CN113180043B - 一种几丁质水解酶抑制剂在调节昆虫生长活性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种几丁质水解酶抑制剂在调节昆虫生长活性中的应用，属于生物技术领域。一种几丁质水解酶抑制剂在调节昆虫生长活性中的应用，所述几丁质水解酶抑制剂为紫草素及其衍生物或黄酮类衍生物。通过对所筛选几丁质水解酶抑制剂的抑制效果、选择性和杀虫活性评价对化合物的抑制活性的研究，结果表明，所述几丁质水解酶抑制剂对糖基水解酶18家族和糖基水解酶20家族均具有抑制效果。本发明所述的几丁质水解酶抑制剂在生物学和化学生物学等领域有广泛的应用前景，尤其是在延缓草地贪夜蛾、亚洲玉米螟和黏虫发育方面有较好的应用前景。

Description

一种几丁质水解酶抑制剂在调节昆虫生长活性中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种几丁质水解酶抑制剂在调节昆虫生长活性中的应用。
背景技术
几丁质(Chitin)是以N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(GlcNAc)为基本单元，通过β-1,4糖苷键连接的天然线性直链多糖。作为重要的结构组成部分，几丁质大量存在于真菌和硅藻的细胞壁、软体动物的外壳、线虫的卵壳以及甲壳类生物和昆虫的外骨骼中，其合成和水解的动态平衡对于这些生物的生长发育具有极其重要的作用。昆虫的卵-幼虫-幼虫-蛹-成虫的每一阶段的发育都伴随着几丁质的降解与合成。昆虫几丁质水解酶活性的丧失会导致昆虫各发育阶段严重的外骨骼缺陷和致死性，并且人体内没有几丁质，表明昆虫几丁质水解酶可能是很有前途的安全的农药靶标。昆虫生长发育过程中周期性的几丁质重塑需要糖基水解酶18家族酶和糖基水解酶20家族酶的协同作用。抑制这两种酶中的一种或同时抑制这两种酶是一种很有前途的害虫防治策略。对昆虫蜕皮液进行蛋白组学分析，发现蜕皮液中包含几丁质酶I(ChtI)、几丁质酶II(ChtII)、几丁质酶h(Chi-h)和N-乙酰己糖胺酶1(Hex1)四种几丁质水解酶，因此开发这几种几丁质水解酶抑制剂对于农业害虫的防治具有非常重要的意义。
然而，由于化学杀虫剂对环境有一定的毒害作用，生物防治又有防治范围的局限性。天然产物的生物相容性好，对环境危害小，应用天然产物或开发天然产物的衍生物或模拟物来进行害虫防治，有较好的应用前景。因此需要从天然产物中筛选几丁质酶抑制剂。在生物体内可能一个酶被抑制但其它酶或其它生理通路替代了原有酶活生理路径产生抗药性，从而降低杀虫效果，因此，需筛选出具有多靶点效应的几丁质水解酶抑制剂。
发明内容
在防治农业害虫的研究中，为了找到高效抑制糖基水解酶18家族(GH18)和糖基水解酶20家族(GH20)的化合物，本发明筛选了天然产物库，通过抑制效果、选择性和杀虫活性评价对化合物的抑制活性进行了抑制效果评价研究，最终筛选到了紫草素及其衍生物以及黄酮类衍生物。
本发明提供了一种几丁质水解酶抑制剂在调节昆虫生长活性中的应用，所述几丁质水解酶抑制剂为都具有共轭π环的紫草素及其衍生物或黄酮类衍生物，所述紫草素及其衍生物的结构通式如式Ⅰ所示：
Figure GDA0003093795500000021
式Ⅰ中，R基团选自以下取代基中的一种：
Figure GDA0003093795500000022
所述黄酮类衍生物的结构通式如式Ⅱ所示：
Figure GDA0003093795500000023
式Ⅱ中，R1、R2、R3、R4、R5、R6可以相同或不同，并独立的选自以下取代基中的一种：
Figure GDA0003093795500000024
进一步地，所述几丁质水解酶抑制剂在抑制糖基水解酶18家族几丁质酶活性中的应用。
进一步地，所述几丁质水解酶抑制剂在抑制糖基水解酶20家族几丁质酶活性中的应用。
进一步地，所述紫草素及其衍生物在抑制亚洲玉米螟N-乙酰己糖胺酶1(Ofhex1)活性时，几丁质水解酶抑制剂在反应体系中使用的终浓度为不低于10μM；在抑制亚洲玉米螟几丁质酶Ⅰ(OfChtI)活性时，其在反应体系中使用的终浓度为不低于20μM；在抑制亚洲玉米螟几丁质酶Ⅱ(OfChtII)活性时，几丁质水解酶抑制剂在反应体系中使用的终浓度为不低于20μM；在抑制亚洲玉米螟几丁质酶h(OfChi-h)活性时，几丁质水解酶抑制剂在反应体系中使用的终浓度为不低于20μM。
进一步地，所述黄酮类衍生物在抑制亚洲玉米螟N-乙酰己糖胺酶1(Ofhex1)活性时，其在反应体系中使用的终浓度为不低于20μM；在抑制亚洲玉米螟几丁质酶Ⅰ(OfChtI)活性时，其在反应体系中使用的终浓度为不低于20μM；在抑制亚洲玉米螟几几丁质酶Ⅱ(OfChtII)活性时，其在反应体系中使用的终浓度为不低于20μM；在抑制亚洲玉米螟几丁质酶h(OfChi-h)活性时，其在反应体系中使用的终浓度为不低于20μM。
进一步地，所述调节昆虫生长活性为防治农业害虫方面的应用。
进一步地，所述农业害虫为鳞翅目昆虫。
进一步地，所述鳞翅目昆虫包括草地贪夜蛾、粘虫、亚洲玉米螟、棉红铃虫、马铃薯块茎蛾、甘薯麦蛾、棉褐带卷蛾、大豆食心虫、梨大食心虫、大造桥虫、菜粉蝶、棉铃虫、舞毒蛾、玉带风蝶、金凤蝶、舟形毛虫、黄腹灯蛾、红腹灯蛾、美国白蛾、葡萄天蛾和稻苞虫、麦蛾等。
进一步地，所述防治农业害虫方面的应用是在延缓草地贪夜蛾、亚洲玉米螟、黏虫发育方面的应用。
本发明提供了评价结构通式如I所示的紫草素及其衍生物抑制活性所获得的数据，包括抑制剂筛选、抑制常数Ki值测定和选择性测定所获得的数据。结果表明，在筛选的所有1680个天然产物库中，化合物Deoxyshikonin(去氧紫草素)对OfHex1的抑制常数Ki值为0.68μM，对OfChtII的抑制常数Ki值为12μM，对OfChi-h的抑制常数Ki值为5.5μM，对OfChtI的抑制常数Ki值为27.88μM。化合物Alkannin(紫草素)对OfHex1的抑制常数Ki值为1.25μM，对OfChtII的抑制常数Ki值为34.53μM，对OfChi-h的抑制常数Ki值为70.46μM。化合物Shikonin(右旋紫草素)对OfHex1的抑制常数Ki值为1.8μM，对OfChi-h的抑制常数Ki值为119.20μM。
表1化合物Alkannin(紫草素)、Deoxyshikonin(去氧紫草素)、Shikonin(右旋紫草素)分别对OfChtI、OfChtII、OfChi-h和OfHex1的Ki值列表
Figure GDA0003093795500000041
本发明提供了评价黄酮类衍生物抑制活性所获得的数据，包括抑制剂筛选、Ki值测定和选择性测定所获得的数据。结果表明，化合物Wogonin(汉黄芩素)对OfChtI的抑制常数Ki值为181.10μM，对OfChII的抑制常数Ki值为7.34μM，对OfChi-h的抑制常数Ki值为205.67μM。化合物Keampferol(山奈酚)对OfChtI的抑制常数Ki值为134.49μM，对OfChtII的抑制常数Ki值为19.66μM，对OfChi-h的抑制常数Ki值为105.13μM，对OfHex1的抑制常数Ki值为18.09μM。化合物Fisetin(漆黄素)对OfChtI的抑制常数Ki值为73.08μM，对OfChtI的抑制常数Ki值为22.14μM，对OfChi-h的抑制常数Ki值为56.44μM，对OfHex1的抑制常数Ki值为9.41μM。化合物Icaritin(脱水淫羊藿素)对OfChtI的抑制常数Ki值为11.68μM，对OfChtII的抑制常数Ki值为100.51μM，对OfChi-h的抑制常数Ki值为7.94μM。
表2化合物Wogonin(汉黄芩素)、Keampferol(山奈酚)、Fisetin(漆黄素)、Icaritin(脱水淫羊藿素)分别对OfChtI、OfChtII、OfChi-h和OfHex1的Ki值列表
Figure GDA0003093795500000051
本发明化合物杀虫活性的方法为：用甲醇作为溶剂溶解几丁质水解酶抑制剂，采用喂食方式将化合物送入研究对象(草地贪夜蛾、亚洲玉米螟、黏虫)体内。经过研究化合物在10mM浓度下对亚洲玉米螟的杀虫活性可以发现，相较于对照组，实验组幼虫的发育被延缓。
附图说明
图1为化合物Alkannin、Deoxyshikonin、Shikonin分别对OfChtI、OfChtII、OfChi-h和OfHex1的Ki值测定示意图；其中，横坐标表示化合物浓度，浓度单位为μM；纵坐标为反应速率倒数。
图2为化合物漆黄素(Fisetin)、山奈酚(Keampferol)、汉黄芩素(Wogonin)、脱水淫羊藿素(Icaritin)分别对OfChtI、OfChtII、OfChi-h和OfHex1的Ki值测定示意图；其中，横坐标表示化合物浓度，浓度单位为μM；纵坐标为反应速率倒数。
图3为10mM化合物Shikonin对草地贪夜蛾和粘虫的生长作用图；其中，A为粘虫对照组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率，B为粘虫实验组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率，C为草地贪夜蛾对照组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率，D为草地贪夜蛾实验组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率，E为粘虫和草地贪夜蛾的体重随天数的变化，MC为粘虫对照组，MS为粘虫实验组，SC为草地贪夜蛾对照组，SS为草地贪夜蛾实验组。
图4为10mM的3-羟基黄酮(3-Hydroxyflavone)、漆黄素(Fisetin)、山奈酚(Keampferol)、汉黄芩素(Wogonin)、脱水淫羊藿素(Icaritin)分别对亚洲玉米螟的生长作用图，其中A为对照组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率，图B为漆黄素(Fisetin)实验组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率。图C为脱水淫羊藿素(Icaritin)实验组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率，图D为汉黄芩素(Wogonin)实验组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率，图E为山奈酚(Keampferol)实验组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率，图F为3-羟基黄酮(3-Hydroxyflavone)实验组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率。图G为饲喂不同抑制剂的亚洲玉米螟的体重随天数的变化，H为对照组和饲喂不同抑制剂8天后亚洲玉米螟的表型。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明实施例中所用的酶OfHex1、OfChi-h、OfChtI和OfChtII如下述参考文献给出：
Chen W.；Qu M.；Zhou Y.；Yang Q.,Structural analysis of group IIchitinase(ChtII)catalysis completes the puzzle of chitin hydrolysisininsects.J.Biol.Chem.2018,293,2652-2660.
Liu T.；Chen L.；Zhou Y.；Jiang X.；Duan Y.；Yang Q.,Structure,catalysis,and inhibition of OfChi-h,the lepidoptera-exclusive insectchitinase.J.Biol.Chem.2017,292,2080-2088.
Chen L.；Zhou Y.；Qu M.；Zhao Y.；Yang Q.,Fully deacetylatedchitooligosaccharides act as efficient glycoside hydrolase family 18chitinaseinhibitors.J.Biol.Chem.2014,289,17932-17940.
Liu T.；Zhang H.；Liu F.；Wu Q.；Shen X.；Yang Q.Structural determinantsof an insectβ-N-acetyl-D-hexosaminidase specialized as a chitinolyticenzyme.J.Biol.Chem.2011,286,4049-4058.
实施例1
将酶OfHex1、OfChi-h、OfChtI和OfChtII作为靶标，对1680个微生物次级代谢产物进行抑制剂筛选。具体步骤如下：
正对照：设置2组平行正对照。在30℃反应温度，100μL反应体系的条件下，糖基水解酶和10μmol/L底物以及2μL的DMSO在20mmol/L的pH 6.0的磷酸盐缓冲液中孵育30min，之后加入100μL的0.5mol/L碳酸钠溶液终止反应，反应液用360nm波长的激发光进行激发后测定450nm波长下的吸光度值。酶为OfHex1时底物为MU-GlcNAc(4-甲基伞形酮基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖)，酶为OfChi-h、OfChtI和OfChtII时底物为MU-(GlcNAc)2(4-甲基伞形酮基-β-D-N,N'-二乙酰基壳二糖糖苷)。
实验组：设置3组平行实验组。在30℃反应温度，100μL反应体系的条件下，糖基水解酶和10μmol/L以及2μL待筛选抑制剂在20mmol/L的pH 6.0的磷酸盐缓冲液中孵育30min，之后加入100μL浓度为0.5mol/L的碳酸钠溶液终止反应，反应液用360nm波长的激发光进行激发后测定450nm波长下的吸光度值。酶为OfHex1时底物为MU-GlcNAc(4-甲基伞形酮基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖)，酶为OfChi-h、OfChtI和OfChtII时底物为MU-(GlcNAc)2(4-甲基伞形酮基-β-D-N,N'-二乙酰基壳二糖糖苷)。
根据以下公式计算抑制活性：
抑制百分数＝(正对照-实验组)/正对照*100％
筛选来源的天然产物库，种类丰富，结构差异明显，主要有抗生素、激素、生物碱、各类毒素及维生素等。对抑制剂进行筛选时，先进行长时间的初筛，在初筛的基础上对初筛获得的阳性结果进行进一步的复筛(具体步骤同上)确认后获得最终数据，结果表明，在10μM终浓度下化合物Deoxyshikonin对OfHex1抑制率为81％，对OfChtI的抑制率为58％，对OfChtII的抑制率为46％，对OfChi-h的抑制率为67％。在10μM终浓度下化合物Shikonin对OfHex1抑制率为54％，对OfChi-h的抑制率为39％。在10μM终浓度下化合物Alkannin对OfHex1抑制率为64％，对OfChtII的抑制率为51％，对OfChi-h的抑制率为76％。在10μM终浓度下化合物Fisetin对OfHex1抑制率为80％，对OfChi-h的抑制率为41％。在10μM终浓度下化合物Keampferol对OfHex1抑制率为63％，对OfChtII的抑制率为66％，对OfChi-h的抑制率为84％。在10μM终浓度下化合物Icaritin对OfChtI的抑制率为49％，对OfChtII的抑制率为30％，对OfChi-h的抑制率为90％。在10μM终浓度下化合物Wogonin对OfChtI的抑制率为69％，对OfChtII的抑制率为69％，对OfChi-h的抑制率为75％。
实施例2
抑制常数Ki测定：
酶为OfHex1时底物为MU-GlcNAc(4-甲基伞形酮基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖)，酶为OfChi-h、OfChtI和OfChtII时底物为MU-(GlcNAc)2(4-甲基伞形酮基-β-D-N,N'-二乙酰基壳二糖糖苷)，反应设置三组底物浓度梯度，在每组底物浓度下取多组适宜的化合物浓度梯度进行抑制活性测定。反应体系为100μL，缓冲环境为20mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0，反应温度30℃，反应时间30min，之后加入100μL浓度为0.5M的碳酸钠溶液终止反应，释放的4-甲基伞形酮经由360nm激发光激发后于450nm波长下测定其吸光度值。数据采用Dixon法绘图，结果如图1和图2所示，化合物Deoxyshikonin(去氧紫草素)对OfHex1的抑制常数Ki值为0.68μM，对OfChtII的抑制常数Ki值为12μM，对OfChi-h的抑制常数Ki值为5.5μM，对OfChtI的抑制常数Ki值为27.88μM。化合物Alkannin(紫草素)对OfHex1的抑制常数Ki值为1.25μM，对OfChtII的抑制常数Ki值为34.53μM，对OfChi-h的抑制常数Ki值为70.46μM。化合物Shikonin(右旋紫草素)对OfHex1的抑制常数Ki值为1.8μM，对OfChi-h的抑制常数Ki值为119.20μM。化合物Wogonin(汉黄芩素)对OfChtI的抑制常数Ki值为181.10μM，对OfChtII的抑制常数Ki值为7.34μM，对OfChi-h的抑制常数Ki值为205.67μM。化合物Keampferol(山奈酚)对OfChtI的抑制常数Ki值为134.49μM，对OfChtII的抑制常数Ki值为19.66μM，对OfChi-h的抑制常数Ki值为105.13μM，对OfHex1的抑制常数Ki值为18.09μM。化合物Fisetin(漆黄素)对OfChtI的抑制常数Ki值为73.08μM，对OfChtII的抑制常数Ki值为22.14μM，对OfChi-h的抑制常数Ki值为56.44μM，对OfHex1的抑制常数Ki值为9.41μM。化合物Icaritin(脱水淫羊藿素)对OfChtI的抑制常数Ki值为11.68μM，对OfChtII的抑制常数Ki值为100.51μM，对OfChi-h的抑制常数Ki值为7.94μM。
实施例3
紫草素及其衍生物的杀虫活性评价具体步骤如下：
实验选取三龄第一天的健康草地贪夜蛾和粘虫幼虫作为实验材料，设置对照组和实验组。化合物Shikonin(右旋紫草素)用甲醇溶解后拌于饲料中，浓度为10mM(1g饲料＝1mL饲料)。对照组幼虫注饲喂加入甲醇后的饲料。幼虫于26℃，相对湿度70％-90％，每天16小时光照，8小时黑暗的条件下培养至幼虫期结束，期间每天对正常幼虫、死亡幼虫、正常蛹和不正常蛹的数量和表型进行统计。
统计结果绘制成图3，图3为10mM化合物Shikonin对草地贪夜蛾和粘虫的生长作用图。其中图3A为粘虫对照组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率，图3B为粘虫实验组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率。图3C为草地贪夜蛾对照组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率，图3D为草地贪夜蛾实验组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率。图3E为粘虫和草地贪夜蛾的体重随天数的变化，MC为粘虫对照组，MS为粘虫实验组，SC为草地贪夜蛾对照组，SS为草地贪夜蛾实验组。
结果表明，实验组幼虫的发育被延缓，有的甚至死亡。化合物Shikonin对草地贪夜蛾和粘虫具有良好的延缓发育或杀灭的作用。
实施例4
黄酮类化合物的杀虫活性评价具体步骤如下：
实验选取三龄第一天的亚洲玉米螟作为实验材料，设置对照组和实验组。黄酮类化合物3-羟基黄酮(3-Hydroxyflavone)、漆黄素(Fisetin)、山奈酚(Keampferol)、汉黄芩素(Wogonin)、脱水淫羊藿素(Icaritin)分别用甲醇溶解后拌于饲料中，浓度为10mM(1g饲料＝1mL饲料)。对照组幼虫注饲喂加入甲醇后的饲料。幼虫于26℃，相对湿度70％-90％，每天16小时光照，8小时黑暗的条件下培养至幼虫期结束，期间每天对正常幼虫、死亡幼虫、正常蛹和不正常蛹的数量和表型进行统计。
统计结果绘制成图4，图3为10mM化合物3-羟基黄酮(3-Hydroxyflavone)、漆黄素(Fisetin)、山奈酚(Keampferol)、汉黄芩素(Wogonin)、脱水淫羊藿素(Icaritin)对亚洲玉米螟的生长作用图。其中图4A为对照组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率，图4B为漆黄素(Fisetin)实验组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率。图4C为脱水淫羊藿素(Icaritin)实验组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率，图4D为汉黄芩素(Wogonin)实验组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率，图4E为山奈酚(Keampferol)实验组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率，图4F为3-羟基黄酮(3-Hydroxyflavone)实验组随时间(天数)的变化不同龄期幼虫所占比例和存活率。图4G为饲喂不同抑制剂的亚洲玉米螟的体重随天数的变化。
结果表明，实验组幼虫的发育被延缓，有的甚至死亡。化合物3-羟基黄酮(3-Hydroxyflavone)、漆黄素(Fisetin)、山奈酚(Keampferol)、汉黄芩素(Wogonin)、脱水淫羊藿素(Icaritin)对草地贪夜蛾和粘虫具有良好的延缓发育或杀灭的作用。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (5)

1.一种几丁质水解酶抑制剂在调节昆虫生长活性中的应用，其特征在于：所述几丁质水解酶抑制剂为都具有共轭π环的紫草素及其衍生物或黄酮类衍生物，所述紫草素及其衍生物的结构式如式下所示：
Figure FDA0003500630230000011
所述黄酮类衍生物的结构式如式下所示：
Figure FDA0003500630230000012
所述几丁质水解酶抑制剂使用的终浓度为不低于10μM，所述昆虫为草地贪夜蛾、粘虫或亚洲玉米螟。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述几丁质水解酶抑制剂在抑制糖基水解酶18家族几丁质酶活性中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述几丁质水解酶抑制剂在抑制糖基水解酶20家族几丁质酶活性中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调节昆虫生长活性为防治农业害虫方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述防治农业害虫方面的应用是在延缓草地贪夜蛾、亚洲玉米螟、黏虫发育方面的应用。
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