CN113138269B - 一种检测卡那霉素的适配体胶体金侧向层析试纸 - Google Patents

一种检测卡那霉素的适配体胶体金侧向层析试纸 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测卡那霉素的适配体胶体金侧向层析试纸，属于分析化学、医药、环境、食品安全、纳米生物传感等领域。本发明利用AuNPs@polyA‑DNA能够快速、灵敏的捕获DNA的互补序列(Aptamer和CapApt)，开发出快速、灵敏、低成本的胶体金侧向层析试纸条。试纸条法检测卡那霉素简便快速，可随时抵检测，只需要将样品口中加入测试溶液，5min以后试纸条显色完全，即可观察实验结果，可以大幅度的提高检测效率。用肉眼进行定性分析，使用胶体金试纸定量分析仪进行定量分析。对食品中卡那霉素残留检测具有重要意义。

Description

一种检测卡那霉素的适配体胶体金侧向层析试纸
技术领域
本发明涉及一种检测卡那霉素的适配体胶体金侧向层析试纸，属于分析化学、医药、环境、食品安全、纳米生物传感等领域。
背景技术
抗生素是细菌、真菌、动物或植物产生的次级代谢产物，具有多种抗病原体活性。其中，卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素，由于其水溶性强、对许多革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有广谱抗菌作用以及价格便宜和用药方便等优点，被广泛应用于兽药和饲料添加剂。然而，抗生素的过度使用会对人类健康和环境安全带来很大的问题。一般来说，抗生素的滥用会导致细菌耐药性的增加和其他副作用，如耳毒性、肾毒性等毒性作用，并对神经肌肉接头产生阻滞作用，引起过敏反应等，严重时会致人死亡。近年来，抗生素的滥用已经成为全球范围内一个严重的公共卫生问题。欧盟委员会明确规定牛奶中的卡那霉素的最高残留量为150μg/kg。为了保障食品的质量和安全，有必要建立简单、快速的卡那霉素的检测方法。现如今，用于检测卡那霉素残留的方法有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法、免疫分析法、荧光测定法和比色法等。这些传统的方法虽然能准确的检测卡那霉素，但大都需要专用的设备，并且操作复杂、易受干扰、灵敏度低、耗时长，导致其应用范围有限，不能设计成便携式设备来实现现场检测。因此，建立一种快速、特异灵敏的卡那霉素等抗生素残留的现场检测具有重要意义。
核酸适配体是一种经过体外筛选技术-指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)，得到的一小段结构化的寡核苷酸序列(RNA或DNA)，可以与相应的靶标分子(蛋白质，病毒，细菌，细胞，重金属离子等)进行高亲和力和强特异性的结合，为化学生物学界和生物医学界提供了一种新的高效快速识别的研究平台。
基于核酸适配体标记的胶体金侧向层析试纸，具有长期稳定、检测时间短、成本低、操作简单、快速等优点，是现场快速检测多种目标物的理想方法。现有核酸适配体胶体金侧向层析试纸条的设计，通常应用巯基化核酸-胶体金偶联物作为标记物。该标记物探针的核酸负载量较高，其在核酸链杂交过程中存在空间位阻，影响其在T线上的杂交速率。AuNPs@polyA-DNA偶联物的制备是基于polyA核酸单链在金纳米粒子(AuNPs)表面的特异性非共价吸附；相比巯基化单链DNA修饰的AuNPs，该偶联物中单链DNA负载量显著降低，单链DNA空间位阻小，可显著提高AuNPs-DNA偶联物的杂交速度(Journal of the AmericanChemical Society,2012,134(29):11876-9.)。
目前，基于适配体识别卡那霉素的胶体金侧向层析试纸研究较少，在文献(Analyst,2018,143(1):182-189.)中，以卡那霉素适配体修饰的金纳米粒子(AuNPs-Apt)为探针，并且利用DNA1修饰银纳米粒子(AgNPs-DNA1)作为信号放大元件。通过DNA1和适配体的互补序列，可以得到AgNP-DNA1-Apt-AuNPs复合物，将其做为分子信标，可在10min内完成卡那霉素的检测，肉眼检测限为35nM。该试纸条需要AgNPs-DNA1放大元件，试纸条的结构较为复杂，不利于产品的稳定生产和应用的重复性。
发明内容
[技术问题]
现有的卡那霉素核酸适配体胶体金侧向层析试纸条采用信号放大方法，设计较复杂，成本较高，基于简单设计且达到高灵敏性能具有挑战性。
[技术方案]
本发明提供一种设计简单且达到高灵敏性能的试纸条，采用竞争结合模式检测小分子(本发明中为卡那霉素与AuNPs@polyA-DNA探针竞争结合卡那霉素适配体)，降低竞争分子(本发明为适配体)用量，有利于提高检测目标物(本发明为卡那霉素)灵敏度。本发明采用AuNPs@polyA-DNA偶联物作为探针，可显著降低了适配体用量，从而实现快速灵敏的定性或定量检测卡那霉素，肉眼检测限达到15ng/mL。
本发明提供一种基于适配体和AuNPs@polyA-DNA偶联物的胶体金侧向层析试纸条检测卡那霉素，该试纸条一般是由样品垫、结合垫(金标垫)、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水垫和PVC胶板组成。
所述试纸条的检测原理为：采用竞争法检测卡那霉素，当样品溶液中不含卡那霉素时，卡那霉素的适配体与AuNPs@polyA-DNA探针结合在检测区域(T线)被CapApt捕获形成AuNPs@polyA-DNA-Apt-capApt复合物，由于AuNPs的积累，在检测区可以观察到一个清晰地深红色带，检测结果为阴性。当样品溶液中含有卡那霉素时，卡那霉素与卡那霉素适配体结合，使卡那霉素适配体不能与AuNPs@polyA-DNA探针结合，从而在检测区域(T线)不能捕获AuNPs@polyA-DNA探针，检测线上AuNPs的积累减少，检测线较浅或不显色，检测结果为阳性。检测区域上的颜色强度与卡那霉素的浓度呈负相关。无论样品溶液中是否含有卡那霉素，AuNPs@polyA-DNA探针都可以在控制区域(C线)被CapDNA捕获。
本发明的第一个目的是提供一种用于检测卡那霉素的核酸适配体，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明第二个目的是提供上述核酸适配体在制备卡那霉素检测试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种胶体金侧向层析试纸条，所述试纸条含有上述核酸适配体和AuNPs@polyA-DNA偶联物。
在一种实施方式中，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述AuNPs@polyA-DNA偶联物是将序列如SEQ ID NO.2所示的polyA-DNA和纳米金离子(AuNPs)偶联得到的。
在一种实施方式中，所述AuNPs的粒径为13～17nm；所述polyA-DNA的浓度为80～120μM。
在一种实施方式中，所述试纸条包括样品垫、结合垫(金标垫)、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水垫和PVC胶板；所述PVC底板上依次黏贴样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫；所述NC膜上依次设有检测区和控制区，且检测区和控制区之间的距离为4～6mm；所述检测区上有链霉亲和素-生物素-capApt，控制区上有链霉亲和素-生物素-capDNA；所述金标垫上含有AuNPs@polyA-DNA偶联物。
在一种实施方式中，所述样品垫与金标垫间重叠部位长度为1～2mm，样品垫置于金标垫上方；金标垫与NC膜间重叠部位长度为1～2mm，金标垫置于NC膜上方；NC膜与吸水垫间重叠部位长度为1～3mm，吸水垫置于NC膜上方。
在一种实施方式中，所述链霉亲和素-生物素-capApt与链霉亲和素-生物素-capDNA是将链霉亲和素分别与3’端连有生物素的capApt和5’端连有生物素的capDNA等体积混合，在4℃孵育1h制备得到的。
在一种实施方式中，所述链霉亲和素浓度为2.5mg/mL，所述capApt和capDNA浓度为250μM。
在一种实施方式中，所述capApt的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；capDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第四个目的是提供一种快速检测卡那霉素的方法，所述方法是采用上述胶体金侧向层析试纸条进行测试，将待测溶液与核酸适配体混合孵育后吸取50-100μL滴加到样品垫上，孵育3～5min，用肉眼进行定性分析或使用胶体金试纸定量分析仪根据标准曲线进行定量分析。
在一种实施方式中，所述标准曲线为y＝-0.3177x+0.7248，式中y为(T/C)相对光信号强度，x为卡那霉素浓度的Log函数(ng/mL)。
在一种实施方式中，所述混合孵育的时间为15～25min。
在一种实施方式中，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述核酸适配体与待测溶液的体积比为1:99。
在一种实施方式中，所述核酸适配体的初始浓度为0.5～1.5μM。
本发明的第五个目的是提供上述胶体金侧向层析试纸条的制备方法，所述方法具体步骤如下：
(1)将样品垫和金标垫切割后加入PBS浸泡并干燥。
(2)将探针AuNPs@polyA-DNA喷涂在金标垫上并干燥。
(3)在NC膜的检测区喷涂链霉亲和素-生物素-capApt，控制区喷涂链霉亲和素-生物素-capDNA，检测区和喷涂区之间距离固定在5mm，35～39℃干燥2h。
(4)将步骤(1)～(3)制备完成的样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在PVC板上即可得到检测卡那霉素的胶体金侧向层析试纸条。
在一种实施方式中，所述AuNPs@polyA-DNA偶联物是将序列如SEQ ID NO.2所示的polyA-DNA和纳米金离子(AuNPs)偶联得到的；所述AuNPs的粒径为13～17nm。
在一种实施方式中，所述AuNPs@polyA-DNA的体积为0.8-1.4μL。
在一种实施方式中，所述polyA-DNA的浓度为80～120μM。
在一种实施方式中，所述样品垫与金标垫间重叠部位长度为1～2mm，样品垫置于金标垫上方；金标垫与NC膜间重叠部位长度为1～2mm，金标垫置于NC膜上方；NC膜与吸水垫间重叠部位长度为1～3mm，吸水垫置于NC膜上方。
本发明的有益效果：
(1)本文发明制备了高灵敏度、高特异性的一种基于适配体胶体金侧向层析试纸条检测卡那霉素。该试纸条对卡那霉素检测反应灵敏(肉眼检测限为15ng/mL，读数仪检测限为1.47ng/mL)、快速(20min)、检测结果重复性高。
(2)本发明提出的检测方法实现了卡那霉素的高灵敏检测。在5-125ng/mL的浓度范围内，T/C线和卡那霉素的浓度呈良好的线性关系，检出限为1.47ng/mL。检测限(LOD)明显低于欧盟委员会规定牛奶中的卡那霉素的最高残留量150μg/kg。
(3)该试纸条可通过观察检测区的颜色变化，肉眼可以实现卡那霉素的定性检测，使用胶体金读数仪可实现定量分析。
(4)本发明制备的AuNPs@polyA-DNA的识别块具有控制空间构象的能力，有利于与互补链的杂交，从而显著提高AuNPs表面的杂交效率。
附图说明
图1是条状生物传感器的结构示意图和检测原理图。
图2是纳米金颗粒的表征：(a)AuNPs的吸收光谱；(b)AuNPs、AuNPs@SH-DNA和AuNPs@polyA-DNA的粒径图。
图3是用试纸条对不同浓度卡那霉素标准溶液的检测图。
图4是在标准检测液中，不同浓度卡那霉素时的T线比C线的相对强度(T/C)标准曲线图。
图5是用试纸条对不同浓度卡那霉素的牛奶样品的检测图。
图6是试纸条的特异性评价。
具体实施方式
实施例一：一种基于核酸适配体的卡那霉素快速检测试纸条
金纳米粒子的制备及功能化、链霉亲和素-生物素-capApt和链霉亲和素-生物素-capDNA复合结构的构建、核酸适配体试纸条的组装。具体步骤为：
1.金纳米粒子的制备及功能化
(1)金纳米粒子(AuNPs)的制备
实验用于合成和储备纳米材料的玻璃器皿均用王水(盐酸：硝酸＝3:1)浸泡12h，用超纯水洗涤干净后使用。
AuNPs的制备采用的是柠檬酸钠还原法。具体如下：
1)将100mL 0.01％的HAuCl4加入250mL锥形瓶中，加热搅拌至溶液暴沸，保持1～2min。
2)向锥形瓶中迅速加入2mL 1％的柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌。溶液的颜色由浅黄色逐渐变为深紫色最后变成酒红色，保持加热10min，制备得到粒径15nm的AuNPs，将其冷却至室温后，4℃冷藏备用。
(2)AuNPs功能化
1)将5-15μL 100μM的polyA-DNA加入1mL步骤(1)中制备得到的AuNPs(10nM)中混合均匀，然后加入20μL 500mM的柠檬酸缓冲液(pH 3.0)。混合均匀后，在室温下孵育3min。
2)孵育完成后，加入60μL pH 7.6的500mM HEPES缓冲液，调整AuNPs溶液的pH为中性，然后在室温下孵育5-10min。
3)孵育完成后10000r/min离心20min，去上清，向沉淀物中加入重悬液复溶，10000r/min、20min重复离心三次除去未反应的核酸，最终加入400μL重悬液获得功能化的AuNPs，即探针AuNPs@polyA-DNA，4℃冷藏备用。
用透射电子显微镜分别对步骤(1)制备的AuNPs和步骤(2)制备的AuNPs@polyA-DNA进行表征，结果如图2所示，制备的粒径15nm的AuNPs在520nm处有单一的特征吸收峰，当与polyA-DNA结合时，最大吸收波长移至530nm，初步证明polyA-DNA成功修饰了AuNPs。
重悬液的组成：20mM Na3PO4，5％BSA，10％蔗糖，0.25％吐温-20。
2.链霉亲和素-生物素-capApt和链霉亲和素-生物素-capDNA的制备
(1)100μL 2.5mg/mL的链霉亲和素分别与100μL 250μM 3’端经生物素标记的capApt和5’端经生物素标记的capDNA混合并在4℃下孵育1h，获得混合液。
(2)使用超滤管(MWCO 30kDa)处理混合液，6000r/min 20min离心三次，重悬于300μL 10mM PBS中，获得链霉亲和素-生物素-capApt和链霉亲和素-生物素-capDNA，4℃储存备用。
3.核酸适配体试纸条的组装
(1)将样品垫和结合垫(金标垫)切成适当尺寸，加入10mM PBS浸泡30min，然后在45℃下干燥。
(2)将步骤1中制备得到的探针AuNPs@polyA-DNA均匀的喷涂在结合垫上，37℃干燥2h。
(3)在NC膜上用三维喷点仪器以0.9μL/cm的速度均匀喷涂步骤2制备的链霉亲和素-生物素-capApt和链霉亲和素-生物素-capDNA，分别作为检测区(T线)和控制区(C线)，检测区和控制区之间的距离固定在5mm，37℃干燥2h。
(4)将步骤(1)～(3)制备完成的样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫按图1依次粘贴在PVC板上，将组装好的试纸条均匀切割为4mm的宽度，放入分装袋中，密封保存。
表1卡那霉素快速检测试纸条的DNA序列
实施例二：用试纸条对卡那霉素标准溶液的测定
(1)卡那霉素标准溶液的制备
卡那霉素标准溶液用Running buffer(4×SSC，pH7)分别稀释终浓度为5、8、5、25、50、125和250ng/mL。用超纯水将核酸适配体(Aptamer)稀释至1μM。
(2)卡那霉素核酸试纸条检测标准曲线的建立：
将99μL不同浓度的卡那霉素标准溶液与1μL Aptamer溶液混合孵育20min，混合反应后将混合液滴加入到样品垫进行检测，反应3min后测定(T/C)相对信号强度，建立(T/C)相对光信号强度与不同卡那霉素浓度之间对应关系的标准曲线。
结果如图3所示，当卡那霉素浓度为15ng/mL时，试纸条上T线的颜色能与不含卡那霉素的溶液(0ng/mL卡那霉素)的试纸条上的T线的颜色有明显的差异；在卡那霉素浓度为5～125ng/mL时T线颜色随卡那霉素浓度的增高而减弱，在卡那霉素浓度为250ng/mL时T线颜色基本没有变化，因此肉眼检测下限为15ng/mL，上限为250ng/mL。
胶体金试纸定量分析仪读取不同浓度卡那霉素的相对强度，得到如图4所示(T/C)相对光信号强度与卡那霉素浓度的变化关系曲线，最低检测线为1.47ng/mL。其中在5～125ng/mL浓度范围内，(T/C)相对光信号强度与浓度存在线性关系，线性回归方程为y＝-0.3177x+0.7248，R2＝0.9830，式中y为(T/C)相对光信号强度，x为卡那霉素的浓度的Log函数(ng/mL)。
实施例三：牛奶样品中卡那霉素残留的检测
利用牛奶模拟样品来测试回收率，步骤为：
(1)AuNPs@polyA-DNA溶液预处理：将制备储藏的AuNPs@polyA-DNA添加0.8～1.4μL体积至试纸条金标垫上，存储于4℃。
(2)样品预处理：将牛奶样本稀释10倍，0.22μm微孔滤膜过滤。在牛奶中加入不同浓度的卡那霉素(50、150、250ng/mL)；
(3)牛奶中卡那霉素的回收率测定：1μL Aptamer(1μM)与99μL含不同浓度卡那霉素的牛奶溶液混合孵育20min，混合反应后再采用试纸条进行检测。
应用实施例一制备得到的核酸适配体试纸条检测牛奶中卡那霉素的含量，结果如表2和图5所示。
表2牛奶样品中卡那霉素残留的检测
实施例四：核酸适配体试纸条的特异性评价
(1)土霉素(terramycin)、庆大霉素(gentamycin)、阿泊拉霉素(apramycin)、阿米卡星(amikacin)以及卡那霉素(kanamycin)标准溶液用Running buffer(4×SSC，pH7)分别稀释终浓度为100ng/mL。用超纯水将卡那霉素的Aptamer稀释至1μM。
(1)将99μL各种抗生素的标准溶液与1μL卡那霉素Aptamer混和孵育20min。
(2)将混合液滴加到试纸条上进行各种抗生素的检测。
如图6，只有卡那霉素的表现出了T线比C线相对强度明显较低，表明该试纸条对卡那霉素具有较高的特异性。
对比例1
选择不同序列的适配体进行卡那霉素检测，将99μL不同浓度的卡那霉素标准溶液与1μL核酸适配体Aptamer溶液混合孵育20min，混合反应后将混合液滴加入到样品垫进行检测，结果显示当选择Aptamer1和Aptamer2序列进行卡那霉素检测时候，肉眼可分辨的卡那霉素为125ng/mL。相比实施例2提供的适配体序列，Aptamer1和Aptamer2序列与AuNPs@polyA-DNA的亲和力偏低。
适配体Aptamer 1：TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA，SEQ ID NO.5；
适配体Aptamer 2：TTTTTTGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA，SEQ ID NO.6。
对比例2
组装卡那霉素检测试纸条的具体实施方式与实施例1、2相同，除了在试纸条上负载探针AuNPs@SH-DNA，检测(T/C)相对光信号强度，结果显示当适配体终浓度为10nM时，探针AuNPs@SH-DNA对适配体的响应信号是负载探针AuNPs@polyA-DNA的0.6倍；适配体浓度越低，探针AuNPs@SH-DNA对适配体的响应信号与探针AuNPs@polyA-DNA之间的差异就越大，当适配体终浓度为2nM，探针AuNPs@SH-DNA对适配体的响应信号是负载探针AuNPs@polyA-DNA的0.3倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种检测卡那霉素的适配体胶体金侧向层析试纸
<130> BAA210392A
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttttgggggt tgaggctaag ccgattt 27
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<400> 2
aaaaaaaaaa aaaaattttt aaaaaaatcg gcttagc 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctcaaccccc aaaaaaa 17
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<212> DNA
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gctaagccga ttttttt 17
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgggggttga ggctaagccg a 21
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttttttgggg gttgaggcta agccga 26

Claims (6)

1.一种胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，含有AuNPs@polyA-DNA偶联物、序列如SEQID NO.1所示的核酸适配体、链霉亲和素-生物素-capApt和链霉亲和素-生物素-capDNA；所述AuNPs@polyA-DNA偶联物是将序列如SEQ ID NO.2所示的polyA-DNA和纳米金离子偶联得到的；所述链霉亲和素-生物素-capApt与链霉亲和素-生物素-capDNA是将链霉亲和素分别与3’端经生物素标记的capApt和5’端经生物素标记的capDNA等体积混合孵育制备得到的；所述capApt的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，capDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，所述纳米金离子的粒径为13~17 nm；所述polyA-DNA的浓度为80~120 µM。
3.根据权利要求1或2所述的胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC胶板；所述PVC胶板上依次黏贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上依次设有检测区和控制区，且检测区和控制区之间的距离为4~6 mm；所述检测区上有链霉亲和素-生物素-capApt，控制区上有链霉亲和素-生物素-capDNA；所述金标垫上含有AuNPs@polyA-DNA偶联物。
4.一种快速检测卡那霉素的方法，其特征在于，所述方法是采用权利要求1~3任一所述胶体金侧向层析试纸条进行测试，将待测溶液与所述核酸适配体混合孵育后滴加到样品垫上，用肉眼进行定性分析或使用胶体金试纸定量分析仪根据标准曲线进行定量分析。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述标准曲线为y=-0.3177x+0.7248，式中y为相对光信号强度，x为卡那霉素浓度的Log函数。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述待测溶液与核酸适配体混合孵育的时间为15~25 min；所述待测溶液与核酸适配体混合的体积比为99:1；所述核酸适配体的初始浓度为0.5~1.5 µM。
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