CN113197226A - 一种植物生长促进剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种植物生长促进剂及其应用。本发明提供的植物生长促进剂包括以荔枝壳提取物作为营养成分培养的微藻，以及荔枝壳提取剩余物，微藻负载在荔枝壳提取剩余物中。本发明通过对荔枝壳进行一系列的提取，以获得荔枝壳提取物以及荔枝壳提取剩余物。其中，荔枝壳提取物可作为微藻培养的营养成分，荔枝壳提取剩余物作为供微藻生长与吸附的稳定材料，与微藻的生长和生产结合，然后再施用于种植中，促进水果、蔬菜等植物的生长，减少种植过程中化肥的使用，对环境保护和绿色农业的发展具有重要意义。

Description

一种植物生长促进剂及其应用
技术领域
本发明属于农业领域，更具体地，本发明涉及一种植物生长促进剂及其应用。
背景技术
农业是我国的重要的支柱产业，而其中种植业是最重要的组成部分。为提高作物的生长与产量，传统农业采用大量使用农药与化肥的耕作模式。在促进作物的增产的同时，对环境造成了污染，大量没有被作物吸收的营养元素进入自然界加快了水体的富营养化。另一方面，目前，农业生产中在作物生长过程中过量使用化肥与杀虫剂的生产模型，造成了土壤退化、生产力下降，农业种植环境污染与资源浪费等问题。大量使用化肥和农药污染对作物生产过程存在显著“环境惩罚”效应。过多使用氮肥会使大量硝酸盐累积于作物体内，作物抗逆性下降，病虫害增加。过量施用磷肥会导致土壤缺乏铁和锌并导致土壤和动植物体内镉含量显著增加，从而造成次生危害；农药的大量使用，造成农田中有益生物骤减，引起土壤板结、酸化甚至危害人类健康等问题.
减少化肥和农药使用量，可以让农业生态环境得到有效改善，适应当今我国生态环保要求。因此，生物肥替代化肥的绿色农业对于解决该问题以及我国的农业可持续性发展具有重要意义。
发明内容
本发明的发明人在研究中发现，微藻是自然界中存在的天然固氮生物，可以与植物进行内外共生。同时，藻细胞产生叶酸、藻多肽、藻多糖、核酸，生物酶等物质具有对植物生长促进、改善土壤结构，解磷解钾、固氮固碳、提高土壤阳离子矿质元素活性等的作用，有利于光合产物的积累和转化，促进植物次生代谢，能提高农作物产量、品质和肥料利用率等。当藻类细胞进入到土壤里自身裂变繁殖，具有中和土壤酸碱性，使土壤趋于中性的功能；活化中微量元素钙、镁、锌、硼、铁、锰等的形成，提高土壤通气保水性，有益微生物繁殖增多，健康的土壤进一步提高作物的产量和品质。
以小球藻为代表的微藻规模化养殖和高值产品加工的产业链中，微藻采收成本高、效率较低依然是一个亟待解决的问题。此外，发明人发现，微藻的活性成分是植物生长促进剂的核心，为稳定微藻的活性成分与加快采收，需要配合某些吸附与稳定剂，以延长植物生长促进剂的效能。
目前，在南方大量的农业废弃物对环境造成污染；其中，荔枝壳是南方农业的蔬果废弃物之一。每逢结果期，大量的荔枝壳被丢弃于环境中，成为农业垃圾。荔枝壳内含有大量生物活性物质，如色素、黄酮、多酚和膳食纤维、多糖等。目前，对荔枝壳活性成分的研究主要集中在色素、总黄酮和多酚的提取工艺及抗氧化性研究，而对其多糖的研究还处于起步阶段。本发明以荔枝壳为加工副产物为对象，通过特殊的提取方式来提取产物中的多糖天然产物，获得具有功能活性的关键天然因子，将天然因子加入微藻的培养，并同时作为基质混入微藻的培养过程，此发明将有助于减少该废弃物对环境的影响，并产生一定的经济价值。更重要的是，本发明采用一系列特殊提取方法处理荔枝壳，不仅可以获得富含荔枝壳多糖的荔枝壳提取物用于微藻生长的营养物，提取之后的荔枝壳提取剩余物还可以成作为供微藻生长与吸附的稳定材料，将其与微藻生长、生产结合，然后再施用于种植中，促进水果、蔬菜等植物的生长，减少种植过程中使用化肥，进一步减少农业的非点源污染与河流的富营养化，对环境保护和绿色农业的发展具有重要意义。
具体地，本发明提供了一种植物生长促进剂，其包括以荔枝壳提取物作为营养成分培养的微藻，以及荔枝壳提取剩余物，所述微藻负载在所述荔枝壳提取剩余物中。
此外，本发明还提供了植物生长促进剂在促进植物生长中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例2中，使用植物生长促进剂后火龙果根系长度的对比结果；
图2为本发明实施例2中，使用植物生长促进剂后火龙果开花次数的对比结果；
图3为本发明实施例2中，使用植物生长促进剂后火龙果产量的对比结果；
图4为本发明实施例2中，使用植物生长促进剂后化肥使用量的对比结果；
图5为本发明实施例3中，使用植物生长促进剂后菜心出芽率的对比结果；
图6为本发明实施例3中，使用植物生长促进剂后菜心生长速度的对比结果；
图7为本发明实施例3中，使用植物生长促进剂后化肥使用量的对比结果；
图8为本发明实施例3中，使用植物生长促进剂后年产量的对比结果；
图9为本发明实施例3中，使用植物生长促进剂后收购价格的对比结果；
图10为本发明实施例4中，使用植物生长促进剂组和对照组的香蕉树生长对比照；
图11为本发明实施例4中，使用植物生长促进剂后的香蕉树生长高度的对比结果；
图12为本发明实施例4中，使用植物生长促进剂后的香蕉树树冠直径的对比结果；
图13为本发明实施例4中，使用植物生长促进剂后的香蕉树树干底部周长的对比结果；
图14为本发明实施例4中，使用植物生长促进剂后的化肥使用量的对比结果；
图15为本发明实施例4中，使用植物生长促进剂后的香蕉树苗成活率对比结果。
具体实施方式
通过以下参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。
实验例1植物生长促进剂的制备
1.荔枝壳处理
1.1荔枝壳预处理
(1)获得荔枝壳后，先清洗，然后超声波清洗仪中，以35kHz，25w，3～5min超声波进行清洗，清洗完毕的荔枝壳粉碎成50目，清洗待用。
1.2脉冲式提取荔枝壳提取物和荔枝壳提取剩余物
(2)将步骤(1)所得荔枝壳按质量/体积比1：3的比例加入无水乙醚，进行索氏抽提4-7h去脂；所得荔枝壳粉末干燥5min后，按质量/体积比1g/1mL加入无水乙醇为溶剂，浸泡4h，去除蛋白质。去除上清液后，以灭菌的纯水洗涤1-2次，所得荔枝壳粉末按1：100-1：200质量/体积比溶解于无菌纯水得到混合物，进入脉冲超声、微波交替水提三阶段过程，该三阶段是按超声-微波-收集上清液-重溶粉末次序进行3次操作。
(3)第一阶段：装有纯水-粉末混合物的容器放入超声处理，条件为55kHz，30w，3-5min超声波进行处理，再经过微波进行处理，将壳孔道打开，条件为微波频率2000MHz，微波功率400W，微波处理时间4-6min。收集上清液，剩余粉末按1：50-1：100质量/体积比溶解于无菌纯水。
(4)第二阶段：超声处理，条件为65-60kHz，40-50w，5-6min；微波处理：微波频率2550-3000MHz，微波功率600-900W，微波处理时间6-9min，收集上清液，剩余粉末按照质量/体积比为(1:50)～(1:100)的比例溶解于无菌纯水。
(5)第三阶段：超声处理，条件为60-70kHz，40-50w，6-8min；微波处理：微波频率3000-3500MHz，微波功率900-950W，微波处理时间9-10min，收集上清液，剩余固体粉末为荔枝壳提取剩余物。
(6)合并收集三个阶段所得上清液即为荔枝壳提取物(粗提物)，经过低温旋转蒸发(50-60摄氏度)，减少溶解水分，再进入超临界纯化阶段。
(7)经超临界纯化法，对溶液中有效成分进行纯化，CO2流量4-10mL/min、萃取压力40-50MPa、萃取釜温度55-60℃、出口温度115℃条件下动态萃取3-44h。萃取的上清液中的物质为纯化后的荔枝壳多糖(荔枝壳提取物)。
1.3荔枝壳提取剩余物的获得和处理
(8)经过脉冲超声、微波交替水提三阶段提取完剩余的固体物质为荔枝壳提取剩余物。荔枝壳提取剩余物经过清洗，然后利用1-3％HCl浸泡1-2h，然后洗净至中性pH6，再放入3％-5％的NaOH，浸泡2-4h，再洗净至中性pH6，最后再放入超声处理，条件为45-55kHz，30-50w，3-5min超声波进行处理2-3遍，再洗净，60摄氏度以下烘干备用(最后烘干为粉末)。最后，按质量分成1/3与2/3两部分，分别作为微藻的培养基成分与稳定吸附剂成分。
2.微藻的培养与制备
2.1获取微藻
(9)微藻可以采用栅藻、小球藻、螺旋藻等藻种。通过购买获得蛋白核小球藻藻种(Chlorella pyrenoidosa)。所获得的微藻需要经过预培养，再进入负载培养阶段。
2.2预培养与强化培养
(10)所购买的藻种(以蛋白核小球藻为例)，将经过灭菌的接种环从所购买的菌种中挑选。放入A0液体培养基中，培养基中加入荔枝壳提取剩余物(步骤(8)所得荔枝壳提取剩余物的1/3)成分。预培养主要用于活化微藻，提高藻细胞的通透性与活力。
(11)预培养的条件如下：首先按1：100的质量比加入A0液体培养基，在30摄氏度6000Lux全天光照条件下培养2～3天，每日摇动2～3次，然后放入超声探头，在条件为25kHz，25w，30s-40s超声波进行处理，增加藻体的通透性，然后光照培养。在培养末期，测定氨氮、总氮与总磷的去除率，分别达到65％、50％和50％以上，离心/过滤藻体，更换等体积A1液体培养基，进入强化培养阶段。
(12)强化培养阶段：在30-35摄氏度6000-7000Lux全天光照条件下培养2～3天，培养时放入四氧化三铁，并在50-100mT静磁场条件下，同步培养0.5-1h，然后再放入超声探头，在条件为30kHz，25w，30s-40s超声波进行处理，重复此步骤2-3次。直至硝酸盐、总氮与总磷的去除效果分别达到80％、70％和70％，同时此时细胞密度将不小于107-108个/ml，通过离心或者过滤收集藻体。
2.3荔枝壳提取剩余物负载藻的植物生长促进剂的制备
(13)制备过程在光反应器进行。将步骤(12)所得藻体转至A2液体培养基内。A2液体培养基先在反应器外进行调配。按藻体与培养液体积比1：1000的比例加入光反应器中(保持温度在20-30℃下光照培养8-12小时)。培养过程中，反应器流速保持在0.7m/s，在培养过程中，微藻负载在荔枝壳提取剩余物中，经过2周的培养后，将沉淀物从反应器中排出，获得植物生长促进剂。
其中，每升A0液体培养基包括如下组分：CH3COONa 5.0g，Na2HPO4 28.73mg，NH4Cl60.00mg，CaCl2·2H2O 18.20mg，用1mM NaOH调整pH至7.0；
每升A2液体培养基包括如下组分：CH3COONa 15.0g，Na2HPO4 28.73mg，NH4Cl100.00mg，CaCl2·2H2O 18.20mg，Fe3O4 20g，用1mM NaOH调整pH至7.0；然后加入荔枝壳提取剩余物100-200g，高岭土50-100g，聚乙烯醇30-50g，硼酸5-10ml，壳聚糖30-50g，荔枝壳提取物10g；
每升A1液体培养基包括如下组分：CH3COONa 5.0g，Na2HPO4 28.73mg，NH4Cl60.00mg，CaCl2·2H2O 18.20mg，Fe3O4 5g，荔枝壳提取剩余物100g，用1mM NaOH调整pH至7.0。
实施例2
采用本发明实施例1所得植物生长促进剂，在种植火龙果中使用。2018年～2019年，在湛江市遂溪县岭北镇某地微藻植物生长促进剂的运用实验中，使用基地4个，面积400亩，
直接浇灌实施例1所得植物生长促进剂，每月使用2次，1瓶(3L)/次/棵，按1：50的体积比用自来水进行稀释。另外有相连的同一地块的400亩作为对照，不使用植物生长促进剂。所有果树均为种植树龄2～3年的火龙果，经过定期每亩使用植物生长促进剂的种植火龙果，根系明显比没有使用的要健壮和发达，具有开花提前、结束晚和花朵多出20％以上，单个果重平均多出10％，同一批次亩产增产28％左右，同时减少25％的化肥使用量，取得明显的经济效益。具体结果如表1和图1～4所示。
图1显示，使用本发明植物生长促进剂后，火龙果根系比较不使用的对照组要长30％-40％以上，显示对根系有明显的促进作用。图2显示使用本发明植物生长促进剂后火龙果开花的批次明显增多，达到14次以上，比对照组的11次的明显增多，显示对火龙果的生长与结果有明显的作用。增产方面，图3显示使用本发明植物生长促进剂后亩产量达到2550公斤，比对照组的2100公斤增加30％。火龙果的优质率也有所提高，从78％提高到93％。图4显示在使用本发明植物生长促进剂后，可以大大减少该作物种植过程的化肥的使用量，每月使用减少5公斤，节约达25％。减少了总氮、总磷的流失。
因此，本发明所得植物生长促进剂无论对植物生长、结果与田间管理都有较明显的改善作用。
实验组与对照组实验数据对比如表1所示。
表1
Figure BDA0003083498890000071
通过以上实验，证明本发明的植物生长促进剂能有效改善火龙果植株的生长情况与果实成长情况，达到减少使用化肥的目的。
实施例3
实施例1所得植物生长促进剂在湛江市湖光镇开展蔬菜种植上的运用实验工作，使用6个，面积280亩，另外有相连的同一地块的280亩作为对照，使用该植物生长促进剂的菜心，根系明显比没有使用的要健壮和发达，具有出芽率高，抗高温暴雨等恶劣天气影响的效果，生长速度快，色泽翠绿，口感清脆等特点，平均亩产多出30％，同时减少35％的化肥使用量，为蔬菜种植取得明显的经济效益。具体结果如图5～9所示，使用时按1：100(质量比例)用自来水稀释实施例1所得植物生长促进剂，施用量按每棵0.25L-0.5L。
图5显示，使用本发明所得植物生长促进剂后，菜心的出芽率比对照组要高出近20％，明显有利于出芽。图6显示使用本发明所得植物生长促进剂后，菜心的生长速度有所提高，只需要26天，比对照组的29天快。化肥使用量方面，图3显示使用本发明所得植物生长促进剂后，化肥的使用量可以大大减少，每茬使用量减少9公斤，节约达36％。而且，使用本发明所得植物生长促进剂后菜心的年产量也大大提高，其收购价格也比对照组的3.2元每公斤要高出0.4元每公斤。因此，本发明所得植物生长促进剂无论对植物的出芽率、生长速度与田间管理都有较明显的改善作用。
实施例4
广东绿百多生物开发有限公司从2018年～2019年，在湛江市雷州市调风镇、遂溪县洋青镇和麻章区等地区开展本发明所得植物生长促进剂在香蕉种植上的运用实验工作，使用基地8个，面积1000亩，另外有相连的同一地块均为：香蕉生长第1～4代，经过定期使用本发明所得植物生长促进剂的香蕉，能明显提高生长速度，增强抗病能力，对于香蕉种植过程中极易出现并且会造成大面积损失的水肿病、烂头病等病害有明显的抑制作用，提高成活率，果实饱满卖相好，同时减少化肥使用量。具体如表2和图10～15所示。使用时按1：100(质量比例)用自来水稀释实施例1所得植物生长促进剂，施用量按每平方米3L。图11显示，使用本发明所得植物生长促进剂后，种植6个月的香蕉比对照组的高出0.2米，显示本发明所得植物生长促进剂对香蕉的高度有促进作用。而且，图12和图13显示，使用本发明所得植物生长促进剂后树冠直径比对照组的长0.4米，树干底部周长比对照组的要长0.6米，显示本发明所得植物生长促进剂对香蕉的生长有明显的促进作用。图14显示在使用本发明所得植物生长促进剂后，可以大大减少该作物种植过程中的化肥使用量，减少了植物的种植成本。图15显示蕉苗的成活率也有所提高，从92％提高到98％。因此，本发明所得植物生长促进剂无论对植物的生长还是节约成本都有好处。
一代蕉使用组与对照组实验数据对比如表2所示。
表2
Figure BDA0003083498890000091
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (9)

1.一种植物生长促进剂，其特征在于，包括以荔枝壳提取物作为营养成分培养的微藻，以及荔枝壳提取剩余物，所述微藻负载在所述荔枝壳提取剩余物中。
2.根据权利要求1所述的植物生长促进剂，其特征在于，所述荔枝壳提取物和所述荔枝壳提取剩余物的制备方法包括如下步骤：
(101)将荔枝壳清洗、粉碎、提取，得到荔枝壳提取物和荔枝壳提取剩余物；
(102)所述荔枝壳提取物经纯化处理，所述荔枝壳提取剩余物经清洗、烘干，即得。
3.根据权利要求2所述的植物生长促进剂，其特征在于，将荔枝壳清洗、粉碎、提取的步骤中，所述提取包括如下步骤：
(201)以质量/体积比为(1:3)～(1:5)的比例，向所述荔枝壳中加入无水乙醚，以索氏抽提4～7h去脂；
(202)干燥处理，然后以质量/体积比为1g/1mL的比例加入无水乙醇作为溶剂浸泡4h，以去除蛋白质；
(203)去除上清液后，以无菌水洗涤1～2次后，以质量/体积比为(1:100)～(1:200)的比例溶解于无菌水中，得到荔枝壳粉末与纯水的第一混合物；
(204)所述第一混合物以55～65kHz、30～50W、3～5min的条件进行超声波处理，然后以微波频率2000～2550MHz、微波功率400～800W、时间为4～6min的条件进行微波处理以将荔枝壳的壳孔道打开，收集上清液；剩余粉末再以质量/体积比为(1:50)～(1:100)的比例溶解于无菌水中，得到第二混合物；
(205)将所述第二混合物以60～65kHz、40～50W、5～6min的条件进行超声波处理，然后以微波频率2550～3000MHz、微波功率600～900W、时间为6～9min的条件进行微波处理，收集上清液，剩余粉末再以质量/体积比为(1:50)～(1:100)的比例溶解于无菌水中，得到第三混合物；
(206)将所述第三混合物以60～70kHz、40～50W、6～8min的条件进行超声波处理，然后以微波频率3000～3500MHz、微波功率900～950W、时间为9～10min的条件进行微波处理，收集上清液；
(207)合并收集步骤(204)～(206)所得上清液为荔枝壳提取物；剩余固体粉末为荔枝壳提取剩余物。
4.根据权利要求2所述的植物生长促进剂，其特征在于，所述荔枝壳提取物经纯化处理的步骤中，所述纯化处理是将所述荔枝壳多糖在50～60℃下进行低温旋转蒸发，减少溶解水分，然后进行超临界纯化，所述超临界纯化是在CO2流量4～10mL/min、萃取压力40～50MPa、萃取釜温度55～60℃、出口温度115℃条件下动态萃取3～44h，所得上清液即为纯化后的荔枝壳提取物。
5.根据权利要求2所述的植物生长促进剂，其特征在于，所述荔枝壳提取剩余物经清洗、烘干的步骤中，所述清洗、烘干是将所述荔枝壳提取剩余物清洗后，以1～3％HCl浸泡1～2h，然后清洗至中性pH＝6，再加入3～5％的NaOH浸泡2～4h，再清洗至中性pH＝6，然后以45～55kHz、30～50W、3～5min的条件进行超声波处理2～3次后，清洗，在60℃下烘干得到粉末。
6.根据权利要求1-5任一项所述的植物生长促进剂，其特征在于，所述微藻为栅藻、小球藻、螺旋藻中的至少一种。
7.根据权利要求1-5任一项所述的植物生长促进剂，其特征在于，微藻负载在所述荔枝壳提取剩余物中的方法包括如下步骤：
(301)将所述微藻置于A0液体培养基中，加入所述荔枝壳提取剩余物进行预培养和强化培养，以活化所述微藻，提高所述微藻细胞的通透性与活力；
(302)将强化后的所述微藻转至A2液体培养基中，在光反应器中进行培养，所述培养过程中，所述微藻负载在所述荔枝壳提取剩余物中，并施以所述荔枝壳提取物，经1～2周，将所得沉淀物从所述光反应器中排出，得到所述植物生长促进剂；
其中，每升所述A0液体培养基包括如下组分：CH3COONa 5.0g，Na2HPO4 28.73mg，NH4Cl60.00mg，CaCl2·2H2O 18.20mg，用1mM NaOH调整pH至7.0；
每升所述A2液体培养基包括如下组分：CH3COONa 15.0g，Na2HPO4 28.73mg，NH4Cl100.00mg，CaCl2·2H2O 18.20mg，Fe3O420g，用1mM NaOH调整pH至7.0；然后加入荔枝壳提取剩余物100-200g，高岭土50-100g，聚乙烯醇30-50g，硼酸5-10ml，壳聚糖30-50g，荔枝壳提取物10g；
每升所述A1液体培养基包括如下组分：CH3COONa 5.0g，Na2HPO4 28.73mg，NH4Cl60.00mg，CaCl2·2H2O 18.20mg，Fe3O4 5g，所述荔枝壳提取剩余物100g，用1mM NaOH调整pH至7.0。
8.根据权利要求7所述的植物生长促进剂，其特征在于，所述预培养的方法如下：按照1:100的质量比将所述微藻加入A0液体培养基，在25～30℃、5000～6000Lux全天光照条件下培养2～3天，每天摇动2～3次，然后放入超声探头，在条件为25kHz、25W、30～40s进行超声波处理，增加藻体的通透性；测定氨氮、总氮和总磷的去除率，分别达到65％、50％和50％以上时，离心/过滤藻体，更换等体积A1液体培养基。
9.根据权利要求7所述的植物生长促进剂，其特征在于，所述强化培养的方法如下：将预培养完毕的藻体在30～35℃、6000～7000Lux全天光照条件下培养2～3天，培养时加入四氧化三铁，并在50～100mT静磁场条件下同步培养0.5～1h，然后放入超声探头，在条件为30kHz、25W、30～40s进行超声波处理2～3次，直至硝酸盐、总氮和总磷的去除率分别达到80％、70％和70％以上，且细胞密度大于等于107～108个/mL，离心/过滤藻体。
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