CN113121684A - 一种卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明实施例涉及一种卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体及其应用，包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下的CDR：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的VH CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的VH CDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VH CDR3；所述轻链可变区包含以下的CDR：氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的VL CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的VL CDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的VL CDR3。本发明的人源中和性抗体为可阻断FSTL1生物活性的抗体，从而调节各种纤维化疾病(例如特发性肺纤维化疾病(IPF)和皮肤纤维化)。

Description

一种卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体及其应用。

背景技术

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

脏器纤维化的本质是组织遭受损伤后的修复反应，以保护组织器官的相对完整性。脏器纤维化主要病理改变为器官组织内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，持续进展可致器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭，严重威胁人类健康和生命，在人体各主要器官疾病的发生和发展过程中均起着重要作用。病理性纤维化的临床影响巨大，但治疗方案极为有限，在很大程度上是支持性而非治疗性，了解导致脏器纤维化发展的细胞和分子途径对于确定潜在的治疗靶点至关重要。

肺纤维化是最重要的脏器纤维化，它是是许多病因各异的肺间质疾病的终末期临床表现，是以肺泡持续性损伤、成纤维细胞增殖及大量细胞外基质沉积为特征，从而导致肺泡和肺间质出现不同程度的炎症和纤维化，进而导致肺结构破坏和呼吸衰竭的一种疾病。特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是最常见的弥漫性肺纤维化疾病，临床上表现为进行性呼吸困难伴刺激性干咳，病情常持续进展，至今病因不明、发病机制不清、缺乏有效的治疗手段，中位生存期仅2-3年。肺纤维化成因复杂，TGF-β是目前已知最重要的一类促纤维化因子，具有诱导纤维母细胞增殖分化成肌纤维母细胞，促进胶原等ECM的合成等作用，是肺纤维化疾病发生发展的总开关。TGF-β及其下游信号在IPF的发病机制中的关键作用，使之成为一个有吸引力的治疗目标。因此，本领域需要发现更多的可干扰TGF-β信号的分子，为治疗IPF等肺纤维化疾病提供潜在的分子靶点和治疗手段。

皮肤纤维化也是一种很常见的器官纤维化，有多种类型和不同的病因，例如外科手术伤口或突发伤口引起的伤口愈合失败，或系统性免疫疾病均可导致局部或大面积皮肤纤维化。轻微局部的皮肤纤维化可能只给患者带来容貌或外形上的困扰，但程度严重的皮肤纤维化则会影响患者的正常生理功能，使患者丧失抵抗外界病原侵袭和伤害的最大屏障，如瘢痕疙瘩，增生性瘢痕以及系统性硬皮病。近些年针对皮肤纤维化的治疗一直局限于外科手术切除，放射治疗或免疫治疗，免疫治疗多使用激素类药物，但激素类药物短期使用复发率较高，长期使用则会给患者带来非常多副作用，包括感染，高血压，高糖血症，骨质疏松，撤药反跳，股骨头无菌坏死，肥胖，精神兴奋，消化性溃疡等等。目前皮肤纤维化药物研究未能取得突破性进展的原因是对不同类型皮肤纤维化的启动因素和病理机制不够了解，无法确切锁定涉及皮肤纤维化病因的关键性细胞因子。目前研究表明TGF-β1是调控皮肤纤维化过程中成纤维细胞活化增生的关键性因子。

卵泡抑素样蛋白1(Follistatin-like1，FSTL1)是最早由Shibanuma M等从小鼠成骨细胞MC3T3-E1中克隆得到一个可被TGF-β1诱导的基因。该基因编码一种可分泌的小分子糖蛋白(38kD)，已有的研究表明FSTL1作为BMP4的抑制因子在肺的发育过程中起重要作用。最近有报道关于FSTL1促进TGF-β在肺纤维化疾病中起作用。FSTL1是一种多功能的分泌性糖蛋白，是一个具有促进组织纤维化的调节因子。

发明内容

发明目的

本发明的目的在于提供一种卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体及其应用，本发明的人源中和性抗体为可阻断FSTL1生物活性的抗体，从而调节各种纤维化疾病(例如特发性肺纤维化疾病(IPF)和皮肤纤维化)，包括可以用来治疗、缓解或改善肺纤维化和皮肤纤维化疾病或症状。

解决方案

为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，

所述重链可变区包含以下的CDR：氨基酸序列如SEQ ID NO:1(EGTFNNYG)所示的VHCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2(VIPIIGIG)所示的VH CDR2，以及氨基酸序列如SEQ IDNO:3(ARHLGGRNSYDVFDI)所示的VH CDR3；

所述轻链可变区包含以下的CDR：氨基酸序列如SEQ ID NO:4(HSLVQSNGNTY)所示的VL CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:5(KVS)所示的VL CDR2，以及氨基酸序列如SEQ IDNO:6(MQARQTPWT)所示的VL CDR3。

本发明的抗体重链可变结构域(VH)的FR和CDR的序列(CDR序列以IMGT规则定义)、抗体轻链可变结构域(VL)的FR和CDR的序列(CDR序列以IMGT规则定义)见表1。

表1序列表信息

SEQ ID NO:	序列描述	序列信息
				VH FR1	QVQLVQSGAEVKKPGSTVKVSCKSS
1	VH CDR1	EGTFNNYG
				VH FR2	ISWIRQAPGQGLEWMGG
2	VH CDR2	VIPIIGIG
				VH FR3	NFPQKFQDRVTMTADKFTGTAYMELSSLRSEDTAVYYC
3	VH CDR3	ARHLGGRNSYDVFDI
				VH FR4	WGQGTLVTVSS
	VL FR1	EIVLTQSPLSLPVTLGQTASISCRSS
			4	VL CDR1	HSLVQSNGNTY
	VL FR2	LTWFQQRPGQSPRRLIY
			5	VL CDR2	KVS
	VL FR3	SRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
			6	VL CDR3	MQARQTPWT
	VL FR4	FGQGTKVEIK

进一步地，所述重链可变区还包括重链可变区框架区；和/或，所述轻链可变区还包括轻链可变区框架区，其中，

所述重链可变区框架区为人抗体的重链可变区框架区，所述轻链可变区为人抗体的轻链可变区框架区。

进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；可选地，所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

进一步地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；可选地，所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

进一步地，所述人源中和性抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；可选地，所述人源中和性抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

进一步地，所述人源中和性抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；可选地，所述人源中和性抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

进一步地，所述人源中和性抗体选自由下述(a)～(b)组成的组：

(a)人源FSTL1中和性抗体，其氨基酸序列包含由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列构成的重链和由SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列构成的轻链；以及

(b)人源FSTL1中和性抗体，其是通过(a)所述的人源FSTL1中和性抗体的翻译后修饰生成的抗体。

进一步地，其为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双特异性抗体或多特异性抗体，可选地，其为scFv抗体。

进一步地，所述抗体为包括重链恒定区和轻链恒定区的全长抗体，所述重链恒定区选自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4，可选地，所述重链恒定区为hIgG1；和/或，所述轻链恒定区选自κ链或λ链，可选地，所述轻链恒定区为人源抗体的κ链。

又一方面，提供一种编码所述的卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

另一方面，提供一种包括所述的核苷酸序列的重组载体。

再一方面，还提供一种包括所述的重组载体的表达系统细胞。

还提供一种用于治疗或改善组织纤维化疾病的药物组合物，其包含所述的卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体或其抗原结合片段。

还提供一种所述的卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体或其抗原结合片段、所述的核苷酸序列、所述的重组载体或所述的表达系统细胞在制备治疗或调节皮肤纤维化疾病的药物中的应用。

有益效果

(1)本发明的人源中和性抗体为可阻断FSTL1生物活性的抗体，从而调节各种纤维化疾病(例如特发性肺纤维化疾病(IPF)和皮肤纤维化)，包括可以用来治疗、缓解或改善肺纤维化和皮肤纤维化疾病或症状。

(2)本发明中的人源中和性抗体较鼠源中和性抗体在实际应用方面价值更高，更接近于临床应用抗体，对于后期临床应用具有更显著的意义，且本发明中的人源抗体与抗原的亲和力显著优于鼠源抗体，具有更高的应用优势。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1是本发明的人源FSTL1抗体的第一轮活性筛选进行重组蛋白刺激后的荧光素酶的活力水平；

图2是本发明的人源FSTL1抗体的第二轮活性筛选进行重组蛋白刺激后的荧光素酶的活力水平；其中，A图、B图为荧光素酶报告基因检测筛选结果，C图、D图为化标志物α-SMA表达图，1-10分别代表JKB6、JKE11、JKF8、JKG4、JK07、JKA10、JKA11、JKB4、JKC5、JK04；

图3是本发明的人源FSTL1抗体的第三轮活性筛选进行重组蛋白刺激后的荧光素酶的活力水平；其中，A图为荧光素酶报告基因检测筛选结果，B图为化标志物α-SMA表达水平图，10、4、5、3、1、2分别代表JK04、JKG4、JK07、JKF8、JKB6、JKE11；

图4是本发明的人源FSTL1中和性抗体JK07和JK04的表面等离子共振SPR实验分析结果，其中A图为JK07抗体与FSTL1蛋白亲和力分析结果，B图为JK04抗体与FSTL1蛋白亲和力分析结果；

图5是鼠源FSTL1中和性抗体2K6和4D22的表面等离子共振SPR实验分析结果，其中，A图为鼠源2K6抗体与FSTL1蛋白亲和力分析结果，B图为鼠源4D22抗体与FSTL1蛋白亲和力分析结果。

图6是本发明的人源FSTL1中和性抗体JK07减轻博莱霉素所诱导的小鼠肺纤维化；其中，A图为各组小鼠生存率变化；B图为各组小鼠肺组织切片H&E染色；C图为各组小鼠体重变化；D图为各组羟脯氨酸检测验证中和性抗体JK07抑制博莱霉素诱导的肺组织中胶原合成；E图为各组H&E染色的肺组织切片进行纤维化面积百分比统计

图7是本发明的人源FSTL1中和性抗体JK07减轻博莱霉素所诱导的小鼠皮肤纤维化，其中，A图为各组小鼠皮肤切片的H&E染色(上)、Masson染色(中)和天狼星红染色(下)切片的代表性图像；B图为各组真皮厚度数据统计；C图为各组胶原含量比例统计；D图为羟脯氨酸含量。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

以下，对本发明进行详述。

抗体中存在IgG、IgM、IgA、IgD和IgE这5类。抗体分子的基本结构在各类中是共通的，由分子量5万～7万的重链和2万～3万的轻链构成。重链由通常包含约440个氨基酸的多肽链构成，各类具有特征性的结构，与IgG、IgM、IgA、IgD、IgE对应地被称为Igγ、Igμ、Igα、Igδ、Igε。此外，IgG中存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的亚类，各自所对应的重链被称为Igγ1、Igγ2、Igγ3、Igγ4。轻链由通常包含约220个氨基酸的多肽链构成，已知有L型和K型这两种，分别被称为Igλ、Igκ。抗体分子的基本结构的肽构成是各自相同的两条重链和两条轻链通过二硫键(S-S键)和非共价键而结合，分子量为15万～19万。两种轻链与哪一种重链均可成对。各个抗体分子总是由相同的两条轻链和相同的两条重链形成。

链内S-S键在重链中有四个(在μ、ε链中有五个)、在轻链中有两个，每100～110个氨基酸残基形成一个环，其立体结构在各环间类似，被称为结构单元或结构域。对于重链、轻链中均位于氨基末端(N末端)的结构域而言，即使是来自同种动物的同一类(亚类)的制备品，其氨基酸序列也不是恒定的，被称为可变区，各结构域分别被称为重链可变区(或VH)和轻链可变区(或VL)。比可变区更靠近羧基末端(C末端)侧的氨基酸序列在各类或亚类中基本恒定，被称为恒定区。恒定区的各结构域从可变区侧起分别依次表示为CH1、CH2、CH3或CL。

抗体的抗原结合部位由VH和VL构成，结合的特异性取决于该部位的氨基酸序列。另一方面，与补体、各种效应细胞的结合之类的生物学活性反映出各类Ig的恒定区的结构的差异。已知重链和轻链的可变区的可变性基本限于在哪一种链中都存在的三个小的超变区，将这些区域称为互补决定区(CDR；从N末端侧起分别为CDR1、CDR2、CDR3)。可变区的其余部分被称为框架区(FR)，是比较恒定的。

包含抗体的VH和VL的各种抗原结合片段也具有抗原结合活性，作为这样的代表性的抗原结合片段，可以列举单链可变区片段(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2。Fab是由轻链与包含VH、CH1结构域和铰链区的一部分的重链片段构成的一价抗体片段。Fab’是由轻链与包含VH、CH1结构域和铰链区的一部分的重链片段构成的一价抗体片段，在该铰链区的部分中包含构成重链间S-S键的半胱氨酸残基。F(ab’)2片段是两个Fab’片段以铰链区中的重链间SS键结合而得到的二价抗体片段。scFv是由利用接头连接的VH和VL构成的一价抗体片段。

序列表自由文本

下述序列表的数字索引<223>中记载了“Artificial Sequence”(人工序列)的说明。具体而言，序列表的SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9所示的碱基序列分别为编码抗FSTL1抗体的重链和轻链的按Kabat编号规定的残基序号1至C末端的碱基序列，序列表的SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列分别为由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9编码的重链和轻链的氨基酸序列。序列表的序列号SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示的碱基序列分别为编码人源FSTL1中和性抗体的重链和轻链的按Kabat编号规定的可变区残基序号1至恒定区C末端的碱基序列，序列表的序列号SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列分别为由序列号SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13编码的重链和轻链的氨基酸序列。

本发明中名词术语的定义与解释

本说明书中使用的抗体的氨基酸残基序号可以通过指定Kabat编号或EU索引(Kabat等、1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第五版、NIHPublication No.91-3242)，按照它们的编号系统来规定。

根据本发明，术语荧光素酶报告基因检测是指取对数生长期的CAGA-NIH3T3细胞，以5000个/mL的细胞悬液接种于96孔板中100μL/孔，培养过夜。待细胞汇合至60～70％，对细胞进行撤血清，即把DMEM完全培养基换成含1‰血清的培养基，24h的饥饿处理后，加入1μg/mL Fstl1抗体(一个抗体设置三个复孔)，和5ng/mL TGF-β1刺激细胞，培养18h后利用Luciferase试剂盒检测荧光素酶的表达强度。具体的检测步骤为:从培养箱中拿出96孔板，弃培养基，预冷的PBS洗2遍，加入1×lysis buffer50μL/孔，置于摇床上室温裂解30min，随后将细胞裂解液转移至干净的白板中35μL/孔，快速加入luciferase底物40μL/孔，立即放到检测仪器中对荧光强度进行检测，随后对结果进行分析，筛选出对TGF-β1/Smad3信号通路具有抑制作用的抗体。

根据本发明，术语Western Blotting检测是指成纤维细胞用RIPA裂解液裂解获得细胞总蛋白，利用BCA系统(Pierce)测定蛋白浓度。细胞上清蛋白用饱和三氯乙酸(TCA)沉淀，并溶于1×sample buffer；细胞与组织蛋白中加入sample buffer，100度变性，利用不同浓度的SDS-PAGE胶分离蛋白。将蛋白湿转到PVDF膜(Roche)上，牛奶封闭后，一抗4度孵育过夜，含0.1％的TBS溶液洗后，HRP酶标二抗室温孵育2小时。利用ECL系统(Pierce)检测蛋白表达量。用于Western blotting的一抗:type I collagen、α-SMA、β-actin(Santa CruzBiotechnology)；phosphor-Smad3(Cell Signaling Technology)。

根据本发明，术语表面等离子体共振(SPR)检测是指在Biacore T200仪器(Biacore AB,乌普萨拉,瑞典)上，利用SPR检测FSTL1中和性抗体(JK07和JK04)与FSTL1蛋白之间的相互关系。抗体胺耦合固定与CM5传感芯片(Biacore)表面，含有10mM HEPES,pH7.4,150mM NaCl,3mM EDTA,and 0.005％表面活性剂polyoxyethylenesorbitan的HBS-EP缓冲液(Biocore)中进行固定化和相互作用的研究。FSTL1蛋白在HBS-EP缓冲液中稀释，以10ul/min的流速进行注射，共50ul。利用HBS-EP缓冲液冲洗至少2分钟观察解离反应。利用BIAevaluation program(Biacore)软件分析结合曲线和解离曲线并计算KD值。

根据本发明，术语微量热泳动(MST)检测是指在微量热泳动仪器中检测鼠源FSTL1中和性抗体(2K6和4D22)与靶点蛋白FSTL1的亲和力，具体实验方法为：将100mL标记缓冲液中的20mM配体蛋白溶液与100mL标记缓冲液中的60mM NT647-NHS荧光团(Nano-TemperTechnologies，德国)混合，并于室温(RT)孵育30分钟。使用NanoTemper Monolith NT.115(NanoTemper Technologies，德国)进行2K6/4D22抗体与NT647配体之间的相互作用。2K6和4D22抗体的系列稀释液在测定缓冲液(含0.05％Tween 20的PBS)中加入50nM NT647配体，每次稀释的最终体积为20mL。将反应混合物装入标准处理的毛细管中，然后通过MST在20％的激发功率和30％的发光二极管(LED)强度下进行分析。

根据本发明，术语主要试剂是指博莱霉素(Bleomycin)购自日本化药株式会社(批号：Y91450)。

本研究所使用的小鼠规格均为SPF级，用于中和性抗体实验的C57BL/6J小鼠，饲养于南开大学动物饲养中心，恒温恒湿，自由饮食。

根据本发明，术语博莱霉素所诱导的小鼠肺纤维化模型制备是指雄性C57BL/6J(周龄8-10周)小鼠，以10％水合氯醛按0.5ml/100g腹腔(I.P.)注射麻醉小鼠，气管内注射博莱霉素2U/kg。具体实施方式如下：麻醉小鼠后称重记录，将小鼠固定于操作台，颈部用70％酒精消毒，用手术刀在小鼠颈部垂直划开大约1cm长创口，利用显微镊分离组织暴露气管，将注射器经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，然后按2U/kg的计量缓慢注入与其体重相适应体积的博莱霉素生理盐水溶液，立即将动物直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布。

根据本发明，术语博莱霉素所诱导的小鼠皮肤纤维化模型制备是指6-8周龄C57BL/6雄性小鼠以7.5％水合氯醛按0.6毫升/100g腹腔(I.P.)注射麻醉，背部朝上，将背部下方两侧毛发剔除，暴露皮肤，用1ml胰岛素注射器将100μl 0.2U博莱霉素注射入小鼠背部皮肤皮下，两侧各100μl。

根据本发明，术语羟脯氨酸含量测定是指分别在博莱霉素处理14天处死小鼠，取右肺或皮肤组织，放于5ml安瓿瓶，烘干，酸水解，调整其PH到6.5-8.0，过滤残渣，PBS调整其总体积为10ml，取50ul样品，加入350ul去离子水，加入200ul氯胺T(Chloramine T)溶液室温孵育20分钟；加入200ul高氯酸(perchloric acid)室温孵育5分钟；加入200ul对二甲氨基苯甲醛(P-DMAB)65℃孵育20分钟。取200ul至96孔板中测定样品557nm的吸光值，利用标准品读数绘制标准曲线，进而利用标准曲线所得公式求得所测样品羟脯氨酸浓度Cs。按以下公式换算为全部右肺所含羟脯氨酸的量W∶W＝Cs×8(所测样品稀释倍数)×10(样品总体积)。

根据本发明，术语Masson染色组织学分析是指取小鼠左侧肺组织,中性福尔马林固定后石蜡包埋,从肺组织的肺门处开始进行切片,传统Masson染色观察纤维化状况、胶原沉积。步骤如下：二甲苯I，10分钟；二甲苯II，10分钟；无水乙醇，10分钟；无水乙醇10分钟；95％乙醇10分钟；95％乙醇10分钟；自来水中片刻；Bouin氏固定液媒染30分钟；酒精苏木素与三氯化铁按1:1混合均匀(现用现配)，染色5分钟；蒸馏水冲洗；1％的盐酸酒精分化；流水冲洗；丽春红酸性品红染色7分钟；蒸馏水冲洗2分钟；加磷钼酸5分钟；吸去磷钼酸加苯胺蓝染色5分钟；加1％冰醋酸洗去苯胺蓝溶液，95％酒精洗3次，每次1分钟；100％乙醇，2分钟；100％乙醇，2分钟；二甲苯I，2分钟；二甲苯II，2分钟；中性树胶封片，通风橱中晾干。应正置透射荧光显微镜(LeicaDFC420C)采集图像数据(200倍放大),在Image-Pro Plus Version6.0(Media Cybernetics,Inc.American)中打开,利用软件选区工具选定全部肺组织区域,利用软件自动计算功能得出所选区域的总像素,然后用同样的方法选取该切片中纤维化的区域利用软件计算出纤维化区域的总像素,纤维化区域总像素Pf与全肺总像素Pw之比即为纤维化所占比例。

根据本发明，术语H&E染色组织学分析是指苏木精伊红(H&E)染色，具体染色步骤如下：二甲苯I，10分钟；二甲苯II，10分钟；无水乙醇，10分钟；无水乙醇10分钟；95％乙醇10分钟；95％乙醇10分钟；自来水中片刻；蒸馏水中片刻；苏木精染核，25s；自来水反蓝，10分钟；显微镜观察细胞核着色；95％乙醇，2分钟；95％乙醇，2分钟；伊红(0.5％，溶于95％乙醇中)，1s；95％乙醇，2分钟；95％乙醇，2分钟；100％乙醇，2分钟；100％乙醇，2分钟；二甲苯I，2分钟；二甲苯II，2分钟；中性树胶封片，通风橱中晾干。

根据本发明，术语天狼星红染色组织学分析是指天狼猩红(Picrosirius Red)染色，具体染色步骤如下：二甲苯I，10分钟；二甲苯II，10分钟；无水乙醇，10分钟；无水乙醇10分钟；95％乙醇10分钟；95％乙醇10分钟；自来水中片刻；蒸馏水中片刻；天狼星红染色液滴染1h；流水稍冲洗，去除切片表面染液；Mayer苏木素染色液染细胞核8～10min；流水冲洗10min；95％乙醇，2分钟；95％乙醇，2分钟；100％乙醇，2分钟；100％乙醇，2分钟；二甲苯I，2分钟；二甲苯II，2分钟；中性树胶封片，通风橱中晾干。

实施例1.人源FSTL1抗体的活性筛选

首先我们从噬菌体展示抗体库中筛选获得47个与人源Fstl1蛋白结合的抗体，将抗体活性序列(sc-Fv)克隆入表达载体中，转染293T细胞，2-3天后收集条件培养基(Conditioned medium)，其中含有高浓度scFv，可以直接加入CAGA-luciferase报告细胞系中进行荧光素酶报告基因检测抗体对Fstl1的中和活性。我们在第一轮抗体活性筛选中使用上述方法得到的条件性培养基通过TGF-β1荧光素酶报告细胞系检测抗Fstl1人源抗体的活性，第一轮筛选重复进行了三次荧光素酶报告基因检测，筛选结果(图1)显示了对照组和实验组在TGF-β1刺激作用下luciferase荧光强度的升高倍数，实验组荧光强度升高倍数值在对照组荧光强度(横线)以下即为有效，通过综合三次重复结果，我们选择了10个抑制作用较强且作用稳定的抗体(JKB6、JKE11、JKF8、JKG4、JK07、JKA10、JKA11、JKB4、JKC5、JK04)。

第一轮筛选所用抗体为scFv活性片段形式，第二轮筛选进一步利用哺乳动物细胞表达Fstl1中和性抗体：将抗体基因从噬菌粒(噬菌体质粒)亚克隆到哺乳动物表达载体(pFUSE-Fc)中，抗体scFv与IgG1的Fc段形成融合蛋白，由IL2信号肽介导分泌到细胞外。将装入不同抗体PFUSE-Fc分别转染293T细胞，一定时间后收集条件培养基(Conditionedmedium)，其中含有高浓度scFv-Fc。第一轮筛选共得出10个活性高的sc-Fv，在第二轮筛选中分两批转化为scFv-Fc，荧光素酶报告基因检测筛选结果如图2的A-B图所示，共有6个抗体在报告细胞系中作用明显(JK04、JKG4、JK07、JKF8、JKB6、JKE11)，利用人肺成纤维细胞系筛选所得结果同报告细胞系筛选的结果基本一致，上述6个抗体可有效抑制TGF-β1诱导的Smad信号通路活化以及成纤维细胞活化标志物α-SMA表达(图2C-D)，综合考虑两种实验结果，我们选定上述6个抗体进行第三轮筛选。

第三轮筛选将第二轮筛选中对Fstl1表现出中和能力的6个scFv-Fc转化成全长IgG蛋白，小量纯化IgG蛋白，并在报告细胞系CAGA-NIH3T3和人成纤维细胞中比较全长IgG对Fstl1的中和能力。此次筛选将每个抗体设定三个浓度梯度：1μg/ml，5μg/ml和10μg/ml，Hepica抗体作为对照抗体，结果显示JK04、JKG4和JK07三个抗体具有剂量依赖性中和作用，JKF8、JKB6和JKE11并无梯度依赖性抑制作用(图3A)，利用人肺成纤维细胞系筛选所得结果同报告细胞系筛选的结果一致，JK04、JKG4和JK07三个抗体可显著抑制成纤维细胞活化标志物α-SMA表达(图3B)，其中JK07效果最优，优于JKG4优于JK04，但JKG4全长IgG蛋白有聚集现象，抗体质量不好不适于下一步研究，因此选择蛋白质量好且有效的JK07和JK04抗体进入后续研究。

图1为人源FSTL1抗体的第一轮活性筛选结果。(A-C)分别为三次重复实验，CAGA-NIH3T3细胞中加入含抗体活性序列的条件培养基100μL/孔，孵育一小时后加入5ng/mLTGF-β1重组蛋白刺激24h，检测荧光素酶的活力。

图2为人源FSTL1抗体的第一轮活性筛选结果，1-10分别代表JKB6、JKE11、JKF8、JKG4、JK07、JKA10、JKA11、JKB4、JKC5、JK04。(A-B)CAGA-NIH3T3细胞中加入含抗体融合蛋白的条件培养基100μL/孔，孵育一小时后加入5ng/mL TGF-β1重组蛋白刺激24h，检测荧光素酶的活力。(C-D)小鼠肺成纤维细胞Mlg细胞中加入含抗体融合蛋白的条件培养基500μL/孔，孵育一小时后加入5ng/mL TGF-β1重组蛋白刺激0.5h后检测TGF-β1下游关键信号通路蛋白Smad3的磷酸化水平；TGF-β1重组蛋白刺激24h后检测成纤维细胞关键活化标志物α-SMA的表达水平，β-actin为内参蛋白。

图3为人源FSTL1抗体的第一轮活性筛选结果，10、4、5、3、1、2分别代表JK04、JKG4、JK07、JKF8、JKB6、JKE11。(A)CAGA-NIH3T3细胞中加入不同浓度纯化后的抗体IgG蛋白(1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)，孵育一小时后加入5ng/mL TG-β1重组蛋白刺激24h，检测荧光素酶的活力。(B)小鼠肺成纤维细胞Mlg细胞中加入纯化后的抗体IgG蛋白10μg/mL，孵育一小时后加入5ng/mL TGF-β1重组蛋白刺激24h后检测成纤维细胞关键活化标志物α-SMA的表达水平，β-actin为内参蛋白。

实施例2.人源FSTL1中和性抗体JK07和JK04的亲和力检测以及与鼠源FSTL1中和性抗体的亲和力比较。

为进一步选择更优异的FSTL1中和性抗体，将活性筛选得到的两个具有中和活力的人源抗体JK07和JK04与靶点蛋白-人源FSTL1蛋白进行了亲和力研究，利用表面等离子共振SPR技术研究亲和力结果显示，JK07抗体与抗原的亲和力为6.17nM，JK04抗体与抗原的亲和力为31.17nM；同时将人源抗体与之前研究得到的鼠源FSTL1中和性抗体2K6和4D22的亲和力进行比较，鼠源FSTL1中和性抗体2K6与抗原的亲和力为106.8nM，鼠源FSTL1中和性抗体4D22与抗原的亲和力为113.1nM，由亲和力数据比较得出人源抗体的亲和力明显优于鼠源抗体，检测的两个人源FSTL1抗体中JK07的亲和力优于JK04，因此后续选择JK07抗体进行下一步的药效学研究。

图4为表面等离子共振SPR实验分析结果。(A)JK07抗体与FSTL1蛋白亲和力分析结果，KD值为6.17nM；(B)JK04抗体与FSTL1蛋白亲和力分析结果，KD值为31.17nM。

图5为微量热泳动MST实验分析结果。(A)2K6抗体与FSTL1蛋白亲和力分析结果，KD值为106.8nM；(B)4D22抗体与FSTL1蛋白亲和力分析结果，KD值为113.1nM。

实施例3.FSTL1中和性抗体(JK07)可缓解博莱霉素所诱导的小鼠肺纤维化。

雄性C57BL/6J(周龄8-10周)小鼠，经气管注射2U/kg博莱霉素，在博莱霉素处理第2、4、6、8、10、12天时，分别通过腹腔注射100ug、200ug、400ug FSTL1中和性抗体(JK07)或相对应的亚型(IgG1)，并用吡啡尼酮在造模7天后每天灌胃200mg/kg作为阳性对照，造模14天后处死取材，检测肺纤维化及胶原含量。

真皮厚度的测量方法：应用O8病理切片扫描仪采集H&E染色图像数据，用Viewpoint软件测量真皮厚度，测量单位为mm，每块皮肤在不同位置测量5次，取平均值进行统计，之后计算博莱霉素组及给药组相对氯化钠组小鼠皮肤厚度的比值，如图7B所示(柱状图中显示的是博莱霉素组与氯化钠组(记为1)的相对比值)。

皮肤胶原含量检测(即羟脯氨酸含量测定)：在博莱霉素注射第14天处死小鼠，分理出造模部位皮肤，剪碎后取5mg放入5mL安培瓶，120℃烘箱烘干，加入3mL浓度为12mol/L的盐酸，120℃下水解6小时，水解后用浓度为10mol/L的NaOH调整pH至6.5-8.0，使用孔径为5μm的过滤器过滤残渣，得滤液，滤液中加入PBS(磷酸盐缓冲溶液)调整总体积为5mL，得到样品A；取50μL样品A，加入350μL去离子水，加入200μL浓度为1.41％的氯胺T(ChloramineT)溶液，室温孵育20分钟，加入200μL浓度为18.9％的高氯酸溶液(perchloric acid，室温孵育5分钟，加入200μL浓度为浓度为20％的对二甲氨基苯甲醛(P-DMAB)溶液，65℃孵育20分钟，得到样品B；取200μL样品B至96孔板中测定样品B在570nm波长处的吸光值，利用L-羟脯氨酸标准品(Sigma)的浓度与吸光度为横纵坐标，绘制标准曲线，依据标准曲线对应的回归方程，计算所测样品羟脯氨酸的浓度。

博莱霉素(2U/kg)处理C57BL/6J小鼠诱导肺纤维化发生，处理后第2、4、6、8、10、12天经腹腔注射JK07抗体的小鼠相比于模型组小鼠生存率明显升高(图6A)，肺纤维化病理明显缓解(图6B)，体重逐渐回升(图6C)。与模型组小鼠相比，注射FSTL1中性抗体的小鼠肺组织中羟脯氨酸的含量明显降低，且成浓度梯度变化(图6D)，这说明JK07抗体确实能够减轻博莱霉素所诱导的胶原含量。对H&E染色组织切片进行纤维化的定量统计，发现注射JK07抗体的小鼠肺纤维化面积明显低于注射PBS缓冲液的小鼠(图6E)。

图6为Fstl1中和性抗体JK07减轻博莱霉素所诱导的小鼠肺纤维化。(A)各组小鼠生存率变化；(B)各组小鼠肺组织切片H&E染色；(C)各组小鼠体重变化；(D)羟脯氨酸检测验证中和性抗体JK07抑制博莱霉素诱导的肺组织中胶原合成；(E)H&E染色的肺组织切片进行纤维化面积百分比统计，验证验证中和性抗体JK07抑制博莱霉素诱导的肺组织纤维化。#代表模型组和正常对照组比较的显著性差异，*代表给药组和模型组比较的显著性差异。###，P＜0.001；*，P<0.05；**，P<0.01，***，P＜0.001。

体内实验证明了阻断FSTL1活性的中和性抗体JK07在小鼠体内可以明显抑制博莱霉素诱导的肺纤维化。

实施例4.FSTL1中和性抗体(JK07)可缓解博莱霉素所诱导的小鼠皮肤纤维化。

6-8周龄C57BL/6雄性小鼠麻醉后背部朝上，将背部下方两侧毛发剔除，暴露皮肤，用1ml胰岛素注射器将100μl 0.2U博莱霉素注射入小鼠背部皮肤皮下，两侧各100μl；中和性抗体组将10μg/ml中和性抗体JK07和100μl博莱霉素混合后打入小鼠背部皮下，从D1天开始每天注射一次，直至D14取材，尼达尼布在造模后以50mg/kg剂量每天灌胃两次作为阳性对照。皮肤纤维化明显的病理特征是真皮层增厚，FSTL1中和性抗体可显著减弱博莱霉素诱导的小鼠皮肤纤维化：石蜡切片H&E染色、Masson染色和天狼星红染色结果显示中和性抗体组小鼠在博莱霉素造模之后皮肤厚度明显小于对照博莱霉素组(图7A)，通过H&E染色图片进行皮肤厚度统计(图7B)以及利用马松染色和天狼星红染色统计真皮层胶原含量比例(图7C)结果也显示FSTL1中和性抗体可显著减弱博莱霉素诱导的小鼠皮肤纤维化，并呈现梯度作用效果，羟脯氨酸检测结果也显示了同样的结论(图7D)，且中和性抗体高剂量组药效优于阳性药尼达尼布。

图7为FSTL1中和性抗体JK07缓解博莱霉素所诱导的小鼠皮肤纤维化。(A)各组小鼠皮肤切片的H&E染色(上)、Masson染色(中)和天狼星红染色(下)切片的代表性图像。标尺，100μm。(B)真皮厚度数据统计。(C)胶原含量比例统计。(D)羟脯氨酸含量。#代表模型组和正常对照组比较的显著性差异，*代表给药组和模型组比较的显著性差异。###，P＜0.001，####，P<0.0001；*，P<0.05；**，P<0.01，***，P＜0.001，****，P<0.0001。

基于以上研究成果，可阻断卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)活性的中和性抗体(JK07)可应用于治疗、缓解或改善肺纤维化和皮肤纤维化疾病或症状的药物的制备中。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津济坤医药科技有限公司

<120> 一种卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体及其应用

<130> 1132-210070F

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

<223> 人源FSTL1中和性抗体JK07的VH CDR1

<400> 1

Glu Gly Thr Phe Asn Asn Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

<223> 人源FSTL1中和性抗体JK07的VH CDR2

<400> 2

Val Ile Pro Ile Ile Gly Ile Gly

1 5

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

<223> 人源FSTL1中和性抗体JK07的VH CDR3

<400> 3

Ala Arg His Leu Gly Gly Arg Asn Ser Tyr Asp Val Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

<223> 人源FSTL1中和性抗体JK07的VL CDR1

<400> 4

His Ser Leu Val Gln Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

<223> 人源FSTL1中和性抗体JK07的VL CDR2

<400> 5

Lys Val Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

<223> 人源FSTL1中和性抗体JK07的VL CDR3

<400> 6

Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 1462

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> CDS

<223> 编码SEQ ID NO：8氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 7

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtctac ggtgaaggtc 120

tcctgcaagt cttctgaagg caccttcaac aactatggta tcagttggat acgacaggcc 180

cctggacaag gacttgagtg gatgggaggg gtcatcccta taattggcat aggaaacttc 240

ccacagaagt tccaggacag agtcacgatg acggcggaca aattcacggg cacagcctat 300

atggagctga gtagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgacaccta 360

gggggtcgta attcctatga tgtctttgat atttggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420

tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480

tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540

gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc cctctagcag cttgggcacc 660

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960

tacgccagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatgat aagtgctagc tggccagaca 1440

tgataagata cattgatgag tt 1462

<210> 8

<211> 472

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

<223> 人源FSTL1中和性抗体JK07的VH链

<400> 8

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

20 25 30

Lys Pro Gly Ser Thr Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Glu Gly Thr

35 40 45

Phe Asn Asn Tyr Gly Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Met Gly Gly Val Ile Pro Ile Ile Gly Ile Gly Asn Phe

65 70 75 80

Pro Gln Lys Phe Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Phe Thr

85 90 95

Gly Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Leu Gly Gly Arg Asn Ser Tyr Asp Val

115 120 125

Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 9

<211> 741

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> CDS

<223> 编码SEQ ID NO：10氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 9

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60

gaaattgtgt tgacgcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gacggcctcc 120

atctcctgca ggtctagtca tagcctcgta caaagtaatg gaaacaccta cttgacttgg 180

tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt acaaggtttc tagccgggac 240

tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 300

agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctcg acaaactccg 360

tggacgttcg gccaagggac caaggtggag atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 420

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt cgtgtgcctg 480

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660

gtcacccatc agggcctgtc ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttga 720

taagtgctag ctggccagac a 741

<210> 10

<211> 239

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

<223> 人源FSTL1中和性抗体JK07的VL链

<400> 10

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro

20 25 30

Val Thr Leu Gly Gln Thr Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser His Ser

35 40 45

Leu Val Gln Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Asp

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

115 120 125

Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

165 170 175

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

195 200 205

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

210 215 220

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 11

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> CDS

<223> 编码SEQ ID NO：12氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 11

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtctac ggtgaaggtc 60

tcctgcaagt cttctgaagg caccttcaac aactatggta tcagttggat acgacaggcc 120

cctggacaag gacttgagtg gatgggaggg gtcatcccta taattggcat aggaaacttc 180

ccacagaagt tccaggacag agtcacgatg acggcggaca aattcacggg cacagcctat 240

atggagctga gtagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgacaccta 300

gggggtcgta attcctatga tgtctttgat atttggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 12

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

<223> 人源FSTL1中和性抗体JK07的VH链可变区

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Glu Gly Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Val Ile Pro Ile Ile Gly Ile Gly Asn Phe Pro Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Phe Thr Gly Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Leu Gly Gly Arg Asn Ser Tyr Asp Val Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> CDS

<223> 编码SEQ ID NO：14氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 13

gaaattgtgt tgacgcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gacggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca tagcctcgta caaagtaatg gaaacaccta cttgacttgg 120

tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt acaaggtttc tagccgggac 180

tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240

agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctcg acaaactccg 300

tggacgttcg gccaagggac caaggtggag atcaaa 336

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> DOMAIN

<223> 人源FSTL1中和性抗体JK07的VL链可变区

<400> 14

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Thr Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser His Ser Leu Val Gln Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Arg Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Claims (10)

1.一种卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，

所述重链可变区包含以下的CDR：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的VH CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的VH CDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VH CDR3；

所述轻链可变区包含以下的CDR：氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的VL CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的VL CDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的VL CDR3。

2.根据权利要求1所述的卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区还包括重链可变区框架区；和/或，所述轻链可变区还包括轻链可变区框架区，其中，

所述重链可变区框架区为人抗体的重链可变区框架区，所述轻链可变区为人抗体的轻链可变区框架区。

3.根据权利要求1所述的卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；可选地，所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；

和/或，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；可选地，所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

和/或，所述人源中和性抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；可选地，所述人源中和性抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

和/或，所述人源中和性抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；可选地，所述人源中和性抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

4.根据权利要求1至3任一所述的卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源中和性抗体选自由下述(a)～(b)组成的组：

(a)人源FSTL1中和性抗体，其氨基酸序列包含由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列构成的重链和由SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列构成的轻链；以及

(b)人源FSTL1中和性抗体，其是通过(a)所述的人源FSTL1中和性抗体的翻译后修饰生成的抗体。

5.如权利要求1至4任一项所述的卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双特异性抗体或多特异性抗体，可选地，其为scFv抗体；

和/或，所述抗体为包括重链恒定区和轻链恒定区的全长抗体，所述重链恒定区选自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4，可选地，所述重链恒定区为hIgG1；和/或，所述轻链恒定区选自κ链或λ链，可选地，所述轻链恒定区为人源抗体的κ链。

6.一种编码权利要求1-5任一所述的卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

7.一种包括权利要求6所述的核苷酸序列的重组载体。

8.一种包括权利要求7所述的重组载体的表达系统细胞。

9.一种用于治疗或改善组织纤维化疾病的药物组合物，其特征在于，其包含如权利要求1～5任一项所述的卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体或其抗原结合片段。

10.一种权利要求1-5之一所述的卵泡抑素样蛋白的人源中和性抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的核苷酸序列、权利要求7所述的重组载体或权利要求8所述的表达系统细胞在制备治疗或调节皮肤纤维化疾病的药物中的应用。

Images