CN113151002A - 一种平菇木霉及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种平菇木霉，上述平菇木霉的拉丁学名为Trichodermapleurotum，菌株号TR1262，保藏号为CGMCC No.21428。本发明还公开了一种有机水溶肥，含有本发明木霉菌发酵产生的木霉菌发酵上清液。本发明通过发酵工艺，既解决了木霉菌工业废水的环境污染问题，又使废物得到再利用，产生了环境与经济的双重效益。本发明制备的有机水溶肥不仅可以明显提高农作物的产量，改善农作物的品质，长期使用可以改良土壤环境以及增强植物的抗逆性和抗病性。

Description

一种平菇木霉及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种平菇木霉及其应用。
背景技术
木霉菌(包括“平菇”木霉)是自然界中对多种植物病原菌有抑制和灭杀功能的微生物。人类利用木霉菌的优良特性，通过特定的加工工艺和技术，将其制成不同剂型的生物农药。木霉菌分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的厚垣孢子、具有易贮藏和使用方便等特点，并且具有以下功效：防治多种植物病害，促进植物生长。
水溶性肥料是一种能够完全溶解于水的多元素复合型肥料，相对于传统的过磷酸钙、造粒复合肥等非全水溶性肥料和缓释品种，水溶性肥料更具有速溶、吸收率高、见效快、无残渣、施用方便等显著优点，得到了现代农业的高度重视和迅猛发展。尤其是在温室效应所带来的日趋严重的环境保护及水资源匮乏的情况下，滴灌系统、喷施喷灌等具有显著节水、节肥功能的新型施肥方式开始得到推广应用，使农业施肥者对肥料的认识发生了根本的变化。截止到2015年6月1日，在农业部登记的水溶肥料品种有6545个，其中大量元素水溶肥料1383个，微量元素水溶肥料1668个，含氨基酸的水溶肥料1630个，含腐植酸水溶肥料1527个，中量元素水溶肥料240个，有机水溶肥料97个。国内各种水溶肥料的产量相差较大，其中大量元素水溶肥料占68％，中量元素的占10％，腐植酸水溶肥料占12％，其他类型的占10％。
近年来，随着我国生物农药行业的迅猛发展，与木霉菌相关的产品增长势头强劲。目前生物农药企业多采用液体发酵技术，批量生产木霉菌制剂。在木霉菌等活体微生物制剂的生产过程中，会产生大量的发酵上清液。每生产1kg的木霉菌产品就有1.5kg的发酵上清液产生。这些上清液中含有多种微量元素，以及发酵过程中产生的小分子和大分子活性物质活性物质，如多种氨基酸、蛋白酶等。这些活性物质再配以腐植酸，能促进作物根系生长，增强作物抗逆能力，促进土壤中有益微生物代谢和生长，缓冲土壤酸碱度，提高土壤保水、保肥和通气能力，提高作物对土壤水肥的吸收，使植株生长健壮，根深叶茂，增加植株干重；促进叶片光合作用，使得果实光亮，促进中微量元素吸收，增加果实重量。然而目前木霉菌制剂生产工厂处理发酵上清液的正常流程是其经过三废处理排放进入环境，这样“简单粗暴”的处理方式，不仅造成一定程度的资源浪费，而且存在污染环境的问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种平菇木霉及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明的第一方面是提供一种平菇木霉，所述平菇木霉的拉丁学名为Trichoderma pleurotum，菌株号TR1262，保藏号为CGMCC No.21428。
本发明的平菇木霉(Trichoderma pleurotum)菌保藏于于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期2021年1月13日。
本发明的第二方面是提供一种平菇木霉发酵上清液，采用上述平菇木霉(Trichoderma pleurotum)菌发酵，平菇木霉发酵上清液的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将所述平菇木霉菌种接于PDA培养基中，恒温培养；
步骤二，将经步骤一培养后的菌种转移至培养液中进行摇瓶培养24-48h，得到一级种子液；
步骤三，将中级发酵罐中的培养液高温高压灭菌，再倒入步骤二所得的所述一级种子液，加压通入无菌空气进行发酵6-8天，得到平菇木霉发酵液；
步骤四，使用离心机将所述平菇木霉发酵液进行离心，即得所述平菇木霉发酵上清液。
进一步地，步骤二和步骤三中，所述培养液包括如下重量比的组分：
Figure BDA0002932086860000021
Figure BDA0002932086860000031
进一步优选地，步骤二和步骤三中，所述培养液包括如下重量比的组分：
Figure BDA0002932086860000032
进一步地，步骤三中，所述发酵的条件为：28～30℃、0.4～0.5kg压力、1500～1800L/H空气流量和120～150rpm转速。
进一步地，步骤三中，所述高温高压灭菌的具体为：121℃、15磅压力下灭菌20min。
进一步地，步骤三中，所述高温高压灭菌后，所述中级发酵罐保持正压，冷却至28～30℃。
进一步优选地，步骤三中，所述高温高压灭菌后，所述中级发酵罐保持正压，冷却至30℃。
进一步地，所述中级发酵罐指的是大于1L而小于1吨规格的发酵罐，所述规格为本技术领域公知常识。
进一步地，在所述高温高压灭菌之前，向所述中级发酵罐内投入消泡剂；在100L规格发酵罐中消泡剂加入体积优选为50ml。
本发明的第三方面是提供一种有机水溶肥，含有上述的平菇木霉发酵上清液，包括如下重量百分比的组分：
Figure BDA0002932086860000033
上述有机水溶肥采用如下方法制备：按照配比，将所述平菇木霉发酵上清液投入配料罐中，然后开启搅拌装置；再将所述海藻精加入所述配料罐中，待搅拌彻底溶解后，再加入硝酸钾、尿素、磷酸氢二钾、糖蜜粉、鱼粉蛋白，搅拌完全溶解后，过滤即得所需的有机水溶肥。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明通过发酵工艺，既解决了平菇木霉工业废水的环境污染问题，又使废物得到再利用，产生了环境与经济的双重效益。
本发明制备的有机水溶肥不仅可以明显提高农作物的产量，改善农作物的品质，长期使用可以改良土壤环境以及增强植物的抗逆性和抗病性。
附图说明
图1为本发明TR1262的分生孢子梗形态的电镜图；
图2为本发明TR1262的孢子形态的电镜图；
图3为本发明TR1262的PDA平板照片。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
本实施例提供了一种平菇木霉，从青海省西宁市草莓根围土壤中采集分离得到，上述平菇木霉的拉丁学名为Trichoderma pleurotum，菌株号TR1262，保藏号为CGMCCNo.21428。
本发明的平菇木霉(Trichoderma pleurotum)菌保藏于于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期2021年1月13日。
平菇木霉的分类鉴定：
上述平菇木霉株在MA上菌落产生有限的气生菌丝，分生孢子梗平展，产孢稀少，开始为白绿色，然后变为灰绿色，逐渐成为暗绿色，老龄时最终为暗灰绿色，菌落区产孢均匀，形成小而不规则的小疱；在PDA上，产孢较多，老龄时为黑绿色。MA反面为无色；在PDA经常产生浅黄色的扇形区，老龄时变为明显的暗黄色至红褐色。
参照图1～图3，上述平菇木霉株分生孢子梗从基质生出，基部一般不分枝，大多数部分具有粘帚霉型的初级分枝，分枝单生，排列不规则，或者在接近顶端位置多达4个分枝排列为旋涡状，分生孢子梗和初级分枝的顶生排列致密的瓶梗。分生孢子梗和分枝相对较宽，基部直径可达8μm，终端分枝一般长度为4～13μm，宽度为3～4μm。瓶梗一般在最终分枝上4～7个排列为轮枝状，近似安瓿形。常常弯曲，在孢子着生顶点附近突然缢缩，大小通常为4.5～7.5×2.5～4.0μm，单生瓶梗少见，没有观察到间生瓶梗，老龄培养物中瓶梗留存。大多数的分生孢子为椭圆形，偶尔可见倒卵形，一端尖细，也有少部分孢子为亚球形，大小为2.5～4.8×1.7～2.6μm(平均3.6×2.1μm)，显微镜下为苍绿色，聚集成团时为黑绿色，壁光滑。厚垣孢子少见，亚球形。
平菇木霉的分子生物学菌种鉴定：
通过PCR(Polymerase Chain Reaction，多聚酶链式反应)对上述TR1262菌株进行基因扩增，通过分子生物学方法鉴定TR1262，确定TR1262的进化关系。上述TR1262的ITS1-5.8S-ITS2基因序列及Tef1α序列序列如下：
ITS1-5.8S-ITS2基因序列：
AAATGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCCCTCGTGGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTCCCTCTGCGGGGGCCGTCTCCGAAATCCAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAGCGGGAGGAA
Tef1α序列：
TCATCCGAGAAAATCGAGAAGGTAAGCTTGACCTGATTTTCGCCTCACTTCTCCCTCCACATTCAATTGTGCCCGACGATTCTGCAGAGAATTTTCGTGTCGACAATTGATATCACCCCGCTTTCCGTTACCCCTCCTTTGGCAGCGACGCAAATTTTTTTGGCAGCCGTTTGGCTTTGGTGGGGTTTTGTGTGCACCCCACTAGCTCGCTGCTTTTTTTTCTGCTTCACTCCCCCCACTAGCCCAGTCATGATTCAACGTGCTCTGTGTCTCGCCATGCAGCGATGCTAACCGCTTTTTCCATCAATAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTACGCTTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTGTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTCTGCTGCTCCATCACCTCCATGCAGGAATGGCGAGCTGGTGCTAACAGGTCATGCGCAGACGCTCCCGGCCACCGTGATTTCATCAAGAACATGATCACTGGTACTTCCCAGGCCGATTGCGCCATTCTCATCATTGCCGCCGGTACTGGTGAGTTCGAGGCTGGTATCTCCAAGGGGATGG
通过分子生物学菌种鉴定并结合形态特征，可确定本发明分离的菌株为平菇木霉株。
上述平菇木霉株的分生孢子阶段为半知菌门(Deuteromycotina)，丝孢纲(Hyphomycetes)，丝孢目(Hyphomycetales)，丛梗孢(Moniliaceae)，木霉属(Trichoderma)，其有性态是属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、肉座目(Hypocreales)、肉座科(Hypocreaceae)、肉座菌(Hypocrea)。
实施例2
本实施例提供一种平菇木霉发酵上清液，上述平菇木霉发酵上清液的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将实施例1分离得到的平菇平菇木霉种接于PDA培养基中，恒温培养；
步骤二，将经步骤一培养后的菌种转移至培养液中进行摇瓶培养24h，得到一级种子液；
步骤三，将中级发酵罐中的培养液121℃、15磅压力下灭菌20min后，保持正压，冷却至30℃，然后向中级发酵罐中倒入步骤二所得的一级种子液，加压通入无菌空气，在28～30℃、0.4～0.5kg压力、1500～1800L/H空气流量和120～150rpm转速条下进行发酵6天，得到平菇木霉发酵液；
步骤四，使用离心机将平菇木霉发酵液进行离心，即得平菇木霉发酵上清液。
步骤二和步骤三中，上述培养液包括如下重量比的组分：
Figure BDA0002932086860000071
优选地，上述培养液包括如下重量比的组分：
Figure BDA0002932086860000072
实施例3
本实施例提供一种有机水溶肥，分别对应含有上述实施例2中采用组别1-3培养液所得的平菇木霉发酵上清液，分别包括如下(表1)重量百分比的组分：
表1
Figure BDA0002932086860000073
Figure BDA0002932086860000081
上述有机水溶肥采用如下方法制备：按照配比，将所述平菇木霉发酵上清液投入配料罐中，然后开启搅拌装置；再将所述海藻精加入所述配料罐中，待搅拌彻底溶解后，再加入硝酸钾、尿素、磷酸氢二钾、糖蜜粉、鱼粉蛋白，搅拌完全溶解后，过滤即得有机水溶肥，避光存贮在阴凉干燥处。
应用例
田间肥效试验：使用上述实施例3-1制备的有机水溶肥开展对车厘子的肥效试验。试验地点在云南省巍山县清华乡进行，车厘子品种为美早、大红灯、拉宾斯，示范面积200亩，示范时间：2020年2月至9月，试验方法：16升/亩/季。共设3种处理，分别是：无施肥对照、有机水溶肥(实施例3-组别1)、生物有机肥(河北闰沃生物技术有限公司)，施肥6个月后对车厘子的根系、树势、产量、品质等方面进行检测。
实验结果表明：
(1)本发明的有机水溶肥对车厘子的新芽促生效果比较明显，使用了本发明有机水溶肥的车厘子果树，其花芽分化的更多，且树势更加旺盛，叶片厚绿，并且有效的提高车厘子的产量和产值(如表2所示)。
表2
Figure BDA0002932086860000082
(2)从表3上可以看出，使用过本发明有机水溶肥的车厘子，其糖分、维生素C、有机酸都要高于市售生物有机肥和无施肥对照，说明该有机水溶肥对车厘子品质的提升有非常好的作用。
表3
检测项目 有机水溶肥 生物有机肥 无施肥对照
维生素C(mg/100g) 3.76 3.24 2.86
有机酸(mg/kg) 9.3×10<sup>3</sup> 8.8×10<sup>3</sup> 8.1×10<sup>3</sup>
糖度(％) 17.6 17.6 17.2
(3)从土壤的检测数据(表4)可以看出，使用了本发明有机水溶肥，土壤内的有机质含量、有效磷、速效钾、水解氮、阳离子交换量等都明显的增加，同时土壤容重降低，说明土壤疏松度、透气性更好。所有使用该有机水溶肥后能够有效的改善土壤换，增加土壤养分，提高作物吸收养分能力。
表4
检测项目 有机水溶肥 生物有机肥 无施肥对照
PH 4.8 4.7 4.3
有机质(g/Kg) 79.1 58.1 43.0
水解性氮(mg/kg) 311 278 194
有效磷(mg/kg) 31.4 28.8 26.8
速效钾(mg/kg) 764 658 302
阳离子交换量(cmol/kg(+)) 13.38 12.2 11.3
容重(g/cm<sup>3</sup>) 0.81 1.1 1.43
(4)本发明有机水溶肥在车厘子生长过程中进行液面喷施，对车厘子褐腐病具有一定的防治效果(如表5所示)。
表5
处理 用量 病情指数 防效
有机水溶肥 300-500倍 3.95 55.65
生物有机肥 300-500倍 4.66 23.89
无施肥对照 / 5.29 /
上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容及图示所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种平菇木霉，其特征在于，所述平菇木霉的拉丁学名为Trichoderma pleurotum，菌株号TR1262，保藏号为CGMCC No.21428。
2.一种平菇木霉发酵上清液，其特征在于，所述平菇木霉发酵上清液的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将所述平菇木霉菌种接于PDA培养基中，恒温培养；
步骤二，将经步骤一培养后的菌种转移至培养液中进行摇瓶培养24-48h，得到一级种子液；
步骤三，将中级发酵罐中的培养液高温高压灭菌，再倒入步骤二所得的所述一级种子液，加压通入无菌空气进行发酵6-8天，得到平菇木霉发酵液；
步骤四，使用离心机将所述平菇木霉发酵液进行离心，即得所述平菇木霉发酵上清液。
3.根据权利要求2所述的平菇木霉发酵上清液，其特征在于，步骤二和步骤三中，所述培养液包括如下重量比的组分：
Figure FDA0002932086850000011
4.根据权利要求3所述的平菇木霉发酵上清液，其特征在于，步骤二和步骤三中，所述培养液包括如下重量比的组分：
Figure FDA0002932086850000012
5.根据权利要求2所述的平菇木霉发酵上清液，其特征在于，步骤三中，所述发酵的条件为：28～30℃、0.4～0.5kg压力、1500～1800L/H空气流量和120～150rpm转速。
6.根据权利要求2所述的平菇木霉发酵上清液，其特征在于，步骤三中，所述高温高压灭菌的具体为：121℃、15磅压力下灭菌20min。
7.根据权利要求2所述的平菇木霉发酵上清液，其特征在于，步骤三中，所述高温高压灭菌后，所述中级发酵罐保持正压，冷却至28～30℃。
8.一种有机水溶肥，含有如权利要求2-7任一项所述的平菇木霉发酵上清液，其特征在于，包括如下重量百分比的组分：
Figure FDA0002932086850000021
9.根据权利要求8所述的有机水溶肥，其特征在于，采用如下方法制备：按照配比，将所述平菇木霉发酵上清液投入配料罐中，然后开启搅拌装置；再将所述海藻精加入所述配料罐中，待搅拌彻底溶解后，再加入硝酸钾、尿素、磷酸氢二钾、糖蜜粉、鱼粉蛋白，搅拌完全溶解后，过滤即得所述有机水溶肥。
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