CN113195714A

CN113195714A - 核酸分离的方法和组合物

Info

Publication number: CN113195714A
Application number: CN201980065415.8A
Authority: CN
Inventors: V·巴拉兹尼诺克; A·I·库蒂亚文; O·Z·纳纳西; D·塞尔盖耶夫; A·A·高尔
Original assignee: Cepheid
Current assignee: Cepheid
Priority date: 2018-08-17
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2021-07-30
Also published as: JP2021533780A; US20210324372A1; KR20210045451A; CA3109805A1; AU2019320825A1; EP3837363A1; JP7516348B2; WO2020037260A1

Abstract

提供了用于从生物样品分离核酸的方法和组合物。

Description

核酸分离的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年8月17日提交的美国临时申请第62/765,013号的权益，其全部内容通过引用并入本文。

关于序列表的声明

与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且通过引用并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称为70132_Seq_Final_2019-08-14.txt。文本文件为3.0KB；创建于2019年8月14日；并在提交说明书时通过EFS-Web提交。

发明领域

本发明涉及从包含核酸的样品中分离核酸的方法和组合物。

背景

与传统的诊断方法相比，通过各种自动化分析技术，例如聚合酶链式反应(PCR)，利用核酸扩增和/或检测的分子诊断分析可以在更短的时间内提供快速而准确的结果，并且可以轻松实现自动化。然而，为了对生物样品进行分子诊断分析，必须从生物材料中分离核酸，以去除可能例如通过抑制聚合酶活性影响分析准确性的组分。即使存在多种用于核酸提取的方法，但是当前可用的方法通常涉及冗长的步骤，并且不易于自动化。因此，在扩增和检测特定靶标之前制备核酸样品是分子诊断学中最具挑战性的步骤。

需要简单且快速的核酸分离方法来制备不含扩增抑制剂的有质量的核酸，所述方法不需要大量样品处理并且可以适应临床实验室自动化。需要能够以与快速、自动化的核酸检测方法兼容的方式促进核酸从包含核酸的生物样品中分离的试剂。

发明概述

一方面，本文提供了用于从包含核酸的样品中分离核酸的方法，包括：

(a)使包含核酸的样品与包含多糖的水性组合物接触，所述多糖包含一个或多个糖醛酸单元；和

(b)在固体载体上浓缩所述核酸，从而分离所述核酸。

在本文公开的方法的一些实施方案中，所述多糖还包含改性的糖醛酸单元，例如糖醛酸酰胺单元、糖醛酸酯单元或其组合。

在一些实施方案中，多糖还包含一个或多个由式II表示的单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中：

R²和R³独立地为H、任选取代的C1-C8烷基、任选取代的C3-C8环烷基、任选取代的C3-C8杂环烷基或任选取代的C2-C20杂烷基。

在一些实施方案中，所述多糖还包含一个或多个式(III)的单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中R³为CH₂CH₂NH₂、CH₂CH₂N(CH₃)₂、CH₂CH₂OH、NH₂、H、CH₃、CH₂CH₂OCH₂CH₂NH₂或CH₂CH₂NHCH₂CH₂NH₂。

在一些实施方案中，所述多糖包含一个或多个具有式VI的结构的单体单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中：

n为0、1、2或3；

R⁴为H或C1-C3烷基；

X在每次出现时独立地为C2-C4亚烷基或C4-C6杂亚烷基；

Y为C2-C3亚烷基或C4-C6杂亚烷基；和

R⁵和R⁶独立地为H或C1-C3烷基。

在一些实施方案中，所述多糖包含一个或多个具有式V的结构的单体单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中：

n为0、1、2或3；

m在每次出现时独立地为2、3或4；

p为2、3或4；

R¹、R²和R³独立地为H或C1-C3烷基；

R⁴为H或C1-C3烷基；和

R⁵和R⁶独立地为H或C1-C3烷基。

在一些实施方案中，所述多糖包含一个或多个由式VI、式VII或式VII I表示的单元，其异构体、盐、互变异构体或其组合：

在一些实施方案中，所述多糖是水溶性多糖。

在一些实施方案中，所述多糖是改性果胶。在一些实施方案中，所述改性果胶选自部分脱酯化果胶、部分脱酯化解聚果胶、酰胺化果胶、酰胺化解聚果胶或其混合物。在一些实施方案中，所述改性果胶是改性柑橘果胶或改性苹果果胶。

在一些实施方案中，所述多糖以约0.1μg/mL至约1000μg/mL、约0.1μg/mL至约500μg/mL、约0.1μg/mL至约200μg/mL、约0.1μg/mL至约100μg/mL、约0.1μg/mL至约50μg/mL、约0.1μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL至约200μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL或约1μg至约20μg的浓度存在于水性组合物中。

在一些实施方案中，所述多糖具有约120kDa至约500kDa、约150kDa至约300kDa或约120kDa至约175kDa的相对分子量。在一些实施方案中，所述改性果胶是通过未改性果胶的酰胺化获得的。在一些实施方案中，所述未改性果胶具有约5kDa至约1,100kDa、约10kDa至约500kDa、约10kDa至约300kDa、约20kDa至约200kDa或约20kDa至约100kDa的相对分子量。

在一些实施方案中，所述核酸通过离心、沉淀或其组合在固体载体上浓缩。在一些实施方案中，所述核酸通过在固体载体上沉淀来浓缩，例如，通过离心或通过过滤器来浓缩。

在一些实施方案中，所述固体载体包含选自二氧化硅、玻璃、烯基主链聚合物、云母、聚碳酸酯、沸石、二氧化钛或其组合的材料。在一些实施方案中，所述固体载体是磁珠、玻璃珠、纤维素过滤器、聚碳酸酯过滤器、聚四氟乙烯过滤器、聚乙烯吡咯烷酮过滤器、聚醚砜过滤器或玻璃过滤器。在一些实施方案中，所述固体载体是离心管如聚乙烯或聚丙烯管的壁。

在一些实施方案中，所述方法还包括洗涤在所述固体载体上沉淀或浓缩的核酸。

在一些实施方案中，所述方法还包括从所述固体载体洗脱所述核酸。在一些实施方案中，所述方法还包括洗涤和洗脱步骤。

在一些实施方案中，洗脱所述核酸包括使所述浓缩的核酸与洗脱剂接触。在一些实施方案中，所述洗脱剂包含氨或碱金属氢氧化物。在一些实施方案中，所述洗脱剂具有约9以上、约10以上或约11以上的pH。在一些实施方案中，所述洗脱剂具有约9至约12、约9.5至约12、约10至约12或约9至约11的pH。在一些实施方案中，所述洗脱剂包含聚阴离子。在一些实施方案中，所述聚阴离子是角叉菜胶。在一些实施方案中，所述聚阴离子是载体核酸。在一些实施方案中，所述洗脱剂包含角叉菜胶和碱金属氢氧化物或氢氧化铵。在一些实施方案中，所述角叉菜胶是i-角叉菜胶。在一些实施方案中，所述洗脱剂包含i-角叉菜胶和氢氧化钾。

在一些实施方案中，所述水性组合物还包含裂解剂。在一些实施方案中，所述水性组合物还包含离液剂。在一些实施方案中，所述离液剂选自硫氰酸胍、盐酸胍、碱金属高氯酸盐、碱金属碘化物、脲、甲酰胺或其组合。在一些实施方案中，所述水溶液还包含盐。在一些实施方案中，所述盐为氯化钠或氯化钙。在一些实施方案中，所述水性组合物还包含缓冲剂。在一些实施方案中，所述缓冲剂为Tris或HEPES。在一些实施方案中，所述水性组合物还包含表面活性剂。在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯。在一些实施方案中，所述水性组合物还包含消泡剂。

在一些实施方案中，所述样品是血液、血浆、血清、精液、组织活检、眼泪、尿液、粪便、唾液、脊髓液、涂布标本、细菌培养物、哺乳动物细胞培养物、病毒培养物、人类细胞、细菌、细胞外液、PCR反应混合物或体外核酸修饰反应混合物。在一些实施方案中，所述组织活检是石蜡包埋的组织。在一些实施方案中，所述核酸包含基因组DNA。在一些实施方案中，所述核酸包含总RNA。在一些实施方案中，所述样品包含微生物核酸或病毒核酸。在一些实施方案中，所述病毒核酸是HBV DNA。在一些实施方案中，所述核酸包含循环核酸。

在一些实施方案中，所述方法在药筒中进行。

在一些实施方案中，所述样品是细胞裂解物。在一些实施方案中，在与所述水性组合物接触之前，使所述样品与裂解缓冲液接触。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液包含一种或多种蛋白酶。

另一方面，本文提供了用于检测样品中的核酸的方法，包括：

(a)使样品与包含多糖的水性组合物接触，所述多糖包含一个或多个糖醛酸单元；

(b)浓缩所述核酸；和

(c)检测所述核酸。

在一些实施方案中，所述多糖包含一个或多个由式II表示的单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中

R²和R³独立地选自H、任选取代的C1-C8烷基、任选取代的C3-C8环烷基、任选取代的C3-C8杂环烷基和任选取代的C2-C20杂烷基。

在一些实施方案中，所述多糖还包含一个或多个由式III表示的单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中R³为H、CH₂CH₂NH₂、CH₂CH₂N(CH₃)₂、CH₂CH₂OH、NH₂、NCH₃、CH₂CH₂OCH₂CH₂NH₂或CH₂CH₂NHCH₂CH₂NH₂。

在一些实施方案中，所述多糖包含一个或多个由式VI表示的单体单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中：

n为0、1、2或3；

R⁴为H或C1-C3烷基；

X在每次出现时独立地为C2-C4亚烷基或C4-C6杂亚烷基；

Y为C2-C3亚烷基或C4-C6杂亚烷基；和

R⁵和R⁶独立地为H或C1-C3烷基。

在一些实施方案中，所述多糖包含一个或多个由式V表示的单体单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中：

n为0、1、2或3；

m在每次出现时独立地为2、3或4；

p为2、3或4；

R⁴为H或C1-C3烷基；和

R⁵和R⁶独立地为H或C1-C3烷基。

在一些实施方案中，所述多糖包含一个或多个由式VI、式VII或式VIII表示的单元，其异构体、盐、互变异构体或其组合：

在一些实施方案中，所述多糖是改性果胶。在一些实施方案中，所述改性果胶是改性柑橘果胶或改性苹果果胶。

在一些实施方案中，所述多糖以约0.1μg/mL至约1000μg/mL、约0.1μg/mL至约500μg/mL、约0.1μg/mL至约200μg/mL、约0.1μg/mL至约100μg/mL、约0.1μg/mL至约50μg/mL、约0.1μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL至约200μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL或约1μg至约20μg的浓度存在于所述水性组合物中。

在一些实施方案中，检测所述核酸包括通过聚合酶链式反应扩增所述核酸。

在一些实施方案中，所述聚合酶链式反应是巢式PCR、等温PCR、qPCR或RT-PCR。

另一方面，本文提供了一种用于核酸分离的试剂盒，所述试剂盒包含多糖，所述多糖包含一个或多个由式(II)-(VIII)表示的单元。在一些实施方案中，所述试剂盒包含使用说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒包含多糖溶液，所述多糖包含一个或多个由式(I)-(VIII)表示的单元。在一些实施方案中，所述试剂盒包含固体形式的多糖，所述多糖包含一个或多个由式(I)-(VIII)表示的单元。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含细胞裂解试剂或细胞裂解组分。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含洗脱试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含缓冲液组分。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含盐。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含离液剂组分。

详述

本文提供了以与自动化核酸扩增分析兼容的方式从包含核酸的样品中分离核酸的方法。

一方面，本文提供了用于从包含核酸的样品中分离核酸的方法，所述方法包括使包含核酸的样品与水性组合物接触以提供分离的(例如沉淀或浓缩的)核酸，其中所述水性组合物包含多糖，所述多糖包含一个或多个糖醛酸单元。

本文所述的组合物和方法可用于从多种包含核酸的样品中分离，例如浓缩或沉淀核酸。合适的样品包括血液、血浆、血清、精液、组织活检、尿液、粪便、唾液、涂布标本、石蜡包埋的组织、细菌培养物、细胞培养物、病毒培养物、PCR反应混合物和体外核酸修饰反应混合物，及其混合物。

本发明的方法的技术特征是包含一个或多个糖醛酸单元的多糖在例如通过沉淀或絮凝促进核酸从样品如细胞裂解物和组织中分离的用途。发明人发现，当本文公开的一些多糖试剂以约0.1μg/mL至约1,000μg/mL的浓度添加到包含核酸的样品如细胞裂解物和其他生物样品中时，出人意料地促进了通过常规方法，例如离心或通过多孔基质过滤的核酸回收，同时提高了产率。在一些实施方案中，所述方法允许在室温下分离核酸，这使得该方法可用于自动化的基于药筒的分子诊断分析。此外，该方法不需要从分离的核酸中去除多糖试剂或额外的纯化步骤，因为该试剂的存在不抑制通过标准核酸扩增方法，例如PCR检测分离的核酸。

多糖试剂

在一些实施方案中，本文所述的多糖试剂包含一个或多个糖醛酸单元。在一些实施方案中，多糖试剂包含糖醛酸单体单元。优选地，多糖包含一个或多个半乳糖醛酸单元。在一些实施方案中，多糖剂是聚半乳糖醛酸(PGA)。在其他实施方案中，多糖是结冷胶、氧化淀粉、氧化纤维素、氧化葡聚糖及其组合。

在一些实施方案中，多糖包含多个糖醛酸单元和一个或多个另外的单体单元。糖醛酸包括包含羰基(例如，醛或酮基)和羧酸(-COOH)官能团二者的糖酸。通常，糖醛酸衍生自末端羟基已被氧化成羧酸的糖，并且通常根据其母体糖来命名，例如，葡萄糖醛酸是衍生自葡萄糖的糖醛酸。衍生自己糖的糖醛酸称为己糖醛酸，并且衍生自戊糖的糖醛酸称为戊糖醛酸。

在一些实施方案中，除了一个或多个糖醛酸单元之外，多糖试剂还包含一个或多个选自由式(I)或式(II)表示的单元的另外的单元，或其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中R¹选自任选取代的C₁-C₈烷基、任选取代的C₃-C₈环烷基、任选取代的C₃-C₈杂环烷基和任选取代的C₂-C₂₀杂烷基；和

R²和R³独立地选自H、任选取代的C₁-C₆烷基、任选取代的C₃-C₆环烷基和任选取代的C₄-C₂₀杂烷基。

在一些实施方案中，R³为任选取代的C₁-C₆烷基。在一些实施方案中，R³为任选取代的C₄-C₂₀杂烷基，例如任选被一个或多个氨基取代的短PEG链。

在一些实施方案中，R¹、R²和R³中的每一个包含不多于一个氨基。在一些实施方案中，R¹、R²和R³中的每一个不包含氨基。在一些实施方案中，R²和R³中的每一个包含一个或多个氨基。在一些实施方案中，R²为H，并且R³为C₄-C₂₀杂烷基，例如包含2-6个乙二醇单元的多胺或低聚乙二醇。

在一些实施方案中，R¹为甲基、乙基或丙基。在一些实施方案中，R²和R³均为H。在一些实施方案中，R²为H，并且R³为任选取代的C₁-C₈烷基。在一些实施方案中，R²为H，并且R³为CH₂CH₂NH₂、CH₂CH₂N(CH₃)₂、CH₂CH₂NHCH₂CH₂NH₂、CH₂CH₂OH、NH₂、H或CH₃。在一些实施方案中，R²和R³均为CH₃。

如本文所使用，术语“烷基”、“烯基”和“炔基”包括直链、支链和环状单价烃基及其组合，当它们未被取代时仅包含C和H。实例包括甲基、乙基、异丁基、环己基、环戊基乙基、2-丙烯基、3-丁炔基等。有时在本文中描述每个这样的基团中的碳原子总数，例如，当该基团可以最多包含十个碳原子时，可以表示为1-10C、C1-C10、C1-C10、C1-10或C1-10。本文所使用的术语“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”是指其中一个或多个链碳原子已被杂原子替代的相应的烃。示例性的杂原子包括N、O、S和P。当允许杂原子替代碳原子时，例如在杂烷基中，描述该基团的数字尽管仍然书写为例如C3-C10，表示所述环或链中碳原子的数目加上作为所描述的环或链中碳原子的替代而被包括的这样的杂原子的数目之和。

单个基团可以包含多于一种类型的多重键，或多于一个多重键；当这些基团包含至少一个碳-碳双键时，它们被包括在术语“烯基”的定义内，并且当这些基团包含至少一个碳-碳三键时，它们被包括在术语“炔基”内。

烷基、烯基和炔基可以任选地被取代至这样的取代在化学上有意义的程度。典型的取代基包括但不限于卤素(F、Cl、Br、I)、＝O、＝NCN、＝NOR、＝NR、OR、NR₂、SR、SO₂R、SO₂NR₂、NRSO₂R、NRCONR₂、NRC(O)OR、NRC(O)R、CN、C(O)OR、C(O)NR₂、OC(O)R、C(O)R和NO₂，其中每个R独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基，并且每个R任选地被卤素(F、Cl、Br、I)、＝O、＝NCN、＝NOR'、＝NR'、OR'、NR'₂、SR'、SO₂R'、SO₂NR'₂、NR'SO₂R'、NR'CONR'₂、NR'C(O)OR'、NR'C(O)R'、CN、C(O)OR'、C(O)NR'₂、OC(O)R'、C(O)R'和NO₂取代，其中每个R'独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基。烷基、烯基和炔基也可以被C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基取代，其各自可以被适合于特定基团的取代基取代。

虽然本文所使用的“烷基”包括环烷基和环烷基烷基，但是术语“环烷基”在本文中用于描述经由环碳原子连接的碳环非芳族基团，而“环烷基烷基”用于描述通过烷基接头连接到分子的碳环非芳族基团。类似地，“杂环基”用于表示包含至少一个杂原子作为环成员并且经由环原子(可以是C或N)连接到分子的非芳族环状基团；“杂环基烷基”可以用于描述通过亚烷基接头连接到另一个分子的基团。如本文所使用，这些术语还包括含有一个或两个双键的环，只要该环不是芳族的。

“芳族”或“芳基”取代基或部分是指具有众所周知的芳香性的单环或稠合双环部分；芳基的实例包括苯基和萘基。类似地，“杂芳族”和“杂芳基”是指这样的单环或稠合双环体系，其含有一个或多个杂原子作为环成员。合适的杂原子包括N、O和S，包含其允许在5元环以及6元环中具有芳香性。典型的杂芳族体系包括单环C5-C6芳族基团，例如吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、噁唑基和咪唑基，以及通过将这些单环基团之一与苯基环或与任何杂芳族单环基团稠合以形成C8-C10双环基团而形成的稠合双环部分，例如吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、异喹啉基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、吡唑并吡啶基、喹唑啉基、喹喔啉基、噌啉基等。在整个环系统中，就电子分布而言，具有芳香性特征的任何单环或稠环双环系统都包括在该定义中。它还包括双环基团，其中至少直接与分子其余部分连接的环具有芳香性特征。通常，环系统包含5-14个环成员原子。通常，单环杂芳基包含5-6个环成员，而双环杂芳基包含8-10个环成员。

芳基和杂芳基部分可以被多种取代基取代，包括C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-C12芳基、C1-C8酰基以及它们的杂化形式(heteroform)，其各自可以本身被进一步取代；芳基和杂芳基部分的其他取代基包括卤素(F、Cl、Br、I)、OR、NR₂、SR、SO₂R、SO₂NR₂、NRSO₂R、NRCONR₂、NRC(O)OR、NRC(O)R、CN、C(O)OR、C(O)NR₂、OC(O)R、C(O)R和NO₂，其中每个R独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-C12芳基烷基或C6-C12杂芳基烷基，并且每个R如上文针对烷基所述的那样任选地被取代。芳基或杂芳基上的取代基还可以被本文所述的基团进一步取代，所述基团适用于每种类型的这样的取代基或取代基的每种组分。因此，例如，芳基烷基取代基可以在芳基部分上被本文描述的用于芳基的典型取代基取代，并且其可以在烷基部分上被本文描述的用于烷基的典型的或适合的取代基进一步取代。

如本文所使用的“任选取代的”表示所描述的特定基团可以具有一个或多个被非氢取代基替代的氢取代基。在一些任选取代的基团或部分中，所有氢取代基均被非氢取代基替代(例如，多氟烷基，如三氟甲基)。如果没有另外说明，则可以存在的这样的取代基的总数等于在所述基团的未取代形式上存在的H原子的数目。在任选的取代基通过双键，例如羰基氧或氧代(＝O)连接的情况下，该基团占据两个可用化合价，因此，可以包括的取代基总数根据可用化合价的数目减少。

在一些实施方案中，所述多糖试剂还包含一个或多个式(III)的单元，或其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中：

R³为CH₂CH₂NH₂、CH₂CH₂N(CH₃)₂、CH₂CH₂OH、CH₃,(CH₂)₂O(CH₂)₂NH₂或CH₂CH₂NHCH₂CH₂NH₂。在一些实施方案中，R³为H。在一些实施方案中，R³为CH₂CH₂OH。

应当理解，如果多糖包含两个或更多个式(II)或(III)的单元，则其R³在多糖内可以相同或不同。

在一些实施方案中，多糖剂是改性果胶。果胶是通常在植物细胞壁中发现的天然存在的复合多糖。果胶通常包含由鼠李糖残基插入并经中性糖侧链和非糖组分例如乙酰基、甲基和阿魏酸基团改性的α1-4连接的聚半乳糖醛酸主链。果胶中的半乳糖醛酸残基被部分酯化并作为甲酯存在。果胶通常以其酯化度为特征，酯化度定义为被酯化的羧基的百分比。具有例如高于50％的酯化度的果胶被分类为高甲酯(“HM”)果胶或高酯果胶，酯化度低于50％的果胶被称为低甲酯(“LM”)果胶或低酯果胶。在水果和蔬菜中发现的大多数果胶是HM果胶。在本文公开的方法的一些实施方案中，多糖试剂是HM果胶或改性HM果胶。

如本文所使用，术语“改性果胶”是指已经通过例如化学、物理或生物学(包括酶促)手段或其一些组合进行结构改性的任何天然存在的果胶。对果胶结构的这样的改性的非限制性实例包括糖部分的脱酯化、水解、氧化和/或还原，糖部分的官能化，构象变化以及分子量、键和聚集状态的变化。在一些实施方案中，结构改性包括脱酯化和水解。在其他实施方案中，结构改性包括分子量和/或聚合度的降低。

改性果胶可以通过本领域已知的化学方法来制备，包括破坏或改变果胶结构的化学键，例如共价键或离子键的任何化学反应或过程。举例来说，可以通过催化、水解、氨解、取代、消除、还原、氧化和自由基反应破坏或形成化学键。在一些实施方案中，改性果胶通过包括水解的方法制备，该水解优选例如通过酸或碱催化。

在一些实施方案中，改性果胶是酰胺化果胶。酰胺化果胶可以通过本领域已知的方法制备。例如，可将包含酯基的果胶，例如未改性果胶，与合适的胺的溶液接触，从而将未改性果胶的酯基转化为酰胺，例如，如方案1所示。

供选择地，可以在合适的偶联剂的存在下，将未改性果胶或其中所有或一些酯基已被水解的果胶与伯胺或仲胺或胺的混合物反应以形成酰胺化果胶，如方案2所述。

任何合适的偶联方法和试剂可用于制备本文公开的酰胺化果胶。合适的偶联剂的非限制性实例包括碳二亚胺偶联剂，例如DCC和EDCI，以及鏻和亚铵类试剂，例如BOP、PyBOP、PyBrOP、TBTU、HBTU、HATU、COMU和TFFH。

在一些实施方案中，本文公开的多糖试剂可通过高碘酸盐处理的多糖，例如果胶的还原胺化而获得。这样的多糖的还原胺化方法是本领域已知的。

可以通过本文所述的任何方法获得改性果胶，例如酰胺化果胶。用于合成改性果胶的特别有用的起始原料包括水果果胶，例如苹果和柑橘果胶。在一些实施方案中，前体(未改性)果胶具有约5kDa至约1,100kDa、约10kDa至约500kDa、约10kDa至约300kDa、约20kDa至约200kDa或约20kDa至约100kDa的相对分子量。在一些实施方案中，多糖试剂具有约120kDa至约300kDa、约150kDa至约300kDa或约120kDa至约175kDa的相对分子量。在一些实施方案中，酰胺化果胶的相对分子量可以通过尺寸排阻色谱法，使用分子量标准物(例如Pululan系列标准物)作为参考来确定。

在一些实施方案中，改性果胶是表2的化合物。

在一些实施方案中，酰胺化果胶是用氨酰胺化的果胶。在一些实施方案中，酰胺化果胶是用氨基乙醇酰胺化的果胶。在其他实施方案中，酰胺化果胶是用乙二胺酰胺化的果胶。在其他实施方案中，酰胺化果胶是用二亚乙基三胺酰胺化的果胶。在一些实施方案中，酰胺化果胶包含一个或多个由式(II)或式(III)表示的单元。在一些实施方案中，酰胺化果胶是通过下表1中列出的程序A-L中任一个获得的果胶。

在一些实施方案中，改性果胶是例如根据本领域已知的方法通过高碘酸盐氧化的果胶的还原胺化而改性的果胶。因此，一方面，本文提供了从样品中分离核酸的方法，所述方法包括使包含核酸的样品与包含改性多糖的水性组合物接触，并在固体载体上浓缩所述核酸，从而分离所述核酸，其中所述改性多糖是通过高碘酸盐氧化的果胶的还原胺化改性的果胶。在一些实施方案中，通过使高碘酸盐氧化的果胶与多胺(例如精胺或亚精胺)和硼氢化物接触来进行还原胺化。

在一些实施方案中，本文公开的酰胺化果胶包含一个或多个具有至少一个氨基的单体单元。在一些实施方案中，酰胺化果胶包含一个或多个由式IV表示的单体单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中：

n为0、1、2或3；

R⁴为H或C₁-C₃烷基；

X在每次出现时独立地为C₂-C₄亚烷基或C₄-C₆杂亚烷基；

Y为C₂-C₃亚烷基或C₄-C₆杂亚烷基；和

R⁵和R⁶独立地为H或C₁-C₃烷基。

在一些实施方案中，本文公开的酰胺化果胶包含一个或多个由式V表示的单体单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中：

n为0、1、2或3；

m在每次出现时独立地为2、3或4；

p为2、3或4；

R⁴为H或C₁-C₃烷基；和

R⁵和R⁶独立地为H或C₁-C₃烷基。

在本文公开的方法的一些实施方案中，酰胺化果胶或改性果胶包含一个或多个包含伯氨基的单体单元。在一些实施方案中，酰胺化果胶用多胺酰胺化。如本文所使用，多胺是包含多个氨基，例如伯、仲和叔氨基及其组合的化合物。适用于本文公开的果胶改性的多胺包括合成多胺和天然存在的多胺(例如亚精胺、精胺和腐胺)二者。在一些实施方案中，多胺选自精胺、亚精胺、尸胺、乙二胺和腐胺。在一些实施方案中，多胺是精胺或亚精胺。

在一些实施方案中，酰胺化果胶包含一个或多个由多糖表示的单元，所述多糖包含一个或多个由式VI、式VII或式VIII表示的单元，其异构体、盐、互变异构体或其组合：

在一些实施方案中，酰胺化果胶包含多个由式I-VII的结构表示的单体单元。如本文所使用，术语“多个”是指多于一个。例如，多个单体单元是指至少两个单体单元、至少三个单体单元或至少单体单元等。如果本发明的实施方案包括多于一个单体单元，它们也可以被称为第一单体单元、第二单体单元、第三单体单元等。

在一些实施方案中，多糖试剂是水溶性多糖，例如，水溶性改性或酰胺化果胶。在一些实施方案中，将多糖溶解在组合物中。在一些实施方案中，将多糖试剂分散在组合物中，例如，组合物包含多糖试剂的悬浮液。在一些实施方案中，组合物包含多糖试剂例如改性果胶或酰胺化果胶的溶液。在一些实施方案中，组合物包含多糖试剂的悬浮液。在一些实施方案中，将多糖试剂溶解或悬浮在水溶液中。

为了促进从包含核酸的样品中分离核酸，将本文所述的多糖试剂添加到样品中以使多糖试剂的最终浓度达到约0.1μg/mL至约1000μg/mL、约0.1μg/mL至约500μg/mL、约0.1μg/mL至约200μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL或约1μg至约20μg。在一些实施方案中，以储备液或悬浮液的形式提供多糖试剂，当其被添加到包含核酸的样品中时，其提供的多糖试剂的最终浓度为约0.1μg/mL至约1000μg/mL、约0.1μg/mL至约500μg/mL、约0.1μg/mL至约200μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL或约1μg至约20μg。在其他实施方案中，将多糖试剂溶解或悬浮在裂解缓冲液中，然后将其添加到包含核酸的样品中以促进核酸的裂解和分离。

其他组分

在本文公开的方法中，除多糖试剂之外，水性组合物还可以包含许多其他试剂，例如缓冲剂、螯合剂、盐、消泡剂、洗涤剂、离液剂、沉淀溶剂、裂解剂和/或有机添加剂。在本文公开的方法中，可以使用本文所述的其他试剂的任何合适的组合。例如，在一些实施方案中，包含多糖试剂的水性组合物可以包含一种或多种缓冲剂、螯合剂、盐、消泡剂、洗涤剂、离液剂、沉淀溶剂、裂解剂、有机添加剂或其组合。

A.缓冲剂

在一些实施方案中，本文公开的组合物包含一种或多种缓冲剂，其在约pH 3.5至约pH 9、约pH 5至约pH 8.5、约pH 6至约pH 8.5的pH范围内缓冲溶液。在一些实施方案中，缓冲剂在约pH 6.6至约7.5、约pH 6.7至7.4、约pH 6.8至约pH 7.3或约6.9至约7.5的pH下缓冲溶液。在一些实施方案中，pH缓冲在约pH 7.05。在一些实施方案中，缓冲剂的浓度为约10mM至最多约100mM或约20mM至最多约50mM或为约50mM。任何合适的缓冲剂，例如通常用于核酸分离的缓冲剂都可以包含在本文公开的组合物中，包括但不限于柠檬酸盐缓冲液、Tris、磷酸盐、PBS、TAPS、N,N-二羟乙基甘氨酸(Bicine)、三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、TAPSO、HEPES、TES、MOPS、PIPES、卡可基酸盐、SSC和MES。

在一些实施方案中，组合物包含HEPES或Tris。通常，缓冲剂以约100mM、约75mM、约50mM、约40mM或约25mM存在。上述各种缓冲剂意图是说明性的；根据本文描述的方法，适用于核酸分离和分析的许多其他缓冲液是本领域技术人员可获得的。

B.螯合剂

在一些实施方案中，本文所述的组合物包含一种或多种螯合剂。螯合剂是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于N-乙酰基-L-半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)和膦酸酯螯合剂(例如，包括但不限于次氮基三(亚甲基)膦酸(NTMP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMP)，二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、1-羟基亚乙基-1,1-二膦酸(HEDP)等)。在一些实施方案中，螯合剂包含EDTA或DTAP。在一些实施方案中，螯合剂包含EDTA。在一些实施方案中，当存在时，螯合剂以约5mM至约200mM或约10mM至约100mM的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，螯合剂以约10mM、约20mM、约30mM、约40mM约60mM、约70mM、约80mM、约90mM或约100mM的浓度存在。在一些实施方案中，螯合剂以约50mM的浓度存在。在一些实施方案中，螯合剂的浓度为约1mM至最多约140mM、约5mM至最多约100mM或约10mM至约50mM。

C.洗涤剂或表面活性剂

在一些实施方案中，本文所述的组合物包含一种或多种合适的洗涤剂。在一些实施方案中，洗涤剂包括离子洗涤剂或非离子洗涤剂。合适的洗涤剂的实例包括苄索氯铵、CHAPS、CHAPSO、1-庚烷磺酸钠盐、1-十二烷磺酸钠盐、正月桂酰肌氨酸钠盐、聚山梨酯例如

80和

20、Brij 58、磺基甜菜碱SB 12、磺基甜菜碱SB 14、溴化十六烷基三甲基铵、氯化十六烷基吡啶、

F-68、SDS、皂苷、

X-100和

X-114。优选地，洗涤剂包含聚山梨酯20，例如

20。在一些实施方案中，洗涤剂以约5mM至最多约200mM、约10mM至最多约100mM、约20mM至最多约50mM或约30mM至最多约40mM的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，洗涤剂的浓度为约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约40mM、约50mM、约75mM、约100mM、约150mM或约200mM。在一些实施方案中，洗涤剂以约35mM的浓度存在。在一些实施方案中，洗涤剂以约0.5％(V/V)至最多约30％(V/V)或约1％(V/V)至最多约20％(V/V)或约5％至最多约15％(V/V)的百分比存在。在一些实施方案中，洗涤剂按重量计占所述溶液的约0.1％至约2％，或占所述溶液的约0.5％至约1.5％，或占多糖试剂溶液的约1％。

D.裂解剂

在一些实施方案中，在分离核酸之前，通过使样品与裂解缓冲液接触来裂解样品。如本文所使用，“裂解缓冲液”是指用于破坏开放细胞的缓冲溶液。在一些实施方案中，裂解缓冲液包含一种或多种本文公开的多糖试剂。在一些实施方案中，本文所述的多糖试剂溶解或悬浮在裂解溶液中。在一些实施方案中，裂解溶液包含一种或多种裂解剂，例如蛋白酶。合适的蛋白酶包括但不限于丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶及其组合。说明性的合适蛋白酶包括但不限于蛋白酶k(广谱丝氨酸蛋白酶)、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等。在一些实施方案中，蛋白酶的量为约0.1mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约5mg/mL、约4mg/mL、约3mg/mL、约2mg/mL或约1mg/mL。其他合适的蛋白酶是本领域技术人员已知的。

E.离液剂

在本发明方法的一些实施方案中，组合物还包含合适的离液剂。离液剂的实例包括钡盐、碱金属高氯酸盐、盐酸胍和硫氰酸胍。根据其溶解度，离液剂通常以约1M至约8M的浓度范围使用。在一些实施方案中，硫氰酸胍用于本文所述的溶液和方法中。

F.有机添加剂

在一些实施方案中，通过沉淀到、结合到或固定到固体基质上来分离核酸。在一些实施方案中，这样的沉淀、结合和/或固定可以在有机添加剂的存在下容易地实现。在一些实施方案中，有机添加剂是可与水混溶的有机溶剂。多种这样的溶剂是本领域已知的。示例性的溶剂包括醇，例如低级醇(例如，C1-C6醇)。在一些实施方案中，组合物可以包含乙醇或异丙醇。在一些实施方案中，醇是乙醇。供选择地，在一些实施方案中，可以使用聚环氧乙烷或低聚环氧乙烷。

适用于本文公开的方法的有机添加剂的其他实例包括例如选自以下的试剂：C3和C4烷基二醇，以及短链乙二醇衍生物和各种水溶性聚合物化合物。这些有机添加剂可以在基本不含乙醇的情况下使用。示例性有机添加剂包括1,2-丁二醇、1,2-丙二醇、1,3-丁二醇、1-甲氧基-2-丙醇乙酸酯、3-甲基-1,3,5-戊三醇、DBE-2二元酸酯、DBE-3二元酸酯、DBE-4二元酸酯、DBE-5二元酸酯、DBE-6己二酸二甲酯、二乙二醇单乙醚(DGME)、二乙二醇单乙醚乙酸酯(DGMEA)、乳酸乙酯、乙二醇、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、四乙二醇(TEG)、四乙二醇(四氢糠基聚乙二醇醚)、四氢糠基-聚乙二醇200、三(乙二醇)-二乙烯基醚、二丙二醇单甲醚(DPGME)、二丙二醇、三乙二醇和三乙二醇单乙醚。

核酸分离方法

在一些实施方案中，本文所述的组合物用于通过沉淀到固相或载体上来分离核酸。在一些实施方案中，固相或载体包括玻璃、二氧化硅、纤维素或其组合。固相或载体包括容器的壁、纤维(例如玻璃纤维)、膜(例如纤维素膜)、珠(例如磁珠、玻璃珠、纤维素珠、微粒或纳米颗粒等)等。在一些实施方案中，固相是填充到柱中的珠。任何合适的固体载体材料都可以与本文所述的方法一起使用，例如，包含选自二氧化硅、玻璃、纤维素、烯基主链聚合物、聚碳酸酯、沸石和二氧化钛的材料的固体载体。

在一些实施方案中，核酸的分离或浓缩可以通过离心或通过过滤通过多孔材料来进行，所述多孔材料例如确定孔径的材料。在这些情况下，本领域技术人员将能够通过选择合适孔隙率的固体载体来优化核酸的回收率。

在一些实施方案中，将多糖试剂添加到大体积(例如，约5mL或更大或约10mL或更大)的样品中有助于从这样的样品中分离核酸，例如通过将核酸浓缩到磁珠上。这对于从稀释的样品中预浓缩核酸非常有用，所述样品太大而无法在微流体核酸检测装置中直接处理。

在一些实施方案中，多糖试剂的添加允许该方法的所有步骤在室温下进行。在一些实施方案中，所述方法适用于在环境温度例如15℃至35℃的温度下分离核酸。在一些实施方案中，使用本文公开的方法分离核酸可以在自动化药筒中进行，所述药筒例如

(Cepheid,Sunnyvale,CA,U.S.A)药筒。

核酸

如本文所使用，术语“核酸”是指任何合成的或天然存在的核酸，例如DNA或RNA，其具有任何可能的构型，即，双链核酸的形式、单链核酸的形式或其任何组合。核酸包括DNA，例如基因组DNA，和RNA，例如总RNA。核酸还包括单链或双链核酸，例如短双链DNA片段。在一些实施方案中，可以通过本文公开的方法分离合成的核酸。在一些实施方案中，核酸是在人血浆或血液中发现的循环核酸。

在一些实施方案中，本文描述的方法用于从包含核酸的溶液中沉淀核酸。包含核酸的溶液可以通过裂解包含核酸的细胞或材料获得。合适的包含核酸的材料包括血液，组织活检，包括样品，例如石蜡包埋的组织，涂布标本，脊髓液，细菌培养物，病毒培养物，尿液，精液，细胞悬液和贴壁细胞，PCR反应混合物和体外核酸修饰反应混合物。包含核酸的材料可以包括人、动物、细菌、真菌、病毒或植物材料。在其他实施方案中，可以从核酸修饰反应或核酸合成反应获得包含核酸的溶液。

核酸检测方法

使用本文所述的方法和试剂分离的核酸具有合适的质量，可以被扩增以检测和/或定量样品中的一个或多个靶核酸序列，而无需去除多糖试剂。本文描述的核酸沉淀方法和试剂也可适用于旨在发现与疾病的诊断和预后有关的基因表达谱的基础研究。该方法还适用于疾病的诊断和/或预后、特定治疗方案的确定和/或治疗效果的监测。

本文所述的方法简化了从生物样品中分离核酸，并有效地制备了非常适合用于PCR、RT-PCR和测序系统的分离的核酸。本发明的方法与已知的核酸分析和检测方法兼容。在一些实施方案中，可以通过任何合适的已知核酸检测方法来检测使用本文所述的方法从包含核酸的样品中分离的核酸。尽管在一些实施方案中，分离的核酸用于扩增反应，但是也考虑其他用途。因此，例如，分离的核酸(或其(多种)扩增产物)可以用于各种杂交方案中，包括但不限于基于核酸的微阵列，以及还可以用于下一代测序(NGS)平台中。

因此，一方面，本文公开了一种用于检测样品中的核酸的方法，包括：(a)使样品与本文公开的包含多糖试剂的水性组合物接触；(b)浓缩所述核酸；和(c)检测所述核酸。在一些实施方案中，通过在固体载体上沉淀来浓缩核酸。

在一些实施方案中，检测方法包括核酸扩增。合适的非限制性示例性扩增方法包括聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶PCR、实时PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR(Q-PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、滚环扩增(RCA)和链置换扩增(SDA)。

在一些实施方案中，扩增方法包括在约90℃至约100℃下初始变性约1至约10分钟，接着是包括以下的循环：在约90℃至约100℃下变性约1至约30秒，在约55℃至约75℃下退火约1至约30秒，并在约55℃至约75℃下延伸约5至约60秒。在一些实施方案中，对于初始变性之后的第一循环，省略了循环变性步骤。具体时间和温度将取决于被扩增的具体核酸序列，并且可以由本领域普通技术人员容易地确定。

在一些实施方案中，核酸的分离和检测在自动化样品处理和/或分析平台中进行。在一些实施方案中，利用可商购的自动化分析平台。例如，在一些实施方案中，利用GeneXpert系统(Cepheid,Sunnyvale,Calif.)。然而，本发明不限于特定的检测方法或分析平台。本领域技术人员认识到可以使用任何数量的平台和方法。

GeneXpert使用独立的一次性药筒。样品提取、扩增和核酸的检测都可以在这个独立的“药筒式实验室”中进行。参见例如第6,374,684号美国专利，其通过引用整体并入本文。药筒的组件包括但不限于包含试剂的处理室、过滤器和用于提取、纯化和扩增靶核酸的捕获技术。阀使流体能够从一个腔室转移到另一个腔室，并包含核酸裂解和过滤组件。光学窗口可以实现实时光学检测。反应管可以实现非常快速的热循环。在一些实施方案中，GenXpert系统包括用于扩展的多个模块。每个模块都包括多个药筒，以及样品处理和分析组件。

在将样品添加到药筒之后，可以使样品与裂解缓冲液接触以释放核酸，并且通过以下来分离释放的核酸：使裂解的样品与包含水溶性多糖的水溶液接触，所述多糖包含一个或多个糖醛酸单元；随后将核酸沉淀到固体基质如二氧化硅或玻璃基质上。在一些实施方案中，将包含一个或多个糖醛酸单元的水溶性多糖溶解在裂解缓冲液中。沉淀后，然后除去上清液，并用洗脱缓冲液例如Tris/EDTA缓冲液从基质上洗脱核酸。然后可以在药筒中处理洗脱液以检测目标靶基因。在一些实施方案中，洗脱液用于重构至少一些以冻干颗粒的形式存在于药筒中的PCR试剂。在一些实施方案中，PCR使用具有热启动功能的Taq聚合酶，例如AptaTaq(Roche Inc.,Basel，瑞士)。

在一些实施方案中，本文描述的方法用于根据本文描述的任何方法从固定的石蜡包埋的生物组织样品中分离核酸(例如，DNA、RNA)；使用一对能够扩增靶核酸区域的寡核苷酸引物使沉淀的核酸扩增，以获得扩增样品；并确定靶核酸的存在和/或量。在一些实施方案中，靶核酸是DNA(例如基因)。在一些实施方案中，靶核酸是RNA(例如，mRNA、非编码RNA等)。在一些实施方案中，使用本文描述的方法分离的核酸非常适合用于诊断方法、预后方法、监测治疗(例如癌症治疗)的方法等。因此，在一些说明性的非限制性实施方案中，从固定的石蜡包埋的样品(例如，从FFPET样品)提取的核酸可以用于确定基因的存在和/或表达水平，和/或基因的突变状态。这样的方法特别适合于确定一种或多种癌症标志物的存在和/或表达水平和/或突变状态。因此，在一些实施方案中，使用本文描述的方法分离的核酸用于检测一种或多种癌症标志物的存在和/或拷贝数和/或表达水平和/或突变状态。

核酸的洗脱

本文公开的检测和分离方法可以任选地包括洗涤步骤，即，可以任选地例如在固体载体上洗涤沉淀的核酸以去除裂解缓冲液的组分。通常，在检测之前溶解浓缩的例如沉淀的核酸。在一些实施方案中，将浓缩的核酸溶解在与PCR反应相容的缓冲液中。

在一些实施方案中，例如，当使用多胺改性的多糖沉淀核酸时，可以通过与合适的洗脱剂接触而从多胺洗脱沉淀的核酸。在一些实施方案中，洗脱剂包括氨或碱金属氢氧化物。在一些实施方案中，洗脱剂具有碱性pH。在一些实施方案中，洗脱剂具有约9至约12、约9.5至约12、约10至约12或约9至约11的pH。优选地，洗脱剂的pH在10以上。优选地，洗脱剂包含其浓度足以破坏核酸与多糖试剂的结合的氢氧化铵、NaOH或KOH。示例性洗脱剂包含1％氨、15mM KOH或15mM NaOH。

在一些实施方案中，洗脱剂包含聚阴离子。在一些实施方案中，聚阴离子是包含多个阴离子基团的聚合物。在一些实施方案中，阴离子基团是磷酸根、膦酸根、硫酸根或磺酸根基团或其组合。在一些实施方案中，聚阴离子是在约7以上的pH下带负电荷的聚合物。合成的聚阴离子和天然存在的聚阴离子二者都可以用于本文公开的方法中。在一些实施方案中，聚阴离子是角叉菜胶。在一些实施方案中，聚阴离子是载体核酸。如本文所使用的载体核酸是不干扰随后例如通过PCR检测浓缩核酸的核酸。示例性的载体核酸包括聚rA、聚dA、鲱鱼精DNA、鲑鱼精DNA等。在一些实施方案中，洗脱剂包含角叉菜胶和碱金属氢氧化物，例如NaOH或KOH。在一些实施方案中，洗脱剂包含i-角叉菜胶和KOH。

尽管本发明的每个要素在本文中被描述为包含多个实施方案，但是应该理解的是，除非另外指出，否则本发明给定要素的每个实施方案都能够与本发明的其他要素的每个实施方案一起使用，并且每种这样的使用均旨在形成本发明的不同实施方案。

本文引用的参考专利、专利申请和科学文献通过引用整体并入本文，就如同每个单独的出版物、专利或专利申请均被明确地和单独地指出通过引用并入。本文所引用的任何参考文献与本说明书的具体教导之间的任何冲突均应以后者为准。同样地，在技术上理解的词语或短语的定义与本说明书中具体教导的词语或短语的定义之间的任何冲突都应以后者为准。

从以上公开内容可以理解，本发明具有各种各样的应用。通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例仅是说明性的，并不以任何方式限制本发明的定义和范围。

实施例

除非另有说明，否则所有试剂均来自商业来源。

实施例1：多糖试剂的制备和表征

根据如下所述并总结于表1中的以下方法之一，由市售材料完成胺改性的酸性多糖的合成，其中EDA是指乙二胺，DETA是指二亚乙基三胺，DMPDA是指1,3-二甲基二丙烯二胺，AETMA是指(2-氨基乙基)三甲基氯化铵盐酸盐，并且TAEA是指三(2-氨基乙基)胺。

制备酰胺化多糖的通用程序(方法A-G)

将起始多糖(1g)分批添加到50mL的水(方法B、D-G)或胺溶液(方法A和C)中，并搅拌30分钟或搅拌直至观察不到可见的固体。如果适用，向该混合物中加入合适的偶联剂(方法D-F)，并且搅拌混合物直至其变均匀。将所得混合物用适量的胺处理(方法B、D-G)，并将该混合物在中速下进一步磁力搅拌表1中规定的时间。反应完成后，将水性反应混合物(方法A、B和D-G)稀释到300mL 1:1丙酮/甲醇中，将浆液搅拌15分钟，然后过滤。过滤的凝胶状物质用甲醇(50mL)冲洗四次。将甲醇反应混合物(方法C)直接过滤，无需稀释到甲醇中。沉淀的改性多糖在真空烘箱中在45℃下干燥过夜。如果适用，将干燥的果胶颗粒用研钵和研杵研磨，得到细粉。

多糖氧化的通用程序(方法H)

将多糖(1g)悬浮在含有TEMPO(30mg)的水(50mL)中，并将悬浮液在冰上冷却。向该混合物中缓慢加入18mL次氯酸钠溶液(10-15％的有效氯)，在次氯酸盐处理过程中使用玻璃电极监测pH值，并通过添加1MNaOH将其保持在10.8附近。当pH稳定时，通过加入250mL乙醇将反应淬灭。通过过滤收集得到的沉淀物，并用60/30/10的异丙醇-水-浓HCl溶液(3×50mL)冲洗，然后用甲醇(3×50mL)冲洗。剩余的固体真空干燥。

从芦荟植物中提取果胶(方法I)

向95g新鲜收集的芦荟叶切片中加入65mL乙醇，并将混合物加热至90℃持续15分钟。然后加入200mL浓氨水，并在搅拌下将混合物加热至90℃持续30分钟。通过玻璃过滤器过滤混合物，并使滤液通过DEAE-纤维素柱。用1M NaH₂PO₄洗脱产物。将产物洗脱液用分子生物学级的水彻底透析(～1kDa膜)，冷冻并冻干。将得到的固体重悬在氨水中。

使用预水解步骤通过EDC/NHS偶联对果胶进行改性的通用程序(方法K-L)

将起始多糖(0.5g)分批添加到50mL水中，并搅拌60分钟或搅拌直至观察不到可见的固体。加入1M氢氧化钠溶液直至pH为12-13，并搅拌20分钟以将任何残留的酯水解为羧酸。在充分搅拌下用1M HCl将溶液小心酸化至pH 4.5-5.5。然后加入EDC.HCl(0.5g)和NHS(0.15g)在5mL水中的溶液，并将混合物在环境温度下搅拌1小时。随后，将相应量的胺以在最少量的去离子水中的溶液形式加入，并将混合物在室温下搅拌22小时。反应完成后，将水性反应混合物稀释至300mL的1:1丙酮/甲醇中，搅拌浆液15分钟，然后过滤。过滤的凝胶状物质用甲醇(50mL)冲洗四次。沉淀的改性多糖在真空烘箱中在45℃下干燥过夜。将干燥的沉淀物用研钵和研杵研磨，得到细粉。为了从产物中除去非共价结合的胺，将产物细粉如下所述进行酸洗。

向粉末状果胶产物中加入100mL酸性洗涤溶液(异丙醇(550mL)、去离子水(345mL)、浓盐酸(105mL))，并将混合物磁力搅拌30分钟。然后将浆液在烧结的玻璃过滤器上过滤，用酸性洗涤溶液(3x25 mL)冲洗，然后用中性洗涤溶液(异丙醇(590mL)和去离子水(345mL)；3x25mL)冲洗。将所得粉末在真空烘箱中在50℃下干燥过夜。

表1.用于制备多糖试剂的合成方法的总结

通过NHS偶连合成示例性多糖试剂(精胺改性的果胶)

将苹果果胶(10.0g)添加到1L的Milli-Q过滤水中，并搅拌1小时。加入5M NaOH(10mL)，再搅拌20分钟，然后加入1N HCl(30mL)(pH＝4.2)。将N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，10.08g，52.59mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，3.026g，52.59mmol)添加到该溶液，并在室温下搅拌1h。加入精胺(80mL，368mmol)，并将溶液在室温下搅拌22h。然后将溶液倒入快速搅拌的MeOH(2L)中并搅拌20分钟。通过经由中空的烧结玻璃漏斗过滤溶液来收集固体，然后用MeOH洗涤两次。固体在50℃下真空干燥40小时。使用电动咖啡研磨机将固体研磨成细粉，并将其悬浮在500mL的酸洗液(55％的异丙醇、34.5％的水和10.5％的浓盐酸)中，并搅拌4.5小时。滤出溶液，并将固体再用酸洗液洗涤两次，然后在50℃下真空干燥过夜。将固体悬浮在750mL去离子水中，并使用50mL离心管以4200rpm离心10分钟。收集上清液并合并。合并沉淀并悬浮在350mL去离子水中，并使用50mL离心管在4200rpm下离心17小时。将上清液与第一上清液合并。所有合并的上清液均通过2微米过滤器过滤。通过冻干干燥过滤的溶液，得到7.78g的精胺-果胶缀合物。C₁₆H₃₂N₄O₅(半乳糖醛酸单体加精胺)的分析计算值：C,53.3；H,8.95；N,15.5。实测值：N,7.21。

通过氧化裂解果胶，然后用精胺还原胺化合成示例性多糖试剂(精胺改性的果胶)

在该实施例中，提供了用各种多胺通过氧化然后还原胺化改性多糖聚合物的通用程序。

(A)氧化。在磁力搅拌下，将苹果果胶(2.5g)分批添加到250mL去离子水中，直至全部溶解。在搅拌下向其中分批加入高碘酸钾2.43g，并搅拌18小时。然后在三天内将反应混合物通过8kd MWCO透析管用水进行透析。随后将所得的脱盐聚合物冻干，得到氧化果胶，为松脆的灰白色固体。可以通过羟胺滴定容易地测量醛的浓度(如Zhao,H.；Heindel,N.D.J.Pharm.Res.8(3),400-402所述)。醛含量测定为4.9mmol/g(每个聚合物单元约1当量醛)。

(B)还原胺化。将来自步骤A的氧化果胶(1.0g)悬浮在100mL去离子水中，添加精胺(1.32g，1.25当量)，并在室温下搅拌18小时。向反应物中加入1g硼氢化钠沉淀，并搅拌18小时。然后在三天内将反应混合物通过8kd MWCO透析管用水进行透析，随后冻干，得到200mg化合物2，为灰白色蓬松固体。

改性多糖的表征

尺寸排阻色谱法、元素分析和/或IR光谱法用于表征通过方法A-L获得的多糖。

使用Perkin Elmer 2400CHN分析仪进行元素分析。通过将精细研磨的化合物粉末放置在配备有通用ATR采样配件的Perkin Elmer Frontier仪器的IR探测器晶体上来记录IR光谱。示例性改性多糖(化合物29)及其未改性前体的代表性IR光谱如图1所示。

表2总结了改性多糖的表征。在表2中，“A+”表示改性剂胺的相应的铵盐，“N/O”表示未观察到IR酰胺频率。这可能是由于与其他峰重叠造成的。

表2.改性多糖的化学表征

通过高效尺寸排阻色谱测定分子量

高效尺寸排阻色谱-蒸发光散射检测(HPSEC-ELSD)用于测定多糖试剂的相对分子量(RMw)。色谱法在安捷伦HPLC系统上进行，使用普鲁兰多糖系列(Sigma Aldrich)作为分子量校准标准品：

1.3kDa：53168BCBS8194V；

12kDa：97873 8224V；

50kDa：43807 BCBT5326；

110kDa：47053 R4555V；

400kDa：18579 BCBT5321；和

800kDa：18789 BCBS8188。

普鲁兰多糖系列是水相尺寸排阻色谱的本领域已知的校准标准品。普鲁兰多糖是具有通过α-1,6连接键合的麦芽三糖单元的线性多糖。普鲁兰多糖标准品通常用作多糖的尺寸排阻色谱的分子量标准。

使用Agilent HPLC尺寸排阻色谱柱(Agilent PL aquagel MIXED–H色谱柱，8μm300x 7.5mm)。通过涡旋振荡1分钟制备在0.05％NaN3溶液中2mg/mL的标准品溶液和样品溶液，然后在室温下静置直至溶解。在进行HPLC分析之前，将所得溶液用0.45um尼龙注射器式过滤器过滤。使用流速为1mL/min的10mM碳酸氢铵(pH 7)流动相，在优化的ELSD条件下(70℃的雾化器、80℃的蒸发器和1.0SLM的气流)，在30分钟内洗脱标准品和分析物样品。与标准品峰的典型积分不同，样品峰由于峰的宽度而用称为“面积和片段(area sum slice)”的积分事件积分。

示例性结果：

多糖试剂	相对分子量
		化合物29	160-270kDa
化合物32	120-160kDa

实施例2：通过离心回收RNA和DNA

该实验表明，多糖试剂可以通过使用离心沉淀来促进DNA和RNA的纯化。与常用的乙醇沉淀程序(Sambrook J,Russell D(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版.Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press)相比，本发明的方法显著缩短了核酸(NA)沉淀程序并允许其在室温下进行，这有利地使样品处理适用于自动化NA分析，例如基于药筒的NA分析。

将核酸(基因组DNA，Promega，Madison，WI目录号G3041，202ng/uL)和RNA对照(Life Technologies，Carlsbad，CA目录号4307281，50ng/uL)以5x期望最终浓度溶解在1xTE缓冲液中(例如5μg/mL最终为1μg/mL)。将多糖试剂以可变的浓度溶解在适当的缓冲液(如美国专利申请20160257998中所述制备的CT/NG缓冲液，和如美国专利申请20170137871中所述制备的病毒和FFPE结合缓冲液)中，以在每种测试样品中提供1、5和20μg的试剂。不添加多糖试剂的缓冲液用作阴性对照，使用0.3M乙酸钠和70％EtOH(使用Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第3版)第1-3卷,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor Press,N.Y.的程序)用作100％沉淀对照。

向在标准Eppendorf管中的100uL核酸样品溶液中添加200uL多糖试剂溶液和200uL EtOH。将样品涡旋5秒以混合，然后以12,000g离心25分钟以使沉淀的DNA沉淀。小心倒出上清液以避免破坏沉淀。用冷却的70％EtOH溶液洗涤沉淀，并在12,000g下离心10分钟，倾析出上清液，并将沉淀在SpeedVac中在稍高的温度(35℃)下干燥。将500uL TE缓冲液添加到每个管中，并通过以最大速度涡旋30秒重悬沉淀。使用定量荧光Picogreen DNA染料(Thermo)或定量荧光Ribogreen RNA染料(Thermo)定量核酸。通过将测试样品与100％对照进行比较，计算出核酸的回收率百分比。结果总结在表3中。

表3.在示例性多糖试剂的存在下通过离心回收核酸

实施例3：通过在过滤装置上沉淀回收RNA和DNA

该实验证明，多糖试剂可通过在过滤装置如膜或玻璃过滤器上沉淀来促进DNA和RNA的纯化。

将核酸(基因组DNA，Promega，Madison，WI目录号G3041，202ng/uL)和RNA对照(Life Technologies，Carlsbad，CA目录号4307281，50ng/uL)以5x期望最终浓度溶解在1xTE缓冲液中(例如5μg/mL最终为1μg/mL)。将多糖试剂以可变的浓度溶解在适当的缓冲液(如实施例2中所述的CT/NG、病毒和FFPE结合缓冲液)中，以在每种测试样品中提供1、5和20μg的试剂。不添加试剂的缓冲液用作阴性对照，使用0.3M乙酸钠和70％EtOH(使用Sambrook等人的程序)用作100％沉淀对照。

向在标准Eppendorf管中的100uL核酸样品溶液中添加200uL多糖试剂溶液和200uL EtOH。将样品涡旋5秒以混合。使用注射器式过滤器装置使所得裂解物通过0.8umPES过滤器。通过使空气通过过滤器除去过量的溶液。在42℃下，用1mL市售Tris洗脱缓冲液从过滤器中洗脱沉淀的物质25分钟。使用定量荧光Picogreen DNA染料或定量荧光Ribogreen RNA染料定量核酸。通过将测试样品与100％对照进行比较，计算出核酸的回收率百分比。结果总结在表4中。

表4.在示例性多糖试剂的存在下通过沉淀回收核酸

实施例4：各种核酸的分离

实施例4A.从人血浆中分离病毒和噬菌体核酸

模拟临床标本的制备

来自储集血液的血浆或Basematrix和灭活病毒被用作模拟临床标本。从EDTA保存的储集全血(Bioreclamation，Westbury，NY)或Basematrix(储集自多个个体，SeracareInc.，Milford，MA)制备的人血浆样品(1mL)用约1mg蛋白酶K(Roche Inc.，Basel，瑞士)处理。

在证明分离病毒或噬菌体核酸的实验中，在分离核酸之前，将已知效价的灭活的HIV病毒或MS2噬菌体(均获自Zeptometrix Inc.,Buffalo,NY)直接加入血浆或Basematrix中。将HIV以10-1000IU/mL的浓度输入血浆或Basematrix中。将MS2噬菌体以最高达1e6CFU/mL输入血浆或Basematrix中。

根据本文公开的方法，在多糖试剂的存在下从模拟的临床样品中分离核酸。在不添加多糖试剂的情况下处理对照样品。通过PCR或RT PCR扩增分离的核酸。ΔCt值计算为相应对照(在不添加多糖试剂的情况下处理的样品)和在添加多糖试剂的情况下处理的样品的Ct值之差。

通过PCR和RT-PCR分析检测分离的核酸

分离后，通过商业方法，例如使用商业试剂盒(例如，AmpliSens、Interlabservice，Russian)检测病毒核酸。本领域技术人员可以选择任何其他检测方法，并根据制造商的说明进行使用。

表5和6显示了测试各种多糖试剂从血浆中提取噬菌体RNA(表5)；和从血浆中提取病毒RNA(HIV)(表6)的结果。通过上述相应的PCR和RT-PCR分析测试在添加或不添加多糖试剂的情况下回收的核酸。ΔCt值表示在没有多糖试剂的情况下获得的Ct值减去在添加多糖试剂的情况下获得的Ct值之间的最小差。

表5

多糖试剂	ΔCt MS2 RNA
		化合物66	5.3
化合物67	10.2
		化合物68	8.7
化合物69	12.8
		化合物72	8.8
化合物73	9.8
		化合物74	8.2
化合物76	10.7

表6

实施例4B：从血浆或Basematrix中提取HBV病毒：

对于HBV DNA提取，每mL人Basematrix中添加约100拷贝的灭活病毒颗粒，然后用2mg/mL蛋白酶K(Roche Inc.，Basel，瑞士)处理，并在室温下孵育5分钟。然后将样品用一体积或两体积的裂解缓冲液裂解、涡旋，并分成含有不同浓度的示例性多糖试剂的等分试样。如美国专利申请20160257998中所述制备CT/NG裂解缓冲液，并如美国专利申请20170137871中所述制备病毒和FFPE裂解缓冲液。然后通过添加一体积或两体积的结合试剂沉淀DNA，涡旋并转移到V-E柱(Zymo Research，Irvine，CA)，并根据供应商的建议旋转。然后将柱用70％乙醇冲洗一次，并用HBV冲洗试剂冲洗两次，然后根据供应商的建议旋转，直到膜变干。冲洗试剂由KCl组成，还包括分子量约为200的聚乙二醇。理想地，洗液中使用的聚乙二醇的分子量范围可以为200至8000Da。本领域技术人员可以根据样品类型来优化结合试剂和/或冲洗组合物的选择。然后将过滤器转移到新的离心管中，并以最大速度旋转以完全干燥膜。然后将每个过滤器转移到新的收集管中。然后将过滤器与适当的低盐洗脱缓冲液在室温下孵育1至5分钟，然后在台式离心机中以最大速度旋转以收集纯化的核酸。

在PCR分析中，反应中使用了200nM浓度的以下寡核苷酸：

正向引物：GGCCATCAGCGCATGC(SEQ ID NO:1)

反向引物：CGGCTGCGAGCAAAACA(SEQ ID NO:2)

探针：用FAM染料(5')和BHQ淬灭剂(3')修饰的CCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTC(SEQ ID NO:3)

除非文中另有说明，否则PCR反应混合物以20uL体积进行。基于供应商描述的条件选择缓冲液组成或以本领域技术人员熟悉的方式进行调整。实时PCR在PCR Max Eco 48(Cole Parmer,Vernon Hills,IL)或BioRad CFX Maestro(BioRad,Hercules,CA)上进行。将反应混合物在95℃下孵育60秒，接着是在95℃下10秒和在60℃下50秒的50个循环。结果总结在下表7中。

表7：通过HBV的PCR反应检测分离的HBV

实施例4C：从血浆或Basematrix中提取HIV病毒

根据制造商的说明，使用Qiagen viral minElute(Qiagen，Hilden，德国)柱试剂盒按照制造商的说明提取灭活的HIV病毒。

在PCR分析中，使用了以下寡核苷酸(200nM)：

正向引物：AATCCCCAAAGTCAAGGAGT(SEQ ID NO:4)

反向引物：ACTGTACCCCCCAATCC(SEQ ID NO:5)

探针：用FAM染料(5')和BHQ淬灭剂(3')修饰的CATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGT(SEQ ID NO:6)

除非另有说明，否则PCR反应混合物以20uL体积进行。基于供应商描述的条件选择缓冲液组成或以本领域技术人员熟悉的方式进行调整。实时PCR在PCR Max Eco 48上进行。将反应混合物在88℃下孵育120秒，在60℃下孵育300秒，接着是在90℃下20秒、在70℃下30秒和在60℃下10秒的1个循环，然后是逐步降低循环的8个循环，其中在90℃下10秒，在69℃下通过8个循环每步降低1℃到62℃，持续30秒，在60℃下10秒，接着是在90℃下10秒和在60℃下40秒的40个循环。结果总结在下表8中。

表8：通过PCR检测分离的HIV

实施例4D：从细菌和人细胞中提取核酸：

在10X Tris EDTA缓冲液(TE)中以10X溶液的形式制备保存的沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟氏球菌(NG)和人细胞。然后将样品在1X TE缓冲液中稀释以制备1X样品，使得可以方便地提取样品中的核酸并使用实时PCR分析进行测量。然后用一体积或两体积的裂解缓冲液裂解细胞、涡旋，并在室温下孵育5分钟。如美国专利申请20160257998中所述制备CT/NG裂解缓冲液，并如美国专利申请20170137871中所述制备病毒和FFPE裂解缓冲液。然后将混合物分成含有不同浓度的CP试剂的样品，并在搅拌下在56℃下孵育5分钟。用一体积或两体积的指定结合试剂沉淀DNA、涡旋，转移到V-E柱(Zymo Research，Irvine，CA)中，并根据供应商的建议旋转。然后将柱用70％乙醇冲洗一次，并用冲洗试剂冲洗两次，然后根据供应商的建议旋转，直到膜变干。冲洗试剂如上所述。然后将过滤器转移到新的离心管中，并以最大速度旋转以完全干燥膜。然后将过滤器转移到新的收集管中，然后与适当的低盐洗脱缓冲液在室温下孵育1至5分钟，然后在台式离心机中以最大速度旋转以收集纯化的核酸。

在PCR分析中使用以下寡核苷酸(200nM)检测CT/NG/hgDNA：

CT正向引物：GAAACACCGCCCG(SEQ ID NO:7)

CT反向引物：TTTGACCGGTTAAAAAAAGAT(SEQ ID NO:8)

CT探针：用FAM染料(5')和BHQ淬灭剂(3')标记的CCGCCCTTCAACATCAGTGAA(SEQ IDNO:9)

NG正向引物：ACGCATGCTGATAGCGTCA(SEQ ID NO:10)

NG反向引物：TTGAGTTCTGCTTCCTCCTTG(SEQ ID NO:11)

NG探针：用FAM染料(5')和BHQ淬灭剂(3')标记的CCGGAGATCCTTGCGATCCTTGCACC(SEQ ID NO:12)

hgDNA正向引物：GCATTCCTGAAGCTGACAGCA(SEQ ID NO:13)

hgDNA反向引物：CTCCAGGCCAGAAAGAGAGAGTAG(SEQ ID NO:14)

hgDNA探针：用FAM染料(5')和BHQ淬灭剂(3')标记的CCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGC(SEQ ID NO:15)

除非文中另有说明，否则PCR反应混合物以20uL体积进行。基于供应商描述的条件选择缓冲液组成或以本领域技术人员熟悉的方式进行调整。实时PCR在PCR Max Eco 48或BioRad CFX Maestro上进行。将反应混合物在95℃下孵育120秒，接着是在95℃下10秒和在60℃下50秒的50个循环。结果总结在下表9-11中。

表9：检测CT的PCR反应的ΔCt

表10：检测NG的PCR反应的ΔCT

表11：通过PCR检测分离的hgDNA

实施例4E：使用柱(Zymo Research)从2mL血浆中提取片段化的MTB DNA：

将片段化的MTB DNA(fMTB DNA 200-400bp)添加到用0.1mL 2mg/mL蛋白酶K(Roche Inc.,Basel，瑞士)处理的2mL血浆样品(BioIVT)中，并在室温下孵育5分钟。然后将样品用3mL病毒裂解缓冲液裂解、涡旋，并加入0.005mL的2.5％的化合物33的溶液。如上所述制备CT/NG、病毒和FFPE裂解缓冲液。然后通过加入3mL乙醇沉淀DNA，涡旋，然后转移至Zymo Research V-E柱，并根据供应商的建议进行旋转。然后用1毫升70％乙醇冲洗柱一次，并用1毫升冲洗试剂冲洗两次，然后根据供应商的建议旋转至膜变干。冲洗试剂由KCl组成，还包括分子量约为200的聚乙二醇。然后将过滤器转移到新的离心管中，以最大速度旋转以完全干燥膜，然后转移到新的收集管中，在室温下与0.1mL适当的低盐洗脱缓冲液孵育1-5分钟，然后在台式离心机中以最大速度旋转以收集纯化的核酸。如Chakravorty等人mBio,2017第8卷第4期e00812-17对Xpert MTB/RIF Ultra分析所述进行PCR。

表12.分离的片段化MTB DNA的PCR检测

化合物	μL(1％溶液)	ΔCt
			30	3	5.7
30	6	无结果
			78	3	5.4
78	6	5.7
			PGA	3	3.3
PGA	6	4
			6	3	4.8
6	6	4.2
			3	3	无结果
3	6	5

实施例4F：使用Zymo Research柱从血浆或尿液样品中提取片段化的MTB DNA

将片段化的MTB DNA(fMTB DNA 200-400bp)添加到用0.25mL 2mg/mL蛋白酶K(Roche)处理的血浆或尿液样品(BioIVT)中，并在室温下孵育5分钟。然后将样品用7.5mL病毒裂解缓冲液裂解、涡旋，并加入0.005mL的2.5％的化合物33的溶液。如上所述制备CT/NG、病毒和FFPE裂解缓冲液。然后通过加入7.5mL乙醇沉淀DNA，涡旋，转移至Zymo Research V-E柱，并根据供应商的建议进行旋转。然后用1毫升70％乙醇冲洗柱一次，并用1毫升HBV冲洗试剂冲洗两次，并根据供应商的建议旋转至膜变干。冲洗试剂由KCl组成，还包括分子量约为200的聚乙二醇。然后将过滤器转移到新的离心管中，以最大速度旋转以完全干燥膜。然后将过滤器转移到新的收集管中，在室温下与0.1mL适当的低盐洗脱缓冲液孵育1-5分钟，然后在台式离心机中以最大速度旋转以收集纯化的核酸。通过将等量的fMTB DNA直接加入单独的RT-PCR反应物中来制备该实验的对照，以具有表示100％提取和回收效率的比较物。如Chakravorty等人mBio,2017第8卷第4期e00812-17对Xpert MTB/RIF Ultra分析所述进行PCR。

表13：在不同量的裂解缓冲液、饱和盐溶液和结合试剂(乙醇、异丙醇、二丙二醇甲醚、聚乙二醇MW 8000)的情况下使用化合物33从尿液(4-5mL)中提取的MTB DNA的检测。ΔCt计算为样品Ct与对照中100％加标之间的差。

表14：使用化合物33裂解缓冲液、饱和盐溶液和结合试剂(乙醇)从血浆(5mL)中提取的MTB DNA的检测。ΔCt计算为样品Ct与对照中100％加标之间的差。

实施例4G：使用离心机从尿液或血浆样品中提取片段化的MTB DNA

将添加了片段化MTB DNA(fMTB DNA 200-400bp)的5毫升血浆与0.25mL蛋白酶K溶液(～2mg/mL)混合，并进行短暂孵育。然后加入5毫升病毒裂解缓冲液以及5毫升饱和硫酸铵。然后将混合物在台式离心机中高速离心10分钟。收集上清液，并向其中加入0.01mL的10％(w/v)糖原溶液、0.005mL的化合物33溶液(CP15 1％)、7.5mL病毒裂解缓冲液和15mL乙醇。然后将混合物在台式离心机中高速旋转20分钟。弃去上清液，用70％乙醇冲洗沉淀，并在台式离心机中高速旋转5分钟。弃去洗液后，将沉淀短暂干燥，并加入0.1mL的低盐洗脱缓冲液。孵育后，收集洗脱缓冲液并通过RT-PCR进一步分析。发现最长达60分钟的更长的洗脱时间可提高产量。通过将等量的fMTB DNA直接加入单独的RT-PCR反应物中来制备该实验的对照，以具有表示100％提取和回收效率的比较物。如Chakravorty等人mBio,2017年7/8月，第8卷第4期e00812-17对Xpert MTB/RIF Ultra分析所述进行PCR。

结果显示在下表15中。

表15：显示了从尿液和血浆中提取MTB DNA的ΔCt。将Ct与100％对照进行比较。

实施例5：多糖试剂浓度对通过沉淀回收DNA的影响

该实验表明，多糖试剂以浓度依赖性的方式促进了核酸的分离。

如上所述通过过滤进行人基因组DNA的沉淀。将核酸(基因组DNA，Promega，Madison，WI目录号G3041，202ng/uL)和RNA对照(Life Technologies，Carlsbad，CA目录号4307281，50ng/uL)以5x期望最终浓度溶解在1x TE缓冲液中(例如5μg/mL最终为1μg/mL)。在每种测试样品中，将多糖试剂以可变的试剂浓度溶解在适当的缓冲液(例如，如上所述的CT/NG缓冲液)中。结果总结在表16中。

表16.在0.8um PES过滤器上捕获的人类基因组DNA百分比作为多糖试剂浓度的函数。通过制备理论上100％的对照品，将测试样品的荧光值除以理论上的对照品值减去空白值来确定百分比。

实施例6：从血浆中基于磁珠提取HBV病毒DNA

该实施例证明多糖试剂促进病毒DNA在磁珠上的沉淀。从珠洗脱的沉淀DNA具有适合的质量，可通过扩增方法(例如PCR)检测到，而无需任何其他去除试剂的步骤。

由EDTA保存的全血(Bioreclamation，Westbury，NY)制备的人血浆样品(0.25mL)用HBV病毒加标，并根据制造商的方案使用Dynabead SILANE viral NA试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取。根据制造商的说明，通过可商购的AmpliSenS HBV FRT检测试剂盒中的RT-PCR技术扩增从临床标本中提取的DNA。每次制备使用的多糖剂浓度为20μg。合并以下以制备每种样品：1440uL人血浆，160mL HBV(50kU/mL)和400uL蛋白酶K 6(Roche Inc.,Basel，瑞士)。使用以下试剂：(a)在裂解缓冲液中的2x无多糖试剂(对照)；(b)在裂解缓冲液中的2x化合物21；和(c)在裂解缓冲液中的2x化合物32。

向2mL离心管中的250uL样品中加入300uL裂解/结合缓冲液(病毒NA)。根据测试条件，将1.4uL的每种样品和裂解缓冲液替换为1.4uL的化合物21或化合物32溶液。将混合物在室温下孵育5分钟，并且将150uL异丙醇添加到每个管中。向每个管中加入50uL新的重悬的Dynabeads(Invitrogen，Carlsbad，CA)，将内容物混合并在室温下孵育10分钟(同时低速混合)。将管在磁力架上放置2分钟，并用移液管除去上清液。将珠重悬于850uL试剂盒的冲洗缓冲液1中，通过将管放在磁力架上1分钟使其沉淀。重复冲洗程序，然后将珠重悬于450uL试剂盒的冲洗缓冲液2中。将样品转移到新的离心管中以减少污染，并重复第二步冲洗。将珠干燥10-15分钟，然后将100uL试剂盒的洗脱缓冲液(病毒NA)添加到每个管中。在70℃下孵育3分钟后，将珠重悬，然后将样品放回磁力架2分钟使其沉淀。将含有提取核酸的上清液转移到新的试管中，用于下游PCR或在-80℃下保存。

表17.使用商业RT-PCR试剂(AmpliSenS HBV FRT监测试剂盒，InterLabServiceLtd.，俄罗斯)从样品中沉淀在磁珠上的病毒核酸(Ct)的RT-PCR检测

添加剂	化合物29	化合物32	无
				HBV Ct	31.8	31.7	34.2

该实验表明，使用本发明的方法分离的核酸可以通过PCR扩增，而无需任何从分离的核酸中去除多糖试剂的额外的步骤。

实施例7：用磁珠和多糖试剂从大量的水、尿液和血浆中提取核酸

该实验证明本文公开的核酸分离方法适用于从较大体积(大于5mL)的样品中分离核酸。

A.从血浆中回收核酸

用约10mg蛋白酶K(Roche Inc.)处理由EDTA保存的全血(Bioreclamation，Westbury，NY)制备的10mL人血浆样品，并与等体积的裂解试剂(包含3-5M硫氰酸胍，0.1％-1％w/v

20)混合，优选到约1.8M的终浓度，并调节至优选7至8的pH。然后向该混合物中加入70-100％的聚环氧乙烷200或等体积的乙醇至约30-40％的终浓度。将样品在振荡器上混合10分钟。将磁珠(Agencourt AMPure XP珠，Beckman Coulter，Brea，CA，按照试剂盒说明书中所规定的使用)和多糖试剂(化合物29，50μg/mL的血浆)添加到混合物，而对于对照实验，仅加入磁珠。将样品放在磁力架上10分钟。如果不使用磁珠，则将样品以4000g离心10分钟。

1.冲洗和洗脱程序：

然后，从体积为30-40mL的整个混合物获得离心沉淀的材料或磁珠(1mL)，并将在裂解物中释放的核酸结合到具有确定孔径，优选为0.4-1um的径迹蚀刻过滤器。随后用1-2M硫氰酸胍和60-100％聚环氧乙烷200或供选择的添加剂(如乙醇)的混合物冲洗纤维或过滤器。随后，用包含聚环氧乙烷200的缓冲液冲洗纤维或过滤器，然后将总DNA洗脱到约80uLTris/EDTA缓冲液(20mM Tris)中。

2. 从临床标本中提取的病毒和人类核酸的PCR和RT-PCR分析

如上所述，通过PCR扩增提取的人基因组DNA。供选择地，将以下人类基因的PCR引物和探针用于检测提取的DNA：GUS B、SDH A、TUB B、RPL P0。用于PCR的酶是AptaTaq DNA聚合酶(Roche Inc.，Basel，瑞士)，每个反应10U。PCR进行在95℃下的10秒变性步骤和在64℃下的40秒退火/延伸循环的45个循环。在表11中显示了通过向磁珠添加示例性多糖试剂而证明优异的DNA回收率的结果，表明当将多糖试剂添加至样品中时，实现了Ct值的显著降低。

B.从尿液中回收核酸

将通过在健康志愿者的知情同意下获得的10mL人尿样品与等体积的硫氰酸胍裂解试剂(含有3-5M硫氰酸胍，0.1％-1％w/v

20)混合，优选到约1.8M的终浓度，并调节至优选7至8的合适的pH。如上所述处理样品并通过PCR进行核酸检测以从大量血浆中回收核酸。代表性的结果显示在表11中，表明当将示例性的多糖试剂添加到样品中时，实现了Ct值的显著降低。

该结果表明添加示例性多糖试剂有助于从大量尿液中回收核酸。

C.从水中回收核酸

10mL水样品用290ng来自Promega Corporation(Madison,WI)的人类基因组DNA加标，并与等体积的硫氰酸胍裂解试剂(包含3-5M硫氰酸胍，0.1％-1％w/v

20)混合，优选到约1.8M的终浓度，并调节至优选7至8的pH。然后向该混合物中加入70-100％的聚环氧乙烷200溶液或等体积的乙醇，以达到约30-40的有机试剂的最终浓度。如上所述处理样品并通过PCR进行核酸检测。代表性的结果显示在表18中，表明当将示例性多糖试剂添加到样品中时，实现了Ct值的显著降低。该结果表明，添加多糖试剂有助于从大量水中回收核酸。

表18.在存在或不存在化合物29的情况下，用GUS B人类基因的引物和探针通过PCR扩增用Beckman Coulter磁珠(Beckman Coulter,Brea,CA)从10mL样品量的水、尿液或人血浆中提取的人基因组DNA。用于PCR的酶是AptaTaq DNA聚合酶(Roche Inc.，Basel，瑞士)，每个反应10U。显示了重复7或8次实验的平均Ct和标准偏差。

样品	添加剂	平均Ct	标准偏差
				10mL水	化合物29	33.2	0.6
10mL水	无	36.5	0.8
				10mL血浆	化合物29	30.5	0.6
10mL血浆	无	37.6	1
				10mL尿液	化合物29	29.4	1.1
10mL尿液	无	33	0.8

在单独的实验中，使用更大量的尿液(5-10mL)进行相同的程序，不同之处在于不使用磁珠，仅将多糖试剂添加到混合物中。发明人通过扩展使用磁珠的研究结果，发现多糖试剂本身可以促进例如通过絮凝从较大量样品中收集和浓缩无细胞核酸，并且可以通过离心进一步浓缩絮凝的核酸。提取核酸聚集体后，发现回收的DNA浓度等同于使用试剂盒制造商规定的方案用磁珠收集的浓度。

实施例8：借助多胺酰胺化果胶通过离心回收hgDNA

该实施例显示，多胺-多糖试剂可用于通过离心从溶液中分离核酸。然后释放提取的核酸并通过PCR检测。提取的DNA具有适合的质量，可以通过扩增方法(例如PCR)进行检测，而无需任何去除试剂的其他步骤。

将化合物80(精胺改性的果胶)溶于水中，并用1M NaOH调节pH值以产生pH 10.5的1％溶液。

将核酸(基因组DNA，Promega，Madison，WI目录号G3041，202ng/uL)溶解在去离子水中(1μg/500μl)。向标准Eppendorf管(2mL)中的500ul核酸样品溶液中加入相应量的1％聚合物溶液，以得到10ug聚合物加标的hgDNA-聚合物溶液。然后将等量的乙醇(500μl)和硫氰酸胍(4.5M，500μl)添加到样品中。作为对照，也可以在不添加任何多糖试剂溶液的情况下制备样品。

将样品涡旋5秒钟以混合，然后在5℃下以20,000rpm离心25分钟以使沉淀的DNA沉淀。小心倒出上清液以避免破坏沉淀。用冷却的70％EtOH溶液洗涤沉淀，并在20,000rpm下离心10分钟，倾析出上清液，并将沉淀在SpeedVac中在40℃下干燥。通过加入20ul含0.04％w/v i-角叉菜胶的15mM KOH来洗脱核酸，将样品在42℃下以1250rpm在热混合器上放置5分钟，然后短暂离心。

如上所述，使用标准缓冲液和来自Qiagen Inc.的Phoenix酶，通过PCR对hgDNA进行定量。将Extra Tris缓冲液(20mM pH 8.6)添加到PCR预混液中，以帮助中和洗脱缓冲液。在95℃下初始30s变性后，进行45个循环PCR(93℃下变性5s和69℃下退火/延伸30s)。

PCR结果总结在表12中，显示了使用示例性核酸分离方法从水中回收核酸。显示了在添加和不添加精胺改性的果胶试剂的情况下，从加标1μghgDNA的1:1:1水/乙醇/硫氰酸胍4.5M离心物中获得的hgDNA的PCR扩增的Ct值。DNA加标对照(100％对照)是以与包含hgDNA的样品相同的方式处理的不包含hgDNA的样品，在PCR之前加标了1μg hgDNA。结果总结在表19中。

表19.回收的hgDNA的扩增的Ct值

实施例9：使用多胺酰胺化果胶通过离心从水中回收hgDNA

该实施例表明，多胺改性的多糖试剂可用于从简单的水溶液中提取核酸，而无需其他添加剂，例如其他溶剂或盐。然后释放提取的核酸并通过PCR检测。提取的DNA具有适合的质量，可以通过扩增方法(例如PCR)进行检测，而无需任何其他去除试剂的其他步骤。

将化合物80(精胺改性的果胶)溶于水中以制备1％溶液。

将核酸(基因组DNA，Promega，Madison，WI目录号G3041，202ng/uL)溶解在去离子水(1μg/1mL)中。向标准1.5mL离心管中的1mL核酸样品溶液中加入相应量的1％聚合物溶液，得到10、50、100和200μg聚合物加标的hgDNA-聚合物溶液。没有其他溶剂或溶液添加到样品中。作为对照，还制备了不添加任何聚合物溶液的样品。

将样品涡旋5秒钟以混合，然后在25℃下以20,000rpm离心25分钟以使沉淀的DNA沉淀。小心倒出上清液以避免破坏沉淀。用冷却的70％EtOH溶液(2mL)洗涤沉淀，并以25,000rpm离心25分钟，倾析上清液，并将沉淀在SpeedVac中在40℃下干燥。通过加入25ul含0.04％w/v i-角叉菜胶的15mM KOH洗脱核酸，将样品在42℃下以1250rpm在热混合器上放置5分钟，然后短暂离心。

如上所述，通过与100％对照相比，通过PCR对hgDNA进行定量，结果显示在表20中。与无聚合物对照相比，多胺酰胺化的多糖显著提高了从水性样品中回收的DNA的产率。还包括化合物29以证明多胺改性的果胶(化合物80)相对于二胺改性的果胶(化合物29)具有更高的提取效率。DNA加标对照(100％对照)是以与包含hgDNA的样品相同的方式处理的不包含hgDNA的样品，在PCR之前加标了1μg hgDNA。结果总结在表20中。

表20.回收的hgDNA的扩增的Ct值

为了证明当使用示例性的用二胺酰胺化的多糖试剂(例如多胺改性的果胶)时，在洗脱缓冲液中具有带负电荷的聚合物(即，聚阴离子如角叉菜胶)的重要性，如上所述制备了含有或不含角叉菜胶的PCR样品。将10、50、100和200μg化合物80(作为1％的水溶液使用)添加到20μL含有0.04％角叉菜胶和1μg hgDNA的15mM KOH的等分试样中。向该模拟洗脱缓冲液中加入80ul PCR预混液(实施例7和8中所述的制备)。表21显示了角叉菜胶对用精胺改性的果胶(化合物80)处理的沉淀中回收的hgDNA的PCR的影响。没有扩增报告为Ct＝45。如果在洗脱缓冲液中不添加角叉菜胶，则无法检测到扩增。

表21.在洗脱试剂中不添加角叉菜胶的情况下，借助化合物80分离的hgDNA扩增的Ct值

添加剂	平均Ct	标准偏差
			化合物80，10μg	>45	n/a
化合物80，50μg	>45	n/a
			化合物80，100μg	>45	n/a
化合物80，200μg	>45	n/a
			100％对照	30.8	0.3

尽管已经说明和描述了说明性实施方案，但是应当理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种改变。

序列表

<110> 塞弗德公司（CEPHEID）

<120> 核酸分离的方法和组合物

<130> FIC21210013P

<150> US 62/765013

<151> 2018-08-17

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(16)

<223> 合成的

<400> 1

ggccatcagc gcatgc 16

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<223> 合成的

<400> 2

cggctgcgag caaaaca 17

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(27)

<223> 合成的

<400> 3

cctctgccga tccatactgc ggaactc 27

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 合成的

<400> 4

aatccccaaa gtcaaggagt 20

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

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<222> (1)..(17)

<223> 合成的

<400> 5

actgtacccc ccaatcc 17

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> 合成的

<400> 6

catcttaaga cagcagtaca aatggcagt 29

<210> 7

<211> 13

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

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<222> (1)..(13)

<223> 合成的

<400> 7

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<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

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<222> (1)..(21)

<223> 合成的

<400> 8

tttgaccggt taaaaaaaga t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 合成的

<400> 9

ccgcccttca acatcagtga a 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 合成的

<400> 10

acgcatgctg atagcgtca 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 合成的

<400> 11

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<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223> 合成的

<400> 12

ccggagatcc ttgcgatcct tgcacc 26

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 合成的

<400> 13

gcattcctga agctgacagc a 21

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(24)

<223> 合成的

<400> 14

ctccaggcca gaaagagaga gtag 24

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> 合成的

<400> 15

ccgtggcctt agctgtgctc gc 22

Claims

1.一种用于从包含核酸的样品中分离核酸的方法，包括：

(b)在固体载体上浓缩所述核酸，从而分离所述核酸。

2.权利要求1所述的方法，其中所述多糖还包含一个或多个由式II表示的单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中：

R²和R³独立地为H、任选取代的C₁-C₈烷基、任选取代的C₃-C₈环烷基、任选取代的C₃-C₈杂环烷基或任选取代的C₂-C₂₀杂烷基。

3.权利要求1所述的方法，其中所述多糖还包含一个或多个式(III)的单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中R³为H、CH₃、CH₂CH₂NH₂、CH₂CH₂N(CH₃)₂、CH₂CH₂OH、(CH₂)₂O(CH₂)₂NH₂或CH₂CH₂NHCH₂CH₂NH₂。

4.权利要求1所述的方法，其中所述多糖包含一个或多个具有式VI的结构的单体单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中：

n为0、1、2或3；

R⁴为H或C₁-C₃烷基；

X在每次出现时独立地为C₂-C₄亚烷基或C₄-C₆杂亚烷基；

Y为C₂-C₃亚烷基或C₄-C₆杂亚烷基；和

R⁵和R⁶独立地为H或C₁-C₃烷基。

5.权利要求1所述的方法，其中所述多糖包含一个或多个具有式V的结构的单体单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中：

n为0、1、2或3；

m在每次出现时独立地为2、3或4；

p为2、3或4；

R⁴为H或C₁-C₃烷基；和

R⁵和R⁶独立地为H或C₁-C₃烷基。

6.权利要求1所述的方法，其中所述多糖包含一个或多个由式VI、式VII或式VIII表示的单元，其异构体、盐、互变异构体或其组合：

7.权利要求1所述的方法，其中所述多糖是水溶性多糖。

8.权利要求1所述的方法，其中所述多糖是改性果胶。

9.权利要求8所述的方法，其中所述改性果胶选自部分脱酯化果胶、部分脱酯化解聚果胶、酰胺化果胶、酰胺化解聚果胶或其混合物。

10.权利要求8所述的方法，其中所述改性果胶是改性柑橘果胶或改性苹果果胶。

11.权利要求1所述的方法，其中所述多糖以约0.1μg/mL至约1000μg/mL、约0.1μg/mL至约500μg/mL、约0.1μg/mL至约200μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL或约1μg至约20μg的浓度存在于水性组合物中。

12.权利要求1所述的方法，其中所述多糖具有约120kDa至约500kDa、约150kDa至约300kDa或约120kDa至约175kDa的相对分子量。

13.权利要求8所述的方法，其中所述改性果胶是通过未改性果胶的酰胺化获得的。

14.权利要求13所述的方法，其中所述未改性果胶具有约5kDa至约1,100kDa、约10kDa至约500kDa、约10kDa至约300kDa、约20kDa至约200kDa或约20kDa至约100kDa的相对分子量。

15.权利要求1所述的方法，其中所述核酸通过离心、沉淀或其组合浓缩。

16.权利要求1所述的方法，其中所述核酸通过在固体载体上沉淀来浓缩。

17.权利要求16所述的方法，其中所述固体载体包含选自二氧化硅、玻璃、烯基主链聚合物、云母、聚碳酸酯、沸石、二氧化钛或其组合的材料。

18.权利要求16所述的方法，其中所述固体载体是磁珠、玻璃珠、纤维素过滤器、聚碳酸酯过滤器、聚四氟乙烯过滤器、聚乙烯吡咯烷酮过滤器、聚醚砜过滤器或玻璃过滤器。

19.权利要求16所述的方法，其中所述方法还包括洗涤在所述固体载体上沉淀的核酸。

20.权利要求16所述的方法，其中所述方法还包括洗脱所述核酸。

21.权利要求20所述的方法，其中所述洗脱包括使所述浓缩的核酸与洗脱剂接触。

22.权利要求21所述的方法，其中所述洗脱剂包含氨或碱金属氢氧化物。

23.权利要求21所述的方法，其中所述洗脱剂具有约9以上、约10以上或约11以上的pH。

24.权利要求21所述的方法，其中所述洗脱剂具有约9至约12、约9.5至约12、约10至约12或约9至约11的pH。

25.权利要求21所述的方法，其中所述洗脱剂包含聚阴离子。

26.权利要求25所述的方法，其中所述聚阴离子是角叉菜胶。

27.权利要求25所述的方法，其中所述聚阴离子是载体核酸。

28.权利要求21所述的方法，其中所述洗脱剂包含i-角叉菜胶和KOH。

29.权利要求1中任一项所述的方法，其中所述水性组合物还包含裂解剂。

30.权利要求1中任一项所述的方法，其中所述水性组合物还包含离液剂。

31.权利要求30所述的方法，其中所述离液剂选自硫氰酸胍、盐酸胍、碱金属高氯酸盐、碱金属碘化物、脲、甲酰胺或其组合。

32.权利要求1所述的方法，其中所述水溶液还包含盐。

33.权利要求32所述的方法，其中所述盐是氯化钠或氯化钙。

34.权利要求1所述的方法，其中所述水性组合物还包含缓冲剂。

35.权利要求34所述的方法，其中所述缓冲剂是Tris或HEPES。

36.权利要求1所述的方法，其中所述水性组合物还包含表面活性剂。

37.权利要求36所述的方法，其中所述表面活性剂是聚山梨酯。

38.权利要求1所述的方法，其中所述水性组合物还包含消泡剂。

39.权利要求1所述的方法，其中所述包含核酸的样品是血液、血浆、血清、精液、脊髓液、组织活检、眼泪、尿液、粪便、唾液、涂布标本、细菌培养物、哺乳动物细胞培养物、病毒培养物、人细胞、细菌、细胞外液、PCR反应混合物或体外核酸修饰反应混合物。

40.权利要求39所述的方法，其中是组织活检是石蜡包埋的组织。

41.权利要求1所述的方法，其中所述核酸包含基因组DNA。

42.权利要求1所述的方法，其中所述核酸包含总RNA。

43.权利要求1所述的方法，其中所述样品包含微生物核酸或病毒核酸。

44.权利要求43所述的方法，其中所述病毒核酸是HBV DNA。

45.权利要求1所述的方法，其中所述核酸包含循环核酸。

46.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在药筒中进行。

47.权利要求1所述的方法，其中所述包含核酸的样品是细胞裂解物。

48.权利要求1所述的方法，其中在与所述水性组合物接触之前，使所述样品与裂解缓冲液接触。

49.权利要求48所述的方法，其中所述裂解缓冲液包含一种或多种蛋白酶。

50.一种用于检测样品中的核酸的方法，包括：

(b)浓缩所述核酸；和

(c)检测所述核酸。

51.权利要求50所述的方法，其中所述多糖包含一个或多个由式II表示的单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

R²和R³独立地选自H、任选取代的C₁-C₈烷基、任选取代的C₃-C₈环烷基、任选取代的C₃-C₈杂环烷基和任选取代的C₂-C₂₀杂烷基。

52.权利要求50所述的方法，其中所述多糖还包含一个或多个由式III表示的单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中R³为H、CH₃、CH₂CH₂NH₂、CH₂CH₂N(CH₃)₂、CH₂CH₂OH、(CH₂)₂O(CH₂)₂NH₂或NHCH₂CH₂NHCH₂CH₂NH₂。

53.权利要求50所述的方法，其中所述多糖包含一个或多个由式VI表示的单体单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：

其中：

n为0、1、2或3；

R⁴为H或C₁-C₃烷基；

X在每次出现时独立地为C₂-C₄亚烷基或C₄-C₆杂亚烷基；

Y为C₂-C₃亚烷基或C₄-C₆杂亚烷基；和

R⁵和R⁶独立地为H或C₁-C₃烷基。

54.权利要求50所述的方法，其中所述多糖包含一个或多个由式V表示的单体单元：

其异构体、盐、互变异构体或组合,其中：

n为0、1、2或3；

m在每次出现时独立地为2、3或4；

p为2、3或4；

R⁴为H或C₁-C₃烷基；和

R⁵和R⁶独立地为H或C₁-C₃烷基。

55.权利要求50所述的方法，其中所述多糖包含一个或多个由式VI、式VII或式VIII表示的单元，其异构体、盐、互变异构体或其组合：

56.权利要求50-55中任一项所述的方法，其中所述多糖是改性果胶。

57.权利要求56所述的方法，其中所述改性果胶是改性柑橘果胶或改性苹果果胶。

58.权利要求56所述的方法，其中所述多糖以约0.1μg/mL至约1000μg/mL、约1μg/mL至约1000μg/mL、约5μg/mL至约500μg/mL、约1μg/mL至约200μg/mL、约5μg/mL至约200μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL或约1μg/mL至约20μg/mL的浓度存在于所述水性组合物中。

59.权利要求49-58中任一项所述的方法，其中检测所述核酸包括通过聚合酶链式反应扩增所述核酸。

60.权利要求59所述的方法，其中所述聚合酶链式反应是巢式PCR、等温PCR、qPCR或RT-PCR。