CN113151422B - 一种可用于分析窖泥微生物群落结构的绝对定量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可用于分析窖泥微生物群落结构的绝对定量方法，属于生物技术领域。此方法选取在窖泥中不存在的丙酮丁醇梭菌作为内标菌，在提取窖泥时另外添加丙酮丁醇梭菌的菌体细胞或其基因组DNA，利用16S rRNA基因高通量扩增子测序，得到各中微生物的相对丰度，再通过丙酮丁醇梭菌与窖泥微生物的相对丰度关系，得到窖泥微生物总生物量，结合各物种的相对丰度，可计算得到各物种的绝对含量。该方法可跨窖泥样本比较同类型微生物的绝对含量。本方法可以用于窖泥微生物酿造功能分析，也可以用于窖泥质量判定。
Description
技术领域
本发明涉及一种可用于分析窖泥微生物群落结构的绝对定量方法，属于生物技术领域。
背景技术
中国白酒历史悠久，被列为世界著名六大蒸馏酒之一，分为清香型、酱香型、浓香型、米香型四大基本香型，其中浓香型白酒的销量与产量占据整个白酒行业的主导地位。独特的泥窖固态发酵、续糟配料、混蒸混烧的酿造工艺使浓香型白酒区别于其他香型，窖池作为浓香型白酒发酵的容器，长期的生产实践经验表明“千年老窖万年糟，酒好全凭窖池老”，浓香型白酒质量随着窖池窖龄的增加而提高。而老窖产好酒的原因在于：随着窖泥的老熟，窖泥内菌群结构趋于稳定，形成具有较高形成具有较高的生物与功能多样性的窖泥微生物生态系统(任聪,杜海,徐岩.中国传统发酵食品微生物组研究进展[J].微生物学报,2017,57(06):885-98.)，窖泥微生物在发酵过程中分解有机物形成代谢产物，各类代谢产物之间相互转化形成了浓香型白酒风味物质。解析窖泥内的微生物组成变化与作用，对提高白酒生产质量具有重要意义。目前，窖泥的质量评价方法主要有三种：感官评定、理化分析和基于菌群结构分析的微生物指标评价。感官评定主要包括色泽、气味、手感等；理化分析包括对窖泥的挥发性有机酸、水分、营养成分、氨氮、pH等进行窖泥质量判定；微生物指标判定指对窖泥微生物菌群结构进行分析。
感官评定方法主要依靠经验积累，对于优质窖泥的描述语缺少定量描述。不同酒厂，甚至不同酿造班组所制定的优质窖泥评判标准也不尽相同，目前没有统一的标准。而理化分析存在判定滞后的缺陷，反映的为长期窖池发酵过程的累积结果，而窖泥质量的优劣在于窖泥中风味功能微生物的含量与比例，该方法无法实时反映出窖泥微生物结构组成和风味功能微生物含量及比例。基于微生物菌群结构对窖泥质量进行评判，可以准确地明确窖泥内的浓香型白酒生产的优势菌属。浓香型白酒质量随着窖池窖龄的增加而提高，老窖产好酒的原因在于窖泥中的厌氧菌群在长期发酵过程中不断驯化富集，Tao、Hu等人(Applied and Environmental Microbiology 2016；82(8):2506-2515；Tao Y,Li J,RuiJ,Xu Z,Zhou Y,et al.Applied and Environmental Microbiology 2014；80(7):2254-2260)的研究表明优质窖泥内的稳定的微生物菌群结构对产优质白酒具有重要作用，随着窖泥使用年份的增长，己酸菌属、互营菌属、甲烷菌属等微生物在窖泥内的丰度不断增加，其中己酸菌属的丰度与优质白酒质量呈正相关，因此窖泥内的微生物结构丰度的变化可作为窖泥质量的判定指标。
在现有的报道中，由高通量测序技术获得的窖泥菌群相对丰度信息中，仅可比较窖泥内的微生物组成的增减变化，推测微生物之间功能的相关性。由于缺乏对窖泥总生物量的认识，当生物量存在数量级差异时，相对丰度的分析无法反映实际的微生物量比关系，导致观察结果出现偏差，具有一定局限性。为更为精确的对窖泥内的微生物组成变化与功能作用进行表征，亟需开发一种快速、便捷、适用于窖泥研究体系的绝对定量技术，以补充现有研究方式存在的不足，有助于加深我们对于窖泥内窖泥微生物菌群结构变化的认识。
发明内容
由于目前的检测方法只能反映窖泥中微生物的相对量，而无法直观、准确地探究微生物数量与窖泥之间的关系，由于窖泥微生物多为未培养微生物，基于qPCR的绝对定量方法需设计特异性引物，存在引物偏好性、物种局限性，并不适用于对所有的窖泥微生物同时进行精确的定量。
因而，本发明提供了一种可用于分析窖泥微生物群落结构的绝对定量方法，通过添加外源菌丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)作为内标菌，可同时对窖泥微生物总量与窖泥微生物菌群结构进行分析，可进一步加深对窖泥微生物菌群结构的解析，解决现有利用相对丰度对窖泥微生物菌群结构进行解析所产生的缺陷。
本发明提供了一种测定窖泥微生物绝对定量的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)选取丙酮丁醇梭菌为内标菌；
(2)添加已知数量的内标菌于窖泥内作为内标，再进行窖泥DNA提取；
(3)通过16S rRNA基因高通量扩增子测序，获得窖泥内不同分类水平的属微生物相对丰度，以丙酮丁醇梭菌的数量为参照，得到原位窖泥微生物的总绝对丰度和原位窖泥内某属水平微生物绝对丰度。
在一种实施方式中，所述内标菌以DNA或菌体细胞的形式添加至窖泥中。
在一种实施方式中，原位窖泥微生物的总绝对丰度与内标菌存在如下关系：
在一种实施方式中，A1为原位窖泥微生物的总绝对丰度(cells/g窖泥)，即单位质量的窖泥内的总微生物数；N为内标菌添加量(cells)，n为内标菌相对丰度(％)，m为窖泥质量(g)。
在一种实施方式中，原位窖泥内某属的微生物绝对丰度与内标菌存在如下关系：
在一种实施方式中，A2为原位窖泥内某属水平微生物绝对丰度(cells/g窖泥)，a为原位窖泥内某属水平微生物的相对丰度，N为内标菌添加量(cells)，n为内标菌相对丰度(％)，m为窖泥质量(g)。
本发明提供了所述方法在窖泥总生物量测定中的应用。
在一种实施方式中，以丙酮丁醇梭菌为内标菌，将内标菌以菌体细胞的形式添加至窖泥中，窖泥总生物量与内标菌存在如下关系：
在一种实施方式中，A1为原位窖泥微生物的总绝对丰度(cells/g窖泥)，即单位质量的窖泥内的菌落数；N为内标菌添加量(cells)，n为内标菌相对丰度(％)，m为窖泥质量(g)。
本发明提供了所述方法在窖泥乳杆菌属生物量测定的应用。
在一种实施方式中，以丙酮丁醇梭菌为内标菌，加入窖泥中提取总DNA，某属的微生物绝对丰度与内标菌存在如下关系：
在一种实施方式中，A2为乳杆菌属绝对丰度(cells/g窖泥)，a为乳杆菌属占据原位窖泥微生物的相对丰度(％)。
本发明提供了所述方法在窖泥质量评价的应用。
在一种实施方式中，测定窖泥中不同属菌株的绝对丰度来评价窖泥质量，所述不同属菌株包括己酸菌属、互营单胞菌属、甲烷杆菌属、甲烷八叠球菌属和甲烷短杆菌。
有益效果：
本发明的方法是基于16S rRNA基因高通量扩增子测序，通过内标菌与窖泥原位微生物的数量关系，得到窖泥微生物的绝对丰度。添加外源微生物作为内标的方式，操作较为简便，且相对准确，还可避免引物特异性与细胞计数难的问题。无需进行特异性引物或序列设计，该方法在获得窖泥微生物菌群结构的同时，还可对窖泥微生物的绝对含量进行测定，可跨窖泥样本比较同类型微生物的绝对含量，为窖泥微生物菌群结构和功能分析提供新技术。
附图说明
图1内标菌可靠性验证图；
图2窖泥生物量的测定图；
图3不同窖龄窖泥样品中乳酸菌含量图；
图4不同质量的窖泥内主要微生物的绝对丰度图。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的培养基如下：
葡萄糖液体培养基(/L)：葡萄糖10～20g，硫酸铵1～2g，无水磷酸氢二钾1～2g，无水磷酸二氢钾0.5～1g，蛋白胨5～10g，酵母粉5～10g，七水合硫酸镁0.05～0.1g，七水合硫酸亚铁0.005～0.01g，一水合硫酸镁0.01～0.02g，氯化钙0.01～0.02g，硫酸锌0.001～0.002g，氯化钴0.001～0.002g，pH为6.5。
实施例1：窖泥微生物定量方法的建立
窖泥微生物定量方法包含以下步骤：(1)选取内标菌；(2)内标菌悬液制备；(3)添加已知数量的内标菌于窖泥内作为内标，然后进行窖泥DNA提取；(4)通过16S rRNA基因高通量扩增子测序，获得窖泥内不同分类水平的属微生物相对丰度，计算得到窖泥内的微生物生物总量，同时基于原位相对丰度计算获得不同属微生物绝对丰度。
(1)选取内标菌
选择窖泥内不存在的微生物作为内标菌，由于窖泥微生物存在大量梭菌纲微生物，内标菌株选取时，考虑窖泥DNA提取效率差异，以微生物属性与原位微生物相近的菌株的梭菌纲微生物作为待选内标菌株，且以破壁更为困难的革兰氏阳性菌为内标菌为优，以确保提取效率的稳定性。常见的易于获取和培养的梭菌纲微生物包括丙酮丁醇梭菌、丁酸梭菌、酪丁酸梭菌、拜氏梭菌，通过与NCBI数据库中的已有的不同来源的窖泥测序数据进行Blast比对分析，发现丙酮丁醇梭菌在窖泥中不存在，可以作为内标菌使用；而常见的丁酸梭菌、酪丁酸梭菌、拜氏梭菌等梭菌纲微生物在窖泥中以一定丰度存在，不适用于作为内标菌使用。
(2)内标菌悬液制备
内标菌液可一次性制备多量，于-80℃冻存备用：
1)配制葡萄糖培养基、生理盐水、10％甘油，115℃灭菌30min。
2)按10％(v/v，100mL/L)的接种比例，利用葡萄糖培养基培养丙酮丁醇梭菌，7-12h后，收集OD600值为0.5-0.7的菌体，于12000rpm离心10min后弃上清液，生理盐水洗涤离心菌体，经12000rpm离心10min收集洗涤后的菌体
3)部分菌体经10％甘油溶液重悬，通过灭菌纱布过滤去除分散不均匀的菌体，获得均一菌悬液，另一部分菌体用于提取DNA。
4)取1mL重悬的菌悬液，用生理盐水稀释10-100倍，进行血球计数板计数，记录细胞数值，计算菌悬液细胞浓度，计算获得菌悬液内细胞数为2.75×108cells/mL。
5)计数步骤为：
a)利用亚甲基蓝染色处理，重悬菌液与亚甲基蓝液按1:4比例添加。
亚甲基蓝染液的配置：(1)溶液A：亚甲基蓝0.3g，酒精(95％)30mL；(2)溶液B：KOH0.01g，蒸馏水100mL。分别配制溶液A及溶液B，混合待用。
b)染色孵育5min。
c)将染色后的菌悬液利用生理盐水进一步稀释，分别获得100倍和50倍稀释悬液。
d)预先清洗检查的血球计数板，血球计数板冲洗后用无水乙醇润洗，用吹风机快速吹干。
e)利用10μL的枪吸取染色后的菌液计数，静置5min后，待视野内的细胞不再快速浮动后开始计数。
(3)添加已知数量的内标菌于窖泥内作为内标，然后进行窖泥DNA提取。
采用QIAGEN DNeasy PowerSoil Kit进行窖泥DNA提取，称量0.25g窖泥于破碎管中，添加内标菌后按试剂盒说明书进行窖泥DNA提取。内标设置1:5:50的添加梯度，分为添加丙酮丁醇梭菌DNA和丙酮丁醇梭菌营养体细胞的方式，评估并选择适宜于窖泥体系的一种方式，DNA添加浓度由细胞添加量换算所得，换算公式为：
式中A为DNA浓度(ng)；N为添加的细菌细胞个数(cells)；Mc为丙酮丁醇梭菌基因组大小4.09Mb；对于双链DNA，碱基对的分子质量为650g/mol。
1)称取0.25g窖泥样品于破碎小管，添加丙酮丁醇梭菌作为内标后，采用QIAGENDNeasy PowerSoil Kit试剂盒参照使用说明书进行窖泥DNA提取。
2)16S rRNA高通量测序技术分析菌群结构，窖泥DNA的PCR扩增引物为515modF(5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’)与806modR(5’-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’)，对细菌和古菌的16S rRNA基因V4可变区进行扩增，建库与测序平台为Illumina Miseq PE300。
(4)通过16S rRNA基因高通量扩增子测序，获得窖泥内属水平下各类窖泥微生物相对丰度，计算得到窖泥内的微生物生物总量，同时基于原位相对丰度计算获得不同属微生物绝对丰度。
经16S rRNA基因扩增子高通量测序测定不同窖龄窖泥内内标与微生物菌群相对丰度，同时进行原位窖泥微生物绝对丰度换算，换算公式为：
A1为原位窖泥微生物的总绝对丰度(cells/g窖泥)；N为内标菌添加量(cells)，n为内标菌相对丰度(％)，m为窖泥质量(本实施例中为0.25g)；
经计算获得窖泥原位生物总量后，对原位窖泥微生物菌群组成相对丰度百分化，计
算属水平下窖泥内各类微生物的生物量，计算式如下：
A1原位窖泥微生物总量(cells/g窖泥)，A2为原位窖泥内某属水平微生物绝对丰度(cells/g窖泥)，a为原位窖泥内某属水平微生物相对丰度(％)。
方法建立完成，首先对内标的两种添加方式进行评估，即对添加丙酮丁醇梭菌基因组DNA和丙酮丁醇梭菌菌体细胞进行评估：
添加细胞时，梯度1含细胞数为1.42×106个/样本(0.25g窖泥)，浓度为5.78×106cells/g窖泥。根据换算公式(1)，梯度1添加基因组DNA的量为DNA6.27 ng/样本，浓度为25.08ng/g窖泥，内标添加比例为梯度1：梯度2：梯度3＝1:5:50。如图1所示，添加细胞时，梯度1含细胞数为1.42×106个/样本(0.25g窖泥)，浓度为5.76×106cells/g窖泥。经16S rRNA基因扩增子测序结果表明，添加细胞作为内标时，从低到高实际内标相对丰度比值为1:8.77:42.57。根据换算公式(1)，梯度1添加基因组DNA的量为DNA6.27 ng/样本，浓度为25.08ng/g窖泥。扩增子测序结果表明，从低到高内标相对丰度比值为1:4.51:12.98。可见，添加细菌细胞作为内标的方式更接近于理论内标梯度设定值(1:5:50)，表明添加细胞作为内标的绝对定量方法具有更高的可靠性，更适宜于窖泥微生物菌群结构分析。
实施例2：窖泥微生物总生物量估算
采用五点取样法，从某厂取得典型窖底泥5份，混合均匀，样本采集后立即放入厌氧袋中，于-80℃冰箱冻存待用。
按照实施案例1中的步骤(4)的描述方法，选择添加4.4×107cells/g窖泥的丙酮丁醇梭菌营养体细胞作为内标的方式进行窖泥DNA的提取后进行16S rRNA基因高通量扩增子测序，根据公式(2)可计算窖泥样品内的生物量。
如图2所示，5个窖泥样品内的生物总量不同，其中样品2的生物总量达1.32×108cells/g窖泥，样品3内的总生物量为2.58×105cells/g窖泥。添加丙酮丁醇梭菌作为内标的方式，可以在观察菌群结构的基础上，快速的计算窖泥内的总生物量，相较于使用PLFA或氯仿熏蒸培养法更加快速便捷，且跟qPCR的定量技术相比具有更广的适用范围。
实施例3：不同窖龄窖泥乳酸菌绝对丰度的测定
取某酒厂各个不同窖龄层级窖池窖泥，每个窖龄层级取5个窖池，采用五点取样法，取窖底泥混合均匀，样品一经采集，即刻放入厌氧袋内，于-80℃冻存样本待用。窖泥样品信息如表1所示。
表2.窖泥样品统计
按照实施例1中的步骤(4)的描述方法，选择添加4.4×107cells/g窖泥的丙酮丁醇梭菌营养体细胞作为内标的方式进行窖泥DNA的提取后进行16S rRNA基因高通量扩增子测序测定窖泥内的乳酸杆菌属绝对丰度，根据公式(3)可计算窖泥样品内的乳酸杆菌属的生物量。
乳酸杆菌属是新窖与退化窖泥内的特征微生物，如图3所示，相对丰度的分析结果表明新窖泥与正老熟窖泥内具有较高丰度的乳酸杆菌属，新窖泥、正老熟窖泥、老窖泥中乳酸杆菌属平均相对丰度分别为53.85％，29.7％，2.7％。浓香型白酒生产中认为大量的乳杆菌属不利于优质白酒的生产，但通过绝对定量分析表明窖泥老熟过程乳杆菌生物量不断增加，老熟窖泥内的乳酸杆菌属绝对丰度并未降低，反而大幅度增加。老熟窖泥内的乳杆菌属平均绝对丰度可达2.71×107cells/g窖泥，是新窖泥的20倍，为正老熟窖泥的1.5倍，这与通过相对定量得出的结论截然相反。表明通过相对丰度并不能反映窖泥内微生物量的真实组成，可能导致错误的结论，需要结合绝对定量方法进行生物量校正，可为窖泥菌群结构分析提供新的信息。
实施例4：绝对定量方法用于窖泥质量判定
采用实施例2中的窖泥样本进行窖泥质量评价，按照实施例1中的步骤(4)的描述方法，选择添加4.4×107cells/g窖泥的丙酮丁醇梭菌营养体细胞作为内标的方式，提取窖泥DNA，进行16S rRNA基因高通量扩增子测序测定窖泥内的己酸菌属、互营单胞菌属、甲烷杆菌属、甲烷八叠球菌属和甲烷短杆菌绝对丰度，根据公式(3)可计算窖泥样品内的己酸菌属、互营单胞菌属、甲烷杆菌属、甲烷八叠球菌属和甲烷短杆菌的生物量。
结果如图3所示，己酸菌属是窖泥内主要产己酸菌，在老熟窖泥中的平均绝对丰度可达5.90×108cells/g窖泥，绝对丰度分别为新窖泥和正老熟窖泥的12500倍和20倍；正老熟窖泥样本中，己酸菌属平均丰度为2.54×107cells/g窖泥，高于新窖泥内的2.35×104cells/g窖泥，是新窖泥内的1000倍(图4A)。己酸菌属的相对丰度和绝对丰度丰度均随着窖泥的老熟逐步升高，其生物量呈现出数量级增长的变化，最终在老熟窖泥内占据绝对优势。不同老熟程度窖泥内的互营单胞菌属相对丰度无显著差异，但对比绝对丰度，老熟窖泥内的绝对丰度可达1.30×107cells/g窖泥，分别是新窖泥内与正老熟窖泥的125倍和8倍(图4B)。以甲烷杆菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷短杆菌属为代表的甲烷菌是窖泥内主要甲烷菌，它们的相对丰度和绝对丰度占比随着窖泥的老熟不断升高：甲烷杆菌属在老熟窖泥内的平均绝对丰度可达2.15×108cells/g窖泥，分别为新窖泥和老熟窖泥的48829倍和1790倍；甲烷八叠球菌属的平均绝对丰度为8.89×107cells/g窖泥，分别为新窖泥和正老熟窖泥的7362倍和2403倍；甲烷短杆菌属的平均绝对丰度微1.94×107cells/g窖泥，分别为新窖泥和正老熟窖泥的1077倍和35倍(图4C-E)。
可以看出，虽然通过相对丰度呈现的物种结构，可以明确窖泥内的窖泥菌属差异，但相对丰度的变化趋势并不一定能真正反映实际的微生物绝对丰度变化趋势，如互营单胞菌属、甲烷八叠球菌属和甲烷短杆菌属，用于评价窖泥的质量会存在偏差，而绝对丰度与相对丰度联用的方法可通过窖泥菌群结构和功能分析对窖泥质量评价提供更为全面精准的信息。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种测定窖泥微生物绝对定量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）选取丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)为内标菌；
（2）添加已知数量的内标菌于窖泥内作为内标菌，再进行窖泥DNA提取；
（3）通过16S rRNA基因高通量扩增子测序，获得窖泥内不同分类水平的属微生物相对丰度，以丙酮丁醇梭菌的数量为参照，得到原位窖泥微生物的总绝对丰度和原位窖泥内某属水平微生物绝对丰度；
原位窖泥微生物的总绝对丰度与内标菌存在如下关系：，
其中，A1为原位窖泥微生物的总绝对丰度，即单位质量的窖泥内的总微生物数；N为内标菌添加量，n为内标菌相对丰度，m为窖泥质量；
原位窖泥内某属的微生物绝对丰度与内标菌存在如下关系：
其中，A2为原位窖泥内某属水平微生物绝对丰度，a为原位窖泥内某属水平微生物的相对丰度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标菌以DNA或菌体细胞的形式添加至窖泥中。
3.权利要求1或2所述方法在窖泥总生物量测定中的应用。
4.权利要求1或2所述方法在窖泥乳杆菌属生物量测定中的应用。
5.权利要求1或2所述方法在窖泥质量评价的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，测定窖泥中不同属菌株的绝对丰度来评价窖泥质量，所述不同属菌株包括己酸菌属、互营单胞菌属、甲烷杆菌属、甲烷八叠球菌属和甲烷短杆菌。
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