CN113189068A - 一种基于荧光分析的农药检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于荧光分析的农药检测方法。本发明将有机荧光探针与蛋白结合,形成具有主客体结构的荧光检测体系,利用具有更强结合力的农药与有机荧光探针发生竞争性的配体置换反应,根据产生的荧光信号与农药浓度的定量关系实现检测。本发明的农药检测方法,成本低、灵敏度高、响应时间短,满足体外快速检测的要求;同时荧光分析法具有非侵入检测和可视化的优势,特别适用于开展动植物体内农残原位检测。

Description

一种基于荧光分析的农药检测方法
技术领域
本发明属于农药残留检测技术领域,具体涉及一种基于荧光分析的农药检测方法。
背景技术
农药是现代农业用于防治病虫害和调节植物生长的化学药剂,按化学结构分类包括有机磷类、有机氯类、氨基甲酸酯类、苯并吡唑类、菊酯类等,按功能分类包括杀虫剂、除草剂、杀菌剂、杀螨剂、植物生长调节剂等。农药的广泛使用为植物生长避免了害虫、杂草、细菌的侵袭,但在提升药效的同时,其本身的高生物毒性可引起蜜蜂、家蚕、鱼类等动物中毒,而动植物体内残留农药过高则会引发食品安全问题。因此,研发高灵敏度的原位检测农药方法具有重要的研究价值和实际意义。
常规农药检测方法主要为仪器分析,包括气相色谱、高效液相色谱、气/液质联用等。尽管利用以上仪器分析法可得到精确的农药检测结果,但基于常规仪器分析法难以实现动植物体内原位检测。荧光分析法作为一种响应时间短、灵敏度高、时间及空间分辨率高、可视化的检测手段已被用于农残检测,已报道的应用于农药检测的荧光传感体系包括有机类荧光探针、量子点材料、上转换纳米材料、金属纳米片等。目前应用于动植物体内原位检测农残的荧光分析体系较少,且已有方法多为针对特定农药(如有机磷类),不能以同一体系根据不同种类农药通过体系优化实现检测分析,因此现有技术仍需改进和发展。相对于单一荧光传感材料的检测体系,基于蛋白-配体超分子作用的分析方法不仅具有传统荧光分析的优势,同时还具备超分子体系中易于调控主、客体材料的特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于荧光分析的农药检测方法。本发明方法构建基于蛋白-配体超分子作用的检测体系是一种能更方便快捷针对不同被检测物调整检测体系,进而实现灵敏、准确原位检测农残的方法。
本发明的基于荧光分析的农药检测方法,包括以下步骤:
S1.将荧光探针溶液与蛋白质溶液混合,振荡后静置,得到蛋白-荧光探针超分子体系a,测试体系a的荧光光谱;
S2.向体系a中加入不同浓度梯度的农药,振荡后静置,得到一系列浓度梯度的蛋白-荧光探针-农药超分子体系b,测试体系b的荧光光谱;
S3.基于测试的体系a、b的荧光光谱获得各浓度下的荧光信号值,建立荧光信号值与农药浓度的标准曲线;通过标准曲线计算得到该体系对被检测农药的灵敏度、检测限;
所述的蛋白质为血清蛋白、生物酶或生物受体,所述的荧光探针为黄酮或查尔酮探针。
本发明的基于荧光分析的农药检测方法,可以针对不同被检测物及其浓度范围调整检测体系的中的蛋白种类及浓度比例,从而可以适用于不同种类不同浓度的农药检测及原位农残检测。
优选,所述的基于荧光分析的农药检测方法,还包括如下的步骤S4:向体系a中加入待测样品,测试荧光光谱,将获得的荧光信号值代入所述的标准曲线,计算得到待测样品的农药浓度。
优选,所述的体系a是通过如下方法制备得到的:
S11.配制浓度为1~10mM的荧光探针的DMSO母液;
S12.配制浓度为0.1~1mM的蛋白质的PBS母液,所述的PBS为0.1X浓度的pH 7.4的PBS;
S13.以PBS稀释蛋白质至10μM,然后滴入荧光探针的DMSO母液使荧光探针浓度同样为10μM,2500rpm振荡1min后静置2min,得到体系a。
优选,所述的体系b是通过如下方法制备得到的:
S21.配制农药的DMSO母液;
S22.滴加不同体积的农药的DMSO母液至体系a形成不同的浓度梯度,2500rpm振荡1min后静置2min,得到一系列浓度梯度的蛋白-荧光探针-农药超分子体系b。
优选,所述的步骤S22中加入的农药的体积小于体系b体积的10%。
优选,所述的蛋白质为人血清蛋白(HSA)、卵血清蛋白(ESA),优选,所述的荧光探针为查尔酮4MC、查尔酮CD1或查尔酮DNC。
优选,所述的农药为新烟碱类杀虫剂、菊酯类杀虫剂、氨基甲酸酯类杀虫剂、苯并吡唑类杀虫剂、邻甲酰胺基苯甲酰胺类杀虫剂、杀菌剂和/或除草剂。
优选,所述的测试体系a、b的荧光光谱,具体为测试各体系的荧光强度、比率荧光强度、发光波长的荧光信号值;所述的通过标准曲线计算得到该体系对被检测农药的灵敏度、检测限,是以标准曲线线性拟合部分的斜率为灵敏度,根据S/N=3规则计算检测限。
本发明还提供所述的基于荧光分析的农药检测方法在农药检测中的应用。
优选,所述应用,为在氟虫腈检测中的应用,所述的蛋白质为人血清蛋白(HSA),所述的荧光探针为查尔酮4MC。
有益效果:
本发明的研究方法设计思路新颖,以蛋白与荧光探针结合构建检测体系,以具有与蛋白强结合能力的农药作为被检测物,通过配体置换反应使探针荧光信号产生变化,以此建立荧光信号与农药浓度的定量关系,实现荧光检测。该方法涉及蛋白-荧光探针-农药三元超分子体系,体系可根据被检测物灵活调控蛋白种类以得到针对不同类型农药的高效检测结果。此外该体系以荧光量子产率高、发光机理明确、合成简便、毒性低的有机染料作为荧光探针,以简单的稀释、混溶、振荡、静置操作配制样品,以荧光光谱测试分析荧光信号与农药浓度的定量关系。在实施例检测条件下,针对氟虫腈的检测限为97nM;且随氟虫腈农药增加,荧光颜色由绿变橙,该结果适用于原位检测动植物体内农残含量。
本发明的超分子荧光分析体系制备简单,制样时间短,适用于实际研究中大量样品快速筛选。本发明的农药检测方法,成本低、灵敏度高、响应时间短,满足体外快速检测的要求;同时荧光分析法具有非侵入检测和可视化的优势,特别适用于开展动植物体内农残原位检测。
附图说明
图1为实施例1所选荧光分子查尔酮4MC、查尔酮CD1、查尔酮DNC的化学结构及在不同人血清蛋白(HSA)浓度下的荧光光谱。
图2为蛋白-荧光探针-农药体系检测方法与四种不同类型农药的荧光滴定光谱。
图3为蛋白-荧光探针-农药体系检测方法与氟虫腈的荧光响应随时间变化图。
图4为蛋白-荧光探针-农药体系检测方法对氟虫腈的标准检测曲线。
图5为查尔酮4MC的结构表征数据。
图6为查尔酮DNC的结构表征数据。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
关于以下实施例中涉及的荧光探针查尔酮4MC、查尔酮CD1、查尔酮DNC说明如下:
查尔酮4MC(其结构式如式I所示)为自行制备得到,
Figure BDA0003042546780000031
式I,
式I化合物的制备步骤如下:
将4-甲氧基邻羟基苯乙酮与对二甲氨基苯甲醛溶解于乙醇与水的混合溶剂中,其中水含量30~50wt%,加入NaOH水溶液(10~20wt%)10ml,在25~80℃下搅拌18~24h,将反应液倒入1000ml水中加酸中和,经重结晶得到4MC。化合物结构表征数据如图5所示。
查尔酮CD1(其结构式如式II所示)为购买得到,
Figure BDA0003042546780000041
式II,
购买自安耐吉化学,产品编号D5312(CAS号:22965-98-6),购买网址链接https://www.energy-chemical.com/front/search.htm?type=anjCas&keyword=D5312。
查尔酮DNC(其结构式如式III所示)为自行制备得到,
Figure BDA0003042546780000042
式III,
式III化合物的制备步骤如下:
将2乙酰基萘与对二甲氨基肉桂醛溶解于乙醇溶剂中,加入NaOH水溶液(10~20wt%)10ml,在25~80℃下搅拌18~24h,将反应液倒入1000ml水中加酸中和,经重结晶得到DNC。化合物结构表征数据如图6所示。
本发明提供一种基于荧光分析的农药检测方法,其关键点在于建立蛋白-荧光探针-农药三元超分子体系,该体系是由一种蛋白质与有机荧光探针作用形成超分子体系a,并产生初始荧光信号;当具有更强结合力的农药与蛋白作用后,通过配体置换反应得到超分子体系b,同时释放荧光探针,并产生实时荧光信号。根据荧光探针同一波长下荧光强度(I)的变化,或双波长比率荧光强度(I1/I2)变化、或最大发光峰波长(λ)的变化,建立荧光信号与农药浓度的关系。
该方法所涉及检测体系的制备及荧光分析包括以下步骤:
(1)将荧光探针与蛋白质混合,得到蛋白-荧光探针超分子体系a,测试体系a的荧光光谱;
(2)向体系a中加入不同浓度梯度的农药,得到一系列蛋白-荧光探针-农药超分子体系b,测试体系b的荧光光谱;
(3)基于测试的体系a、b的荧光光谱,计算各浓度下的荧光信号值,建立荧光信号值与农药浓度的标准曲线;
(4)通过标准曲线计算得到该体系对被检测农药的灵敏度、检测限。
本发明提供的荧光分析农药检测方法中涉及的蛋白-荧光探针-农药三元超分子体系,其中对用于检测体系的蛋白质来源没有特殊限定,种类包括但不限于血清蛋白、生物酶、生物受体等;对用于检测体系的荧光探针来源没有特殊限定,采用市售或自制的有机小分子荧光探针均可,种类包括但不限于黄酮、查尔酮等;对用于检测体系的农药来源没有特殊限定,采用已商品化有机合成农药或研发新药均可,种类包括但不限于新烟碱类、菊酯类、氨基甲酸酯类、苯并吡唑类等药物。
本发明所述检测体系a的制备方法包括以下步骤:
A)配制荧光探针的DMSO母液,浓度为1~10mM;
B)配制蛋白质母液的PBS(pH=7.4)母液,浓度为0.1~1mM;
C)以PBS稀释蛋白质至10μM,然后滴入荧光探针使其浓度同样为10μM,2500rpm振荡1min后静置2min得到检测体系a。
体系b的制备方法包括以下步骤:
A)配制农药的DMSO母液;
B)滴加不同体积的农药的DMSO母液至体系a形成不同的浓度梯度,2500rpm振荡1min后静置2min,得到一系列浓度梯度的蛋白-荧光探针-农药超分子体系b。
本发明所述荧光光谱分析方法包括:以荧光光谱测试各体系得到荧光强度、比率荧光强度、发光波长等荧光信号值,拟合荧光信号值与农药浓度得到标准曲线,利用线性拟合部分的斜率作为灵敏度,利用S/N=3规则计算检测限。
本发明的超分子荧光分析体系制备方法简单,制样时间短,适用于实际研究中大量样品快速筛选。
本发明还提供一种用于高灵敏检测氟虫腈的比率荧光检测体系,优选使用人血清蛋白配制蛋白母液并制备后续检测体系,优选磷酸缓冲液浓度为0.1X,pH值为7.4,优选使用查尔酮4MC(其结构式如式I所示),优选DMSO为荧光探针和农药母液的溶剂。本发明优选荧光探针与蛋白在振荡条件下结合后再与农药反应,得到蛋白-荧光探针-农药三元超分子体系。
Figure BDA0003042546780000051
式I。
下面通过具体实施例对本发明的用于农药检测的超分子体系及其检测性能进行详细说明。
实施例1
蛋白-荧光探针体系的制备。
以人血清蛋白(HSA)与查尔酮4MC荧光探针组合为例,蛋白-荧光探针体系的具体制备方法如下:
将66.5mg人血清蛋白(HSA)溶于1ml PBS缓冲溶液(pH=7.4,0.1X)中,常温振荡1min得到均一的浓度为1×10-3mol/L的蛋白母液。将3.0mg查尔酮4MC溶于5ml DMSO中,超声1min得到浓度为2×10-3mol/L的查尔酮4MC荧光探针母液。移取20μL蛋白母液至2ml PBS缓冲溶液中,振荡条件下加入10μL查尔酮4MC荧光探针母液,继续振荡1min后静置2min得到蛋白-荧光探针体系,人血清蛋白(HSA)与查尔酮4MC荧光探针浓度均为10μM。
根据上述相同的制备方法,只是替换其中的荧光探针为查尔酮CD1(其结构式如式II所示)、查尔酮DNC(其结构式如式III所示),分别制备得到人血清蛋白(HSA)与查尔酮CD1荧光探针浓度均为10μM的蛋白-荧光探针体系、人血清蛋白(HSA)与查尔酮DNC荧光探针浓度均为10μM的蛋白-荧光探针体系。
Figure BDA0003042546780000061
式II,
Figure BDA0003042546780000062
式III。
根据上述相同的制备方法,只是将蛋白-荧光探针体系中的蛋白配制成不同浓度,检测上述3种不同查尔酮荧光探针在不同人血清蛋白(HSA)浓度(0~700μM)的荧光光谱。结果如图1所示,查尔酮4MC荧光探针与人血清蛋白(HSA)作用后,荧光按箭头指向从红光逐渐转变为绿光;查尔酮CD1荧光探针与HSA作用后,其特征的绿色荧光被点亮;而查尔酮DNC荧光探针与HSA作用后,其本身的红光逐渐增强。以上结果显示,不同查尔酮荧光探针与人血清蛋白(HSA)作用后可产生荧光点亮、比色响应等信号变化,通过分子结构设计可调控荧光发光波段。
实施例2
蛋白-荧光探针-农药体系的制备。
将农药溶于2ml DMSO中得到浓度为50mM的农药母液。滴加不同体积的农药母液至实施例1中所得蛋白-荧光探针体系(蛋白与探针浓度均为10μM),得到一系列农药添加浓度为0~1mM(0~100e.q.)的蛋白-荧光探针-农药体系。
实施例3
蛋白-荧光探针体系对农药的荧光光谱响应。
测试氯虫苯甲酰胺、丁硫克百威、氟虫腈、阿维菌素四种常用农药在不同浓度添加量下的荧光光谱响应,具体体系的制备参照实施例2中的制备方法,其中的蛋白为人血清蛋白(HSA),其中的探针为查尔酮4MC荧光探针。结果如图2所示。可知四种农药加入后均造成原本蛋白-荧光探针体系荧光光谱变化,其中氯虫苯甲酰胺、丁硫克百威、阿维菌素加入后,荧光强度被大幅猝灭;而氟虫腈加入后,体系在512nm的荧光强度大幅降低,而585nm的荧光强度逐渐升高,随氟虫腈浓度增大,荧光颜色由绿变黄,再变红,再变橙色;图2中为该过程对应的荧光颜色变化。
以氟虫腈为例,进一步对该体系(其中的蛋白为人血清蛋白(HSA),其中的探针为查尔酮4MC荧光探针)定量检测农药的性能进行评估。该体系在不同氟虫腈添加浓度的荧光响应随时间变化如图3所示,可知60s后荧光信号值基本趋于稳定,表明该体系对氟虫腈响应速率快。取I512对氟虫腈浓度c拟合得到如图4所示的标准曲线(1-I/I0=0.0187c+9.688×10-4),线性拟合得到低浓度范围荧光强度与农药浓度的线性关系,根据S/N=3规则计算检测限为97nM。
综上所述,该方法提供的基于蛋白-配体作用的三元超分子体系是可对多种农药进行快速荧光分析,利用荧光颜色变化可快速判断蛋白-荧光探针体系是否与农药具有响应,进一步根据荧光光谱测试结果,以荧光强度、比率荧光强度等信号值对农药浓度拟合得到标准曲线可得到定量检测结果。该方法不仅具有荧光分析检测法的高灵敏、快速响应、可视化效果等优势,还可针对不同农药底物对超分子体系进行灵活调控;比如:对于农药吡唑螺环c-27(其结构式如式IV所示,公开于专利申请CN201810219338.4中),
Figure BDA0003042546780000081
式IV,
体系中的蛋白可以选用对吡唑螺环c-27存在明显结合作用的人血清蛋白(HSA)或卵血清蛋白(ESA),体系中的荧光探针可选用查尔酮4MC,从而用于实现对农药吡唑螺环c-27的检测分析。本发明方法可作为针对不同类型农药及新药的分析方法。

Claims (10)

1.一种基于荧光分析的农药检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.将荧光探针溶液与蛋白质溶液混合,振荡后静置,得到蛋白-荧光探针超分子体系a,测试体系a的荧光光谱;
S2.向体系a中加入不同浓度梯度的农药,振荡后静置,得到一系列浓度梯度的蛋白-荧光探针-农药超分子体系b,测试体系b的荧光光谱;
S3.基于测试的体系a、b的荧光光谱获得各浓度下的荧光信号值,建立荧光信号值与农药浓度的标准曲线;通过标准曲线计算得到该体系对被检测农药的灵敏度、检测限;
所述的蛋白质为血清蛋白、生物酶或生物受体,所述的荧光探针为黄酮或查尔酮探针。
2.根据权利要求1所述的基于荧光分析的农药检测方法,其特征在于,还包括如下的步骤S4:向体系a中加入待测样品,测试荧光光谱,将获得的荧光信号值代入所述的标准曲线,计算得到待测样品的农药浓度。
3.根据权利要求1所述的基于荧光分析的农药检测方法,其特征在于,所述的体系a是通过如下方法制备得到的:
S11.配制浓度为1~10mM的荧光探针的DMSO母液;
S12.配制浓度为0.1~1mM的蛋白质的PBS母液,所述的PBS为0.1X浓度的pH 7.4的PBS;
S13.以PBS稀释蛋白质至10μM,然后滴入荧光探针的DMSO母液使荧光探针浓度同样为10μM,2500rpm振荡1min后静置2min,得到体系a。
4.根据权利要求1所述的基于荧光分析的农药检测方法,其特征在于,所述的体系b是通过如下方法制备得到的:
S21.配制农药的DMSO母液;
S22.滴加不同体积的农药的DMSO母液至体系a形成不同的浓度梯度,2500rpm振荡1min后静置2min,得到一系列浓度梯度的蛋白-荧光探针-农药超分子体系b。
5.根据权利要求4所述的基于荧光分析的农药检测方法,其特征在于,所述的步骤S22中加入的农药的体积小于体系b体积的10%。
6.根据权利要求1所述的基于荧光分析的农药检测方法,其特征在于,所述的蛋白质为人血清蛋白、卵血清蛋白,所述的荧光探针为查尔酮4MC、查尔酮CD1或查尔酮DNC。
7.根据权利要求1所述的基于荧光分析的农药检测方法,其特征在于,所述的农药为新烟碱类杀虫剂、菊酯类杀虫剂、氨基甲酸酯类杀虫剂、苯并吡唑类杀虫剂、邻甲酰胺基苯甲酰胺类杀虫剂、杀菌剂和/或除草剂。
8.根据权利要求1所述的基于荧光分析的农药检测方法,其特征在于,所述的测试体系a、b的荧光光谱,具体为测试各体系的荧光强度、比率荧光强度、发光波长的荧光信号值;所述的通过标准曲线计算得到该体系对被检测农药的灵敏度、检测限,是以标准曲线线性拟合部分的斜率为灵敏度,根据S/N=3规则计算检测限。
9.权利要求1-8任一项所述的基于荧光分析的农药检测方法在农药检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,为在氟虫腈检测中的应用,所述的蛋白质为人血清蛋白,所述的荧光探针为查尔酮4MC。
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