CN113115767A - 一种鱼类卵子的体外保存液及其应用 - Google Patents

一种鱼类卵子的体外保存液及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鱼类卵子的体外保存液，按体积分数计其包含以下各组分：基础培养液53.63％‑82.87％、鱼血清1.37％‑2.13％和鱼卵巢液15.0％‑45.0％。本发明还公开了鱼类卵子的体外保存液的应用，将离体的成熟鱼类卵子浸泡于所述鱼类卵子的体外保存液中，浸泡的条件为：700‑1000μL/100‑200粒，24‑26℃下浸泡30min‑60min。大大减少了卵巢液的使用，能够有效维持卵胶膜结构和卵子活力，保证了卵子的受精能力，为鱼类卵子体外显微操作和遗传育种研究工作提供了有利条件。

Description

一种鱼类卵子的体外保存液及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种鱼类卵子的体外保存液及其应用。
背景技术
鱼类主要为体外受精、体外发育的繁育方式。大多数真骨鱼类的卵巢为封闭型卵巢，卵巢腹膜所形成的卵巢膜包围，成熟的卵子不落在腹腔而落于卵巢腔中，经输卵管输出体外。成熟排出的鱼类卵外面包有透明胶状保护膜，称为卵胶膜。卵胶膜对于卵和胚胎具重要保护作用：一方面能防御损伤、避免外环境对受精卵的侵害，使胚胎就能在相对稳定的环境中完成各阶段的发育，提高胚胎的成活率；另一方面卵胶膜内的胶质有调节钙离子浓度的作用，保护卵维持正常渗透压，使卵达到最佳受精状态。卵胶膜含有大量的糖蛋白，卵子产出遇水后，卵胶膜吸水膨胀，失去受精能力。卵子在卵巢液中较为稳定，但鱼类卵巢液少、获取量有限。在科学研究及生产实践中，对于精卵产出不同步，尤其是开展卵子体外操作时，维持卵胶膜结构和卵子活力、提高受精发育率是亟待解决的技术瓶颈问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种适用于维持鱼类离体卵子卵胶膜结构和卵子活力的鱼类卵子的体外保存液及其应用。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种鱼类卵子的体外保存液，按体积分数计其包含以下各组分：基础培养液53.63％-82.87％、鱼血清1.37％-2.13％和鱼卵巢液15.0％-45.0％。
上述的鱼类卵子的体外保存液，优选的，所述体外保存液按体积分数计其包含以下各组分：基础培养液68.25％、鱼血清1.75％和鱼卵巢液30.0％。
优选的，所述基础培养液包括以下各组分及其浓度：谷氨酸580-590mg/L、D-葡萄糖0.8-1.5g/L、CaCl2110-130mg/L、KCl 170-190mg/L、NaCl 6.0-7.0g/L、Na2HPO4135-145mg/L、HEPES 0.9-1.0g/L、NaHCO32.3-2.5g/L、MgCl·6H2O 165-175mg/L和MgSO4·7H2O65-75mg/L。
本发明是结合鱼类卵子发育特点和卵巢液组成成分分析，制备了一种适用于维持鱼类离体卵子卵胶膜结构和卵子活力的卵巢液稀释剂。稀释剂基础液中Glu(谷氨酸)和D-葡萄糖作为基本营养成分，并和钙盐、钾盐、钠盐、镁盐等无机盐成分维持与卵子内部适宜的渗透势，维持卵胶膜结构鱼血清含有丰富的适合鱼类细胞的营养成分，能够为体外暂存的鱼类细胞提供起稳定和解毒作用的因子，对离体卵起到保护作用。
优选的，所述鱼类卵子的体外保存液的pH值为8.0-8.5，采用的pH调节剂为NaHCO3溶液。
优选的，所述鱼血清由以下方法得到：将鱼的血液平铺于培养皿中并转入0-4℃冰浴环境下静置3-4h；然后吸取析出的血清，0-4℃、3500-4000rpm离心8-15min，在无菌超净工作台中用过滤网过滤后收集血清，并于-20℃分装保存。
优选的，所述鱼卵巢液由以下方法得到：将鱼卵在常温下6000-8000rpm离心10-15min，收集上清液，-80℃分装保存。
基于一个总的发明构思，本发明还相应提供一种所述的鱼类卵子的体外保存液的应用，将离体的成熟鱼类卵子浸泡于所述鱼类卵子的体外保存液中，浸泡的条件为：700-1000μL/100-200粒，24-26℃下浸泡30min-60min。在此条件下浸泡离体的成熟鱼类卵子，卵胶膜不会出现吸水现象和结构变化，且胚胎存活率保持在85％以上。
上述的应用，优选的，所述的鱼类为团头鲂、鲫、鲤或斑马鱼。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的鱼类卵子的体外保存液及其应用，大大减少了卵巢液的使用，能够有效维持卵胶膜结构和卵子活力，保证了卵子的受精能力，为鱼类卵子体外显微操作和遗传育种研究工作提供了有利条件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为斑马鱼卵子在不同保存液中体外保存30min后的斑马鱼卵子形态(其中：A、基础培养液；B、基础培养液+1.75％鲤鱼血清；C、基础培养液+1.75％鲤鱼血清+30％鱼卵巢液)；
图2为斑马鱼卵子在不同保存液中体外保存30min后的体外受精后的胚胎发育情况(其中：A、基础培养液；B、基础培养液+1.75％鲤鱼血清；C、基础培养液+1.75％鲤鱼血清+30％鱼卵巢液)；
图3为斑马鱼卵子在实施例1的体外保存液中保存30min后的斑马鱼成熟卵胶膜形态结构(标尺为1μm)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种本发明的鱼类卵子的体外保存液，其配方包括以下各组分及其体积分数：基础培养液68.25％，鱼血清1.75％，鱼卵巢液30％，pH为8.11。
其中，基础培养液配方：CaCl2120mg/L，KCl 180mg/L，NaCl 6500mg/L，Na2HPO4142mg/L，HEPES 950mg/L，NaHCO32400mg/L，MgCl2·6H2O 170mg/L，MgSO4·7H2O70mg/L，L-Glu(谷氨酸)584mg/L，D-葡萄糖1000mg/L。
鱼血清由以下方法得到：用注射器从鱼的尾静脉采血，将血液平铺于培养皿中并转入4℃静置4h；吸取析出的血清，4℃、4000rpm离心10min，在无菌超净工作台中用过滤网过滤后收集血清，并于-20℃分装保存。
鱼卵巢液由以下方法得到：催产后通过人工挤卵收集产出的鱼卵，常温下8000rpm离心10min，收集上清液，-80℃分装保存。
实施例2：团头鲂卵子体外保存
实施例1的鱼类卵子的体外保存液的应用，包括如下步骤：将实施例1的基础培养液6.825mL和鱼血清0.175mL混匀后，用NaHCO3溶液将其pH调至8.11，加入3mL的卵巢液(现用现配)；将收集的排出体外的团头鲂成熟卵子浸泡在含有卵子体外保存液的玻璃皿中(1mL/100粒)，24-26℃下卵子体外保存，30min后吸去保存液后可正常进行人工授精操作，胚胎存活率89％。
实施例3：红鲫卵子体外保存
实施例1的鱼类卵子的体外保存液的应用，包括如下步骤：将实施例1的基础培养液6.825mL和鱼血清0.175mL混匀后，用NaHCO3溶液将其pH调至8.11，加入3mL的卵巢液(现用现配)；将收集的排出体外的团头鲂成熟卵子浸泡在含有卵子体外保存液的玻璃皿中(0.7mL/100粒)，24-26℃下卵子体外保存，30min后吸去保存液后可正常进行人工授精操作，胚胎存活率92％。
实施例4：斑马鱼卵子体外保存
实施例1的鱼类卵子的体外保存液的应用，包括如下步骤：将实施例1的基础培养液6.825mL和鱼血清0.175mL混匀后，用NaHCO3溶液将其pH调至8.11，加入3.00mL的卵巢液(现用现配)；将收集的排出体外的斑马鱼成熟卵子浸泡在含有卵子体外保存液的玻璃皿中(1mL/100粒)，24-26℃下卵子体外保存，30min后吸去保存液后可正常进行人工授精，胚胎存活率90％。
斑马鱼卵子在不同保存液中的保存30min后的效果见图1、图2、图3和表1。
表1：不同体外保存液对成熟卵的影响
Figure BDA0003033818950000041
由图1-3及表1可知，本发明的鱼类卵子的体外保存液，在24-26℃下斑马鱼卵子体外保存30min后，卵胶膜不会出现吸水现象和结构变化，且胚胎存活率高达90％。不仅大大减少了卵巢液的使用，而且能够有效维持卵胶膜结构和卵子活力，保证了卵子的受精能力，为鱼类卵子体外显微操作和遗传育种研究工作提供了有利条件。

Claims (8)

1.一种鱼类卵子的体外保存液，其特征在于，按体积分数计其包含以下各组分：基础培养液53.63％-82.87％、鱼血清1.37％-2.13％和鱼卵巢液15.0％-45.0％。
2.根据权利要求1所述的鱼类卵子的体外保存液，其特征在于，所述体外保存液按体积分数计其包含以下各组分：基础培养液68.25％、鱼血清1.75％和鱼卵巢液30.0％。
3.根据权利要求1所述的鱼类卵子的体外保存液，其特征在于，所述基础培养液包括以下各组分及其浓度：谷氨酸580-590mg/L、D-葡萄糖0.8-1.5g/L、CaCl2 110-130mg/L、KCl170-190mg/L、NaCl 6.0-7.0g/L、Na2HPO4 135-145mg/L、HEPES 0.9-1.0g/L、NaHCO3 2.3-2.5g/L、MgCl·6H2O 165-175mg/L和MgSO4·7H2O 65-75mg/L。
4.根据权利要求1所述的鱼类卵子的体外保存液，其特征在于，所述鱼类卵子的体外保存液的pH值为8.0-8.5，采用的pH调节剂为NaHCO3溶液。
5.根据权利要求1所述的鱼类卵子的体外保存液，其特征在于，所述鱼血清由以下方法得到：将鱼的血液平铺于培养皿中并转入0-4℃的冰浴环境下静置3-4h；然后吸取析出的血清，0-4℃、3500-4000rpm离心8-15min，在无菌超净工作台中用过滤网过滤后收集血清，并于-20℃分装保存。
6.根据权利要求1所述的鱼类卵子的体外保存液，其特征在于，所述鱼卵巢液由以下方法得到：将鱼卵在常温下6000-8000rpm离心10-15min，收集上清液，-80℃分装保存。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述的鱼类卵子的体外保存液的应用，其特征在于，将离体的成熟鱼类卵子浸泡于所述鱼类卵子的体外保存液中，浸泡的条件为：700-1000μL/100-200粒，24-26℃下浸泡30min-60min。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的鱼类为团头鲂、鲫、鲤或斑马鱼。
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