CN113201529A - 核酸提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种核酸提取方法，包括：S101、将样本与裂解液混合，使样本充分裂解；S103、在S101得到的溶液中加入磁珠，使得磁珠与样本裂解出来的核酸结合；S105、磁棒移动至磁棒套内后，整体向下移动，进入溶液中吸附磁珠；吸附完成后，磁棒和磁棒套保持相对位置不动，上下振荡若干次；S107、将磁珠转移至清洗液中，磁棒套上下振荡使得磁珠均匀分散于清洗液，洗去附着在磁珠表面的、除核酸以外的物质；S109、利用磁棒将清洗完成的磁珠吸附于磁棒套外表面，并对磁珠和磁棒套进行干燥处理；S111、将干燥后的磁珠转移至洗脱液中进行洗脱，附着在磁珠上的核酸脱离磁珠进入洗脱液中，利用磁棒和磁棒套将溶液中的磁珠吸附回收，即得核酸溶液。本发明能够减小核酸提取量的损失。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取领域，更具体的说，它涉及一种核酸提取方法。
背景技术
目前，核酸(例如DNA或者RNA)的提取主要采用离心柱法和磁珠法两种提取方法。磁珠法核酸提取是以纳米生物磁珠为载体的一种新型核酸提取技术，运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用二氧化硅包被的纳米磁性微球的超顺磁性，在Chaotropic盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA。目前，对于DNA的提取，磁珠法核酸提取一般可以分为四步：裂解、结合、洗涤、洗脱。
磁珠法核酸提取仪器可分为：移液式和磁棒式。磁棒式核酸提取仪器采用磁棒法的磁性分离方式，通过特制的磁棒套进行转移磁珠同时转移样本，磁珠定向团聚在磁棒表面的专门的磁棒套上，通过精确的运动来实现磁珠从样本裂解液到洗涤液再到洗脱液，从而完成核酸测自动化提取过程。具体操过程如下：
加样本：加入液体样本到裂解液孔中；
裂解/结合：裂解液裂解样本(反应一段时间，期间底部加热加速裂解)，期间磁棒套(只有磁棒套、无磁棒)插入到液面下进行上下振荡混匀，使核酸悬浮在裂解液中；裂解完成后，加入磁珠，磁棒套上下振荡使得磁珠均匀分散到裂解液中吸附核酸，磁棒插入磁棒套内静置至磁珠都吸附在磁棒套上；
洗涤：将磁珠转移到洗涤液中，磁棒套上下振荡混匀使得磁珠均匀分散到洗涤液中，静置一段时间后，磁棒插入磁棒套静置至磁珠都吸附在磁棒套上；
洗脱：将洗涤后的磁珠取出，磁棒取出，磁棒套上下振荡混匀使得磁珠均匀分散到洗脱液中，一般加热至65℃/5min静置、加热使核酸与磁珠脱离，在较高的温度下、磁棒插入磁棒套静置至磁珠都吸附在磁棒套上，回收磁珠，如此，核酸提取仪的工作完成。
上述方法存在的问题是：在磁珠与核酸结合后，磁棒吸附磁珠过程中，由于相邻磁棒之间的磁场差异，以及磁棒和磁棒套在深孔板(容器)内的位置问题，会有部分磁珠被相邻孔内的磁棒引导，附着在深孔板(容器)内壁，导致核酸提取量损失较大。
发明内容
本发明的目的是针对上述存在的问题，提供一种能够减小核酸提取量损失的核酸提取方法。
为了达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
一种核酸提取方法，包括：
S101、将样本与裂解液混合，使样本充分裂解；
S103、在步骤S101得到的溶液中加入磁珠，使得磁珠与样本裂解出来的核酸结合；
S105、磁棒移动至磁棒套内后，整体向下移动，进入溶液中吸附磁珠；吸附完成后，磁棒和磁棒套保持相对位置不动，上下振荡若干次；
S107、将磁珠转移至清洗液中，磁棒套上下振荡使得磁珠均匀分散于清洗液，洗去附着在磁珠表面的、除核酸以外的物质；
S109、利用磁棒将清洗完成的磁珠吸附于磁棒套外表面，并对磁珠和磁棒套进行干燥处理；
S111、将干燥后的磁珠转移至洗脱液中进行洗脱，使得附着在磁珠上的核酸脱离磁珠进入洗脱液中，利用磁棒和磁棒套将溶液中的磁珠吸附回收，即得核酸溶液。
在磁珠与核酸结合后，磁棒吸附磁珠过程中，由于相邻磁棒之间的磁场差异，以及磁棒和磁棒套在深孔板(容器)内的位置问题，会有部分磁珠被相邻孔内的磁棒引导，附着在深孔板(容器)内壁，导致核酸提取量损失；通过磁棒与磁棒套同时上下振荡，附着在深孔板(容器)内壁的磁珠会由于溶液的急剧变化产生流动，磁棒套下降过程中将溶液向外排开，此时磁珠会随溶液向上移动，当磁棒套向上移动时磁珠会随溶液向中心流去。如此往复几次，磁珠会脱离深孔板(容器)内壁，逐步被当前孔位的磁棒所吸附在磁棒套底部，从而减小核酸提取量的损失。
优选的，将磁珠转移至清洗液中，磁棒套上下振荡使得磁珠均匀分散于清洗液，具体为：
将磁棒套、位于磁棒套内的磁棒、吸附于磁棒套外表面的磁珠停留在清洗液的中上层，保持磁棒套不动，将磁棒从磁棒套内撤去；在磁珠沉底之前，磁棒套上下振荡使得磁珠均匀分散于清洗液。磁棒套在磁珠沉底之前进行上下振荡，能够更好的让磁珠表面物质充分与清洗液接触，洗去附着在磁珠表面的蛋白与其它物质，只保留核酸与磁珠的结合。
优选的，利用磁棒将清洗完成的磁珠吸附于磁棒套外表面，并对磁珠和磁棒套进行干燥处理，具体为：
利用磁棒将清洗完成的磁珠吸附于磁棒套外表面后，磁棒和磁棒套同步上移至核酸提取仪工作腔中部进行上下振荡，同时工作腔一侧进风，另一侧排风，形成空气流动，从而形成多方位的干燥，防止清洗液对后续的操作产生影响。
优选的，所述步骤S101、S103在核酸提取仪的裂解区域完成，所述裂解区域由多个裂解工位组成，每个裂解工位均具有用于盛装裂解液的容器；所述步骤S111在核酸提取仪的洗脱区域完成，所述洗脱区域由多个洗脱工位组成，每个洗脱工位均具有用于盛装洗脱液的容器；所述裂解工位与洗脱工位一一对应。所述容器可以采用96孔深孔板或者384孔深孔板，例如采用96孔深孔板时，按照6*8个孔位一组，分为两组，第一组孔位中的洗脱孔位与第二组孔位中的裂解孔位间隔至少一个孔位布置，避免第一组孔位中洗脱孔位加热与第二组孔位中裂解孔位加热的相互干扰。
优选的，所述裂解区域和/或洗脱区域设置有正对容器内溶液的红外测温模块；采用红外测温模块直接对溶液进行测温，所测温度即溶液温度。
优选的，所述裂解区域和/或洗脱区域底部设有加热模块，用于加速裂解和/或加速洗脱。
优选的，所述加热模块包括：
下导热块，通过螺钉安装于核酸提取仪的底板上；
上导热块，通过螺钉安装于下导热块上，用于给容器内的溶液加热；
加热膜，位于下导热块和核酸提取仪的底板之间，用于产生热量并经下导热块传导至上导热块。
由于上导热块与下导热块之间可拆卸连接，能够适用不同规格、型号的深孔板(常见深孔板底部形状主要有U型和V型两种)。
优选的，所述加热模块还包括安装于核酸提取仪的底板上、且位于下导热块上方的隔温块，该隔温块上开设有与上导热块相匹配的通孔，所述上导热块位于该通孔内。利用隔温块能够有效减少上导热块的热量从侧面散发，另一方面能够避免操作人员操作中不小心碰到上导热块出现烫伤。
优选的，所述加热模块还包括位于加热膜与核酸提取仪底板之间的压板，用于保证加热膜的平整。
优选的，所述加热模块还包括位于加热膜与压板之间的保温硅胶垫，能够有效减少热量从底面散发。
优选的，所述核酸提取仪的底板上设置有连接块，该连接块经橡胶柱与核酸提取仪的外壳连接；利用橡胶柱实现核酸提取仪的底板与外壳的软性连接，使得核酸提取过程中还会存在一定的左右前后晃动，使得振动、磁吸、洗脱等过程的效果更好。
优选的，所述外壳上设置有限位块，该限位块一端固定于外壳上，另一端折弯后伸至核酸提取仪的底板的上方(使得限位块整体呈L形)，并在其与核酸提取仪的底板之间形成间隙，在出现核酸提取仪倒置状态时，利用限位块对核酸提取仪的底板的限位作用，保证核酸提取仪的底板的稳定性。
优选的，所述步骤S107和S109之间还包括：
S108、执行步骤S105、S107若干次，能够有效保证洗去附着在磁珠表面的、除核酸以外的物质。
优选的，所述步骤S103还包括，磁棒套在溶液中上层进行上下振荡，将磁珠和溶液进行充分混合，使得磁珠均匀分散到裂解液中吸附核酸，能够加快磁珠与核酸的结合。
本发明的有益效果在于：
1、在磁棒完成磁珠吸附后，磁棒与磁棒套同时上下振荡，附着在深孔板(容器)内壁的磁珠会由于溶液的急剧变化产生流动，磁棒套下降过程中将溶液向外排开，此时磁珠会随溶液向上移动，当磁棒套向上移动时磁珠会随溶液向中心流去。如此往复几次，磁珠会脱离深孔板(容器)内壁，逐步被当前孔位的磁棒所吸附在磁棒套底部，从而减小核酸提取量的损失。
2、磁棒套在磁珠沉底之前进行上下振荡，能够更好的让磁珠表面物质充分与清洗液接触，洗去附着在磁珠表面的蛋白与其它物质，只保留核酸与磁珠的结合。
3、采用红外测温模块直接对溶液进行测温，温控更精准。
4、上导热块与下导热块之间可拆卸连接，能够适用不同规格、型号的深孔板，产品适应性更好。
5、利用磁棒将清洗完成的磁珠吸附于磁棒套外表面后，磁棒和磁棒套同步上移至核酸提取仪工作腔中部进行上下振荡，同时工作腔一侧进风，另一侧排风，形成空气流动，形成多方位的干燥，防止清洗液对后续的操作产生影响。
附图说明
图1为本发明核酸提取流程示意图。
图2为本发明核酸提取仪的结构示意图。
图3为本发明核酸提取仪工作腔内部结构示意图。
图4为本发明深孔板安装于核酸提取仪工作腔后的结构示意图。
图5为图4深孔板的结构放大图。
图6为本发明加热模块的结构示意图。
图7为本发明核酸提取仪内部结构示意图。
图8为图7的俯视图。
图9为本发明核酸提取仪内部结构立体图。
具体实施方式
为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明方法可以适用的样本包括来源于动物、植物、食品、病原微生物等样本，例如包括来源于人或动物的唾液、血及其成分、汗液、分泌物、组织、器官、组织和器官的培养物，细胞培养物和介质。
如图1所示，本实施例一种核酸提取方法，包括：
S101、将样本与裂解液混合，使样本充分裂解。该步骤在图1中的孔位1完成。
具体的，为了保证样本的充分裂解，在样本与裂解液混合后，将磁棒套移动至液体内进行上下振动一定时间。
S103、在步骤S101得到的溶液中加入磁珠，使得磁珠与样本裂解出来的核酸结合。该步骤在图1中的孔位1完成。
具体的，磁棒移动至磁棒套内，并与磁棒套一起进入用于存放磁珠的孔位，将磁珠吸附并转移到步骤S101得到的溶液中，磁棒套底部停留在液位中上层，随即撤去磁棒；磁棒套在液位中上层进行上下振动，将磁珠和溶液进行充分混合，并使磁珠表面特异性物质和裂解出来的核酸结合。
S105、磁棒移动至磁棒套内后，整体向下移动，进入溶液中吸附磁珠；吸附完成后，磁棒和磁棒套保持相对位置不动，上下振荡若干次。该步骤在图1中的孔位1完成。
具体的，在磁棒套不离开深孔板(用于存储溶液的容器)的情况下，磁棒向下移动至磁棒套内；随即磁棒和磁棒套同步(两者不会发生相对位移)进行分段向下移动至溶液中，使结合核酸后的磁珠被吸附在磁棒套底部。由于相邻磁棒之间的磁场差异，以及磁棒和磁棒套在深孔板(容器)内的位置问题，会有部分磁珠被相邻孔内的磁棒引导，附着在深孔板(容器)内壁，导致核酸提取量损失；通过磁棒与磁棒套同步上下振荡(两者保持相对位置不动)若干次，附着在深孔板(容器)内壁的磁珠会由于溶液的急剧变化产生流动，磁棒套下降过程中将溶液向外排开，此时磁珠会随溶液向上移动，当磁棒套向上移动时磁珠会随溶液向中心流去。如此往复几次，磁珠会脱离深孔板(容器)内壁，逐步被当前孔位的磁棒所吸附在磁棒套底部，从而减小核酸提取量的损失。
S107、将磁珠转移至清洗液中，磁棒套上下振荡使得磁珠均匀分散于清洗液，洗去附着在磁珠表面的、除核酸以外的物质。该步骤在图1中的孔位2完成。
具体的，将磁棒套、位于磁棒套内的磁棒、吸附于磁棒套外表面的磁珠停留在清洗液的中上层，保持磁棒套不动，将磁棒从磁棒套内迅速撤去；此时磁珠脱离磁棒套，由于水阻尚未落入深孔板底部(尚未沉底)，磁棒套立即进行上下振动，达到将磁珠均匀混合在清洗液内，让磁珠表面物质与清洗液充分接触，洗去附着在磁珠表面的蛋白与其它物质，只保留核酸与磁珠的结合。清洗结束后，磁棒套离开液面，但仍然处于深孔板内部。
S108、执行步骤S105、S107若干次。本例中，执行步骤S105、S107两次，即执行清洗程序三次，能够有效保证洗去附着在磁珠表面的、除核酸以外的物质。该步骤所述的两次清洗依次在图1中的孔位3和孔位4完成。
S109、利用磁棒将清洗完成的磁珠吸附于磁棒套外表面，并对磁珠和磁棒套进行干燥处理。
具体的，利用磁棒将清洗完成的磁珠吸附于磁棒套外表面后，磁棒和磁棒套同步上移至核酸提取仪工作腔1中停留，然后对清洗结束的磁棒套和磁珠进行干燥处理，防止清洗液对后续的操作产生影响。干燥过程中，利用工作腔1一侧的风扇2工作实现进风，另一侧的风扇2工作实现排风，微风循环，同时磁棒和磁棒套同步上下缓慢振荡，形成多方位、多方式的干燥。
S111、将干燥后的磁珠转移至洗脱液中进行洗脱，使得附着在磁珠上的核酸脱离磁珠进入洗脱液中，利用磁棒和磁棒套将溶液中的磁珠吸附回收移动至用于存放磁珠的孔位，即得核酸溶液。该步骤在图1中的孔位5完成。
如图2-图4所示，上述步骤S101、S103在核酸提取仪的裂解区域完成，所述裂解区域由多个裂解工位组成，每个裂解工位均具有用于盛装裂解液的容器；所述步骤S111在核酸提取仪的洗脱区域完成，所述洗脱区域由多个洗脱工位组成，每个洗脱工位均具有用于盛装洗脱液的容器；所述裂解工位与洗脱工位一一对应。所述容器可以采用96孔深孔板或者384孔深孔板，如图5所示，本实施例采用的96孔深孔板4(该深孔板安装于工作腔内的结构如图4所示)，按照6*8个孔位一组，分为两组，第一组孔位中的洗脱孔位与第二组孔位中的裂解孔位间隔至少一个孔位布置，避免第一组孔位中洗脱孔位加热与第二组孔位中裂解孔位加热的相互干扰。
作为本实施例的一种优选实施方案，所述裂解区域和/或洗脱区域设置有正对容器内溶液的红外测温模块3，采用红外测温模块直接对溶液进行测温，所测温度即溶液温度。
为了提高裂解、洗脱的速度，本实施例在所述裂解区域和/或洗脱区域底部设有加热模块。如图6所示，本例中，所述加热模块包括：
下导热块5，通过螺钉安装于核酸提取仪的底板11上；
上导热块6，通过螺钉安装于下导热块5上；其上表面形成有与所述深孔板底面形状、尺寸相配套的凹陷部，用于给深孔板(容器)内的溶液加热；
加热膜7，位于下导热块5和核酸提取仪的底板11之间，用于产生热量并经下导热块5传导至上导热块6，对深孔板(容器)内的溶液进行加热；
隔温块8，通过螺钉安装于核酸提取仪的底板11上、且位于下导热块5上方；该隔温块上开设有与上导热块6相匹配的通孔，所述上导热块6位于该通孔内；利用隔温块8能够有效减少上导热块6的热量从侧面散发，另一方面能够避免操作人员操作中不小心碰到上导热块6出现烫伤；
压板9，位于加热膜7与核酸提取仪底板11之间，用于保证加热膜7的平整；
保温硅胶垫10，位于加热膜7与压板9之间，能够有效减少热量从底面散发。
由于上导热块6与下导热块5之间可拆卸连接，能够适用不同规格、型号的深孔板(常见深孔板底部形状主要有U型和V型两种)。
如图7-图9所示，所述核酸提取仪的底板11上设置有连接块12，该连接块12经橡胶柱13与核酸提取仪的外壳14连接；利用橡胶柱13实现核酸提取仪的底板11与外壳14的软性连接，使得核酸提取过程中，核酸提取仪的底板11还会存在一定的前后左右晃动，使得振动、磁吸、洗脱等过程的效果更好。
作为本实施例的一种优选实施方案，所述外壳14上设置有限位块15，该限位块一端固定于外壳14上，另一端折弯后伸至核酸提取仪的底板11的上方(使得限位块整体呈L形)，并在其与核酸提取仪的底板11之间形成间隙，在出现核酸提取仪倒置状态时，利用限位块对核酸提取仪的底板11的限位作用，保证核酸提取仪的底板11的稳定性。
Claims (10)
1.一种核酸提取方法，其特征在于包括：
S101、将样本与裂解液混合，使样本充分裂解；
S103、在步骤S101得到的溶液中加入磁珠，使得磁珠与样本裂解出来的核酸结合；
S105、磁棒移动至磁棒套内后，整体向下移动，进入溶液中吸附磁珠；吸附完成后，磁棒和磁棒套保持相对位置不动，上下振荡若干次；
S107、将磁珠转移至清洗液中，磁棒套上下振荡使得磁珠均匀分散于清洗液，洗去附着在磁珠表面的、除核酸以外的物质；
S109、利用磁棒将清洗完成的磁珠吸附于磁棒套外表面，并对磁珠和磁棒套进行干燥处理；
S111、将干燥后的磁珠转移至洗脱液中进行洗脱，使得附着在磁珠上的核酸脱离磁珠进入洗脱液中，利用磁棒和磁棒套将溶液中的磁珠吸附回收，即得核酸溶液。
2.根据权利要求1所述的核酸提取方法，其特征在于，将磁珠转移至清洗液中，磁棒套上下振荡使得磁珠均匀分散于清洗液，具体为：
将磁棒套、位于磁棒套内的磁棒、吸附于磁棒套外表面的磁珠停留在清洗液的中上层，保持磁棒套不动，将磁棒从磁棒套内撤去；在磁珠沉底之前，磁棒套上下振荡使得磁珠均匀分散于清洗液。
3.根据权利要求1所述的核酸提取方法，其特征在于，利用磁棒将清洗完成的磁珠吸附于磁棒套外表面，并对磁珠和磁棒套进行干燥处理，具体为：
利用磁棒将清洗完成的磁珠吸附于磁棒套外表面后，磁棒和磁棒套同步上移至核酸提取仪工作腔中部进行上下振荡，同时工作腔一侧进风，另一侧排风，形成空气流动。
4.根据权利要求1所述的核酸提取方法，其特征在于：所述步骤S101、S103在核酸提取仪的裂解区域完成，所述裂解区域由多个裂解工位组成，每个裂解工位均具有用于盛装裂解液的容器；所述步骤S111在核酸提取仪的洗脱区域完成，所述洗脱区域由多个洗脱工位组成，每个洗脱工位均具有用于盛装洗脱液的容器；所述裂解工位与洗脱工位一一对应。
5.根据权利要求4所述的核酸提取方法，其特征在于：所述裂解区域和/或洗脱区域设置有正对容器内溶液的红外测温模块。
6.根据权利要求4所述的核酸提取方法，其特征在于：所述裂解区域和/或洗脱区域底部设有加热模块。
7.根据权利要求6所述的核酸提取方法，其特征在于，所述加热模块包括：
下导热块，通过螺钉安装于核酸提取仪的底板上；
上导热块，通过螺钉安装于下导热块上，用于给容器内的溶液加热；
加热膜，位于下导热块和核酸提取仪的底板之间，用于产生热量并经下导热块传导至上导热块。
8.根据权利要求7所述的核酸提取方法，其特征在于：所述加热模块还包括安装于核酸提取仪的底板上、且位于下导热块上方的隔温块，该隔温块上开设有与上导热块相匹配的通孔，所述上导热块位于该通孔内；所述加热模块还包括位于加热膜与核酸提取仪底板之间的压板；所述加热模块还包括位于加热膜与压板之间的保温硅胶垫。
9.根据权利要求7所述的核酸提取方法，其特征在于：所述核酸提取仪的底板上设置有连接块，该连接块经橡胶柱与核酸提取仪的外壳连接；所述外壳上设置有限位块，该限位块一端固定于外壳上，另一端折弯后伸至核酸提取仪的底板的上方，并在其与核酸提取仪的底板之间形成间隙。
10.根据权利要求1所述的核酸提取方法，其特征在于：所述步骤S107和S109之间还包括：
S108、执行步骤S105、S107若干次。
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