CN113092346B - 一种藻类细胞计数检测系统及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种藻类细胞计数检测系统及其检测方法，该系统包括显微图像采集系统及图像处理计数系统，显微图像采集系统由数字摄像机、显微镜系统、流通池、流通管道组成；图像处理计数系统为计算机，包含有图像处理模块、数据统计及输出模块。采用本发明的藻类细胞计数检测系统及其检测方法可以方便、快捷、准确的获取藻类密度数据，为藻华预警和控制提供数据。
Description
技术领域
本发明涉水环境检测技术领域，尤其涉及藻类密度检测，具体为一种藻类细胞计数检测系统及其检测方法。
背景技术
水体环境富营养化引起的水华在我国日趋严重。淡水湖泊如太湖、滇池、巢湖每年夏天秋季都会爆发蓝藻水华，其优势种是能产生微囊藻毒素的微囊藻。有毒蓝藻水华的发生不仅给水体生态系统带来严重危害，同时藻毒素对人体健康也产生直接或潜在的危害，因此控制水华发生、消除毒素危害已刻不容缓。微囊藻细胞数的监测将为藻华的预警和控制提供第一手资料。
藻类密度计数方法分为个体计数法和细胞计数法两种。由于生物个体存在差异，特别是集群的微囊藻，不同个体间差异非常大，能达到几百甚至上千倍，所以常用细胞计数法，以便科学地确定藻类生长状况。但细胞计数法速度慢、耗时长，且一般要在实验室操作，不适用于户外以自动化方式进行作业。
发明内容
为了克服现有技术的问题，本发明提供了一种藻类细胞计数检测系统及其检测方法，可以方便、快捷、准确的获取藻类密度数据，为藻华预警和控制提供数据。
本发明的目的是这样实现的：
一种藻类细胞计数检测系统，包括显微图像采集系统及图像处理计数系统，所述显微图像采集系统由数字摄像机、显微镜系统、流通池、流通管道组成；所述图像处理计数系统为计算机，包含有图像处理模块、数据统计及输出模块；
所述流通池：为一端开口的盒体，盒体上端开口处两个边沿分别设置一个进液管和一个出液管，进液管和出液管之间通过一段透明的细胞显示管连接，所述细胞显示管的内径为5～6μm；
所述流通管道：分为两段，一段连接进液管的进液端，另一段连接出液管的出液端，且流通管道连接有进液蠕动泵；
所述显微镜系统：包括光源、物镜、6个透镜、一个半透明的反射镜、一个圆形挡板、一个环形光阑；所述物镜与流通池中的细胞显示管位置相对，环形光阑与数字摄像机的镜头位置相对；环形光阑的外径大于圆形挡板的直径，圆形挡板的直径与环形光阑中间的圆孔直径相同；光源、第一透镜、第六透镜、圆形挡板、第二透镜、第三透镜、反射镜、物镜组成了入射光路；第四透镜、第五透镜、光阑组成了出射光路；光源、第一透镜、第六透镜、圆形挡板、第二透镜、第三透镜的中心排列在一条水平轴线上，反射镜与水平轴线成45度夹角；物镜、第四透镜、第五透镜、光阑的中心排列在一条垂直轴线上，反射镜与垂直轴线成45度夹角；光源经过第一透镜成为平行光，再经过第六透镜后聚为圆形光斑，圆形光斑的直径等于环形光阑的外径，圆形光斑经过圆形挡板后变为圆环形光经过第二透镜及第三透镜汇聚后，一部分通过反射镜反射进入物镜，经物镜边缘射出；藻细胞产生的后向散射光经过物镜、再经过第四透镜、第五透镜和光阑被数字摄像机接收，形成暗场图像，
所述数字摄像机：通过数据线与图像处理计数系统连接，并传输暗场图像。
进一步的改进，所述图像处理模块包含有细胞图像增强模块、数学形态学处理模块、细胞图像分割模块、细胞图像匹配模块；所述细胞图像增强模块通过三段线性变换法对细胞图像灰度拉伸以增强细胞与背景的对比度，通过中值滤波法或中值滤波法与高通滤波法结合消除噪声使细胞图像平滑；所述数学形态学处理模块通过形态学运算子及其组合来进行细胞图像形状和结构的分析及处理；所述细胞图像分割模块通过阈值分割技术、微分算子边缘检测、区域增长技术、聚类分割技术对细胞或其内部细胞器的容积进行计量分析，进行形态分析，计算形态变化量；细胞图像增强模块处理后产生的新图像可以为其他模块所使用。
进一步的，所述数字摄像机为CCD相机。
进一步的，所述流通池中进液管和出液管为不锈金属材质，内均为100μm，所述细胞显示管的材质为PDMS，细胞显示管两端通过热熔后冷却与进液管和出液管固定连接。
进一步的，显微镜系统中的光源为波长为550nm的LED，物镜NA＝1.37，圆形挡板的直径为3mm，环形光阑外径为4mm，环形光阑中间的圆孔直径为3mm。
一种藻类细胞计数检测方法，采用任意一项所述的藻类细胞计数检测系统，操作步骤为：
1)通电启动蠕动泵，抽取纯水对管路进行清洗，然后断电；
2)抽取待测样品，蠕动泵停止，静待，使流通池的液体静止；
3)启动数字摄相机进行拍照，上传图片数据至图像处理计数系统进行藻细胞计数，得出计数结果，保存图片和计数结果；
4)重新通电，启动蠕动泵对管路进行清洗；
5)重复步骤1)～4)至检测结束，关闭蠕动泵，断电。
本发明的优点和有益效果是：
本发明采用暗视场全反射显微成像、现场拍摄与图像处理技术结合获得一种藻类细胞计数检测系统，自动对细胞进行精确计数，方便、快捷，且适用于野外及在线操作，具有很强的实用性。
藻类细胞计数检测系统中流通池结构及显微系统的设置，形成了暗场细胞图像，增加了细胞的辨识度，且使细胞单层、单个显示，极大提高了细胞计数的效果和准确性。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为藻类细胞计数检测系统整体连接结构示意图；
图2为流通池结构示意图；
图3为显微镜系统结构原理示意图；
图4为藻类细胞计数检测系统工作流程图。
附图标记：
A.数字摄像机；B.显微镜系统；C.流通池；D.流通管道；E.计算机；1.盒体；2.进液管；3.出液管；4.细胞显示管；L1～L6分别为第一透镜至第六透镜；T1为圆形挡板；T2为环形光阑；F1为放射镜；M1为目镜。
具体实施方式
实施例1：
如图1所示，一种藻类细胞计数检测系统，包括显微图像采集系统及图像处理计数系统，所述显微图像采集系统由数字摄像机A、显微镜系统B、流通池C、流通管道D组成；所述图像处理计数系统为计算机E，包含有图像处理模块、数据统计及输出模块；
所述流通池C如图2示：为一端开口的盒体1，盒体1上端开口处两个边沿分别设置一个进液管2和一个出液管3，进液管2和出液管3之间通过一段透明的细胞显示管4连接，所述细胞显示管的内径为5～6μm；流通池中进液管和出液管为不锈金属材质(如不锈钢)，内均为100μm，所述细胞显示管的材质为PDMS，细胞显示管两端通过热熔后冷却与进液管和出液管固定连接，本实施例中的盒体也为PDMS材质。
细胞显示管内的细胞通过显微镜放大后直接映射到摄像机的CCD平面成像，细胞显示管的内径设置为5～6μm使藻细胞能以排序方式顺利通过且细胞不堆叠，流通管道：分为两段，一段连接进液管2的进液端，另一段连接出液管3的出液端，且流通管道连接有进液蠕动泵；蠕动泵通过电磁阀控制开关。
显微镜系统如图3所示：包括光源、物镜M1、6个透镜L1～L6、一个半透明的反射镜F1(可为透光率为50％的玻璃)、一个圆形挡板T1、一个环形光阑T2；所述物镜与流通池中的细胞显示管位置相对，环形光阑与数字摄像机的镜头位置相对，本实施例中将显微镜系统设置在流通池的下方，将数字摄像机设置在显微镜的下方；环形光阑的外径大于圆形挡板的直径，圆形挡板的直径与环形光阑中间的圆孔直径相同；光源、第一透镜、第六透镜、圆形挡板、第二透镜、第三透镜、反射镜、物镜组成了入射光路；第四透镜、第五透镜、光阑组成了出射光路；光源、第一透镜、第六透镜、圆形挡板、第二透镜、第三透镜的中心排列在一条水平轴线上，反射镜与水平轴线成45度夹角；物镜、第四透镜、第五透镜、光阑的中心排列在一条垂直轴线上，反射镜与垂直轴线成45度夹角；光源经过第一透镜成为平行光，再经过第六透镜后聚为圆形光斑，圆形光斑的直径(本实施例中为4mm)等于环形光阑的外径，圆形光斑经过圆形挡板后变为圆环形光经过第二透镜及第三透镜汇聚后，一部分通过反射镜反射进入物镜，经物镜边缘射出，在流通池液体界面处产生倏逝波，形成全反射，这样，就可以通过倏逝波与吸附在界面处的细胞反应，并仅观察到该界面处100-200nm高度区域内的细胞，排除Z轴更上区域的物质对成像的干扰；此种照明方式，照明光线偏移大部分不进入物镜，只有藻细胞产生的后向散射光经过物镜、再经过第四透镜、第五透镜和光阑被数字摄像机接收，形成暗场图像。由于在入射光路有一个挡板，出射光路有一个光阑。挡板和光阑的形状相互互补。从物镜返回的零级衍射光被遮挡，只有高于零级的衍射光，包括正负1级，正负2级，依次类推的光才能被照相机接受。因此，图像可形成暗视场成像。这样，可以提高图像对比度，背景是黑色，只有细胞是亮的，利于图像识别。本实施例中，显微镜系统中的光源为波长为550nm的LED，物镜NA＝1.37，圆形挡板的直径为3mm，环形光阑外径为4mm，环形光阑中间的圆孔直径为3mm。
数字摄像机：通过数据线与图像处理计数系统连接，并传输暗场图像。本实施例选用大恒光电MER-230-168U3M数字摄像机，分辨率为1920X1200，像素尺寸5.86μmX5.86μm，模数转化精度为10bit，增益0dB-24dB；信噪比为53.49Db；额定功率<2.5W@5V。显微镜视野尺寸为5.7μm，显微镜视野5.7μm与摄像机5.86μm匹配的比较好。
由蠕动泵抽取的待测样品经由流通管道D进入流通池C，流通池细胞显示管区域经过显微镜系统B放大后在A数字摄像机CCD成像面上成像，通过计算机采集成像后的图像并计算藻细胞的个数。
图像处理模块包含有细胞图像增强模块、数学形态学处理模块、细胞图像分割模块、细胞图像匹配模块；细胞图像增强模块通过三段线性变换法对细胞图像灰度拉伸以增强细胞与背景的对比度，通过中值滤波法或中值滤波法与高通滤波法结合消除噪声使细胞图像平滑；
所述数学形态学处理模块通过形态学运算子及其组合来进行细胞图像形状和结构的分析及处理；细胞图像分割模块通过阈值分割技术、微分算子边缘检测、区域增长技术、聚类分割技术对细胞或其内部细胞器的容积进行计量分析，进行形态分析，计算形态变化量；细胞图像增强模块处理后产生的新图像可以为其他模块所使用。
实施例2：
本实施例为采用实施例1中的藻类细胞计数检测系统进行藻类细胞计数检测的方法。具体工作流程如图4所示。
操作步骤为：
1)通电电磁阀，启动蠕动泵，抽取纯水对管路进行清洗3min，然后断电；
2)抽取待测样品，时间2min，蠕动泵停止，静待4min，使流通池的液体静止；
3)启动数字摄相机进行拍照，上传图片数据至图像处理计数系统进行藻细胞计数，得出计数结果，保存图片和计数结果；
4)重新通电电磁阀，启动蠕动泵对管路进行清洗；
5)重复步骤1)～4)至检测结束，关闭电磁阀和蠕动泵。
通过藻细胞计数检测系统，经过蠕动泵抽取不同浓度的藻细胞液，让细胞液通过流通管道进入显微镜系统的流通池，数字摄像机拍摄视野藻细胞的图片并记录系统给出的藻细胞数量，通过人工计数与系统计数的比较，实测本项目藻细胞计数的准确率达到95％以上，见表1。
表1藻细胞计数系统实验统计
通过细胞图像处理系统对大批量细胞图像作细胞计数，快速方便地得到了实验结果，计数误差较小，可以看出，系统准确率在95％以上，特别是对显微镜视野内藻细胞数量10个左右及以下时候，准确率达到100％。
最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.一种藻类细胞计数检测系统，其特征在于：包括显微图像采集系统及图像处理计数系统，所述显微图像采集系统由数字摄像机、显微镜系统、流通池和流通管道组成；所述图像处理计数系统为计算机，包含有图像处理模块和数据统计及输出模块；
所述流通池：为一端开口的盒体，盒体上端开口处两个边沿分别设置一个进液管和一个出液管，进液管和出液管之间通过一段透明的细胞显示管连接，所述细胞显示管的内径为5~6µm；
所述流通管道：分为两段，一段连接进液管的进液端，另一段连接出液管的出液端，且流通管道连接有进液蠕动泵；
所述显微镜系统：包括光源、物镜、6个透镜、一个半透明的反射镜、一个圆形挡板和一个环形光阑；所述物镜与流通池中的细胞显示管位置相对，环形光阑与数字摄像机的镜头位置相对；环形光阑的外径大于圆形挡板的直径，圆形挡板的直径与环形光阑中间的圆孔直径相同；光源、第一透镜、第六透镜、圆形挡板、第二透镜、第三透镜、反射镜和物镜组成了入射光路；第四透镜、第五透镜和光阑组成了出射光路；光源、第一透镜、第六透镜、圆形挡板、第二透镜和第三透镜的中心排列在一条水平轴线上，反射镜与水平轴线成45度夹角；物镜、第四透镜、第五透镜和光阑的中心排列在一条垂直轴线上，反射镜与垂直轴线成45度夹角；光源经过第一透镜成为平行光，再经过第六透镜后聚为圆形光斑，圆形光斑的直径等于环形光阑的外径，圆形光斑经过圆形挡板后变为圆环形光经过第二透镜及第三透镜汇聚后，一部分通过反射镜反射进入物镜，经物镜边缘射出；藻细胞产生的后向散射光经过物镜、再经过第四透镜、第五透镜和光阑被数字摄像机接收，形成暗场图像，所述流通池中进液管和出液管为不锈金属材质，内径均为100µm，所述细胞显示管的材质为PDMS，细胞显示管两端通过热熔后冷却与进液管和出液管固定连接；所述数字摄像机：通过数据线与图像处理计数系统连接，并传输暗场图像；
显微镜系统中的光源为波长为550nm的LED，物镜NA=1.37，圆形挡板的直径为3mm，环形光阑外径为4mm，环形光阑中间的圆孔直径为3mm。
2.根据权利要求1所述的藻类细胞计数检测系统，其特征在于：所述图像处理模块包含有细胞图像增强模块、数学形态学处理模块、细胞图像分割模块和细胞图像匹配模块；
所述细胞图像增强模块通过三段线性变换法对细胞图像灰度拉伸以增强细胞与背景的对比度，通过中值滤波法或中值滤波法与高通滤波法结合消除噪声使细胞图像平滑；
所述数学形态学处理模块通过形态学运算子及其组合来进行细胞图像形状和结构的分析及处理；
所述细胞图像分割模块通过阈值分割技术、微分算子边缘检测、区域增长技术和聚类分割技术对细胞或其内部细胞器的容积进行计量分析，进行形态分析，计算形态变化量；
细胞图像增强模块处理后产生的新图像能够为数学形态学处理模块、细胞图像分割模块和细胞图像匹配模块所使用。
3.根据权利要求1所述的藻类细胞计数检测系统，其特征在于：所述数字摄像机为CCD相机。
4.一种藻类细胞计数检测方法，采用权利要求1~3中任意一项所述的藻类细胞计数检测系统，其特征在于：操作步骤为：
1) 通电启动蠕动泵，抽取纯水对管路进行清洗，然后断电；
2）抽取待测样品，蠕动泵停止，静待，使流通池的液体静止；
3）启动数字摄相机进行拍照，上传图片数据至图像处理计数系统进行藻细胞计数，得出计数结果，保存图片和计数结果；
4）重新通电，启动蠕动泵对管路进行清洗；
5）重复步骤1）~4）至检测结束，关闭蠕动泵，断电。
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