CN113150156A - 抗tigit抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物学领域，涉及一种抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、其组合物及应用。本发明的抗TIGIT抗体及其抗原结合片段能够有效阻断TIGIT和其配体CD155和CD112的结合，进而有效促进T细胞的活化，具有良好的抗肿瘤应用前景。

Description

抗TIGIT抗体及其用途
技术领域
本发明属于生物学领域，涉及一种抗TIGIT抗体。
背景技术
恶性肿瘤(癌症)是严重影响中国人群健康的主要疾病之一，且近十几年来恶性肿瘤的发病死亡均呈持续上升态势。目前对于肿瘤的治疗手段仍以手术、放疗和化疗为主。随着对肿瘤发生机理的认识不断加深，免疫疗法彻底改变了晚期恶性肿瘤的临床治疗方式，也极大地扭转了肿瘤治疗手段的现状。以PD-1/PD-L1、CTLA-4等免疫检查点抑制剂为代表的免疫疗法可以阻断免疫抑制信号，从而促进T细胞的激活和对肿瘤的免疫应答。但是，目前免疫疗法存在响应率不高和耐药性的问题，表明存在其他免疫耐受机制帮助肿瘤逃脱免疫监控。
TIGIT是一种免疫共抑制受体，属免疫球蛋白超家族成员，主要表达于效应T细胞、记忆T细胞、调节T细胞(Treg)、NK细胞中。TIGIT目前已知的配体有CD155和CD112，CD155和CD112主要在DC细胞、巨噬细胞、T细胞等免疫细胞表面表达，此外，在很多肿瘤细胞上CD155和CD112有高表达。TIGIT信号通路在肿瘤细胞逃脱免疫监视中发挥了重要作用。TIGIT与CD155或CD112的结合可减弱DC细胞的抗原呈递功能，或直接向T细胞和NK细胞内部传递抑制性信号。当TIGIT在调节T细胞上表达时，TIGIT信号通路增强调节T细胞抑制功能，从而抑制多种免疫细胞的活性。研究表明，阻断TIGIT信号通路可增强效应T细胞和NK细胞活性，促进免疫细胞表达IFNγ。在小鼠肿瘤模型中靶向TIGIT单抗可减缓或抑制肿瘤的生长，临床上抗TIGIT单抗与其它免疫检查点抑制剂的联用可提高患者的响应率，并降低疾病风险。因此，特异性的抗TIGIT单抗可增强抗肿瘤免疫应答，是实现肿瘤免疫治疗的有效策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的抗TIGIT抗体，其能够与TIGIT特异性结合，对肿瘤治疗很有潜力。
第一个方面，本发明提供结合TIGIT或其片段的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括三个CDR，分别为VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，轻链可变区包括三个CDR，分别为VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；其中，
VH CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或者与SEQ ID NO：3有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
VH CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或者与SEQ ID NO：4有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
VH CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，或者与SEQ ID NO：5有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
VL CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，或者与SEQ ID NO：8有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
VL CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，或者与SEQ ID NO：9有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
VL CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，或者与SEQ ID NO：10有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性。
在一些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQID NO:1具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在一些实施方式中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，或与SEQID NO:6具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在某些优选的实施方案中，所述重链可变区中含有的3个CDR，和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR，由Kabat或Chothia编号系统定义。
在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段可进一步包含重链恒定区、轻链恒定区中的一种或多种。在进一步优选的实施方式中，所述轻链恒定区是λ链或κ链恒定区。在一些优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体或人源化抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，本发明的抗体包括重链和轻链，所述重链的氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示，或者与SEQ ID NO:11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，或者与SEQ ID NO:12具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在另一方面，提供一种核酸分子，包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的核苷酸。在一些实施方式中，所述核酸分子编码所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区。
在优选的实施方式中，所述核酸分子编码重链可变区，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，或与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。在其它优选的实施方式中，所述核酸分子编码轻链可变区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，或与SEQ ID NO:7具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在另一方面，本发明提供一种生物材料，为：
(1)包含本发明的核酸分子的载体、宿主细胞或微生物等；或
(2)上述(1)的表达产物、悬浮液、上清液等。
本领域技术人员根据抗体的氨基酸序列能够容易地选择并制备包含所述抗体的编码序列的载体、宿主细胞或微生物，并能够知道如何培养这样的宿主细胞或微生物，从而获得相应的表达产物、悬浮液、上清液等，以获得相应的抗体。这都是本领域常规技术手段。
在另一方面，本发明提供一种组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段；优选地，所述组合物为药物组合物，进一步包含药学上可接受的载体。
在另一方面，提供制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：培养上述的宿主细胞使抗体或抗原结合片段表达，及自宿主细胞中分离所述抗体或抗原结合片段。
在另一方面，提供药物联合物，包括本发明的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种其它治疗剂；优选地，所述其它治疗剂为另一种抗体，如抗PD-L1抗体。
在另一方面，提供本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的核酸分子或本发明的生物材料或本发明的组合物或本发明的药物联合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
在另一方面，提供本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的核酸分子或本发明的生物材料或本发明的组合物或本发明的药物联合物在制备阻断TIGIT与其配体结合的制剂中的应用，所述配体如CD155或CD112。
在另一方面，提供本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的核酸分子或本发明的生物材料或本发明的组合物与一种或多种其它癌症治疗剂联合在制备治疗肿瘤的药物或制备阻断TIGIT与其配体的结合的制剂中的应用，所述配体如CD155或CD112。
在另一方面，本发明提供一种刺激个体免疫反应或增强免疫细胞活性的方法，包括向需要的个体施用本发明的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，或者本发明的组合物，或者本发明的药物联合物。
在另一方面，本发明提供治疗肿瘤或者阻断TIGIT与CD155或CD112结合的方法，包括向需要的个体施用本发明的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，或者本发明的组合物，或者本发明的药物联合物。
本发明的上述方案中，所述肿瘤为白血病、淋巴瘤、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、黑色素瘤、胰腺癌、结直肠癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、鼻咽癌。
本发明的抗TIGIT抗体及其抗原结合片段是阻断性抗体，能够有效阻断TIGIT和CD155或CD122的结合，进而有效促进T细胞的激活，增强抗肿瘤免疫反应，具有良好的成药前景。
附图说明
图1显示了鼠源抗体对TIGIT蛋白的结合。
图2显示了鼠源抗体与细胞膜上TIGIT的结合。
图3显示了鼠源抗体对TIGIT与CD155结合的阻断作用。
图4显示了鼠源抗体对TIGIT与CD112结合的阻断作用。
图5显示了嵌合抗体c7D3对TIGIT蛋白的结合。
图6显示了嵌合抗体c7D3对TIGIT与CD155结合的阻断作用。
图7显示了嵌合抗体c7D3对TIGIT与CD112结合的阻断作用。
图8显示了嵌合抗体c7D3在TIGIT/CD155报告基因实验中促进T细胞激活相关报告基因的表达。
图9显示了嵌合抗体c7D3激活PBMC细胞释放IL-2细胞因子。
图10显示了嵌合抗体c7D3激活PBMC细胞释放IFN-γ细胞因子。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来说明本发明内容。如无明确说明，以下方法中使用的试剂和仪器都是本领域常用试剂和仪器，可以通过商购方式获得；所使用的方法都是本领域常规方法，本领域技术人员根据实施例所描述的内容可以毫无疑义地施行所述方法并获得相应的结果。
定义：
本发明中，术语“抗体”指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论天然的或者部分或全部合成(例如重组)产生的，包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可变区的保留全长免疫球蛋白的结合特异性能力的任何片段。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、合成抗体、重组产生的抗体、人抗体、非人抗体(例如鼠源抗体)、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体以及抗体片段，例如但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、Fd片段、Fd'片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、或者上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgGI、IgG2、lgG3、IgG4、I.A1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员。在优选的实施方案中，本发明的抗体是鼠源抗体或嵌合抗体。
如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见，例如Methods in Molecular Biology,Vol 207:Recombinant Antibodies forCancer Therapy Methods and Protocols(2003)；Chapter 1；p 3-25,Kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合抗原的抗体。
如本文所用，“常规抗体”指包含两条重链(其可以标示为H和H')和两条轻链(其可以标示为L和L')和两个抗原结合位点的抗体，其中每条重链可以是全长免疫球蛋白重链或保留抗原结合能力的其任何功能区(例如重链包括但不限于VH链、VH-CH1链和VH-CH1-CH2-CH3链)，并且每条轻链可以是全长轻链或任何功能区(例如轻链包括但不限于VL链和VL-CL链)。每条重链(H和H')与一条轻链(分别为L和L')配对。
如本文所用，全长抗体是具有两条全长重链(例如VH-CH1-CH2-CH3)和两条全长轻链(VL-CL)和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌B细胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
如本文所用，dsFv指具有稳定VH-VL对的工程化分子间二硫键的Fv。
如本文所用，Fab片段是用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白所获得的抗体片段，或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。Fab片段包含轻链(包含VL和CL)和另一条链，所述另一条链包含重链的可变结构域(VH)和重链的一个恒定区结构域(CH1)。
如本文所用，F(ab')2片段是在pH 4.0-4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白所获得的抗体片段，或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。F(ab')2片段基本上包含两个Fab片段，其中每个重链部分包含额外的几个氨基酸，包括形成连接两个片段的二硫键的半胱氨酸。
如本文所用，Fab'片段是包含F(ab')2片段的一半(一条重链和一条轻链)的片段。
如本文所用，ScFv片段指包含通过多肽接头以任何顺序共价连接的可变轻链(VL)和可变重链(VH)的抗体片段。
如本文所用，可变结构域或可变区是识别并特异结合抗原的抗体重链或轻链的结构域，其包含在不同抗体之间变化的氨基酸序列。每条轻链和每条重链分别具有一个可变区结构域VL和VH。可变结构域提供抗原特异性，并且因此负责抗原识别。每个可变区包含CDR和框架区(FR)，CDR是抗原结合位点结构域的部分。
如本文所用，“抗原结合结构域”和“抗原结合位点”同义地用来指识别并与同种抗原物理相互作用的抗体内的结构域。天然的常规全长抗体分子具有两个常规抗原结合位点，每个包含重链可变区部分和轻链可变区部分。常规抗原结合位点包含连接可变区结构域内反向平行的β链的环。抗原结合位点可以包含可变区结构域的其它部分。每个常规抗原结合位点包含3个来自重链的高变区和3个来自轻链的高变区。高变区也称为互补决定区(CDR)。
如本文所用，“高变区”、“互补决定区”和“CDR”可以交换地使用，并且指一起形成抗体的抗原结合位点的每个可变区内的多个部分中的一个。每个可变区结构域包含3个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。例如，轻链可变区结构域包含3个CDR，命名为VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；重链可变区结构域包含3个CDR，命名为H CDRI(或VH CDR1)、H CDR2(或VHCDR2)和H CDR3(或VH CDR3)。可变区中的3个CDR沿线性氨基酸序列是不连续的，但是在折叠的多肽中接近。CDR位于连接可变结构域的β折叠的平行链的环内。如本文所述，本领域技术人员知道并且可以基于Kabat或Chotnia编号鉴定CDR(参见例如Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Tnterest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,AIH Publication No.91-3242,和Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。
如本文所用，框架区(FR)是位于β折叠内的抗体可变区结构域内的结构域；在氨基酸序列而言，FR区比高变区相对更保守。
如本文所用，“恒定区”结构域是抗体重链或轻链中的结构域，其包含比可变区结构域的氨基酸序列相对更保守的氨基酸序列。在常规全长抗体分子中，每条轻链具有单个轻链恒定区(CL)结构域，每条重链包含一个或多个重链恒定区(CH)结构域，包括(CH1、CH2、CH3和CH4)。抗体恒定区可以服务于效应子功能，例如但不限于清除该抗体特异性结合的抗原、病原体和毒素，例如通过与各种细胞、生物分子和组织相互作用。
如本文所用，VH结构域的功能区是保留完整VH结构域的至少部分结合特异性(例如通过保留完整VH结构域的一个或多个CDR)的完整VH结构域的至少一部分，从而所述VH结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VL结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VH结构域的功能区是包含VH结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
如本文所用，VL结构域的功能区是保留完整VL结构域的至少部分结合特异性(例如通过保留完整VL结构域的一个或多个CDR)的完整VL结构域的至少一部分，从而所述VL结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VH结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VL结构域的功能区是包含VL结构域的CDRI、CDR2和/或CDR3的区域。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
如本文所用，分离的核酸分子是从存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。诸如cDNA分子的“分离的”核酸分子可以在通过重组技术制备时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。本文所提供的示例性分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
序列“一致性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性。(参见，例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana PresS,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；and Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的一致性的方法，但是术语“一致性”是技术人员公知的(Carrillo,H.&Lipman,D.,SIAM J AppliedMath 48:1073(1988))。
如本文所用，“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过ELISA定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色，Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于CHO细胞、HeLa细胞、HEK细胞例如HEK 293细胞。
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。
如本文所用，“表达载体”包括能够表达DNA的载体，所述DNA与诸如启动子区的能够影响这类DNA片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。
如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何抗体或其抗原结合片段以及本文所提供的组合物的任何药学用途。
如本文所用，“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。同样，如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生，并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
如本文所用，术语“个体”是指哺乳动物，例如人。
本发明的抗体
本发明提供一种针对TIGIT的抗体，即抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性识别并结合TIGIT。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段能特异性结合TIGIT并阻断TIGIT与其配体(包括CD155和CD122)的结合，诱导T细胞激活，促进抗肿瘤免疫反应。
在一些实施方案中，所针对的肿瘤包括但不限于下文关于肿瘤性疾病所描述的那些。在另一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段能够抑制肿瘤生长至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％。
在一方面，本发明提供一种针对TIGIT的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括三个CDR，分别为VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3，轻链可变区包括三个CDR，分别为VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；其中，
VH CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或者与SEQ ID NO：3有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
VH CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或者与SEQ ID NO：4有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
VH CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，或者与SEQ ID NO：5有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
VL CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，或者与SEQ ID NO：8有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
VL CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，或者与SEQ ID NO：9有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
VL CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，或者与SEQ ID NO：10有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性。
在一些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQID NO:1具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在一些实施方式中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，或与SEQID NO:6具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在某些实施方案中，可在本文所提供抗体的Fc区引入氨基酸修饰，所述氨基酸修饰可以是一个或多个，以此产生Fc变体。Fc变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰的人Fc区序列。
适用于本发明的“抗体及其抗原结合片段”包括但不限于多克隆、单克隆、单价、双特异性、多特异性、重组、异源、嵌合、人源化、去免疫原性的抗体，或Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、单链抗体、纳米抗体和上述任一种的表位结合片段。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以是单特异的、双特异的或多特异性的。抗TIGIT抗体可以与另一种抗体或抗体片段连接以产生具有第二或更多结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
在某些实施方案中，抗体可经进一步修饰以添加功能性组分，适合抗体衍生作用的部分包括但不限于以下实例，PEG、葡聚糖、蛋白质、脂类、治疗剂或毒素。抗体可以通过磷酸化、乙酰化、糖基化、聚乙二醇化、酰胺化、或与其它蛋白连接等进行修饰。
肿瘤性疾病
本发明的抗体对TIGIT的阻断可以增强患者对肿瘤细胞的免疫应答。TIGIT与其配体CD155或CD112的结合可抑制免疫细胞的激活作用，进而帮助肿瘤细胞逃避T细胞的杀伤。靶向TIGIT能够产生良好的抗肿瘤作用，可增强效应T细胞和NK细胞的活性，并减少免疫抑制性调节T细胞的活性。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以用于治疗肿瘤性疾病。可以使用本发明的抗体或其抗原结合片段进行预防和/或治疗的优选的肿瘤性疾病(或癌症)包括一般对免疫治疗有应答的癌症。可治疗的癌症的非限制性的实例包括但不限于白血病、淋巴瘤、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、黑色素瘤、胰腺癌、结直肠癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、鼻咽癌。
核酸、载体和抗体产生方法
在另一方面，本发明提供分离的核酸分子,其包含编码前述本发明的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列区。在一些实施方案中，所述核苷酸序列区的核苷酸序列可以针对用于表达的宿主细胞进行密码子优化。例如，所述核苷酸序列区的核苷酸序列包括SEQID NO:2和SEQ ID NO:7，分别编码抗体重链和轻链的可变区。
本发明还提供一种表达载体，其包含至少一种前述本发明的核酸分子。
本发明的一方面还提供一种宿主细胞，其由至少一种前述本发明的核酸分子或表达载体转化。
本发明的又一方面还涉及一种生产抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：(i)在适合核酸分子或表达载体表达的情况下培养本发明的宿主细胞，和(ii)分离并纯化由所述核酸分子或表达载体表达的抗体或其抗原结合片段。
药物组合物
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的抗体以及药学上可接受的载体。
本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂、吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、肌肉内施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体分子、免疫缀合物包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其它天然条件的作用。
本发明的药物组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。常规介质或试剂，除了任何与活性化合物不相容的范围外，都可能在本发明的药物组合中。还可以向组合物中渗入补充的活性化合物。
治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其它适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。
本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本发明的抗体优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它肠胃外给药途径，例如注射或输注。
或者，本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、舌下。
药物组合物中本发明的抗体或其抗原结合片段还可以与诸如细胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白等治疗性部分缀合。
细胞毒素包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括但不限于：紫杉醇、丝裂霉素、长春新碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、放线菌素D、吐根碱和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。
本发明的抗体也可以与放射性同位素缀合，产生细胞毒性放射性药物，也被称作放射性抗体缀合物。能够与诊断或治疗性使用的抗体缀合的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、铟111、钇90。制备放射性抗体缀合物的方法在本领域是公知的。
本发明的抗体也可以与具有需要的生物活性的蛋白缀合，可用于修饰特定的生物学反应。这样的生物活性蛋白包括：蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、白喉霉素、肿瘤坏死因子、干扰素γ、INFγ、淋巴因子、白介素-1、白介素-2、白介素-6、白介素-10。
联合治疗
本发明还提供了联合疗法，包括本发明所述抗TIGIT抗体或药物组合物和至少另外一种或多种治疗剂联合使用，所述另外一种治疗剂包括但不限于化疗剂、放疗剂和生物大分子药物，如抗PD-L1抗体。本发明的抗体和所述化疗剂、放疗剂或生物大分子药物可以全部在一次施用或分开施用。当分开施用时(采用互相不同的施用方案的情况下)，它们可以连续施用而不中断或与预定的间隔施用。
本发明示例下的抗TIGIT抗体序列
表1：本发明抗体的VH、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3，VL、VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3的氨基酸序列编号
Figure BDA0003033329620000121
表2：本发明抗体的VH、VL DNA序列编号
抗体编号 VH DNA序列编号 VL DNA序列编号
c7D3 2 7
表3：本发明序列信息
Figure BDA0003033329620000122
Figure BDA0003033329620000131
表4 c7D3抗体重链和轻链氨基酸序列
Figure BDA0003033329620000132
Figure BDA0003033329620000141
实施例1：抗TIGIT抗体鼠单抗的制备
本实施例描述了使用杂交瘤技术制备小鼠抗人TIGIT单克隆抗体的方法。首先表达胞外区TIGIT蛋白(Uniprot：Q495A1)作为免疫原，将胞外区TIGIT蛋白氨基酸序列(Met22-Pro141)C末端添加6xHis标签，然后克隆到表达载体上，得到胞外区TIGIT蛋白。将表达载体瞬时转染293细胞(来源：ATCC)，5天后收集细胞培养液并纯化。为制备抗人TIGIT小鼠单克隆抗体，首先用100μg胞外区TIGIT蛋白对4周龄的BAL B/c小鼠(维通利华提供)进行免疫。首次免疫后的第14天和第28天，用50μg胞外区TIGIT蛋白对免疫后的小鼠进行再次免疫。采用ELISA法检测免疫后小鼠血清效价，将胞外区TIGIT蛋白以PBS稀释至0.5μg/ml的浓度，包被微孔板4℃过夜。然后用5％BSA-PBST封闭液37℃封闭1h。PBST(厂家：上海生工，货号：C520004)洗板后，将来自免疫小鼠的血清稀释液加入板中并37℃孵育1小时。洗板加入山羊抗鼠IgG(厂家：Sigma，货号：A2554，1:5000稀释)，37℃反应1小时。洗板后加入TMB溶液(厂家：湖州英创，货号：TMB-S-001)，室温避光反应10分钟，然后加入2N H2SO4终止反应。置于酶标仪(Molecular Devices，M5)上450nm波长检测吸光度。在免疫后第42天，用50μg胞外区TIGIT蛋白对有足够效价的抗TIGIT抗体的小鼠进行加强免疫。3-5天后处死小鼠，收集脾细胞，用IMDM(厂家：上海源培，货号：L610KJ)基础培养基离心清洗细胞2-3次，然后按1:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(京天成提供)混合，在混合的细胞中加入PEG(厂家：Roche，货号：25771700)并轻柔搅拌，37℃静置30s。融合后的细胞稀释到含15％胎牛血清(厂家：浙江天杭生物，货号：11011-8611)、1×HAT(厂家：Sigma，货号：H0262-1VL)的IMEM选择性培养基中，按200微升每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％CO2、37℃培养箱中。10-14天后用ELISA实验检测杂交瘤上清液中抗TIGIT抗体。10个不同的杂交瘤克隆被鉴定出来，包括8G6、8E11、8D11、8A11、7D3、7D1、7A11、7A1、15B10、15B11。
采用竞争ELISA法分析杂交瘤上清是否可以阻断TIGIT与其配体CD155的结合。将CD155(厂家：Acrobiosystems，货号：CD5-H5251)以PBS稀释至3μg/ml，包被于96孔酶标板并4℃过夜；洗板后加入2％BSA-PBST封闭液，37℃封闭1.5h。将4倍稀释的杂交瘤上清和1μg/ml生物素标记的TIGIT(厂家：Acrobiosystems，货号：TIT-H82E5)加入板上，37℃孵育1小时。洗板后加入HRP标记的链霉亲和素(厂家：Abcam，货号：ab7403)，37℃反应1小时。洗板后，加入TMB溶液，室温避光反应30分钟，加入2N H2SO4终止反应，酶标仪检测450nm波长吸光度(OD450)。IgG(百英生物提供)作为实验对照。按下表公式计算杂交瘤上清对TIGIT与CD155结合的抑制率，其中，最小信号孔为空白溶液组，最大信号孔为不加杂交瘤上清、只加入生物素标记的TIGIT：
Figure BDA0003033329620000151
结果见表5，显示7D3对TIGIT与CD155结合的抑制率最强。将7D3选出并用于进一步分析。
表5：杂交瘤上清对TIGIT与CD155结合的抑制作用
编号 8G6 8E11 8D11 8A11 7D3 7D1 7A11 7A1 15B10 15B11 IgG1
抑制率(％) 69.59 20.46 26.53 19.40 96.36 20.95 19.03 21.61 51.44 45.31 1.68
实施例2：鼠源抗体对TIGIT的结合
采用ELISA方法定量检测鼠源抗体与人TIGIT蛋白的结合能力，将人TIGIT蛋白(厂家：Acrobiosystems，货号：TIT-H52H3)以0.5μg/ml的浓度稀释到PBS中，包被微孔板4℃过夜。然后用5％BSA-PBST封闭液37℃封闭1h；PBST洗板后，将7D3稀释到不同浓度(133.33nM起始，4倍稀释，共10个浓度)加入板中并37℃孵育1小时。洗板加入山羊抗鼠IgG(厂家：Sigma，货号：A2554，1:5000稀释)，37℃反应1小时。洗板后加入TMB溶液，室温避光反应10分钟，然后加入2N H2SO4终止反应。置于酶标仪上450nm波长检测吸光度。结果见图1，显示7D3对人TIGIT蛋白有浓度依赖性结合，EC50为0.1082nM。
采用流式细胞实验(FACS)分析鼠源单抗与表达TIGIT的293T-TIGIT细胞的结合。293T-TIGIT细胞的构建过程如下：通过慢病毒转染的方式将表达TIGIT的病毒上清(来源赛业生物)感染293T细胞，加压筛选2周后，检测TIGIT的表达，得到过表达TIGIT的293细胞株。将293T-TIGIT细胞与不同浓度的7D3(最高浓度为33nM，5倍稀释，共8个浓度点)于4℃反应30分钟。洗涤细胞2次后，加入FITC标记的山羊抗鼠IgG(厂家：Abcam，货号：ab6785，1:500稀释)，4℃避光反应30分钟。洗涤细胞2次后，用流式细胞仪(BD FACSCalibur)检测。结果见图2，显示7D3能结合细胞膜上表达的TIGIT，EC50为0.01132nM。
实施例3：鼠源抗TIGIT抗体对TIGIT与CD155结合的阻断作用
按实施例1所述竞争ELISA方法检测抗TIGIT抗体7D3对TIGIT与CD155结合的阻断作用。其中抗体起始浓度为133.33nM，再用0.2％BSA-PBST进行4倍梯度稀释共得到10个梯度。用22G2作为阳性对照，根据US10189902公开的序列(重轻链可变区序列分别为SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:9，恒定区序列分别为SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:49)产生22G2。比较的结果在图3中呈现，7D3的IC50为0.804nM，22G2的IC50为1.961nM，显示7D3能有效阻断TIGIT与CD155的结合，而且7D3抗体对TIGIT和CD155的阻断作用强于22G2。
实施例4：鼠源抗TIGIT抗体对TIGIT与CD112结合的阻断作用
采用竞争ELISA法分析7D3对TIGIT与其另外一个配体CD112的结合。将CD112(厂家：Acrobiosystems，货号：PV2-H5253)以PBS稀释至4μg/ml包被于96孔酶标板并4℃过夜；洗板后加入2％BSA-PBST封闭液，37℃封闭1.5h。将7D3和阳性抗体22G2稀释至浓度为133.33nM，再用0.2％BSA-PBST进行4倍梯度稀释共得到10个梯度，和生物素标记的TIGIT(厂家：Acrobiosystems，货号：TIT-H82E5)加入板上，37℃孵育1小时。洗板后加入HRP标记的链霉亲和素(厂家：Abcam，货号：ab7403)，37℃反应1小时。洗板后，加入TMB溶液，室温避光反应30分钟，加入2N H2SO4终止反应，酶标仪检测450nm波长吸光度。IgG(百英生物提供)作为实验对照。结果见图4，7D3的IC50为3.97nM，22G2的IC50为18.12nM，显示7D3能有效阻断TIGIT与CD112的结合，而且7D3抗体对TIGIT和CD112的阻断作用强于22G2。
实施例5：轻重链可变区测序和鼠人嵌合抗体的表达
按照常规方法对表达7D3的杂交瘤细胞进行RNA提取并逆转录为cDNA，并对抗体基因序列进行序列确定，得到7D3的重链可变区和轻链可变区序列，氨基酸序列分别如SEQ IDNO:1和6所示，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和7所示。进一步，对氨基酸序列进行分析，参考Kabat等的数据库(Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunologicalTnterest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,AIHPublication No.91-3242)确定CDR序列，其中，重链3个CDR的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:3、4和5所示，轻链3个CDR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:8、9和10所示。
为表达嵌合抗体，将7D3的重链、轻链可变区分别和人源抗体重链IgG1恒定区、人源抗体轻链kappa恒定区连接，克隆到载体pBRex-3中。使用PEI(来源：Polysciences)将上述载体转染至CHO-S细胞(来源：Thermofisher)中，培养约7天，取上清液，用protein A纯化上清液，使抗体纯度>95％，表达的嵌合抗体命名为c7D3，其中重链的氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；人源抗体重链IgG1恒定区、人源抗体轻链kappa恒定区的核苷酸序列为常规序列。
实施例6：嵌合抗体和TIGIT的结合
采用ELISA方法定量检测嵌合抗体与人TIGIT蛋白的结合能力，将TIGIT(厂家：Acrobiosystems，货号：TIT-H52H3)以0.5μg/ml的浓度稀释到PBS中，包被微孔板4℃过夜。然后用5％BSA-PBS封闭液37℃封闭1h；PBST洗板后，将c7D3和对照抗体22G2稀释到不同浓度(133.33nM起始，4倍稀释，共10个浓度)加入板中并37℃孵育1小时。洗板加入HRP标记的山羊抗人IgG(厂家：Sigma，货号A0170,1:5000稀释)，37℃反应1小时。洗板后加入TMB溶液，室温避光反应10分钟，然后加入2N H2SO4终止反应。置于酶标仪上450nm波长检测吸光度。结果见图5，c7D3与TIGIT结合的EC50值为0.105nM，表明c7D3与TIGIT具有较高的结合活性，另外，对照抗体22G2与TIGIT结合的EC50值为0.497nM，表明c7D3与TIGIT的结合活性强于22G2。
实施例7：嵌合抗体对TIGIT与CD155结合的阻断作用
按实施例1所述竞争ELISA方法检测抗TIGIT嵌合抗体c7D3对TIGIT与CD155结合的阻断作用。其中抗体起始浓度为133.33nM，再用0.2％BSA-PBST进行2倍梯度稀释共得到10个梯度。结果见图6，显示c7D3保留了亲本抗体对TIGIT与CD155结合的阻断作用，c7D3的IC50为3.516nM，22G2的IC50为8.545nM，表明c7D3抗体对TIGIT和CD155的阻断作用强于22G2。
实施例8：嵌合抗体对TIGIT与CD112结合的阻断作用
按实施例4所述方法检测嵌合抗体c7D3对TIGIT与CD112结合的阻断作用，结果见图7，c7D3和对照抗体22G2的IC50分别为18.13nM和43.58nM，显示c7D3能有效阻断TIGIT与CD112的结合，c7D3相比对照抗体22G2具有更强的阻断作用。
实施例9：嵌合抗体抑制TIGIT/CD155报告基因活性
采用TIGIT/CD155报告基因实验进一步分析了c7D3在细胞水平的生物学活性。该报告基因实验由两个遗传工程化细胞系组成：TIGIT效应细胞(来源：金斯瑞)和CD155aAPC/CHO-K1细胞(来源：金斯瑞)，其中TIGIT效应细胞为表达有人源TIGIT和萤光素酶报告基因的Jurkat T细胞，CD155 aAPC/CHO-K1细胞为表达有人源CD155及TCR激活蛋白的CHO-K1细胞。当两种细胞共培养时，TIGIT与其配体CD155相互作用，抑制IL2启动子调控的荧光素酶表达。当实验体系中引入抗TIGIT阻断性抗体后，该抗体与效应细胞表达的TIGIT相结合，阻断TIGIT与CD155的相互作用，解除抑制信号，并激活T细胞受体(TCR)信号途径和IL2启动子，促进荧光素酶的表达。后者催化底物产生化学发光信号。将CD155 aAPC/CHO-K1细胞接种到96孔细胞培养板，培养箱中孵育16-20小时，然后加入TIGIT效应细胞和c7D3抗体，培养板置于培养箱中孵育约6小时，加入荧光素酶底物(来源：Promega)，酶标仪上读取化学发光值，结果见图8。和IgG1对照抗体相比，c7D3诱导了化学发光信号值的增加，EC50为74.47nM，表明c7D3能有效抑制TIGIT与其配体的结合，并激活T细胞活化信号通路。
实施例10：嵌合抗体激活PBMC细胞释放细胞因子
检测嵌合抗体c7D3刺激PBMC分泌细胞因子IL-2、IFN-γ的水平，分析c7D3对人原代T淋巴细胞功能的影响。将CD155(厂家：Acrobiosystems，货号：CD5-H5251)以PBS稀释至1μg/ml的浓度，加至96孔细胞培养板中，每孔100μl，4℃包被过夜；将PBMC细胞(来源于ALLcells)以RPMI 1640培养基调整密度为2.5×106个/ml，40μl每孔接种至CD155包被的96孔细胞培养板中，加入40μl 150ng/ml的SEB(厂家：Toxin technology，货号BT202)；将梯度稀释的嵌合抗体c7D3或等量的同型IgG1空白对照抗体或上述c7D3抗体与抗PD-L1抗体(B11，序列参见WO2019233462)的组合(1：1)，40μl/孔加至96细胞培养板中；置于37℃，5％CO2培养箱孵育4天。取出细胞培养板，2000rpm离心10min收集细胞培养上清，采用ELISA的方法分别检测IL-2(厂家：BD，货号：550611)和IFN-γ(厂家：Abcam，货号：ab46025)的浓度，结果分别如图9和图10所示。结果显示，与IgG1对照抗体相比，嵌合抗体c7D3能促进PBMC分泌细胞因子IL-2和IFN-γ，表明c7D3能有效促进T细胞激活，并且c7D3和抗PD-L1抗体联合用药效果明显优于两者各自单独用药效果。
序列表
<110> 浙江博锐生物制药有限公司
<120> 抗TIGIT抗体及其用途
<130> DSP1F210807ZX
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asn Gly Pro Leu Arg Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaggtgcagc tgcagcagag cgggccagag ctggtgaagc caggagccag cgtgaagatg 60
agctgtaagg ccagcggcta cacatttaca agctacgtga tgcactgggt gaagcagaag 120
cccggacagg gcctggaatg gatcggctac attaaccctt acaatgacgg gaccaagtac 180
aacgagaagt tcaaaggcaa ggccaccctg accagcgaca agagcagcag caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc cagaagagga 300
aacggccccc tgagagtgtt tgcctactgg ggacagggga caaccgtgac agtgagcagc 360
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Tyr Val Met His
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Arg Gly Asn Gly Pro Leu Arg Val Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Gly Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacattgtga tgacccagac ccccaaattt atgagcacct ccgtgggcga cagagtgagc 60
attacctgca aagccagcca ggacgtgagc accgccgtgg cttggtatca gcagaaacct 120
ggccagagcc ccaagctgct gatctacagc gccagctaca ggtacaccgg cgtgcccgac 180
agattcacag gaagcggctc cggcaccgac tttacattca ccatcagcag cgtgcaggct 240
gagggactgg ccgtgtatta ctgccagcag cactacagca ccccccccac ctttggagcc 300
ggcaccaagc tggagatcaa g 321
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 11
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asn Gly Pro Leu Arg Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 12
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Gly Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (11)

1.抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括三个CDR，分别为VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，轻链可变区包括三个CDR，分别为VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
所述VH CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，或者所述VH CDR1的氨基酸序列与SEQID NO：3有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
所述VH CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，或者所述VH CDR2的氨基酸序列与SEQID NO：4有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
所述VH CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，或者所述VH CDR3的氨基酸序列与SEQID NO：5有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
所述VL CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，或者所述VL CDR1的氨基酸序列与SEQID NO：8有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
所述VL CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，或者所述VL CDR1的氨基酸序列与SEQID NO：9有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
所述VL CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，或者所述VL CDR3的氨基酸序列与SEQ ID NO：10有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
优选地，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中，
VH CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
VH CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
VH CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
VL CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
VL CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
VL CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
2.根据权利要求1所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO:1具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，或与SEQ ID NO:6具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
3.根据权利要求1或2所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，进一步包含重链恒定区、轻链恒定区中的一种或多种；优选地，所述轻链恒定区是λ链或κ链恒定区；进一步优选地，所述抗体或其抗原结合片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型；更优选地，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体或人源化抗体或其抗原结合片段。
4.根据权利要求3所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包括重链和轻链，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，或者与SEQ ID NO:11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，或者与SEQ ID NO:12具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
5.一种核酸分子，包含编码权利要求1～4任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸；优选地，所述核酸分子编码所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区；进一步优选地，所述核酸分子编码重链可变区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，或与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者所述核酸分子编码轻链可变区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，或与SEQ IDNO:7具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
6.一种生物材料，为：
(1)包含权利要求5所述的核酸分子的载体、宿主细胞或微生物；或
(2)上述(1)的表达产物、悬浮液或上清液。
7.一种组合物，其包含权利要求1～4任一项所述的抗体或其抗原结合片段；优选地，所述组合物为药物组合物，进一步包含制药学上可接受的载体。
8.制备权利要求1～4任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：培养权利要求6中所述的宿主细胞使抗体或抗原结合片段表达，及自宿主细胞中分离所述抗体或抗原结合片段。
9.一种药物联合物，包括权利要求1～4任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种其它治疗剂；优选地，所述其它治疗剂为另一种抗体，如抗PD-L1抗体。
10.权利要求1～4任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的生物材料或权利要求7所述的组合物或权利要求9所述的药物联合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用；优选地，所述肿瘤为白血病、淋巴瘤、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、黑色素瘤、胰腺癌、结直肠癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌或鼻咽癌。
11.权利要求1～4任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的生物材料或权利要求7所述的组合物或权利要求9所述的药物联合物在制备阻断TIGIT与其配体，如CD155或CD112的结合的制剂中的应用。
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