CN107586834B

CN107586834B - 一种基于高通量测序和代谢产物导向的微生物分离方法

Info

Publication number: CN107586834B
Application number: CN201610512694.6A
Authority: CN
Inventors: 杜海; 徐岩
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2036-06-30
Also published as: CN107586834A

Abstract

本发明公开了一种基于高通量测序和代谢产物导向的微生物分离方法，属于微生物技术领域。本发明的方法，能够从复杂的微生物群落中得到具有特定相关代谢产物的微生物。采用本发明方法能够获知微生物群落结构中与目标代谢产物相关性最强的微生物种属，自此基础上设置与该微生物种属相应的培养基进行培养，克服了已有菌株分离筛选所存在的盲目性。

Description

一种基于高通量测序和代谢产物导向的微生物分离方法

技术领域

本发明涉及一种基于高通量测序和代谢产物导向的微生物分离方法，属于微生物技术领域。

背景技术

污水、土壤、窖泥、排泄物等复杂样品中往往生活着大量的微生物，包括细菌、真菌、放线菌、病毒和原生生物等。为了对复杂样品进行解析，往往需要从复杂的群落结构确定目标代谢物的来源。然而，如何从复杂的群落结构确定目标代谢物的来源一直是一大难题。以往只能通过可培养方式确定微生物与风味等代谢产物的关系，但某些微生物难以培养且难以确定单一微生物在复杂的体系中对某一代谢产物的贡献度。

以白酒为例。白酒是世界著名的六大蒸馏酒之一，其中，浓香型白酒占据重要地位，其产量及市场占有率占整个白酒行业的70％左右。浓香型白酒最具特色的生产工艺之一是采用泥窖发酵。窖池作为酒醅发酵容器，提供厌氧环境，其中的窖泥提供了大量的酿造用菌，产生许多对酒体有贡献的风味物质。除窖泥外，浓香型白酒酿造微生物还来源于大曲、小曲、空气、生产机械、水、原料等。其中窖泥和大曲是酿造过程中最主要的微生物来源。窖泥微生物与浓香型白酒主体呈香物质己酸乙酯的产生密切相关，因此窖泥微生物菌群在很大程度上影响浓香型白酒品质及风味特征。

窖泥中微生物经过长期高酸度、高水分、缺氧等极端环境的驯化，形成了与生产环境相互依存的特殊窖池微生物区系。全面地解析窖泥中的微生物菌群结构及多样性为评估窖泥质量与安全性、优化菌群结构、明确微生物代谢功能、强化代谢功能及发现新的微生物类群提供了重要依据。因此，窖泥群落结构一直是浓香型白酒领域的研究重点。有必要从窖泥中筛选能够产特定风味的微生物，以便于指导白酒的生产工艺。

目前，分离筛选窖泥为微生物的方法有传统的可培养技术、变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术、rRNA基因克隆文库技术。但传统的可培养技术具有不可避免的局限性，由于培养基与自然环境之间存在营养差异，大量微生物无法培养，而且筛选得到的菌株还需要进行长期的实验分析、比较才能得到想要的与特定风味相关的微生物。而变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术、rRNA基因克隆文库技术，只能得到微生物的菌群分布情况，无法得到特定的微生物菌株，更无法与风味对应上。

基于上述问题，迫切需要开发一种基于代谢产物导向的微生物筛菌方法，能够从复杂的微生物群落中筛选得到与特定风味相关的微生物。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种复杂微生物样品中代谢产物与微生物的对应关系的分析方法，所述方法包括：提取数个复杂微生物样品的基因组、采用高通量测序技术分别获取各样品的微生物群落信息，获得各样品的微生物菌群结构的定性和相对定量信息，并分析各样品的目标代谢产物含量，然后用EXCEL的CORREL函数分析技术和CCA分析(canonical correlation analysis，典型相关分析)技术分析微生物属种与目标代谢产物的相关性，得到与目标代谢产物相关性系数相对较高的1种或者多种微生物属种，即得到了与复杂微生物样品中目标代谢产物密切相关的微生物属种。

在本发明的一种实施方式中，所述复杂微生物样品的个数为5个以上，优选样品中目标代谢物质的含量差异较大的样品(比如相差20％、30％、50％、80％、80％以上等)，更优选包括含有目标代谢物质的样品和不含有目标代谢物质的样品。

在本发明的一种实施方式中，所述复杂微生物样品为污水、土壤、窖泥、排泄物等。

在本发明的一种实施方式中，所述复杂微生物样品为窖泥，取自窖池中的不同层次。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌群结构的定性和相对定量信息，是指微生物的属种和相对含量。

在本发明的一种实施方式中，所述代谢产物为风味物质。

在本发明的一种实施方式中，所述目标代谢产物，可以是4-甲基苯酚(PC)、双乙酰、硫化氢、二甲基二硫、异丁醇、二肽、2,4,6-三氯苯甲醚、糠醛、乙醛、乳酸、己酸、丁酸、吲哚、三甲基-吲哚等。

在本发明的一种实施方式中，所述的用EXCEL的CORREL函数分析技术和CCA分析技术分析微生物属种与目标代谢产物的相关性，具体是指：

(1)先用EXCEL的CORREL函数分析高通量测序技术得到的样品中微生物的属种与样品中目标代谢产物的相关性，得到相关性系数相对较高的1个或者多个微生物的属种名称；

(2)根据步骤(1)得到的相关性系数相对较高的微生物的属种信息，设定1种或者多种富集培养基，然后将同一种含有目标代谢产物的样品采用富集培养基进行培养，培养后检测目标代谢产物含量，目标代谢产物含量最高的培养基即为对目标微生物富集效果相对最好的富集培养基；

(3)将目标代谢产物含量不同的样品接种于步骤(2)得到的对目标微生物富集效果相对最好的富集培养基中进行发酵培养；

(4)发酵结束后测定发酵液中目标代谢产物的含量，选取目标代谢产物产量差异相对较大的发酵液作为代表性样品，提取基因组，通过高通量测序技术得到所述代表性样品中微生物的属种和含量，然后将发酵液中目标代谢产物含量和目标代谢产物含量最大的发酵液中的菌体含量靠前的微生物属种看作环境因子，做CCA分析，即得到与目标代谢产物相关性系数相对较高的1种或者多种微生物属种。

本发明还提供了一种基于所述分析方法的代谢产物导向的微生物分离方法，是先按照所述分析方法得到与目标代谢产物相关性系数相对较高的1种或者多种微生物属种，再根据与目标代谢产物相关性系数相对较高的微生物属种制定相应的分离策略。

在本发明的一种实施方式中，所述制定相应的分离策略，是指采用适合与目标代谢产物相关性系数相对较高的微生物属种的相应的培养基进行培养。

在本发明的一种实施方式中，所述用EXCEL的CORREL函数进行相关性分析，计算公式为：

(4)发酵结束后测定发酵液中目标代谢产物的含量，选取目标代谢产物产量差异相对较大的发酵液作为代表性样品，提取基因组，通过高通量测序技术得到所述代表性样品中微生物的属种和含量，然后将目标代谢产物和目标代谢产物含量最大的发酵液中的菌体含量靠前的微生物属种看作环境因子，做CCA分析，即得到与目标代谢产物相关性系数相对较高的1种或者多种微生物属种。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的富集培养基为己酸菌培养基(g·L^-1)：酵母膏5，蛋白胨5，乙酸钠6，磷酸氢二钾0.4，硫酸镁0.2，硫酸铵0.5，碳酸钙5，磷酸氢二钾1，磷酸二氢钾0.5，乙醇20mL(乙醇在接种前加入)。如果是己酸菌固体培养基，那么添加琼脂。

在本发明的一种实施方式中，所述样品为窖泥；所述步骤(2)的培养，是将新鲜窖泥悬于0.85-0.95％NaCl溶液，在固体培养基涂布后放于厌氧培养箱37℃静置培养3天，挑取单菌落划线，划线得到单菌落后挑选单菌落于液体培养基中，在37℃的厌氧培养箱中培养3天。

在本发明的一种实施方式中，所述新鲜窖泥5g悬于100mL NaCl溶液。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述的菌体含量靠前的微生物属种，是选择含量排前7或者前10的微生物属或者种。

本发明的优点和效果：

本发明方法，能够从复杂的微生物群落中得到具有特定相关代谢产物的微生物。采用本发明方法能够获知微生物群落结构中与目标代谢产物相关性最强的微生物种属，自此基础上设置与该微生物种属相应的培养基进行培养，克服了已有菌株分离筛选所存在的盲目性。

附图说明

图1为窖壁上、窖壁中、窖池底部窖泥中PC含量；

图2为三种培养基培养窖泥后PC浓度与梭菌属基因拷贝数含量图；

图3为细菌属组成结构；

图4为PC和菌群结构CCA分析。

具体实施方式

实施例1：窖泥样品采集

窖泥作为浓香型白酒中的主要微生物来源之一，不仅贡献了大量的有益风味物质，一些不好的风味物质如窖泥臭也进入酒体。徐岩团队检测窖泥中的可挥发性组分后，应用现代分离及风味研究技术，确认产生窖泥臭的化合物是4-甲基苯酚(PC)，PC感官描述为窖泥臭、皮革臭、焦皮臭、动物臭，并测定该物质在46％vol酒精水溶液中的嗅觉阈值为166.97μg·L^-1。朱燕等人检测酒中酚类物质时，在浓香、清香、酱香型白酒中均检测到PC，其中浓香型白酒中该物质的含量可达1196μg·L^-1，明显高于其它香型。PC含量过高，窖泥臭味明显，会严重破坏酒体的原有风味体系，造成质量问题。虽然已经确定浓香型白酒中窖泥臭风味主要来源于PC。但浓香型白酒酿造微生物体系复杂，且窖泥厌氧微生物需要较为严苛的分离及培养条件。因此关于PC的微生物来源及代谢途径的研究还是一片空白。

窖泥样品取自浓香型酒厂白酒，窖泥共取样3次，取样窖池不同，取法相同。窖壁上部窖泥取样点距地面约0.2m，窖壁中部窖泥取样点距地面约1m，窖底窖泥取样点距地面约2m。上述窖泥取样点分别从四壁中点取样，每个点取约100g，并混匀作为一个样品，取三个窖池作为平行样。窖底窖泥样品采用五点取样法，每个点取约100g，然后混匀作为一个样品，取三个窖池作为平行样。样品分4℃和-20℃保存，分别用于菌株分离及风味检测。

实施例2：窖池不同层次窖泥中PC含量变化及菌群结构解析

提取窖泥基因组、采用MiSeq方法测定窖泥菌群结构，并测定窖泥中PC含量。

一、窖泥基因组提取

具体提取步骤如下：

1.将3g新鲜窖泥样品用20mL无菌0.1mo·L^-1PBS(0.0577mol·L^-1Na₂HPO₄，0.0423mol·L^-1NaH₂PO₄)缓冲液悬浮，加入5颗玻璃珠，漩涡震荡2～3min。

2.300g·min^-1离心5min，取上清，沉淀用PBS缓冲液充分洗涤3次，离心后收集全部上清。

3.12000r·min^-1离心10min，收集细胞沉淀。

4.分别用5mL PBS洗涤3次至溶液干净无色，加入1min buffer Z(10mmol·L^- ¹TrisHCl；pH 8.0，150mmol·L^-1NaCl)。

5.将重悬的菌体混匀后，转移至加油0.3g玻璃珠(0.1mm)的螺帽管中，加入150μl苯酚，Beadbuter细胞破碎仪以最大速度击打4min(每次80s，共3次，中间将螺帽管冰浴1min)。

6.击打4min后，加入110μL 10％SDS，轻轻混匀后，冰浴10min，每5min轻轻颠倒混匀。

7.加入150μl氯仿和异戊醇(24:1)溶液后混匀，12000r·min^-1离心12min，收集上清，加入十分之一体积的3mol·L^-1醋酸钠。

8.分别用等体积的苯酚、苯酚：氯仿(1：1)、氯仿各抽提一次，12000r·min^-1离心10min后，收集上清。

9.加入2倍体积冰乙醇后，-20℃至少沉淀2h，12000min^-1离心20min后，弃上清，沉淀于真空干燥机中干燥，干燥后溶于无菌水中。

二、提取基因组后送北京奥维森基因科技有限公司测序。

16S rDNAV3、V4区扩增，引物为338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。

三、窖池不同层次窖泥中PC含量测定

窖池上中底部窖泥接触氧气的时间及所处位置的氧气浓度是不同的，且营养物质含量及pH都存在差异，菌群结构也应是有差异的，测定窖壁上部(距地面约0.2m)、窖壁中部(距地面约1m)、窖池底部(距地面约2m)窖泥中的PC含量。窖壁上、窖壁中、窖池底部窖泥中PC含量如图1所示，含量分别为4.62、8.53、16.91mg/kg。

不同层次窖泥中均检测到PC，且窖池由上部到底部，PC含量逐渐升高，窖池底部窖泥含量最高，达到16.90mg·kg^-1。风味是微生物代谢的产物，PC含量不同，微生物群落结构也应存在差异。已有研究表明酒醅中细菌的种类及数量也明显多于真菌。目前，研究学者已发现的产PC的菌株较少，但都属于细菌。因此，本发明主要针对细菌菌群进行研究。

四、不同层次窖泥中细菌菌群结构分析

为明确窖泥中产PC的主要菌群，运用高通量测序技术测定窖壁上部、窖壁中部、窖池底部窖泥中的菌群结构。

表1窖池上部、中部、底部窖泥样品中微生物群落多样性指数

覆盖率在97.45％以上，表明测序深度较好，能反映样品中的物种信息。窖池中，从窖壁上部到窖池底部窖泥中的操作分类单位(operational taxonomic unit，OTUs)的数目逐渐增多。其中上部窖泥中约有389个OTUs，中部窖泥约有944个OTUs，底部窖泥约有1572个OTUs。底部窖泥中0TUs约为上部窖泥的4倍。底部窖泥样品中微生物多样性指数Chao1指数、Shannon指数和谱系多样性指数均最高，而上部窖泥样品均最低。这表明底部窖泥中样品物种丰富度要明显高于窖壁上部窖泥。

表2窖壁上、窖壁中、窖池底部窖泥细菌纲结构组成表

注：Other代表含量低于1％纲的和；Unclassified代表含量大于1％，但是不确定纲的类别的和。

在纲水平，窖泥样品共检测到41个纲。其中7个(含量大于1％)为主要优势纲，分别是Clostridia、Bacteroidia、Synergistia、Bacilli、Mollicutes、Coriobacteriia和Anaerolineae。Clostridia和Synergistia在中部和底部窖泥中的含量高于上部窖泥，而Bacilli在上部窖泥中的含量明显高于中底部窖泥。PC浓度在中底部窖泥中的含量明显高于上部窖泥。因此，初步推测Clostridia和Synergistia产PC的可能性较大。

表3窖泥中细菌属水平组成

注：Uncalssified代表高于1％，但是无法确定属类别的和；Other代表含量低于1％属的和。

在属水平，窖泥样品共检测到108个属。其中含量在1％以上的属共有18个。三个不同位置窖泥样品细菌结构在属水平上存在较大差异。上部窖泥样品以Ruminococcus、Lactobacillus和Prevotella(含量在5％以上)为主，中部窖泥样品以Ruminococcus和Sedimentibacter为主，底部窖泥样品以Syntrophomonas、Caloramator、Ruminococcus和Clostridium为主。

用EXCEL的CORREL函数进行相关性分析，计算公式为：

使用相关系数可以确定两种属性之间的关系。与PC相关性较高(相关性系数＞0.95)的属有6个，分别是Syntrophomonas、Coprococcus、Caloramator、Clostridium、Tepidimicrobium和Sporanaerobacter。这6个属都属于Clostridiales。其中，Clostridium和Caloramator属于Clostridiaceae，Syntrophomonas属于Syntrophomonadaceae，其余三个属都属于Tissierellaceae。上述六个属极可能是PC的主要微生物来源。

实施例3：不同培养基培养窖泥混合微生物后发酵液中PC浓度与菌群结构分析

为进一步明确窖泥中PC的主要菌群来源，设计窖泥培养实验。牛肉膏蛋白胨培养基(X)为基础培养基，己酸菌培养基(J)和强化梭菌培养基(R)可针对培养重要酿造功能菌己酸菌和梭菌。相同培养基样品间只有菌群结构一个变量。利用三种培养基构建PC浓度差异较大的样品，探究菌群结构与PC浓度之间的关系。

表4三种培养基培养窖泥混合微生物后PC产量与梭菌属基因拷贝数

如表4所示，窖泥经三种培养基培养后，三种培养基中梭菌属基因拷贝数由低到高分别为强化梭菌培养基(R)、牛肉膏蛋白胨培养基(X)、己酸菌培养基(J)。其中J中梭菌属基因拷贝数约为R中6.75倍，X中的1.36倍。说明强化梭菌培养基对窖泥中的梭菌培养效果不佳，己酸菌培养基对梭菌属的富集效果最好。

此外，考察了三种培养基培养窖泥后PC浓度与梭菌属基因拷贝数含量之间的关系(图2)。结果发现，培养基相同的情况下，因菌群结构差异，不同样品PC含量差别较大。其中，强化梭菌培养基中PC浓度在0.07～1.29mg·L^-1之间，牛肉膏蛋白胨培养基中在0.02～2.25mg·L^-1之间，己酸菌培养基在0.02～9.77mg·L^-1之间。相同培养基不同样品间梭菌属基因拷贝数也存在较大差异，由此得知样品间菌群结构差异较大。己酸菌培养基样品中PC浓度与梭菌属拷贝数呈负相关关系，R²为-0.45。强化梭菌培养基样品中PC浓度与梭菌属拷贝数无明显关系，R²仅为0.09。牛肉膏蛋白胨培养基样品中PC浓度与梭菌属拷贝数无明显关系。

发酵结束后，挑选PC产量差异较大的样品，提取基因组，然后用Miseq测定其中的细菌菌群结构。如图3所示。

所有样品中共检测出15个细菌门，其中厚壁菌门(Firmicutes)为绝对优势菌，占98.66％以上。梭菌纲中的梭菌科占50％以上。所有样品中共检测出106个细菌属，其中含量在1％以上的属包括Clostridium、IncertaeSedis、Bacillus、Lactobacillus、Tepidimicrobium、Anaerosporobacter等。Clostridium含量最高，在24.65～86.66％之间。不同样品菌群结构存在一定差异，同一属在不同样品中存在较大差异。样品共有的属有Tepidimicrobium、Stenotrophomonas、IncertaeSedis、Clostridium和Citrobacter。其中Citrobacter和Stenotrophomonas含量较低，在0.05％以下。

己酸菌培养基样品间PC浓度差值最大，其中J2(己酸菌培养基中2号样品)PC含量达到9.77mg·L^-1，选取其作为代表性样品。将PC与J2含量前7的属看作环境因子，做CCA分析，如图4。

CCA分析显示，PC与Clostridium sensustricto12和Clostridiumsensustricto14的正相关性最高，与Clostridium sensustricto10和Clostridiumsensustricto18呈负相关关系。Clostridium sensustricto12和Clostridiumsensustricto14中的菌株产PC的可能性较大，而Clostridium sensustricto10和Clostridium sensustricto17中的菌株产PC的可能性较小。

典范对应分析(canonical correspondence analusis,CCA)，是基于对应分析发展而来的一种排序方法，将对应分析与多元回归分析相结合，每一步计算均与环境因子进行回归，又称多元直接梯度分析。其基本思路是在对应分析的迭代过程中，每次得到的样方排序坐标值均与环境因子进行多元线性回归。CCA排序图解释：箭头表示环境因子，箭头所处的象限表示环境因子与排序轴之间的正负相关性，箭头连线的长度代表着某个环境因子与研究对象分布相关程度的大小，连线越长，代表这个环境因子对研究对象的分布影响越大。箭头连线与排序轴的家教代表这某个环境因子与排序轴的相关性大小，夹角越小，相关性越高。

根据EXCEL的CORREL函数分析属与PC的相关性，相关性系数在0.5以上的属包括Clostridium sensustricto9、Escherichia-Shigella、Fonticella、Clostridiumsensustricto1、Proteiniphilum和Clostridium sensustricto12。其中Clostridiumsensustricto9、Clostridium sensustricto1和Clostridium sensustricto12属于梭菌属。Clostridium sensustricto9与PC的相关性最强，相关性系数为0.94；Clostridiumsensustricto12在样品中的平均含量最高，达到17.50％。

OTUs序列在NCBI在线库比对显示，Clostridium sensustricto9中主要包括Clostridium amylolyticum和Clostridium tyrobutyricum。Clostridiumsensustricto12中含量由高到低依次为C.tyrobutyricum、Clostridium aciditolerans、Clostridium acetobutylicum和Clostridium sporogenes。Clostridium sensustricto12中主要是Clostridium bowmanii和C.sporogenes。上述菌株与PC的相关性较高。

选择每种培养基选择PC浓度不同的代表性样品。统计J1、J2、J6和J9四个样品中readers数大于1000的OTUs序列，并在NCBI在线库比对结果如表5所示。

表5己酸菌培养基中OTUs(readers>1000)的种的含量及与PC相关性分析

己酸菌培养基样品中，readers大于1000的OTUs序列占各个样品总readers的78.74～93.71％，基本可以反映样品绝大部分微生物信息。四个样品以梭菌属细菌为优势菌。根据相关性系数，Clostridium tyrobutyricum、C.sporosphaeroides、C.sporogenes、C.acetobutylicum和C.amylolyticum相关性系数均大于0.48，上述5株菌产PC的可能性较大。四个样品中J2和J6中PC含量最高。C.tyrobutyricum与PC的相关性系数达到0.88，且在J2、J6中含量达到30％，极有可能是己酸菌培养基样品中PC的主要产生菌。C.subterminale和C.populeti是J9和J1中的主体菌，含量在15％以上，但与PC的相关性系数只有-0.71，推测这两株菌不产PC或产PC的能力极弱。

表6强化梭菌培养基中OTUs(readers>1000)的种的含量及与PC相关性分析

强化梭菌培养基四个样品中，readers大于1000的OTUs序列占各个样品总readers的85.23～95.11％，基本可以反映各样品的微生物信息。四个样品也以梭菌属细菌为主体菌群。根据相关性系数，Clostridium swellfunianum、C.sporosphaeroides、C.sporogenes、C.tyrobutyricum相关性系数均为正值，产PC的可能性较大。其中C.swellfunianum相关性系数最高，达到了0.95，产PC的可能性较大。C.acetobutylicum和C.subterminale为R9和R8的主体菌，含量在27％以上，但两个样品中PC含量低于0.3mg·L^-1。由此推论，C.acetobutylicum和C.subterminale不产生PC或产PC的能力极弱。

表7牛肉膏蛋白胨培养基中OTUs(readers>1000)的种的含量及与PC相关性分析

牛肉膏蛋白胨培养基样品中，readers大于1000的OTUs序列占各个样品总readers的87.03～94.02％，基本可以反映各样品的微生物信息。四个样品中也以梭菌属为主体菌群。其中含量最高的是C.sporogenes，含量在24％以上。C.sporogenes在X4中的含量达到了44％，但PC浓度只有0.04mg·L^-1。因此判断C.sporogenes并不产生PC。C.argentinense在X4中含量达到23.38％，但X1和X6中并未检测到，判断其也不产PC。C.amylolyticum在X4中含量为18.27，说明其也不产PC。根据相关性系数，C.swellfunianum、C.subterminale和C.mangenotii相关性系数均大于0.84，产PC的可能性较大。

三种培养基中细菌菌群均以梭菌属为优势菌属。其中C.tyrobutyricum、C.sporogenes和C.swellfunianum为三种培养共有。但不同培养基间含量存在较大差异，己酸菌培养基中以C.tyrobutyricum为主，而牛肉膏蛋白胨培养基中以为主。己酸菌培养基添加乙醇和乙酸钠为碳源，而牛肉膏蛋白胨中的碳源只有葡萄糖。C.tyrobutyricum利用乙醇的能力强于C.sporogene。己酸菌培养基中的PC产量明显高于牛肉膏蛋白胨培养基。因此C.tyrobutyricum产PC的可能性较大。

综合三种培养基中各样品PC浓度及种属的含量推测，C.tyrobutyricum、C.sporosphaeroides、C.swellfunianum和C.mangenotii产PC的可能性较大。C.subterminale、C.amylolyticum、C.populeti、C.acetobutylicum、C.argentinense和C.sporogenes产PC能力极弱或不产PC。

实施例4：窖泥中产PC微生物的分离与鉴定

对窖泥中产PC微生物进行强化梭菌培养基(RCM)分离，通过菌落形态初步判断多株为细菌菌株，测定16S rRNA基因序列后与Genbank数据库比对，确定种属。

与Genbank数据库比对后，得到4个可以产生PC的种，分别是Eubacteriumcontortum、C.tyrobutyricum、C.butyricum和C.aminovalericum。上述4个种都属于Clostridiales，除Eubacterium contortum外都属于Clostridium。而梭菌属在窖底窖泥中含量以达到了5.23％。因此，梭菌属可能为PC主要微生物来源。

C.tyrobutyricum约占窖泥原核微生物0.04％。三种培养基培养窖泥后PC及各菌群的含量分析显示，C.tyrobutyricum极可能产生PC。分离后的菌株C.tyrobutyricum确实可以产PC且PC产量较高。综上得出，梭菌属为PC的主要微生物来源。C.tyrobutyricum为窖泥微生物培养后发酵液中PC的主要来源。其PC产量较高，在窖泥中相对含量约为0.04％，是PC的主要贡献种之一。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种基于代谢产物导向的微生物分离方法，其特征在于，所述方法包括：提取数个复杂微生物样品的基因组、采用高通量测序技术分别获取各样品的微生物群落信息，获得各样品的微生物菌群结构的定性和相对定量信息，并分析各样品的目标代谢产物含量，然后用EXCEL的CORREL函数分析技术和CCA分析技术分析微生物属种与目标代谢产物的相关性，得到与目标代谢产物相关性系数相对较高的1种或者多种微生物属种，即得到了与复杂微生物样品中目标代谢产物密切相关的微生物属种；再根据与目标风味产物相关性系数相对较高的微生物属种制定相应的分离策略；所述代谢产物为是4-甲基苯酚；所述的用EXCEL的CORREL函数分析技术和CCA分析技术分析微生物属种与目标代谢产物的相关性，具体是指：

（1）先用EXCEL的CORREL函数分析高通量测序技术得到的样品中微生物的属种与样品中目标代谢产物的相关性，得到相关性系数相对较高的1个或者多个微生物的属种名称；

（2）将目标代谢产物含量不同的样品接种于富集培养基中进行发酵培养；所述富集培养基为己酸菌培养基：酵母膏 5g·L^-1，蛋白胨 5g·L^-1，乙酸钠 6g·L^-1，磷酸氢二钾0.4g·L^-1，硫酸镁0.2g·L^-1，硫酸铵 0.5g·L^-1，碳酸钙 5g·L^-1，磷酸氢二钾 1g·L^-1，磷酸二氢钾 0.5g·L^-1，乙醇 20 mL；

发酵结束后测定发酵液中目标风味物质的含量，选取目标代谢产物产量差异相对较大的发酵液作为代表性样品，提取基因组，通过高通量测序技术得到所述代表性样品中微生物的属种和含量，然后将目标代谢产物和目标代谢产物含量最大的发酵液中的菌体含量靠前的微生物属种看作环境因子，做CCA分析，即得到与目标代谢产物相关性系数相对较高的1种或者多种微生物属种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制定相应的分离策略，是指采用适合与目标代谢产物相关性系数相对较高的微生物属种的相应的培养基进行培养。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复杂微生物样品为污水、土壤、窖泥、排泄物。