CN103081911A

CN103081911A - 壳寡糖作为昆虫几丁质酶抑制剂及杀虫剂的应用

Info

Publication number: CN103081911A
Application number: CN2013100101262A
Authority: CN
Inventors: 杨青; 杜昱光; 刘田; 赵勇; 赵小明; 杨君; 姜秀萍
Original assignee: Dalian University of Technology; Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian University of Technology; Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2013-01-10
Filing date: 2013-01-10
Publication date: 2013-05-08

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，特别涉及壳寡糖作为昆虫几丁质酶抑制剂及壳寡糖作为杀虫剂方面的应用。壳寡糖包括二种：一种是聚合度为2-6的氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的单体，另一种是聚合度为2-20的氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的混合物；将上述的壳寡糖作为昆虫几丁质酶抑制剂及杀虫剂，用于杀水生害虫的制剂壳寡糖混合物的含量需大于0.0005%，用于杀陆生害虫的制剂壳寡糖混合物的含量需大于0.006%。

Description

壳寡糖作为昆虫几丁质酶抑制剂及杀虫剂的应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及到一种壳寡糖作为昆虫几丁质酶抑制剂及壳寡糖杀虫活性方面的应用。

背景技术

自从人类学会了耕作，就开始了与农业害虫的斗争。杀虫剂是控制农业害虫的主要手段之一，全球每年依靠杀虫剂的使用能够挽回农业害虫造成损失的30%～35%。然而，目前商品化的杀虫剂主要针对乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱受体等少数几个靶标，存在严重的抗性问题。因此，必须开发针对新靶标的杀虫剂。

几丁质是构成昆虫体壁，气管和围食膜的主要结构成分，在昆虫生长发育的过程中必需不断的进行合成与降解。同时，几丁质不存在于植物、哺乳动物和人类体内。因此，昆虫几丁质代谢相关酶是“绿色”的杀虫剂靶标。几丁质酶是昆虫几丁质水解过程的关键酶。对昆虫几丁质酶的RNA干扰证实该酶表达量下调会引起昆虫生长发育异常而死亡，Zhu et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA。因此，昆虫几丁质酶抑制剂是潜在的“绿色”杀虫剂。

目前已报道几丁质酶抑制剂主要是天然产物allosamidin、argadin及argifin等，这些化合物虽然抑制活性较好，但无论天然提取还是全合成均非常困难且成本较高。最近报道的通过高通量筛选获得的甲基黄嘌呤衍生物等，这些化合物抑制活性较差而且合成成本较高。因此，非常有必要开发更经济、实用的几丁质酶抑制抑制剂。

壳寡糖是由2-20个氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的寡聚糖，也是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基寡糖，具有水溶性好、安全无毒等优点。壳寡糖因其结构的特殊性，在营养与保健、畜牧养殖、植物生长调节及抗病害等方面具有广泛的应用。但到目前为止，壳寡糖选择性抑制几丁质酶的活性还尚未有报道。由于壳聚糖与几丁质具有相似的结构，如附图1所示。申请人推测壳寡糖能够与活性口袋结合抑制几丁质酶的活性，进而体现出杀虫活性。

亚洲玉米螟是我国玉米最主要的害虫，每年造成玉米减产10%～30%，还能危害棉花、高梁、谷子和大麻等农作物。申请人已经克隆了亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的基因，GeneBank登录号：DQ294305，该基因在亚洲玉米螟化蛹之前表达量显著上调。对赤拟谷盗中同源基因TcCht5的RNA干扰会引起昆虫变态发育异常而死亡，Zhu et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA。申请人在毕赤酵母中实现了OfCht5的高活性重组表达，为昆虫几丁质酶抑制剂的筛选提供了前提和基础，Wu Q, et al. Insect Sci, 2012。

发明内容

本发明提供了一种壳寡糖在昆虫几丁质酶抑制剂及杀虫剂的应用方法。

本发明解决技术问题采用的方案如下：

壳寡糖，包括二种：一种是聚合度为2-6的氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的单体，另一种是聚合度为2-20的氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的混合物。

本发明提供了壳寡糖单体水溶液作为昆虫几丁质酶抑制剂的应用。聚合度为2-6的壳寡糖单体水溶液在体外均能抑制亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的活性，其中以壳6糖的抑制活力最高，其抑制常数为24.3 μM（表1）。

表1 不同聚合度壳寡糖的对亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的抑制常数

等温量热滴定表明聚合度为2-6的壳寡糖单体均能与亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5结合（图3-7）。一分子的OfCht5能够结合两分子的聚合度为2和3的壳寡糖，但是只能结合一分子的聚合度为4和6的壳寡糖（表2）。

表2 不同聚合度壳寡糖单体对亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的结合活性

本发明提供了壳寡糖混合物作为杀虫剂的应用。壳寡糖混合物可以制备液体制剂或固体制剂。液体制剂可以是农用的任意液体制剂，优选的可以为水剂、微乳剂或悬浮剂；固体制剂可以是农用的任意固体制剂，优选的可以为可湿性粉剂或颗粒剂。其中，用于杀水生害虫如库蚊幼虫的制剂壳寡糖混合物的含量需大于0.0005%；用于杀陆生害虫如亚洲玉米螟幼虫的制剂壳寡糖混合物的含量需大于0.006%。壳寡糖混合物水剂对于不同种属昆虫的杀虫活性如表3所示。

表3 壳寡糖混合物的杀虫活性

附图说明

图1 几丁质和壳聚糖的化学结构。

图2 壳寡糖混合物HPLC图谱。

图3壳2糖对亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的结合活性。

图4 壳3糖对亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的结合活性。

图5 壳4糖对亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的结合活性。

图6 壳5糖对亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的结合活性。

图7 壳6糖对亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的结合活性。

具体实施方式

以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。

一、壳寡糖对亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的抑制活性

亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的重组表达及纯化方法参考论文：Wu Q,et al. Insect Sci.,2012, DOI 10.1111/j.1744-7917.2012.01512.x。酶活力测定选择对硝基苯酚-N,N’-二乙酰壳二糖（pNP-β-(GlcNAc)₂）为底物，由于几丁质酶水解糖苷键后生成游离的对硝基苯酚（pNP）在405 nm有特征吸收，采用瑞士帝肯公司的Sunrise^TM酶标仪来测定酶活力。分离纯化过程中对活力的测定选择60 μL反应体系，在96孔板中混合一定量的OfCht5与测酶活缓冲液（20 mM NaH₂PO₄，pH 6.0）共58.8 μL，及1.2 μL 5 mM pNP-β-(GlcNAc)₂，室温温育一定时间后，加入60 μL 0.5 M Na₂CO₃终止反应，于405 nm测定吸收值。壳寡糖的抑制活性通过在96孔板中稀释得到0~1000 ppm浓度梯度后利用上述测活方法进行测定。

二、壳寡糖与亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的结合模式

采用通用医疗公司的ITC-200微量等温仪分析壳寡糖与亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的结合模式。滴定所用蛋白溶液为溶解于50 mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES，pH 8.0）, 100 mM 氯化钠的OfCht5，终浓度为0.1 mM。滴定所用壳寡糖溶液为相同缓冲体系，终浓度为1 mM。滴定过程分13次进行，每次3μL。滴定数据通过仪器自带软件包处理获得。

三、壳寡糖的杀虫活性测定

1、杀库蚊幼虫活性

尖音库蚊为室内饲养的正常群体。称取供试化合物约2mg于盘尼西林药瓶中，加10mL丙酮（或适宜溶剂），振荡溶解，即为200 ppm母液。移取1 mL母液，加入盛有89毫升水的100 mL烧杯中，选取10头4龄初蚊子幼虫，连同10 mL饲养液一并倒入烧杯中，其药液的浓度即为2ppm。将处理放入标准处理室内，直至全部化蛹或者死亡后检查结果。以含有1 mL试验溶剂的水溶液为空白对照。

2、杀玉米螟活性

玉米螟为室内饲养的正常群体。试验方法：浸叶法。用玉米叶浸渍于丙酮配制的药液中（600 ppm），待药液干后接入3龄幼虫，主要为胃毒、触杀作用，同时观察幼虫取食现象。72小时后检查死亡率。

3、杀棉铃虫的活性

棉铃虫为室内饲养的正常群体。试验方法：浸叶法。用玉米叶浸渍于丙酮配制的药液中（600ppm），待药液干后接入3龄幼虫，主要为胃毒、触杀作用，同时观察幼虫取食现象。72小时后检查死亡率。

4、杀粘虫活性

粘虫为室内饲养的正常群体。试验方法：浸叶法。用玉米叶浸渍于丙酮配制的药液中（600 ppm），待药液干后接入3龄幼虫，主要为胃毒、触杀作用，同时观察幼虫取食现象。72小时检查死亡率。

5、杀小菜蛾活性

试验方法：浸叶法。用甘蓝叶浸渍于丙酮配制的药液中（600 ppm），待药液干后接入2龄小菜蛾幼虫30头。将试验处理置于标准处理室内，96h检查结果以拨针轻触虫体，不动者为死亡。计算死亡率。

6、杀甜菜夜蛾活性

试验方法：浸叶法。用甘蓝叶浸渍于丙酮配制的药液中（600 ppm），待药液干后接入2龄甜菜夜蛾幼虫30头。将试验处理置于标准处理室内，96h检查结果以拨针轻触虫体，不动者为死亡。计算死亡率。

7、杀朱砂叶螨活性

供试验用豆苗长至两片真叶时，选择长势比较整齐、叶面积大约4-5平方厘米、株高10厘米左右的植株接虫，每株虫量不少于60头，一般控制在60-100头左右。接虫24小时后进行药剂处理，供试植株从茎基部剪下，连虫带苗一起将叶片浸入所试验的药液（600 ppm）中，浸药时间控制在5秒钟。植株从药液取出后，轻轻抖动，去掉多余的药液，然后移入水培缸中。处理后的植株放在25℃恒温室中。对活动螨处理后96小时在双目镜下检查死活虫数，计算死亡率。

8、杀豌豆蚜活性

将带有60头左右发育至成虫前两天个体整齐一致的豆蚜若虫的供试蚕豆植株（豆苗叶片展开，株高12cm左右）从盆栽中剪下，在预先培植好的一定浓度药液中浸沾3秒钟, 取出甩掉余液, 插在12孔泡沫塑料板上保湿(泡沫塑料板厚3.5cm, 放在35×45cm的瓷盘内, 用水浸湿), 待药液干后用玻璃罩(上口用纱布, 橡皮筋封好)罩上。处理完毕，在标准的恒温、恒湿条件下放置。96h后调查试虫死亡情况.以拨针轻触虫体，不动者为死亡。计算死亡率。

Claims

1.壳寡糖作为昆虫几丁质酶抑制剂的应用，其特征在于，所述的壳寡糖，包括二种：一种是聚合度为2-6的氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的单体，另一种是聚合度为2-20的氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的混合物；将上述的壳寡糖水溶液作为昆虫几丁质酶抑制剂。

2.壳寡糖作为杀虫剂的应用，其特征在于，壳寡糖制备液体制剂或固体制剂，用于杀水生害虫的制剂壳寡糖混合物的含量需大于0.0005%，用于杀陆生害虫的制剂壳寡糖混合物的含量需大于0.006%。

3.权利要求1所述的壳寡糖作为杀虫剂的应用，其特征在于，壳寡糖制备液体制剂或固体制剂，用于杀水生害虫的制剂壳寡糖混合物的含量需大于0.0005%，用于杀陆生害虫的制剂壳寡糖混合物的含量需大于0.006%。

4.权利要求3所述的壳寡糖作为杀虫剂的应用，其特征在于，其中，用于杀库蚊幼虫的制剂壳寡糖混合物的含量需大于0.0005%；用于杀亚洲玉米螟幼虫、棉铃虫幼虫、小菜蛾幼虫的制剂壳寡糖混合物的含量需大于0.006%。

5.根据权利要求2或3或4所述的应用，其特征在于，液体制剂为水剂、微乳剂或悬浮剂。

6.根据权利要求2或3或4所述的应用，其特征在于，固体制剂为可湿性粉剂或颗粒剂。