光子探测的荧光寿命与单光子探测的荧光寿命之间的定量关系；

校正模块，用于基于所述定量关系，校正所述TCSPC系统的荧光寿命偏差。

根据本发明实施例提供的荧光寿命偏差的定量化校正方法及装置，借助蒙特卡洛模拟方法模拟在一个激光脉冲周期内发射不同数量光子时，TCSPC系统的探测情况，获取不同发射光子数所对应的荧光衰减光子数分布直方图；利用最小二乘法对荧光衰减光子数分布直方图进行拟合，得到TCSPC系统对应于不同发射光子数探测时的荧光寿命；统计TCSPC系统采样过程中，多光子探测的荧光寿命与单光子探测的荧光寿命之间的定量关系；基于定量关系，校正TCSPC系统的荧光寿命偏差。通过本发明的实施，利用多光子探测的数据来保证TCSPC系统的高计数效率，缩短光子的采集时间，从而提高了TCSPC荧光寿命的成像速度。

本发明其他特征和相应的效果在说明书的后面部分进行阐述说明，且应当理解，至少部分效果从本发明说明书中的记载变的显而易见。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的TCSPC系统组成示意图；

图2为本发明提供的堆积效应对记录波形的影响示意图；

图3为本发明第一实施例提供的定量化校正方法的基本流程示意图；

图4为本发明第一实施例提供的荧光强度衰减曲线和仪器响应曲线的示意图；

图5为本发明第一实施例提供的荧光强度衰减曲线的拟合示意图；

图6为本发明第一实施例提供的荧光寿命设定值为2ns时的模拟寿命示意图；

图7为本发明第一实施例提供的荧光寿命设定值为3ns时的模拟寿命示意图；

图8为本发明第一实施例提供的荧光寿命设定值为4ns时的模拟寿命示意图；

图9为本发明第一实施例提供的荧光寿命设定值为5ns时的模拟寿命示意图；

图10为本发明第二实施例提供的定量化校正装置的程序模块示意图。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

第一实施例：

为了解决相关技术中的TCSPC系统的计数效率较低、荧光寿命测量较为耗时的问题，本实施例提出了一种荧光寿命偏差的定量化校正方法，如图3所示为本实施例提供的定量化校正方法的基本流程示意图，本实施例提出的定量化校正方法包括以下的步骤：

步骤301、借助蒙特卡洛模拟方法模拟在一个激光脉冲周期内发射不同数量光子时，TCSPC系统的探测情况，获取不同发射光子数所对应的荧光衰减光子数分布直方图。

具体的，本实施例借助蒙特卡洛模拟的方法，设定好理想荧光寿命值(TCSPC系统在低计数率条件下单光子探测所测得数据)，模拟在一个激光脉冲周期内发射n(1，2，3…)个光子时，TCSPC系统的探测情况，获得一个脉冲不同多个发射光子数所对应的TCSPC荧光衰减光子数分布直方图。

在本实施例一种可选的实施方式中，上述借助蒙特卡洛模拟方法模拟在一个激光脉冲周期内发射不同数量光子时，TCSPC系统的探测情况，获取不同发射光子数所对应的荧光衰减光子数分布直方图的步骤，包括：预先设定好激光重复频率、仪器响应函数的期望值与均方差、理想荧光寿命值；利用MATLAB生成均匀分布随机数，并通过逆变换方法产生自然指数(e指数)分布随机数以及高斯函数分布随机数，其中，自然指数分布随机数与高斯函数分布随机数之和为探测延迟时间；通过大量重复生成随机数来模拟不同探测延迟时间数据点，将统计得到的探测延迟时间柱状分布图作为荧光衰减光子数分布直方图。

具体的，蒙特卡洛方法是一种随机产生符合目标随机变量概率分布特征的随机数值序列，作为输入变量进行特定的模拟试验的方法。主要步骤有两点：第一，建立一个概率模型；第二，根据该模型进行大量抽样。蒙特卡洛方法的基础是概率统计理论，它利用计算机的模拟计算能力，通过在计算机上进行统计抽样实验，为各种各样的物理问题和数学问题提供近似的解。通俗来讲，这是一种暴力算法，通过大量抽样，得到近似解。下面再介绍如何建立TCSPC系统的蒙特卡洛模拟的概率模型。

建立一个产生随机数序列的模型，是进行蒙特卡洛模拟的先决条件。随机数产生的规律要符合荧光衰减的规律。实际荧光寿命检测的荧光强度曲线是一个高斯函数(系统的仪器响应函数，即

)与理想的荧光强度曲线(e指数衰减函数，即I(t)＝I₀exp(-t/τ)，其中τ为荧光寿命)的卷积，即

那么想要生成实际荧光寿命检测的荧光强度曲线，就要先生成高斯函数以及e指数衰减函数。由于计算机只能生成均匀分布随机数，大多数概率分布的随机数都是由均匀分布U(0,1)的随机数转化而来。一般可以有三种转换方法，分别为逆变换法、合成法以及筛选法。

本实施例下面以逆变换法为例子进行举例说明：

首先，e指数衰减函数的生成：

假设在一个a到c的区间里，有一个随机变量x，它的概率密度函数为L(x)，也就是目标函数分布，则有公式：

区间(0,1)内有一个均匀分布的随机变量z，变量z与变量x存在一一对应的关系，即x＝g(z)。通过推导可以知道，必然存在z₁∈(0,1)，在x＝g(z)为减函数的情况下使得下式成立：

在x＝g(z)为增函数的情况下，则是使得下式成立：

在TCSPC系统中，荧光发射是自发辐射，而自发辐射系数A₂₁(表示每一个处于激发态的粒子在单位时间内发生自发跃迁的几率)，n₂(t₁)表示某时刻激发态剩余的粒子数。在[t₁,t₁+dt₁]区间内，有以下关系：

而时间大于等于t₁时刻，发生自发跃迁的概率等于t₁时刻剩余粒子数n₂(t₁)与初始粒子数n₀的比值。所以公式(4)也可以表示为：

对公式(5)进行分部积分并整理，且因为P{t≥0}＝1，所以公式(5)可以化简为：

其中P{t≥t₁}表示时间大于等于t₁时，发生自发跃迁的概率。

由公式(6)，则可以得出：

那么荧光寿命的概率密度函数为：

f(t)＝dP{t<t₁}/dt₁＝A₂₁exp(-A₂₁t) (8)

从公式(7)可以看出该分布函数与均匀分布的关系式是增函数关系。所以，这里结合公式(3)可以得出：

由等式(9)可以推导出：

t₁＝-ln(1-z₁)/A₂₁ (10)

而根据定义，自发辐射系数是荧光寿命的倒数，即：

A₂₁＝1/τ (11)

所以等式(10)可以变换为：

t₁＝-ln(1-z₁)·τ (12)

上式中的z₁是在区间[0,1]均匀分布的随机变量，通过公式(12)，可以得到一个e指数函数分布。

其次，仪器响应时间分布函数(高斯函数)的生成：

现设定两个高斯分布的概率密度函数：

然后将上述公式化为极坐标形式，即x＝rcosθ，y＝rsinθ，可以得到：

对公式(15)分别积分，求其概率分布，有：

根据逆变换的原理，可以得到：

经过变换，最终可以得到：

θ＝2πU₂ (21)

U₁、U₂是在区间[0,1]均匀分布的变量，然后将这些变量化为直角坐标的形式，即可以得到公式(22)公式(23)。

其中z₀、z₁是两个独立的高斯分布。

步骤302、利用最小二乘法对荧光衰减光子数分布直方图进行拟合，得到TCSPC系统对应于不同发射光子数探测时的荧光寿命。

具体的，在本实施例中，利用最小二乘法，对不同激发条件下的TCSPC荧光衰减光子数分布直方图进行拟合，得到TCSPC系统对应于n个光子探测时的荧光寿命τ_n。

在本实施例一种可选的实施方式中，上述利用最小二乘法对荧光衰减光子数分布直方图进行拟合的步骤，包括：预先设定一条荧光衰减理论曲线；荧光衰减理论曲线表示为：

求解关联于荧光衰减理论曲线的最优化模型的最优解；最优化模型表示为：min||y-f(x)||²；

其中，[x,y]表示荧光衰减光子数分布数据，a表示荧光衰减的初始幅值，b表示高斯函数的期望值，c表示高斯函数的均方差，e表示自然指数，d表示TCSPC系统对应于不同发射光子数探测时的荧光寿命，g表示背景基线偏差。

具体的，非线性最小二乘法曲线拟合是用来估计非线性静态模型参数的一种估计方法。对于平面上给定的点(x_i,y_i)(i＝0,1,2,…,n，设n比较大)，要寻找y与x之间的近似函数关系，即y＝f(x；θ)，其中θ是该函数的参数。在估计参数的时候，模型的函数形式f是已知的，通过平面上给定的点，不停地进行迭代运算。参数估计的准则就是误差平方和达到极小值。只要估计出来的近似函数上的点与目标函数点的误差平方和足够小或者满足使用者的误差要求，曲线拟合就是成功的。

从非线性最小二乘法的基本原理可以得出，对平面上的一些点进行曲线拟合，需要设定一个曲线模型，也就是经验曲线y^*(x)＝f(x；θ)，使得

则称y＝y^*(x)为平面上的点的最小二乘拟合曲线。

而针对TCSPC系统蒙特卡洛模拟结果的散点图，它的经验曲线就是一个仪器响应函数(高斯函数)卷积上一个e指数衰减函数，如公式(25)所示，其中参数b是高斯函数的平均值也就是期望值，参数c则是高斯函数的均方差，参数d是e指数衰减函数的寿命τ，也是本实施例最终以期得到的参数。

而对经验函数进行迭代运算，在Matlab中可以使用lsqcurvefit函数来达到效果。本实施例采用后者，其调用格式为：[a,resnorm]＝lsqcurvefit[f(x),a0,XDATA,YDATA,EB]。其中f(x)是已知的函数类型，a0是估计参数的初始值，XDATA和YDATA是实验数据，EB是误差平方和的期望值。输出a是拟合出来的参数集。

步骤303、统计TCSPC系统采样过程中，多光子探测的荧光寿命与单光子探测的荧光寿命之间的定量关系。

具体的，在本实施例中，通过观察法对蒙特卡洛模拟所获得的数据进行归纳，提出TCSPC系统在多光子探测下(荧光寿命τ_n)和在单光子探测下(荧光寿命τ)分别测量得到的荧光寿命值之间存在定量数学关系：τ_n＝τ/n，并用概率论统计分析证明了该数学关系。

下面再具体介绍本实施例其中一种借助探究TCSPC多光子发射荧光寿命与单光子发射荧光寿命关系的方法：

步骤一、利用蒙特卡洛模拟来模拟TCSPC系统的工作过程，借助MATLAB软件，利用rand函数生成在(0,1)区间内均匀分布函数，且设定好高斯函数中的期望值以及均方差值(具体数值可参考实际TCSPC系统仪器响应情况，这里期望值设定为1.2ns，均方误差值设定为0.15ns)。

步骤二、设定抽样个数(这里设定为10⁶)、激光器的重复频率(设定为80MHz)。

步骤三、通过步骤一、二设定的参数和公式(12)、(22)、(23)可以得到仪器响应时间和单光子探测情况下(即没有光子堆积效应时)的荧光光子到达时间。然后不断进行抽样，最终得到10⁶个仪器响应时间点以及10⁶个单光子探测情况下的荧光光子到达时间。这两者相加就是探测器检测到光子的时间。最终可以生成10⁶个数据点(数据点个数是程序设定值，可以修改，数据点越多，结果越精确，误差越小)。每一个数据点就代表光子到达探测器(相对于激发脉冲时间)的时间。

如果是对存在光子堆积效应的情形进行模拟，即这里称为“多光子发射”的情况。假设平均一个计数周期发射n个光子，则需要抽样n×10⁶个数据点，并且取每一组(n个)数据点中的最小值作为所探测到的第一个光子的到达时间，组成10⁶个新的数据点。

步骤四、记录相同时间点的频次。将一个计数周期分为1024个通道，通过直方图的大量累积并加入背景噪声，得到荧光强度散点散点图。而这个记录和累积的过程，可以通过MATLAB中的hist函数实现。

如图4为本实施例提供的荧光强度衰减曲线和仪器响应曲线的示意图，其中，黑色线条表示荧光强度衰减曲线，灰色线条表示仪器响应曲线。

步骤五、利用公式(25)的经验函数，在MATLAB软件使用lsqcurvefit函数进行迭代运算，即对步骤四所得到的荧光强度散点图进行非线性最小二乘法曲线拟合，直到最优解。最终可以得到荧光强度衰减曲线的拟合结果，其中的荧光强度衰减曲线的拟合示意图如图5所示，图中星状黑点是离散点，灰色线条是拟合曲线。

步骤六、通过对步骤四的结果进行线性拟合以及数据分析。

通过步骤五，对一个计数周期内发射光子数为1-4个的荧光强度衰减散点图进行非线性最小二乘法拟合。可以得到如表1至表4所示的数据。通用参数设置为：激光频率80MHz，响应函数的期望值为1.2ns，响应函数的均方误差值为0.15ns，设定发射光子数为1-4个(对应表1至表4)，荧光寿命(设定值)为2-5ns。每组各进行3次蒙特卡洛模拟和曲线拟合，拟合到的寿命取平均值。

表1一个计数周期有1个光子发射的拟合数据

表2一个计数周期有2个光子发射的拟合数据

表3一个计数周期有3个光子发射的拟合数据

表4一个计数周期有4个光子发射的拟合数据

对比表1至表4可以看出，保持荧光寿命设定值不改变，随着一个计数周期内发射光子数的增加，蒙特卡洛模拟的荧光寿命呈现衰减的现象。为了更容易看出发射光子数与蒙特卡洛模拟的TCSPC探测得到的荧光寿命之间的关系，我们以发射光子数为x轴，模拟寿命为y轴做一个曲线图，分别如图6至图9(对应不同的寿命设定值，其中荧光寿命设定值为3ns、4ns和5ns时除了表1至表4中展示的数据外，还额外多计算了多组不同的发射光子数)所示。

通过图6至图9，可以更加清楚地看出随着发射光子数的增多，蒙特卡洛模拟的寿命逐渐递减。这完全符合TCSPC系统的特性。本实施例对这四个图上的数据分别用y＝A/x进行趋势线拟合，结果发现相关系数都是无限接近R²＝1，且参数A这表明了TCSPC探测得到的寿命随计数周期光子数的这种衰减几乎是严格呈反比关系的。因此可以得知发射光子数和荧光寿命之间的关系为：

τ_n＝τ/n (27)

其中τ是对应荧光团的实际荧光寿命，τ_n指的是一个计数周期发射n个光子时TCSPC系统测得的荧光寿命，n是发射光子的个数。

步骤304、基于定量关系，校正TCSPC系统的荧光寿命偏差。

具体的，本实施例借助上述探究TCSPC多光子探测荧光寿命τ_n与单光子探测荧光寿命τ关系的方法，得到一个TCSPC采样时多光子探测的荧光寿命定量校正方法，适用于高密度标记、高功率激发的快速荧光寿命成像。

在本实施例一种可选的实施方式中，上述基于定量关系，校正TCSPC系统的荧光寿命偏差的步骤，包括：构建一个计数周期内的发射光子数与辐射照度的关联关系；基于关联关系以及一个计数周期内的辐射照度，校正TCSPC系统在高计数率下工作的荧光寿命偏差。

进一步地，在本实施例一种可选的实施方式中，上述构建一个计数周期内的发射光子数与辐射照度的关联关系的步骤，包括：基于辐射照度的计算公式E_e＝dφ_e/dA、辐射功率的计算公式φ_e＝dQ_e/dt、光子能量的计算公式Q_e＝nhν，构建一个计数周期内的发射光子数与辐射照度的关联关系；关联关系表示为：n＝E_edAdt/hν；其中，dΦ_e表示照射在面元上的辐射通量，dA表示探测器面元的面积，Φ_e表示辐射功率，Q_e表示某段时间的光子能量，E_e表示辐射照度，dt表示一个计数周期，h表示普朗克常数，ν表示荧光光子的频率。

本实施例下面对定量校正一个TCSPC采样时多光子探测的荧光寿命的具体实现过程进行说明：

已知辐射照度公式：

E_e＝dφ_e/dA (28)

其中，dΦ_e指的是照射在面元上的辐射通量，dA是该面元的面积。辐射通量Φ_e称为辐射功率，定义为单位时间流过的辐射能量，即：

φ_e＝dQ_e/dt (29)

其中，Q_e为某段时间的光子能量。代入光子能量Q_e＝nhν，可以得出：

n＝E_edAdt/hν (30)

其中，本实施例可以通过照度计测得辐射照度E_e；面元的面积dA是探测器的探测面积；时间dt则是一个计数周期T。h为普朗克常数，ν为荧光光子的频率。因此，当TCSPC系统的探测器面积和计数周期都确定下来，则辐射照度E_e和光子数n之间就是线性关系，即：

n＝CE_e (31)

其中C＝dAdt/hν。

将公式(31)代入公式(27)，可以得到：

τ_n＝τ/CE_e (32)

其中τ_n为一个计数周期发射n个光子时TCSPC系统测得的荧光寿命，τ为我们想要的实际荧光寿命，即修正后的荧光寿命值。

凭借公式(32)，只要利用照度计测得一个计数周期内的辐射照度，再结合在这个辐射照度强度下，TCSPC系统测得的荧光寿命，即可以求出实际的荧光寿命，继而校正发生偏离的荧光强度曲线，以达到减少光子采集时间的目的。

应当说明的是，为了减小测量误差，还有几点需要注意：第一，照度计的时间灵敏度要足够高，能够对一个计数周期这个时间段内发生的光子数变化做出响应；第二，要把激发光强度调得足够大，因为每个计数周期发生光子数都不是一个定值，但只要激发光强度足够大，使得一个计数周期发生足够多的光子，那么就可以把一个计数周期发射的光子数n近似看做一个定值。

本实施例下面从统计学的角度来验证本发明所提供的方法的可行性：

设定单光子探测事件为T，发射n个光子事件就相当于进行n次单光子探测事件，分别是T₁,T₂,T₃,…,T_n。因为在TCSPC系统的采集过程中，PMT探测器只能响应每个计数周期第一个到达探测器的光子。所以多光子事件M的概率分布就相当于F(M)＝F[min(T₁,T₂,T₃,…,T_n)]，其中M＝min(T₁,T₂,T₃,…,T_n)，n为发射光子的个数。则：

P{M≥t₁}＝P{min(T₁,T₂,…T_n)≥t₁}

＝P{T₁≥t₁,T₂≥t₁,…,T_n≥t₁} (33)

因为每个单光子探测事件都是独立不相关的，所以上式可以写为：

P{M≥t₁}＝P{T₁≥t₁}×P{T₂≥t₁}×…×P{T_n≥t₁} (34)

由前面的结论有：

P{T≥t₁}＝exp(-t₁/τ) (35)

结合公式(34)和公式(35)，可以得到：

P{M≥t₁}＝[exp(-t₁/τ)]ⁿ (36)

类似公式(4)和公式(5)的关系，公式(36)可以写为：

n₂(t)＝n₀exp(-nt/τ) (37)

所以

I(t)＝I₀exp(-nt/τ) (38)

得证公式(27)成立。

根据本发明实施例提供的荧光寿命偏差的定量化校正方法，借助蒙特卡洛模拟方法模拟在一个激光脉冲周期内发射不同数量光子时，TCSPC系统的探测情况，获取不同发射光子数所对应的荧光衰减光子数分布直方图；利用最小二乘法对荧光衰减光子数分布直方图进行拟合，得到TCSPC系统对应于不同发射光子数探测时的荧光寿命；统计TCSPC系统采样过程中，多光子探测的荧光寿命与单光子探测的荧光寿命之间的定量关系；基于定量关系，校正TCSPC系统的荧光寿命偏差。通过本发明的实施，利用多光子探测的数据来保证TCSPC系统的高计数效率，缩短光子的采集时间，从而提高了TCSPC荧光寿命的成像速度。

第二实施例：

为了解决相关技术中的TCSPC系统的计数效率较低、荧光寿命测量较为耗时的问题，本实施例示出了一种荧光寿命偏差的定量化校正装置，具体请参见图10，本实施例的定量化校正装置包括：

获取模块1001，用于借助蒙特卡洛模拟方法模拟在一个激光脉冲周期内发射不同数量光子时，TCSPC系统的探测情况，获取不同发射光子数所对应的荧光衰减光子数分布直方图；

拟合模块1002，用于利用最小二乘法对荧光衰减光子数分布直方图进行拟合，得到TCSPC系统对应于不同发射光子数探测时的荧光寿命；

统计模块1003，用于统计TCSPC系统采样过程中，多光子探测的荧光寿命与单光子探测的荧光寿命之间的定量关系；

校正模块1004，用于基于定量关系，校正TCSPC系统的荧光寿命偏差。

在本实施例一种可选的实施方式中，获取模块具体用于：预先设定好激光重复频率、仪器响应函数的期望值与均方差、理想荧光寿命值；利用MATLAB生成均匀分布随机数，并通过逆变换方法产生自然指数分布随机数以及高斯函数分布随机数；其中，自然指数分布随机数与高斯函数分布随机数之和为探测延迟时间；通过重复生成随机数来模拟不同探测延迟时间数据点，将统计得到的探测延迟时间柱状分布图作为荧光衰减光子数分布直方图。

在本实施例一种可选的实施方式中，拟合模块具体用于：预先设定一条荧光衰减理论曲线；荧光衰减理论曲线表示为：

求解关联于荧光衰减理论曲线的最优化模型的最优解；最优化模型表示为：min||y-f(x)||²；其中，[x,y]表示荧光衰减光子数分布数据，a表示荧光衰减的初始幅值，b表示高斯函数的期望值，c表示高斯函数的均方差，e表示自然指数，d表示TCSPC系统对应于不同发射光子数探测时的荧光寿命，g表示背景基线偏差。

在本实施例一种可选的实施方式中，校正模块具体用于：构建一个计数周期内的发射光子数与辐射照度的关联关系；基于关联关系以及一个计数周期内的辐射照度，校正TCSPC系统在高计数率下工作的荧光寿命偏差。

进一步地，在本实施例一种可选的实施方式中，校正模块在执行构建一个计数周期内的发射光子数与辐射照度的关联关系的功能时，具体用于：基于辐射照度的计算公式E_e＝dφ_e/dA、辐射功率的计算公式φ_e＝dQ_e/dt、光子能量的计算公式Q_e＝nhν，构建一个计数周期内的发射光子数与辐射照度的关联关系；关联关系表示为：n＝E_edAdt/hν；其中，dΦ_e表示照射在面元上的辐射通量，dA表示探测器面元的面积，Φ_e表示辐射功率，Q_e表示某段时间的光子能量，E_e表示辐射照度，dt表示一个计数周期，h表示普朗克常数，ν表示荧光光子的频率。

应当说明的是，前述实施例中的定量化校正方法，均可基于本实施例提供的定量化校正装置实现，所属领域的普通技术人员可以清楚的了解到，为描述的方便和简洁，本实施例中所描述的定量化校正装置的具体工作过程，可以参考前述方法实施例中的对应过程，在此不再赘述。

采用本实施例提供的荧光寿命偏差的定量化校正装置，借助蒙特卡洛模拟方法模拟在一个激光脉冲周期内发射不同数量光子时，TCSPC系统的探测情况，获取不同发射光子数所对应的荧光衰减光子数分布直方图；利用最小二乘法对荧光衰减光子数分布直方图进行拟合，得到TCSPC系统对应于不同发射光子数探测时的荧光寿命；统计TCSPC系统采样过程中，多光子探测的荧光寿命与单光子探测的荧光寿命之间的定量关系；基于定量关系，校正TCSPC系统的荧光寿命偏差。通过本发明的实施，利用多光子探测的数据来保证TCSPC系统的高计数效率，缩短光子的采集时间，从而提高了TCSPC荧光寿命的成像速度。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明实施例所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种荧光寿命偏差的定量化校正方法，其特征在于，包括：

预先设定好时间相关单光子计数系统的激光重复频率、仪器响应函数的期望值与均方差、理想荧光寿命值；

利用MATLAB生成均匀分布随机数，并通过逆变换方法产生自然指数分布随机数以及高斯函数分布随机数；其中，所述自然指数分布随机数与所述高斯函数分布随机数之和为探测延迟时间；

通过重复生成随机数来模拟不同探测延迟时间数据点，将统计得到的探测延迟时间柱状分布图作为荧光衰减光子数分布直方图；

利用最小二乘法对所述荧光衰减光子数分布直方图进行拟合，得到所述时间相关单光子计数系统对应于不同发射光子数探测时的荧光寿命；

统计所述时间相关单光子计数系统采样过程中，多光子探测的荧光寿命与单光子探测的荧光寿命之间的定量关系；

基于所述定量关系，校正所述时间相关单光子计数系统的荧光寿命偏差。

2.如权利要求1所述的定量化校正方法，其特征在于，所述利用最小二乘法对所述荧光衰减光子数分布直方图进行拟合的步骤，包括：

预先设定一条荧光衰减理论曲线；所述荧光衰减理论曲线表示为：

求解关联于所述荧光衰减理论曲线的最优化模型的最优解；所述最优化模型表示为：min||y-f(x)||²；

其中，[x,y]表示荧光衰减光子数分布数据，a表示荧光衰减的初始幅值，b表示高斯函数的期望值，c表示高斯函数的均方差，e表示自然指数，d表示所述时间相关单光子计数系统对应于不同发射光子数探测时的荧光寿命，g表示背景基线偏差。

3.如权利要求1所述的定量化校正方法，其特征在于，所述基于所述定量关系，校正所述时间相关单光子计数系统的荧光寿命偏差的步骤，包括：

构建一个计数周期内的发射光子数与辐射照度的关联关系；

基于所述关联关系以及一个计数周期内的辐射照度，校正所述时间相关单光子计数系统在高计数率下工作的荧光寿命偏差。

4.如权利要求3所述的定量化校正方法，其特征在于，所述构建一个计数周期内的发射光子数与辐射照度的关联关系的步骤，包括：

基于辐射照度的计算公式E_e＝dφ_e/dA、辐射功率的计算公式φ_e＝dQ_e/dt、光子能量的计算公式Q_e＝nhν，构建一个计数周期内的发射光子数与辐射照度的关联关系；所述关联关系表示为：n＝E_edAdt/hν；

其中，dΦ_e表示照射在面元上的辐射通量，dA表示探测器面元的面积，Φ_e表示辐射功率，Q_e表示某段时间的光子能量，E_e表示辐射照度，dt表示一个计数周期，h表示普朗克常数，ν表示荧光光子的频率。

5.一种荧光寿命偏差的定量化校正装置，其特征在于，包括：

获取模块，用于预先设定好时间相关单光子计数系统的激光重复频率、仪器响应函数的期望值与均方差、理想荧光寿命值；利用MATLAB生成均匀分布随机数，并通过逆变换方法产生自然指数分布随机数以及高斯函数分布随机数；通过重复生成随机数来模拟不同探测延迟时间数据点，将统计得到的探测延迟时间柱状分布图作为荧光衰减光子数分布直方图；其中，所述自然指数分布随机数与所述高斯函数分布随机数之和为探测延迟时间；

拟合模块，用于利用最小二乘法对所述荧光衰减光子数分布直方图进行拟合，得到所述时间相关单光子计数系统对应于不同发射光子数探测时的荧光寿命；

统计模块，用于统计所述时间相关单光子计数系统采样过程中，多光子探测的荧光寿命与单光子探测的荧光寿命之间的定量关系；

校正模块，用于基于所述定量关系，校正所述时间相关单光子计数系统的荧光寿命偏差。

6.如权利要求5所述的定量化校正装置，其特征在于，所述拟合模块具体用于：

预先设定一条荧光衰减理论曲线；所述荧光衰减理论曲线表示为：

求解关联于所述荧光衰减理论曲线的最优化模型的最优解；所述最优化模型表示为：min||y-f(x)||²；

其中，[x,y]表示荧光衰减光子数分布数据，a表示荧光衰减的初始幅值，b表示高斯函数的期望值，c表示高斯函数的均方差，e表示自然指数，d表示所述时间相关单光子计数系统对应于不同发射光子数探测时的荧光寿命，g表示背景基线偏差。

7.如权利要求5所述的定量化校正装置，其特征在于，所述校正模块具体用于：

构建一个计数周期内的发射光子数与辐射照度的关联关系；

基于所述关联关系以及一个计数周期内的辐射照度，校正所述时间相关单光子计数系统在高计数率下工作的荧光寿命偏差。

8.如权利要求7所述的定量化校正装置，其特征在于，所述校正模块在执行所述构建一个计数周期内的发射光子数与辐射照度的关联关系的功能时，具体用于：

基于辐射照度的计算公式E_e＝dφ_e/dA、辐射功率的计算公式φ_e＝dQ_e/dt、光子能量的计算公式Q_e＝nhν，构建一个计数周期内的发射光子数与辐射照度的关联关系；所述关联关系表示为：n＝E_edAdt/hν；

其中，dΦ_e表示照射在面元上的辐射通量，dA表示探测器面元的面积，Φ_e表示辐射功率，Q_e表示某段时间的光子能量，E_e表示辐射照度，dt表示一个计数周期，h表示普朗克常数，ν表示荧光光子的频率。

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