CN113105486B

CN113105486B - 一种硼酸酯类化合物及其药学上可接受的盐、其制备方法及其用途

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Publication number: CN113105486B
Application number: CN202110208360.0A
Authority: CN
Inventors: 朱永强; 雷萌; 张文
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2021-02-24
Filing date: 2021-02-24
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2041-02-24
Also published as: CN113105486A

Abstract

如式(1)所示硼酸酯类化合物及其药学上可接受的盐、其制备方法及其用途，

Description

一种硼酸酯类化合物及其药学上可接受的盐、其制备方法及其用途

技术领域

本发明属于药物合成领域，具体涉及一种硼酸酯类化合物及其药学上可接受的盐、其制备方法及其用途。

背景技术

目前，恶性肿瘤仍然是威胁人们生命的主要疾病之一。癌症的治疗目前虽然已经取得了很大的进步，但还未能从根本上治疗癌症。目前上市的抗癌药物虽然具有一定的疗效，但它们大多是细胞毒药物，具有严重的毒副作用。因此，如何从有效的肿瘤靶点出发来研究靶向性的新型抗癌药物成为医药工作者的当务之急。

泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-Proteasome Pathway，简称UPP)能够调控参与细胞周期控制的蛋白质的水平，这一途径与癌症、心脑血管疾病及神经系统退行性疾病的发病等都有重要的关系。使用一些有效的抑制剂来抑制这一途径过度降解重要的蛋白质将会为上述疾病的治疗提供新的思路。

发明内容

为了克服现有技术中还缺少有效的肿瘤靶向性的新型抗癌药物，从而提供一种结构新颖的且具有抑制蛋白酶体功能的硼酸酯类化合物。它们作为20S蛋白酶体抑制剂，能阻断肿瘤细胞增殖，诱发肿瘤细胞凋亡，从而可用于人和动物的多种疾病如恶性肿瘤的治疗和预防。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案一种硼酸酯类化合物及其药学上可接受盐，其中：所述硼酸酯类化合物结构如式I所示：

其中：R₁选自氢、C_1～10烷基、C_1～10烷氧基、芳基或杂芳基中的一种，所述C_1～10烷基、C_1～10烷氧基、芳基或杂芳基可以被一个或多个C_1～4烷基、C_1～4烷氧基、卤素或卤代C_1～4烷基取代；R₂选自氢、氘、C_1～4烷基或C_3～7环烷基中的一种，所述C_1～4烷基可以被一个或多个C_1～4烷氧基、C_1～4烷硫基、氰基、硝基、羟基、巯基、氨基、卤素、C_3～7环烷基取代；A环选自以下结构中的一种：

优选的，R₁选自苯基、卤代苯基、卤代C_1～4烷基苯基、C_1～4烷氧基苯基、异噁唑基、C_1～4烷基异噁唑基、吡嗪基中的一种。

优选的，R₁选自二氯苯基、二氟苯基、甲基异恶唑基、吡嗪基、二溴苯基、双三氟甲基苯基、二甲氧苯基中的一种。

优选的，R₁选自2,5-二氯苯基、2,5-二氟苯基、5-甲基异恶唑基、吡嗪基、2,5-二溴苯基、2,5-双三氟甲基苯基、2,5-二甲氧苯基中的一种。

优选的，R₂选自氢、C_1～4烷基、甲硫基甲基、环丙基、环丙基甲基、环戊基中的一种。

优选的，所述化合物包括

作为本发明的另一方面，本发明提供一种硼酸酯类化合物及其药学上可接受的盐的制备方法，其包括：经如下所示路线进行合成，

术语“烷基”用于表示饱和烃基，C_1～10的烷基是指含有1～10个碳原子的饱和烃基，C_1～4的烷基是指含有1～4个碳原子的饱和烃基。

术语“环烷基”指非芳族碳环基，包括环化的烷基。环烷基可以包括二环或多环系统。环烷基的例子包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基。C_3～7的环烷基是指含有3～7个碳原子的环烷基。

术语“烷氧基”是指-O-烷基基团，其碳原子数一般为1～10个。烷氧基的例子包括甲氧基，乙氧基，丙氧基(如，n-丙氧基和异丙氧基)，t-丁氧基等。

术语“烷硫基”是指-S-烷基基团，其碳原子数一般为1～10个。烷硫基的例子包括甲硫基，乙硫基，丙硫基(如，n-丙硫基和异丙硫基)，t-丁硫基等。

术语“芳基”是指芳族碳环基，包括单环或多环芳烃例如苯基，萘基，蒽基，菲基等。

术语“杂芳基”是指5至12个成员的芳族杂环，包括单环和双环系统，其中至少一个碳原子(一个或两个环的)被独立地选自氮、氧和硫的杂原子取代，或者一个或两个环的至少两个碳原子被独立地选自氮、氧和硫的杂原子取代。(5-至12-元)杂芳基可以是吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、吡咯基、吲哚基、恶唑基、苯并恶唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异恶唑基、恶二唑啉基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、嘧啶基、吡嗪基、噻二唑基、三嗪基、噻吩基、喹啉基、喹唑啉基等。

术语“卤素”包括氟，氯，溴和碘。

术语“氰基”是指-CN。

术语“硝基”是指-NO₂。

术语“羟基”是指-OH。

术语“巯基”是指-SH。

术语“氨基”是指-NH₂。

作为本发明的另一方面，本发明提供一种硼酸酯类化合物及其药学上可接受盐的应用，其为在制备抑制蛋白酶体药物上的应用。

优选的，所述药物包括药物可接受载体。

优选的，在制备治疗炎症、免疫相关性疾病、癌症或者过度增殖性疾病、改变生物体中蛋白酶体产生的抗原肽的药物方面的应用。

本发明所用术语“药物可接受”是指那些配体、原料、组合物和/或剂型在合理的医疗判断范围内，适合与人体组织和动物组织接触，而不会有过度的毒性、刺激性、变态反应或者其它问题或并发症，同时具有合理的利益/风险比。

本文所用术语“药物可接受载体”是指药物可接受原料、成分或溶媒，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料。所有载体都必须是“可接受的”，即与制剂的其它制剂成分是相容的，并且对患者没有害处。化合物在某些实施方案中，本发明药物组合物是非致热的，即在给予患者后不会引起明显的体温升高。

术语“药物可接受盐”是指抑制剂的相对无毒的无机酸加成盐和有机酸加成盐。这些盐可以在抑制剂的最终分离和纯化时在原位制备，或者使游离碱形式的纯化抑制剂单独与合适的有机酸或无机酸反应，然后分离由此形成的盐。在其它情况下，用于本发明方法的抑制剂可包含一个或多个酸性官能团，能够与药物可接受碱形成药物可接受盐。在这些情况下，术语“药物可接受盐”是指抑制剂的相对无毒的无机碱加成盐和有机碱加成盐。这些盐同样可以在抑制剂的最终分离和纯化时在原位制备，或者使游离酸形式的纯化抑制剂单独与合适的碱(例如药物可接受金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)、氨或者药物可接受有机伯胺、仲胺或叔胺反应。

酶抑制剂的用途

据报道，在细胞水平上有多种蛋白酶体抑制的生物效应，用各种蛋白酶体抑制剂处理细胞后，出现多泛蛋白化蛋白的累积、细胞形态变化和细胞凋亡，抑制蛋白酶体也被建议作为一种可能的抗肿瘤治疗策略。在抗肿瘤化合物筛选中首先鉴定出epoxomicin，证实了蛋白酶体是抗肿瘤化疗药物靶。因此，这些化合物可用于治疗癌症。还把抑制蛋白酶体与抑制NF-κB激活和稳定p53水平联系起来。因此，本发明化合物还可用于抑制NF-κB激活以及稳定细胞培养物中的p53水平。由于NF-κB是炎症的关键调节因子，所以它是抗炎治疗干预的富有吸引力的靶点。因此，本发明化合物可用于治疗慢性炎症相关性疾病，包括但不限于COPD、银屑病、支气管炎、肺气肿和囊性纤维化。

本发明公开化合物可用于治疗蛋白酶体的蛋白水解功能直接介导的病症(例如肌肉废用)或者通过蛋白酶体加工的蛋白质(例如NF-κB)间接介导的病症。蛋白酶体参与蛋白质(例如酶)的快速消除和翻译后加工，所述蛋白质涉及细胞调节(例如细胞周期、基因转录和代谢途径)、胞间通讯和免疫反应(例如抗原呈递)。下文阐述的具体例子包括；β-淀粉状蛋白和调节蛋白，例如细胞周期蛋白、TGF-β和转录因子NF-κB。

本发明的其它实施方案涉及恶病质和肌肉萎缩病。蛋白酶体降解成熟网织红细胞和生长中成纤维细胞内的许多蛋白。在缺乏胰岛素或血清的细胞中，蛋白水解速率几乎加倍。抑制蛋白酶体可减少蛋白水解作用，由此减少肌肉蛋白损失以及肾或肝的氮负荷。本发明抑制剂可用于治疗癌症、慢性传染病、发热、肌肉废用(萎缩)和去神经、神经损伤、禁食、酸中毒相关性肾衰竭、糖尿病和肝衰竭等疾病。因此，本发明的实施方案包括以下方法：降低细胞的肌肉蛋白降解速率；降低胞内蛋白降解速速率；降低细胞的p53蛋白降解速速率；以及抑制p53相关性癌生长。

蛋白酶体加工的另一种蛋白是Rel蛋白家族的成员NF-κB。Rel家族的转录激活蛋白可以分为两组。第一组需要蛋白酶解加工，包括p50(NF-κB1，105kDa)和p52(NF-κ2、100kDa)。第二组不需要蛋白酶解加工，包括p65(RelA、Rel(c-Rel)和RelB)。同二聚体和杂二聚体均可由Rel家族成员形成；例如，NF-κB是p50-p65杂二聚体。IκB和p105在磷酸化和泛蛋白化后，这两种蛋白分别被降解和加工，从而产生活性NF-κB，NF-κB从细胞质转运到细胞核。泛蛋白化p105也由纯化的蛋白酶体加工(Palombella等，Cell(1994)78：773-785)。活性NF-κB与其它转录激活因子以及例如HMGI(Y)形成立体特异性增强子复合物，诱导选择性表达特定基因。

NF-κB调节涉及免疫、炎症反应和有丝分裂事件的基因。例如，免疫球蛋白轻链κ基因、IL-2受体α链基因、I类主要组织相容性复合体基因以及编码例如IL-2、IL-6、粒细胞集落刺激因子和IFN-β的许多细胞因子基因的表达都需要NF-κB(Palombella等，Cell(1994)78：773-785)。本发明部分实施方案包括影响IL-2、MHC-I、IL-6、TNFα、IFN-β或任何其它前述蛋白的表达水平的方法，每种方法都包括给予患者有效量的本公开化合物。包括p50的复合体是急性炎症反应和免疫反应的快速介质(Thanos，D.和Maniatis，T.，Cell(1995)80：529-532)。

NF-κB还参与编码E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM和VCAM-1的细胞粘附基因的表达(Collins，T.，Lab.Invest.(1993)68：499-508)。本发明一个实施方案是抑制细胞粘附(例如E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM或VCAM-1介导的细胞粘附)的方法。

胞内蛋白水解产生用于呈递给T淋巴细胞的小肽，从而诱导I类MHC介导的免疫应答。免疫系统筛选被病毒感染或已经历癌转化的自体细胞。一个实施方案是抑制细胞的抗原呈递的方法，该方法包括使细胞与本发明化合物接触。本发明化合物可以用于治疗免疫相关性疾病，例如变态反应、哮喘、器官/组织排斥反应(移植物抗宿主病)和自身免疫疾病，包括但不限于狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化和炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和节段性回肠炎)。再一个实施方案是改变由蛋白酶体或其它具有多催化活性的Ntn产生的抗原肽库的方法。例如，如果20S蛋白酶体的PGPH活性被选择性抑制，由该蛋白酶体产生并用MHC分子呈递到细胞表面的抗原肽组，不相同于没有任何酶抑制作用或者例如该蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性被选择性抑制这两种情况任一种所产生和呈递的抗原肽组。

某些蛋白酶体抑制剂在体外和体内阻断泛蛋白化NF-κB的降解和加工。蛋白酶体抑制剂还阻断IκB-α降解和NF-κB激活(Palombella等，Cell(1994)78：773-785；Traenckner)等，(EMBO J.(1994)13：5433-5441)。本发明一个实施方案是抑制IκB-α降解的方法。另一实施方案是降低NF-κB在细胞、肌肉、器官或患者中的细胞含量的方法，该方法包需要蛋白酶解加工的其它真核转录因子包括通用转录因子TFIIA、单纯疱疹病毒VP16辅助蛋白(宿主细胞因子)、病毒诱导性IFN调节因子2蛋白以及结合膜的固醇调节元件结合蛋白1。

细胞周期蛋白涉及细胞周期调控。蛋白酶体参与细胞周期蛋白的降解。细胞周期蛋白的实例包括有丝分裂细胞周期蛋白、G1细胞周期蛋白和细胞周期蛋白B。细胞周期蛋白的降解使得细胞退出一个细胞周期阶段(例如有丝分裂)，而进入另一个阶段(例如分裂)。人们认为所有的细胞周期蛋白都与p34.sup.cdc2蛋白激酶或相关激酶缔合。蛋白水解靶向信号定位于氨基酸42-RAALGNISEN-50(降解框)。有证据表明，细胞周期蛋白被转化为易被泛蛋白连接酶破坏的形式，或者细胞周期蛋白特异性连接酶在有丝分裂期间被激活(Ciechanover，A.，Cell，(1994)79：13-21)。抑制蛋白酶体可抑制细胞周期蛋白降解，从而抑制例如细胞周期蛋白相关性癌症中的细胞增殖(Kumatori等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：7071-7075)。本发明一个实施方案是治疗患者增殖性疾病(例如癌症、银屑病或再狭窄)的方法，

另外一些实施方案是影响癌基因蛋白的蛋白酶体依赖性调节的方法以及治疗或抑制癌生长的方法，每种方法都包括。HPV-16和HPV-18衍生的E6蛋白在粗制网织红细胞裂解物中刺激p53的ATP-和泛蛋白-依赖性缀合和降解。已经证实，具有突变不耐热E1的细胞系中隐性癌基因p53在非许可温度下累积。高水平的p53可能导致细胞凋亡。由泛蛋白系统降解的原癌基因蛋白实例包括c-Mos、c-Fos和c-Jun。一个实施方案是治疗p53相关性细胞凋亡的方法，该方法

最后，本发明化合物还可作为诊断试剂(例如用于诊断试剂盒或临床实验室)，用于筛选Ntn水解酶(包括蛋白酶体)加工的蛋白(例如酶、转录因子)。本发明化合物还可作为研究用试剂用于特异性结合X/MB1亚基或α链以及抑制与其相关的蛋白水解活性。例如，可以测定蛋白酶体其它亚基的活性(及其特异性抑制剂)。

大多数细胞蛋白在成熟或激活期间都要进行蛋白酶解加工。本文公开的酶抑制剂可用于测定细胞、发育或生理过程或输出量是否受到特定Ntn水解酶的蛋白水解活性的调节。一种这样的方法包括获取生物体、完整细胞制备物或细胞提取物；使所述生物体、细胞制备物或细胞提取物接触本发明化合物；使接触了本发明化合物的生物体、细胞制备物或细胞提取物发信号，然后监测所述过程或输出量。本发明化合物的高度选择性允许在特定的细胞、发育或生理过程中快速、准确地消除或影响Ntn(例如20S蛋白酶体)。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的硼酸酯类化合物结构新颖且具有抑制蛋白酶体功能。本发明的硼酸酯类化合物在溶液中的稳定性远远高于Ixazomib。特别是在pH1.2和pH6.8时，本发明的化合物稳定性更有优势。此外，微粒体稳定性结果表明，本发明的化合物在5种不同肝微粒体具有较好的稳定性，而Ixazomib在食蟹猴中的微粒体半衰期太长，药物基本不代谢，会引起严重的毒性。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例1：本发明的化合物的制备可按照如下过程实施：

化合物(II)的制备

1、化合物(II-3)的制备：

将化合物(II-1)，HOBt溶解在无水DCM(二氯甲烷)中在-5℃搅拌10min后，在此温度下加入EDCI·HCl，搅拌15～20min，再加入化合物(II-2)搅拌15～20min，随后加入DIPEA搅拌20分钟，移至室温反应。反应完全后，倾入水中，分别用稀HCl，NaHCO₃溶液洗涤，合并有机相后用饱和食盐水洗涤，用DCM萃取，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，得到化合物(II-3)。

2、化合物(II-4)的制备：

将化合物(II-3)溶解在无水DCM中，在-5℃下缓慢滴加TFA，搅拌0.5小时候后，升到室温搅拌3小时后检测。反应完毕，浓缩反应液得到黄褐色油状物，-5℃下缓慢滴加氨水剧烈搅拌至pH为9，用DCM萃取三次，合并有机相并浓缩，得到化合物(II-4)。

3、化合物(II-6)的制备：

将R₁基团取代的羧酸,即化合物(II-5)，HOBt溶解在无水DCM中在-5℃搅拌10min后，在此温度下加入EDCI·HCl，搅拌15～20min，再加入化合物(II-4)搅拌15～20min，随后加入DIPEA搅拌20分钟，移至室温反应。反应完全后，倾入水中，分别用稀HCl，NaHCO₃溶液洗涤，合并有机相后饱和食盐水洗涤，用DCM萃取，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，得到化合物(II-6)。

4、化合物(II)的制备：

将化合物(II-6)溶于MeOH中搅拌溶解后，依次加入异丁基硼酸、正己烷和1N HCl，室温反应3-6h。反应完全后减压蒸至只剩H₂O，用正己烷萃取三次，再用乙酸乙酯萃取至水相无产物。合并有机相，无水硫酸钠干燥，蒸干得化合物(II)。

上述制备工艺的简要原理如下：式(II-1)，(II-2)在缩合剂作用下反应得到式(II-3)，式(II-3)在三氟乙酸作用下生成(II-4)。式(II-4)再和R1基团取代的羧酸在肽缩合剂的作用下反应生成式(II-6)，式(II-6)在异丁基硼酸作用下反应生成(II)。最后式(II)和式A环50℃回流生成(I)。

R₁，R₂，A环的定义如前所述。以下详述本发明化合物的制备方法：

化合物(II)的制备方法包括如下的步骤：

1)式(II-1)结构的Boc氨基酸和式(II-2)结构的硼替佐米中间体三氟乙酸盐在缩合剂作用下得到式(II-3)结构的化合物；

2)式(II-3)结构的化合物溶于DCM后，加入三氟乙酸，反应后用氨水调节pH至9生成式(II-4)结构的化合物。

3)式(II-4)结构的化合物和式(II-5)带R₁基团的羧酸在缩合剂作用下缩合生成式(II--6)结构的化合物。

4)式(II-6)结构的化合物在异丁基硼酸作用下发生酯交换反应得到(II)结构的化合物。

最后将化合物(II)和A环在无水EA中50℃回流反应生成(I)。所用缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(缩写为EDCI.HCl)，1-羟基苯并三氮唑(缩写为HOBt)。

化合物(I)的制备

1、化合物(I)的制备：

将化合物(II)和A环溶于无水乙酸乙酯中，50℃回流，待反应完，浓缩经高压制备得到化合物(I)。

以下以具体化合物的合成来描述本发明的化合物制备过程：

酸片段的制备：

以(R)-(1-(2-(2-，2,5-二氯苯甲酰胺基)乙酰氨基)-3-甲基丁基)硼酸8的制备为例：

将化合物1(1g,5.71mmol),HOBt(1.16g,8.56mmol)溶解在无水DCM(50mL)中，在-5℃搅拌10min后，在此温度下加入EDCI·HCl(1.64g,8.56mmol)搅拌15～20min，再加入化合物2(2.17g，5.71mmol)搅拌15～20min，随后加入DIPEA(2.98mL,17.12mmol)搅拌20分钟，移至室温反应。反应完全后，倾入冰水中，分别用0.4N HCl，5％NaHCO₃碳酸氢钠，合并有机相后饱和食盐水洗涤，用DCM萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，得到化合物3。

将化合物3(2g,4.74mmol)，溶解在无水DCM(30mL)中，在-5℃下于缓慢滴加TFA(10mL)，搅拌0.5小时后，升到室温搅拌3小时。反应完毕，浓缩反应液得到黄褐色油状物，即为化合物4。

将上述化合物4(2.3g,4.74mmol)，溶解在无水DCM(20mL)中，在-5℃下于缓慢滴加氨水直至pH为9，用DCM萃取三次，合并有机相，蒸干溶剂，得到化合物5。

将化合物5(1g,3.10mmol),HOBt(0.63g,4.65mmol)溶解在无水DCM(15mL)中在-5℃搅拌10min后，在此温度下加入EDCI·HCl(0.89g,4.65mmol)搅拌15～20min，再加入化合物6(0.59g,3.10mmol)搅拌15～20min，随后加入DIPEA(1.62,9.3mmol)搅拌20分钟，移至室温反应。反应完全后，倾入冰水中，分别用0.4N HCl，5％NaHCO₃碳酸氢钠，合并有机相后饱和食盐水洗涤，用DCM萃取，合并有机相后无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，得到化合物7。

将化合物7(1g,2.02mmol)溶于MeOH/正己烷(10mL/4mL)中，随后加入异丁基硼酸(1.03g,10.1mmol)搅拌10分钟，再加入1N HCl(5.05ml,5.05mmol)。反应完全后，用正己烷萃取多遍，合并水相，用乙酸乙酯萃取多遍，合并有机相后，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，得到化合物8，收率90％；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.61(q,J＝1.5Hz,1H),7.49(q,J＝1.5Hz,2H),4.25(s,2H),3.35(t,J＝1.5Hz,1H),1.69(dt,J＝13.4,6.7Hz,1H),1.47–1.25(m,2H),0.94(d,J＝6.6Hz,6H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ174.41,167.43,136.53,132.59,131.21(d,J＝22.0Hz),129.35,128.76,39.50,38.68,25.64,22.37,21.00.HRMScalcd for C14H19BCl2N2O4:[M+Na]383.0709,found 383.0724.

本发明中所有硼酸片段化合物的合成方法与化合物8相似。合成的具体化合物及其化合物信息如下表1。

表1

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环A的制备：

以化合物5,6-二羟基-7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸23为例：

将化合物20(2.12ml,29.38mmol)和化合物21(7.82ml,58.76mmol)混合于耐压管中，室温搅拌。待反应完，蒸干得到化合物22。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.63(s,1H),4.51(dd,J＝5.3,3.0Hz,2H),3.74(m,2H),3.21(d,1H),2.51(d,J＝1.5Hz,1H),1.93(d,J＝1.5Hz,1H),1.67(d,J＝1.5Hz,1H).

将化合物22(1g,7.14mmol)、二水合氧化三甲胺(NMO)(0.87g,7.86mmol)溶于t-BuOH/H₂O/Pyr(20ml:2ml:2ml)的混合溶液中，加入催化量四氧化锇(OsO₄)。待反应完，加亚硫酸氢钠淬灭2h。蒸干溶液，用甲醇溶解，硅藻土抽滤，合并滤液，蒸干得化合物23。收率50％；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.16(dd,J＝5.8,1.4Hz,1H),3.73(t,J＝6.6Hz,1H),3.66(t,J＝7.7Hz,1H),2.81(dt,J＝11.2,5.4Hz,1H),2.57(t,J＝6.3Hz,1H),1.81–1.63(m,1H),1.60–1.45(m,1H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ174.81–171.35(m),84.77–80.63(m),73.98,71.01,44.14,28.18.

本发明中所有环A化合物的合成方法和化合物23相似。合成的具体化合物及其表征数据如下表2：

表2

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式(I)化合物的制备

以化合物2-((R)-1-(2-(2,5-二氯苯甲酰胺基)乙酰胺基)-3-甲基丁基)六氢-4,7-环氧苯并[d][1,3,2]二氧杂硼环-5-羧酸32的制备为例：

将化合物8(100mg,0.28mmol)和化合物23(49mg,0.28mmol)溶于无水EA(10ml)中，50℃回流。待反应完，蒸干溶剂，经高压制备得到化合物32，其收率64％，¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.68(t,J＝1.5Hz,1H),7.55(d,J＝1.5Hz,2H),4.23(dd,J＝11.5,5.8Hz,1H),4.16(dd,J＝9.2,5.7Hz,1H),4.10(s,2H),4.07(d,J＝5.6Hz,1H),3.99(d,J＝5.6Hz,1H),2.78(dq,J＝11.2,5.9,5.5Hz,1H),2.44(t,J＝7.7Hz,1H),1.80–1.60(m,2H),1.57–1.44(m,1H),1.41–1.11(m,2H),0.95–0.70(m,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ173.85,166.00,137.49,132.02,131.47,129.47,81.53,81.25,80.83,80.62,78.78,43.78,27.54,25.38,23.54,22.91.HRMS calcd for C₂₁H₂₅BCl₂N₂O_7:[M+Na]521.1028,found 521.1034.

本发明中所有化合物的具体合成方法和化合物32相似：

合成的具体化合物及结构表征数据如下表3：

表3

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实施例2：抑制蛋白酶体活性测定

一、蛋白酶体抑制活性

本发明利用荧光多肽底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC(简写Suc-LLVY-AMC，Suc表示琥珀酰基，AMC表示7-酰胺-4-甲基香豆素)来测定蛋白酶体的糜蛋白酶样酶活性。

本发明所用的蛋白酶体为人红细胞20S蛋白酶体，酶、荧光底物及测试缓冲液均购自Enzo公司。实验体系为16μL，其中底物8μL，蛋白酶体4μL(0.8ng)，最终浓度为50μM，药物(抑制剂)4μL，最终浓度为2×10^-6M～4.88×10^-10M,最后一个浓度是0M，实际配置浓度为8×10^-6M～1.95×10^-9M，最后一个浓度是0M。具体实验过程如下：

1、药物配置：称取药物，加入DMSO溶解至浓度为10^-2M。用移液枪吸取2μL加至98μLDMSO得到2×10^-4M，然后再从2×10^-4M浓度药物中吸取8μL加入198μL H₂O中得到8×10^-6M，利用同样的方法得到2×10^-6M、5×10^-7M、1.25×10^-7M、3.12×10^-8M、7.8×10^-9M、1.95×10^- ⁹M浓度的药物，最后一个浓度0M为不加药。

2、底物制备：将25mg荧光多肽底物溶解于654μL DMSO中，得到50mM储备液，于-20℃保存，使用时稀释500倍，每份样品中加入8μL，使得反应体系中的最终底物浓度为50μM。

3、反应体系制备：用缓冲溶液将20S蛋白酶体由2ng/μL稀释成浓度为8ng/μL的溶液，加入到384孔荧光酶标板中，每孔加入4μL，再在每孔中加入4μL待测样品，使用已上市药物Ixazomib为阳性对照药，37℃下反应15min。反应结束后，每孔加入8μL荧光底物，37℃避光反应1小时，利用360nm/460nm荧光酶标仪(BMG LABTECH POLARstar OPTIMA MicroplateReader)检测荧光值。

4、数据处理：计算扣除本底物后不同浓度的药物作用下所得产物的荧光值,运用GraphPad Prism软件，计算药物对蛋白酶体抑制的IC₅₀浓度。NA：没有测定；

化合物编号	IC₅₀(nM)	化合物编号	IC₅₀(nM)	化合物编号	IC₅₀(nM)
						Ixazomib	6.48
32	6.26	41	19.66	50	22.4
						33	5.21	42	NA	51	4.05
34	9.63	43	72.51	52	2.85
						35	136.59	44	NA	53	1.82
36	138.6	45	138.06	54	1.53
						37	660	46	无活性
38	无活性	47	7.68
						39	18.36	48	9.81
40	24.61	49	8.43

二、细胞株抑制活性

本发明利用的检测液为单溶液细胞增殖检测盒，来自Promega公司；所用的细胞为RPMI8226。实验体系为110uL，其中含有细胞悬液90μL，检测液10μL，药物(抑制剂)10μL，其终浓度为4.54×10^-8M～1.77×10^-9M，最后一个浓度是0M，实际配置浓度为5×10^-7M～1.95×10^-8M，最后一个浓度是0M。具体实验过程如下：

1、药物配置：准确称量药物，加入DMSO溶解至10^-2M。用移液器吸取1μL加至199μLDMSO得到5×10^-5M，然后从5×10^-5M浓度药物中吸取3.3μL加326.7μL无血清的RPMI1640培养基得到5×10^-7M，1.5倍梯度稀释，得到3.3×10^-7M、2.2×10^-7M、1.48×10^-7M、9.87×10^- ⁸M、6.58×10^-8M、4.38×10^-8M、2.92×10^-8M、1.95×10^-8M浓度的药物，最后一个浓度0M为不加药。

2、细胞悬液配置：细胞分别计数后，稀释配置RPMI8226为1×10⁴个/孔。

3、反应体系制备：96孔荧光酶标板中每孔加入细胞悬液90μL，孵育24h；然后每孔中加入10μL待测样品，使用已上市药物Ixazomib为阳性对照药，孵育24h；反应完毕后，每孔加入10μL检测液，孵育1h，490nm荧光酶标仪(BMG LABTECH POLARstar OPTIMA MicroplateReader)检测吸光度。

4、数据处理：计算扣除本底后不同浓度药物作用下所得产物的吸光度,运用GraphPad Prism软件，计算药物对细胞毒性的IC₅₀浓度(nM)。

部分化合物的结果如下表：

化合物编号	IC₅₀(nM)	化合物编号	IC₅₀(nM)	化合物编号	IC₅₀(nM)
						Ixazomib	7.39
32	4.36	41	16.07	50	6.83
						33	4.98	42	14.99	51	63.19
34	5.33	43	34.63	52	2.9
						35	无活性	44	52.10	53	5.6
36	70.2	45	34.35	54	13.6
						37	无活性	46	36.19
38	27.40	47	6.91
						39	13.38	48	8.74
40	16.07	49	7.48

实施例3：化合物稳定性实验

一、化合物在模拟胃液、肠液和pH6.8的磷酸缓冲液中的稳定性

实验通过LC-MS对不同pH溶液中不同时间点的分解得到的肽硼酸片段进行检测，该片段的含量对应母体化合物的分解量。

1、各pH缓冲液配置：pH1.2:8-9ml(8.33ml)浓盐酸加水定容至1000ml；pH4.5:取醋酸铵7.7g，加水50ml溶解后，加冰醋酸6ml，再定容到100ml；pH6.8:取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀。

2、化合物配置：将化合物用不同pH缓冲液配置成1mg/ml的浓度，置于37℃恒温水浴锅中模拟人体环境。计时并按照实验方案对0h、2h的化合物进行定量检测。

3、检测方式：仪器：液相色谱质谱联用仪(LC-MS)，岛津公司；层析柱：正向氰基柱(XB-CN),Welch；洗脱方式：Hex(A)：EtOH(B)＝4：1

部分化合物在不同pH溶液中的稳定性如下表，溶液稳定性数据表明，本发明中的化合物在溶液中的稳定性远远高于Ixazomib。特别是在pH1.2和pH6.8时，本发明的化合物稳定性更有优势。

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二、化合物的微粒体稳定性

通过液质联用(LC-MS/MS)方法考察化合物52、53在NADPH还原辅酶的作用下在肝微粒体中代谢的速度和程度，并比较不同代谢种属之间的差异。

质谱条件如下：

离子化模式(Ionization mode)：正离子模式(Positive)，Ion Electrospray(ESI)

扫描模式(Scan Type)：多反应监测(MRM)

电喷雾电压(Ion Spray Voltage)：5500V

涡旋离子喷雾温度(Turbo Ion Spray Temp)：550℃

气帘气种类(Curtain Gas Type)：40.0psi

碰撞池气体种类(CAD Gas Type)：9.00

雾化气(Nebulizing Gas，Gas1)种类：60.0psi

辅助气(Auxiliary Gas，Gas 2)种类：60.0psi

化合物代码	化合物名称	监测离子对	停留时间*(msec)	DP(eV)	CE(eV)
						分析物1	52	621.3→284.1	80.0	100	30.0
分析物2	53	635.1→284.1	80.0	100	35.0
						分析物3	Testosterone	289.1→109.2	80.0	90.0	30.0
内标	甲苯磺丁脲	271.1→91.0	80.0	37.0	100.0

*注明：停留时间，此处指的是在监测离子对时，每次扫描一个离子对时所停留的时间。

色谱条件

色谱柱：Ultimate XB C18(50.0×2.1mm,5.00μm,Welch)

流动相A：超纯水(0.1％甲酸)

流动相B：乙腈

自动进样器清洗溶液(Rinse Port Wash Solution)：甲醇

柱温箱温度(Column Temperature)：30℃

流速(Flow Rate)：1.00mL/min

色谱柱平衡状态时的柱压(Initial Back Pressure)：12.0MPa(Typical)

自动进样器温度(Sample Tray Temp)：4.0℃

自动进样器清洗模式(Rinse Mode)：Before and after asporation,

自动进样器清洗时间(Rinse Time)：1s

自动进样器洗针体积(Rinse Volume)：500μL

自动进样器进样针清洗时浸泡时间(Rinse Dip Time)：1s

自动进样器进样体积(Injection Volume)：10.0μL

色谱梯度程序：

Time(min)	Module	Function	Value(％)
				0.70	Pumps	Pump B Conc.	45
1.40	Pumps	Pump B Conc.	98
				2.00	Pumps	Pump B Conc.	98
2.10	Pumps	Pump B Conc.	10
				2.70	System Controller	Stop

分别求算阳性对照物Testosterone，待测物52、53和内标的峰面积比，与T0时间的值对比求得不同孵育时间的原形的相对含量(R)，然后对此比值求对数Ln R，最后以时间为横坐标作图，Ln R为纵坐标作图。根据斜率ke(即消除速率常数)求得分析物(52、53)在不同种属肝微粒体中的半衰期(t_1/2＝0.693/k_e)及其内在清除速率，并比较各待测物在不同种属肝微粒体中的代谢差异。

在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性

Testosterone在人、食蟹猴、犬、大鼠、小鼠肝微粒体中的半衰期分别为31.1min、8.00min、9.3min、0.4min和4.6min(表-1)，说明该孵育体系条件下，酶的活性正常。

表-1：Testosterone在人、食蟹猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体中的半衰期及内在清除率

微粒体稳定性结果表明，本发明的化合物52及53在5种不同肝微粒体具有较好的稳定性，而Ixazomib在食蟹猴中的微粒体半衰期太长，药物基本不代谢，会引起严重的毒性。

酶抑制剂的用途

本发明的其它实施方案涉及恶病质和肌肉萎缩病。蛋白酶体降解成熟网织红细胞和生长中成纤维细胞内的许多蛋白。在缺乏胰岛素或血清的细胞中，蛋白水解速率几乎加倍。抑制蛋白酶体可减少蛋白水解作用，由此减少肌肉蛋白损失以及肾或肝的氮负荷。本发明抑制剂可用于治疗癌症、慢性传染病、发热、肌肉废用(萎缩)和去神经、神经损伤、禁食、酸中毒相关性肾衰竭、糖尿病和肝衰竭等疾病。因此，本发明的实施方案包括以下方法：降低细胞的肌肉蛋白降解速率；降低胞内蛋白降解速速率；降低细胞的p53蛋白降解速速率；以及抑制p53相关性癌生长。上述方法都包括使细胞(体内或体外，例如患者的肌肉)与有效量的本发明化合物(例如药物组合物)接触。

NF-κB还参与编码E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM和VCAM-1的细胞粘附基因的表达(Collins，T.，Lab.Invest.(1993)68：499-508)。本发明一个实施方案是抑制细胞粘附(例如E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM或VCAM-1介导的细胞粘附)的方法，该方法包括使细胞与有效量的本发明化合物(或药物组合物)接触，或者给予患者有效量的本发明化合物(或药物组合物)。

胞内蛋白水解产生用于呈递给T淋巴细胞的小肽，从而诱导I类MHC介导的免疫应答。免疫系统筛选被病毒感染或已经历癌转化的自体细胞。一个实施方案是抑制细胞的抗原呈递的方法，该方法包括使细胞与本发明化合物接触。本发明化合物可以用于治疗免疫相关性疾病，例如变态反应、哮喘、器官/组织排斥反应(移植物抗宿主病)和自身免疫疾病，包括但不限于狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化和炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和节段性回肠炎)。因此，另一实施方案是抑制患者免疫系统的方法(例如抑制移植排异反应、变态反应、自身免疫疾病和哮喘)，该方法包括给予患者有效量的本发明化合物。

再一个实施方案是改变由蛋白酶体或其它具有多催化活性的Ntn产生的抗原肽库的方法。例如，如果20S蛋白酶体的PGPH活性被选择性抑制，由该蛋白酶体产生并用MHC分子呈递到细胞表面的抗原肽组，不相同于没有任何酶抑制作用或者例如该蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性被选择性抑制这两种情况任一种所产生和呈递的抗原肽组。

某些蛋白酶体抑制剂在体外和体内阻断泛蛋白化NF-κB的降解和加工。蛋白酶体抑制剂还阻断IκB-α降解和NF-κB激活(Palombella等，Cell(1994)78：773-785；Traenckner)等，(EMBO J.(1994)13：5433-5441)。本发明一个实施方案是抑制IκB-α降解的方法，该方法包括使细胞与本发明化合物接触。另一实施方案是降低NF-κB在细胞、肌肉、器官或患者中的细胞含量的方法，该方法包括使细胞、肌肉、器官或患者与本发明化合物接触。

需要蛋白酶解加工的其它真核转录因子包括通用转录因子TFIIA、单纯疱疹病毒VP16辅助蛋白(宿主细胞因子)、病毒诱导性IFN调节因子2蛋白以及结合膜的固醇调节元件结合蛋白1。

本发明的其它实施方案是影响细胞周期蛋白依赖性真核细胞周期的方法，该方法包括使细胞(体外或体内)与本发明化合物接触。细胞周期蛋白涉及细胞周期调控。蛋白酶体参与细胞周期蛋白的降解。细胞周期蛋白的实例包括有丝分裂细胞周期蛋白、G1细胞周期蛋白和细胞周期蛋白B。细胞周期蛋白的降解使得细胞退出一个细胞周期阶段(例如有丝分裂)，而进入另一个阶段(例如分裂)。人们认为所有的细胞周期蛋白都与p34.sup.cdc2蛋白激酶或相关激酶缔合。蛋白水解靶向信号定位于氨基酸42-RAALGNISEN-50(降解框)。有证据表明，细胞周期蛋白被转化为易被泛蛋白连接酶破坏的形式，或者细胞周期蛋白特异性连接酶在有丝分裂期间被激活(Ciechanover，A.，Cell，(1994)79：13-21)。抑制蛋白酶体可抑制细胞周期蛋白降解，从而抑制例如细胞周期蛋白相关性癌症中的细胞增殖(Kumatori等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：7071-7075)。本发明一个实施方案是治疗患者增殖性疾病(例如癌症、银屑病或再狭窄)的方法，该方法包括给予患者有效量的本发明化合物。本发明还包括治疗患者细胞周期蛋白相关性炎症的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的本发明化合物。

另外一些实施方案是影响癌基因蛋白的蛋白酶体依赖性调节的方法以及治疗或抑制癌生长的方法，每种方法都包括使细胞(体内，例如患者体内，或者体外)与本发明化合物接触。HPV-16和HPV-18衍生的E6蛋白在粗制网织红细胞裂解物中刺激p53的ATP-和泛蛋白-依赖性缀合和降解。已经证实，具有突变不耐热E1的细胞系中隐性癌基因p53在非许可温度下累积。高水平的p53可能导致细胞凋亡。由泛蛋白系统降解的原癌基因蛋白实例包括c-Mos、c-Fos和c-Jun。一个实施方案是治疗p53相关性细胞凋亡的方法，该方法包括给予患者有效量的本发明化合物。

给药

根据待治疗疾病和患者的年龄、健康状况和体重，按照本文所述方法制备的化合物可以按各种不同的形式给药，这是本领域众所周知的。例如，当化合物准备用于口服给药时，它们可以配制为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂或糖浆剂；或者用于胃肠外给药时，可以配制为注射剂(静脉内、肌内或皮下)、输注制剂或栓剂。通过眼粘膜途径给药时，它们可以配制为滴眼剂或眼膏剂。这些制剂可以通过常规方法制备，必要时，活性成分可以与任何常规添加剂或赋形剂(例如粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、增溶剂、悬浮剂、乳化剂、包衣剂、环糊精和/或缓冲剂)混合。尽管剂量将取决于患者的症状、年龄和体重、所要治疗或预防的疾病的性质和严重程度、给药途径和药物形式，但是一般来讲，本发明化合物对成人患者的推荐日剂量为0.01mg-2000mg，可作为单剂量或多个分剂量给予。与载体混合制备单剂量形式的活性成分量通常是可产生治疗效果的化合物量。

就特定患者上的治疗效果而言，获得最佳疗效的精确给药时间和/或组合物剂量将取决于具体化合物的活性、药代动力学和生物利用度、患者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对特定剂量的反应以及药物类型)、给药途径等。无论如何，以上的准则可用作精确调整疗法的基础，例如确定最佳的给药时间和/或给药剂量，这仅仅需要常规的实验，包括监测患者和调节剂量和/或给药时间。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种硼酸酯类化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于：所述化合物选自

2.权利要求1所述的硼酸酯类化合物及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：按如下所示路线进行合成，

式II所示的化合物与以下结构式23、25、26、28、29中的一种反应得到如权利要求1所述的化合物；

其中，式II-1至式II-6中的取代基R₁、R₂分别对应所制得的权利要求1所述化合物上的取代基。

3.权利要求1所述的硼酸酯类化合物及其药学上可接受的盐的应用，其特征在于：在制备抑制蛋白酶体药物上的应用。

4.根据权利要求3所述的硼酸酯类化合物及其药学上可接受的盐的应用，其特征在于：所述药物包括药物可接受载体。

5.根据权利要求3所述的硼酸酯类化合物及其药学上可接受的盐的应用，其特征在于：在制备治疗炎症、癌症、改变生物体中蛋白酶体产生的抗原肽的药物方面的应用。