CN113117058A - 可平衡Th1/Th2反应的流脑-乙脑联合疫苗可溶性微针 - Google Patents

可平衡Th1/Th2反应的流脑-乙脑联合疫苗可溶性微针 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可平衡Th1/Th2反应的流脑‑乙脑联合疫苗可溶性微针，包括针体和背衬，所述的针体由流脑‑乙脑联合疫苗、基质材料和佐剂组成，其中，所述的佐剂为铁皮石斛多糖，流脑‑乙脑联合疫苗与的含量比为1：2；所述的基质材料为聚乙烯基吡咯烷酮和硫酸软骨素的混合。本发明通过选择特定的TLR4配体作为佐剂，选择特定的流脑‑乙脑联合疫苗与佐剂的含量比，以及适当的载药量，使制得的流脑‑乙脑联合疫苗可溶性微针能够增强Th1免疫反应，以调节Th1/Th2免疫反应趋于平衡，又能够提高流脑‑乙脑联合疫苗的免疫应答强度，实现了真正的安全、有效。

Description

可平衡Th1/Th2反应的流脑-乙脑联合疫苗可溶性微针
技术领域
本发明涉及流脑-乙脑联合疫苗的给药技术领域，具体涉及一种可平衡Th1/Th2反应的流脑-乙脑联合疫苗可溶性微针。
背景技术
乙型脑炎是中枢神经系统急性病毒感染的疾病，且常造成患者死亡或留下神经系统后遗症。流行性乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)简称乙脑病毒，表面有包膜，包膜中有糖基化蛋白E和非糖基化蛋白M。乙脑是一种由蚊类传播的人畜共患疾病，人因被带病毒的蚊虫叮咬而感染。目前还没有治疗乙脑的药物，乙脑疫苗的免疫接种是预防流行性乙型脑炎最为重要的措施。
流脑即流行性脑脊髓膜炎(Meningococcal meningitis)，是由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的化脓性脑膜炎。根据脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖特性的不同至少可分为13个血清群:A、B、C、D、E29、H、I、K、L、W135、X、Y、Z，但只有属于A，B，C，Y和W135这5个群中的任一群才会致病。在世界许多地方包括中国在内的脑膜炎球菌对抗菌素的耐药性大量增加，就使得通过免疫接种疫苗来预防和控制该病成为紧迫的任务。
联合疫苗是指由两种或两种以上不同的生物体或提纯抗原联合配制而成，可预防多种病原体或同一病原体的不同抗原所引发的疾病。联合疫苗一直是WHO积极倡导的疫苗免疫发展方向。其优势在于减少了接种对象被注射次数，改善依从性，降低了副反应发生率，减少发生疑似预防接种异常反应(adverse events following immunization,AEFI)的风险，提高疫苗接种率。因此将上述两种疫苗制备成联合疫苗进行免疫，比两种疫苗进行分次免疫更具有优势。
经皮免疫(Transcutaneous immunization,TCI)是免疫源性抗原通过皮肤输入表皮免疫靶点诱导产生全身免疫反应的一种免疫方式，其可参与机体免疫应答的全过程。但皮肤的角质层是阻碍抗原输送至皮内产生免疫反应的最大屏障，而微针阵列技术的透皮给药方式可以克服角质层对药物的阻挡。同时，相比于皮下或肌肉注射的方式接种，微针给药使得患者顺应性良好，明显减少疼痛感。且可溶性微针刺入皮肤后可自行溶解，避免了固体实心微针针头断裂引起生物相容性的问题。利用可溶性微针递送疫苗，既可避免生物相容性问题，又增加了顺应性并达到相应的免疫效果。因此，可考虑将流脑-乙脑联合疫苗制备成可溶性微针。
研究表明，疫苗经皮免疫倾向于诱导辅助性Th2型体液免疫应答，而辅助性Th1型的细胞免疫应答对保护机体免受包括病毒和细菌在内的许多病原体的侵袭更为重要(Koutsonanos DG,Martin MDP,Zarnitsyn VG,etal.Transdermal InfluenzaImmunization with Vaccine-Coated Microneedle Arrays[J].PLOS ONE,2009,4.)。若免疫过程中Th1型反应弱，则诱导细胞免疫和细胞毒性T细胞应答弱，使得疫苗的免疫保护不全面、不持久。此外，由于可溶性微针的载药量远小于注射给药的剂量，可能导致所激活的免疫反应强度大大降低。
由于流脑疫苗病原体为细菌类，乙脑疫苗病原体为病毒类，因此将流脑疫和乙脑疫苗制成联苗可溶性微针时，如何提高Th1型反应，使得Th1/Th2免疫反应达到平衡是技术关键所在。
目前，检索关于平衡Th1/Th2免疫反应的相关文献，涉及如下：
Toll样受体(TLRs)参与调控Th1/Th2应答，TLRs的激活进而促使未成熟前体细胞即为Th0向Th1细胞或Th2细胞分化。而且，TLRs配体种类、TLRs配体的剂量均可能影响其诱导Th0分化的方向，可诱导Th2反应或诱导Th1反应(蔡怡华,郑捷.Toll样受体与Th1和Th2型免疫应答[J].国际免疫学杂志,2006,29(5).)。因此，本发明申请人考虑选择TLRs配体作为佐剂，以调控Th1/Th2应答。
TLR4配体包括糖脂类、多糖类。已有文献报道，糖脂类的LPS在使用时存在一定的安全隐患(Reed SG,Hsu FC,Carter D,etal.The science of vaccine adjuvants:advances in TLR4ligand adjuvants[J].Current Opinion in Immunology,2016,41:85-90.)。多糖类中LNFPIII-Dex能诱导Th2型免疫反应，但AC-1却能诱导Th1型免疫反应(ZhangX,Qi C,Guo Y,etal.Toll-like receptor 4-related immunostimulatorypolysaccharides:Primary structure,activity relationships,and possibleinteraction models[J].Carbohydrate Polymers,2016:S014486171630474X.)。由此可知，TLR4配体作为佐剂，其诱导Th0分化的方向，存在极大的不确定性。
综上所述，选择何种安全、有效的TLR4配体作为佐剂，既能够增强Th1免疫反应，以调节Th1/Th2免疫反应趋于平衡，又能够提高流脑-乙脑联合疫苗的免疫应答强度，是本领域技术人员在开发流脑-乙脑联合疫苗可溶性微针时急需解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供了一种流脑-乙脑联合疫苗可溶性微针，通过选择适合成分与含量的TLR4配体作为佐剂，以及载药量，实现可调节Th1/Th2免疫反应趋于平衡，解决了上述现有技术存在的不足之处。
为此，本发明采取了以下技术方案：
一种可平衡Th1/Th2反应的流脑-乙脑联合疫苗可溶性微针，包括针体和背衬，所述的针体由流脑-乙脑联合疫苗、基质材料和佐剂组成，其中，佐剂为铁皮石斛多糖，流脑-乙脑联合疫苗与铁皮石斛多糖的含量比为(1：1)～(1：3)；基质材料为聚乙烯基吡咯烷酮和硫酸软骨素的混合。
优选的，针体中，流脑-乙脑联合疫苗与佐剂的含量比为1：2。
优选的，基质材料中，聚乙烯基吡咯烷酮和硫酸软骨素的含量比为2：1。
优选的，针体中，流脑-乙脑联合疫苗与佐剂的质量占比总和不高于10％。
优选的，针体中，流脑-乙脑联合疫苗的质量占比为3.33％。
优选的，针体中各组分及其质量占比如下：流脑-乙脑联合疫苗的占比为3.33％，铁皮石斛多糖的占比为6.67％，聚乙烯基吡咯烷酮的占比为60％，硫酸软骨素的占比为30％。
综上，与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过选择特定的TLR4配体(铁皮石斛多糖)作为佐剂，选择特定的流脑-乙脑联合疫苗与佐剂的含量比，以及适当的载药量，使制得的流脑-乙脑联合疫苗可溶性微针既能够增强Th1免疫反应，使调节Th1/Th2免疫反应趋于平衡，又能够提高流脑-乙脑联合疫苗的免疫应答强度，实现了真正的安全、有效。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1流脑-乙脑联合疫苗可溶性微针制备
乙脑灭活疫苗、A+C群流脑多糖结合疫苗的联合疫苗可溶性微针贴的制备如下：
①阳模制备采用计算机辅助设计(CAD)设计阳模模具，制备针长600μm的10×10微针阵列阳模。以聚二甲基硅氧烷制备阴模。
②将基质材料聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和硫酸软骨素(CS)按2:1比例溶解，制成基质溶液，再与处方量的流脑-乙脑联合疫苗、佐剂铁皮石斛多糖(DvP-1)混匀，即为针体制作液，离心入模成微针针体。将羧甲基纤维素溶解，所得水溶液作为基底液，入模离心成微针背衬，干燥脱模，即得成品。
实施例2佐剂的种类对联合疫苗免疫性能的影响
设定针体中基质材料(PVP和CS按2：1混合，下同)、流脑-乙脑联合疫苗、佐剂的质量占比为一定值，仅改变佐剂的种类，探究不同佐剂对可溶性微针中流脑-乙脑联合疫苗的免疫性能影响。可溶性微针制备工艺如上述实施例1进行制备。
选用6周龄BALB/C小鼠，分成4组，每组6只小鼠，每只小鼠按处方剂量微针给药联合疫苗和佐剂或生理盐水(见表1)，施放于小鼠后背两侧，小鼠均给药前脱毛过夜。其中联合疫苗为A+C群流脑多糖结合疫苗，乙脑灭活疫苗，两者比例为2:1(以下实施例中疫苗比例均为2:1，并简称为联合疫苗)，佐剂的成分选择为：氢氧化铝、黄芪多糖、DvP-1。每次小鼠给药的联合疫苗剂量，参照人体与实验动物的给药剂量换算方法换算后给药，且联合疫苗与各种佐剂或生理盐水以1:1的比例配制。
对于A+C群流脑多糖结合疫苗，免疫原性以测定疫苗后的杀菌抗体为标准，免疫前抗体滴度<1：2为阴性，免疫后抗体滴度≥1：4或免疫后较免疫前抗体≥4倍增长者为阳转；并分别检测A群、C群流脑血清抗体滴度GMT。
对于乙脑灭活疫苗，采用蚀斑减少中和试验(PRNT)方法测定血清乙脑中和抗体。血清乙脑中和抗体效价≥1：10为阳性；免疫前抗体滴度≤1：5，免疫后≥1：10或免疫后抗体滴度比免疫前≥4倍增长为免疫成功。评价指标为平均GMT增长倍数、阳转率，以判断佐剂对疫苗的免疫原性影响。
采用间接ELISA法检测小鼠流脑、乙脑疫苗血清特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度。IgG2a被认为是Th1反应的替代生物标志物，而IgG1是Th2反应的生物标志物，通常用IgG2a/IgG1的比例来评价疫苗诱导的免疫应答是偏向Th1型免疫反应还是Th2型免疫反应。以IgG2a/IgG1为指标，评价各实验组Th1/Th2型免疫反应是否平衡。当IgG2a/IgG1比例接近1时表示得到了相对平衡的Th1和Th2型免疫应答，测试结果的均值见表2。
表1.试验分组表
实验组 成分
1 疫苗+生理盐水(1:1)
2 疫苗+氢氧化铝(1:1)
3 疫苗+黄芪多糖(1:1)
4 疫苗+DvP-1(1:1)
表2.不同佐剂对联合疫苗免疫效果影响
Figure BDA0002346354700000041
从表2中可知，
1)未添加佐剂的疫苗组以及添加各种佐剂的疫苗组，其阳转率没有显著差异，但是在GMT增长倍数上有明显差异。
2)从GMT增长倍数看，添加佐剂的实验组其相比于未加佐剂的实验组，GMT增长倍数显著增大，说明氢氧化铝、黄芪多糖、铁皮石斛多糖DvP-1都能够增加联合疫苗的GMT。但是，添加DvP-1实验组其GMT增长倍数明显高于比氢氧化铝、黄芪多糖，即铁皮石斛多糖DvP-1增强该联合疫苗免疫原性能力最佳。
3)从IgG2a/IgG1的比例看，未添加佐剂的实验组以及分别添加氢氧化铝、黄芪多糖佐剂的实验组，其IgG2a/IgG1比值在0.340～0.515之间，表明免疫反应偏向Th2型免疫反应，可知氢氧化铝、黄芪多糖佐剂能明显诱导Th2型反应，但都不能平衡Th1/Th2免疫反应。
添加DvP-1的实验组，其IgG2a/IgG1比值趋近于1，均大于0.790，表明免疫反应偏向Th1型免疫反应，可知DvP-1能有效诱导流脑-乙脑联合疫苗的Th1免疫反应，且能平衡Th1/Th2反应。
综上所述，选择铁皮石斛多糖(DvP-1)作为流脑-乙脑联合疫苗可溶性微针的佐剂。
实施例3佐剂的含量对联合疫苗免疫性能的影响
设定针体中基质材料(PVP+CS)的质量占比为一定值，设定佐剂为DvP-1，仅改变流脑-乙脑联合疫苗与佐剂的含量比，探究不同含量比对可溶性微针中流脑-乙脑联合疫苗的免疫性能影响。可溶性微针制备工艺如上述实施例1进行制备。
选用6周龄BALB/C小鼠，分成7组，每组6只小鼠，每只小鼠腹腔注射人用剂量的联合疫苗和佐剂，每次注射的联合疫苗含量为一定值，注射成分见表3。
以不添加佐剂组(生理盐水组)为空白对照，初次免疫2周后加强免疫1次，末次免疫后7天釆血。采用间接ELISA法检测小鼠血清特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度(GMT)，以平均GMT增长倍数、IgG2a/IgG1为指标，测试方法同实施例2，测试结果的均值见表4。
表3.注射分组表
实验组 成分
1 疫苗+生理盐水(1:1)
2 疫苗+DvP-1(2:1)
3 疫苗+DvP-1(1:1)
4 疫苗+DvP-1(1:2)
5 疫苗+DvP-1(1:3)
6 疫苗+DvP-1(1:4)
7 疫苗+DvP-1(1:5)
表4.不同比例的佐剂、联合疫苗对免疫效果影响
Figure BDA0002346354700000061
从表4中可知，
1)当疫苗：DvP-1为2:1时，其GMT增长倍数、IgG2a/IgG1比值与生理盐水组没有明显差异。说明该比例DvP-1不具有增强疫苗免疫原性和平衡Th1/Th2反应的能力。
2)随着DvP-1的占比增加，疫苗的GMT增长倍数呈现增长趋势。但当疫苗：DvP-1的含量比在(1:3)～(1:5)时，GMT增长倍数基本不变，说明疫苗：DvP-1为1:3时，其增强疫苗免疫原性的能力已是最大。
3)随着DvP-1的占比增加，疫苗IgG2a/IgG1比值呈现先增大、后减小的趋势，且IgG2a/IgG1比值减小为0.400附近，有诱导Th2反应的趋势，说明DvP-1在联合疫苗中的剂量决定了Th0分化方向。
4)仅当疫苗：DvP-1比值在(1:1)～(1:3)范围内，联合疫苗的IgG2a/IgG1比值均趋近于1，说明该范围的DvP-1剂量可有效诱导联合疫苗Th1型免疫反应，使得Th1/Th2反应平衡。其中，比例为1:2时，效果最佳。
综上所述，选择联合疫苗与DvP-1的含量比为(1:1)～(1:3)，最佳含量比为1:2。
实施例4疫苗载药量对微针机械性能影响
设定针体中基质材料PVP与CS的含量比为一定值(PVP:CS＝2:1)，设定流脑-乙脑联合疫苗与佐剂DvP-1的含量比为1:2，仅改变联合疫苗和佐剂在针体中的质量占比总和，按照表5制备可溶性微针，考察不同的载药量对微针性能影响。涉及的微针与阴模，其制备方法参照实施例1。
按如下方法检测微针的机械强度、皮肤穿刺性能。
(1)置于质构仪下进行压变性能测试，从压变曲线中计算出微针的断裂力，断裂力越大则机械强度越大；
(2)采用质构仪向人工皮肤施加微针，以判断各微针的刺入效果。将微针背衬粘在的圆柱形探头上，采用石蜡膜作为人工皮肤，将人工皮肤裁剪成2×2cm的正方形，平铺在厚度为5mm的聚苯乙烯泡沫板上，并使人工皮肤处于微针的正下方。设置刺入力为10N，刺入速度为0.5m/s，刺入后持续施压时间为30s。刺入完成后，取出人工皮肤，采用人工皮肤电阻法判定微针的刺入效果。
将微针刺入后的人工皮肤固定在电阻测定装置上，人工皮肤夹在两个半池中间，池内注满与生理盐水等渗的K2SO4溶液，在距离石蜡膜10mm处各有一根竖直的惰性石墨电极，并与LCR数字交流电桥连接。测量时，将LCR电桥设置为电阻档R，选择并联模式(PAR)，测试频率为100HZ。每张人工皮肤在使用微针前均先用上述测试方法测电阻，电阻大于20MΩ方能进行实验，以保证测试前人工皮肤的完整性。将上述制备的微针进行人工皮肤穿刺性能测试，结果见表5。
根据大量预实验结果，当穿刺前后人工皮肤的电阻变化率<5％时，符合要求。
表5.载药量对微针处方的性能影响(mean±SD,n＝5)
Figure BDA0002346354700000071
注：1*相当于空白微针组，表明未载药时的机械强度和穿刺人工皮肤的电阻；
由表5可知，
1)当微针中所含联合疫苗含量增多时，微针机械性能有下降趋势，单从机械性能无法判断联合疫苗与DvP-1的质量占比总和从0～30％之间微针刺入性能的差别。但，从穿刺人工皮肤电阻可以看出，随着联合疫苗载药量的增多(即：基质材料的质量占比下降)，微针刺入后的人工皮肤的电阻都高于空白微针组，且呈上升趋势。
2)相比空白微针组，当联合疫苗与DvP-1的质量占比总和≤10％(见实验组2、3)时，穿刺人工皮肤电阻的变化率小于5％，表明载入疫苗不会显著降低可溶性微针的穿刺性能，穿刺性能较好，符合要求；但当联合疫苗与DvP-1的质量占比总和>10％(见实验组4、5、6)时，穿刺人工皮肤电阻的变化率小于5％，表明载入过量的疫苗会影响穿刺性能，不符合要求。
3)综合考虑，选择联合疫苗和佐剂在针体中的质量占比总和为10％(即：基质材料的质量占比>90％)作为最优处方。
综上所述，本发明针体中各组分及其质量占比的最佳处方为：流脑-乙脑联合疫苗的占比为3.33％，铁皮石斛多糖的占比为6.67％，聚乙烯基吡咯烷酮的占比为60％，硫酸软骨素的占比为30％。
实施例5流脑-乙脑联合疫苗可溶性微针的安全性实验
根据实施例4中的最佳处方制备含佐剂的流脑-乙脑联合疫苗可溶性微针6片，选用6周龄BALB/C小鼠6只，小心把小鼠腹部一侧的毛除去。然后将可溶性微针贴片按压在小鼠的无毛区域，按压时间为3分钟，可溶性微针针体中的联合疫苗完全释放到小鼠皮肤中，完成经皮给药。分别在给药前，给药后的2、4、6、8小时观察小鼠微针贴片部位有无出现局部红肿、红斑、硬结；观察小鼠是否出现疼痛、局部发热、呕吐症状。
结果显示，小鼠在给药后，其给药部位均无出现红肿等现象，小鼠生理状况良好，未出现异常，表明本发明制得的流脑-乙脑联合疫苗可溶性微针安全性高。

Claims (6)

1.一种可平衡Th1/Th2反应的流脑-乙脑联合疫苗可溶性微针，包括针体和背衬，其特征在于，所述的针体由流脑-乙脑联合疫苗、基质材料和佐剂组成，其中，所述的佐剂为铁皮石斛多糖，流脑-乙脑联合疫苗与铁皮石斛多糖的含量比为(1：1)～(1：3)；所述的基质材料为聚乙烯基吡咯烷酮和硫酸软骨素的混合。
2.根据权利要求1所述的热稳定的乙脑疫苗可溶性微针递送系统，其特征在于，所述的针体中，流脑-乙脑联合疫苗与佐剂的含量比为1：2。
3.根据权利要求1所述的热稳定的乙脑疫苗可溶性微针递送系统，其特征在于，所述的基质材料中，聚乙烯基吡咯烷酮和硫酸软骨素的含量比为2：1。
4.根据权利要求1所述的热稳定的乙脑疫苗可溶性微针递送系统，其特征在于，所述的针体中，流脑-乙脑联合疫苗与佐剂的质量占比总和不高于10％。
5.根据权利要求4所述的热稳定的乙脑疫苗可溶性微针递送系统，其特征在于，所述的针体中，流脑-乙脑联合疫苗的质量占比为3.33％。
6.根据权利要求1～5任一所述的热稳定的乙脑疫苗可溶性微针递送系统，其特征在于，所述的针体中各组分及其质量占比如下：流脑-乙脑联合疫苗的占比为3.33％，铁皮石斛多糖的占比为6.67％，聚乙烯基吡咯烷酮的占比为60％，硫酸软骨素的占比为30％。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114306590A (zh) * 2021-12-31 2022-04-12 皖西学院 具有免疫增强作用的兽用疫苗稀释液及其制备方法与应用

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