CN107014755A - 一种用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统。包括：照明光源、载物台、显微镜、反射镜、成像透镜和成像器件；所述照明光源射出的光投射在载物台上，再透过载物台投射进显微镜中；从显微镜中投射出来的光经过反射镜反射进入成像器件中。本发明通过对水体中的藻类进行显微光谱成像，并通过获取其每个藻类的光谱信息进行比较，从而对藻类类别进行鉴别，并进行计。本发明克服了传统化学方法会干扰样品及其周边环境的缺点，实现了无损检测，可以对水体中的藻类进行反复和持续的监测，还能够获得更多和更准确的样品信息。

Description

一种用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统

技术领域

本发明涉及光谱成像技术和光谱鉴别技术领域，尤其涉及一种用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统。

背景技术

由于水体富营养化等原因，在海洋或者淡水水系中均会出现“赤潮”现象。“赤潮”现象是指在特定的环境条件下，水体中某些浮游植物、原生动物或细菌爆发性增殖或高度聚集而引起水体变色的一种有害生态现象。赤潮生物释放毒素赤潮生物释放的毒素可引起海洋鱼、虾、贝等生物死亡，或使毒素富集在海产品中最终对摄食它们的其他动物包括人类产生毒害作用，此外赤潮生物大量消耗氧气，造成水体溶解氧减少，也会使海洋生物因缺氧而大量死亡。作为赤潮形成的重要因素，藻类在水体中的繁殖情况备受关注。

然而，目前仍缺乏有限的研究工具和研究方法对水体中各种藻类的繁殖情况进行持续监控。采用传统显微镜对水体进行观察虽然可以实现无损检测，进而能够持续监控，但水体中藻类成分复杂，有些藻类的类别不能仅仅从形貌上进行分辨，也很难凭肉眼来统计水体中藻类个数。而采用化学标记的办法尽管非常精确和便于统计，但是藻类自身及所处环境受到了严重干扰，甚至直接影响藻类的生长，故也不合适用于持续监测水体中的藻类繁殖情况。

目前亟待开发一种能够对水体中藻类繁殖情况进行持续准确监测的设备和方法，这将有助于推动与赤潮相关的研究，为预防和控制赤潮的产生提供有力的支持。鉴于各种藻类各自的色素成分和组成物质有差别，因此其颜色或者自发荧光也有差别，可以通过光谱信息对藻类进行种类鉴别。

因此，现有技术存在缺陷，需要改进。

发明内容

本发明的主要目的在于克服本发明的主要目的在于克服传统检测手段和检测方法无法满足对水体中藻类繁殖情况进行准确和无损监控的缺点，提出一种光谱鉴别技术与光谱成像技术结合的全新监控系统，致力于推动赤潮相关研究的发展。

本发明公开了一种用于持续无干扰地监控复杂水体环境中藻类种类和增殖情况的系统。通过对水体中的藻类进行显微光谱成像，并通过获取其每个藻类的光谱信息进行比较，从而对藻类类别进行鉴别，并进行计数。

本发明所述用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统通过以下的技术方案实现：

一种用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统，包括：照明光源、载物台、显微镜、反射镜、成像透镜和成像器件；所述照明光源射出的光投射在载物台上，再透过载物台投射进显微镜中；从显微镜中投射出来的光经过反射镜反射进入成像器件中。

进一步地，所述反射镜为45°反射镜，包括第一45°反射镜和第二45°反射镜；所述成像透镜包括第一成像透镜和第二成像透镜；所述成像器件包括灰度成像透镜和彩色成像透镜；所述用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统还包括二向分色镜和液晶滤波器件；

照明光源射出的光投射在载物台上，再透过载物台，从上至下穿过显微镜中，并投射在第一45°反射镜上。第一45°反射镜再将光线反射到45°半透半反镜。反射到45°半透半反镜上的光分为两路，一路光被45°半透半反镜反射后穿过第一成像透镜射入彩色成像器件内；另一路光透过45°半透半反镜后射在第二45°反射镜上，经过第二45°反射镜反射的光透过液晶滤波器件和第二成像透镜后，最终投入灰度成像器件内。

进一步地，所述用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统还包括激发光系统、准直透镜组以及二向分色镜；

所述激发光系统发射的光透过准直透镜组射在二向分色镜上，再经过二向分色镜反射由下至上射入显微镜中。照明光源射出的光投射在载物台上，再透过载物台，从上至下投射进显微镜中，并透过二向分色镜投射在第一45°反射镜上。第一45°反射镜再将光线反射到45°半透半反镜。反射到45°半透半反镜上的光分为两路，一路光被45°半透半反镜反射后穿过第一成像透镜射入彩色成像器件内；另一路光透过45°半透半反镜后射在第二45°反射镜上，经过第二45°反射镜反射的光透过液晶滤波器件和第二成像透镜后，最终投入灰度成像器件内。

优选地，所述照明光源为宽光谱光源，所述照明光源为高压氙灯或者卤素灯。

优选地，所述显微物镜为消色差无穷远系统显微物镜。

优选地，所述二向分色镜需采用对短于激发光波长的光进行反射，对于长于激发光波长的光进行透射。

优选地，所述的准直透镜组有三个凸透镜组成，激发光系统应位于前透镜焦点处，前透镜与中间透镜的距离不限，中间透镜与后透镜焦距为f₂和f₃，则两者距离为f₂+f₃，激发光通过该系统被放大的倍数为A＝f₂/f₃。

优选地，所述液晶滤波器件对可见光波段(380-760nm)进行滤波调节；所述的激发光系统为短波长(波长<410nm)光源，所述的激发光系统的光源为紫外光灯、紫外LD以及紫外LED；所述反射镜反射的光的波段为可见光波段。

优选地，所述的液晶滤波器的光谱分辨率达到1nm，能够对第二反射镜反射进来的信号光进行滤波，从而输出单波长信号光并经过第二成像透镜在灰度成像器件中成单波长下的灰度图像。

优选地，所述的灰色成像器件和彩色成像器件为CCD或CMOS器件。

采用上述方案，本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1、本发明克服了传统化学方法会干扰样品及其周边环境的缺点，实现了无损检测，可以对水体中的藻类进行反复和持续的监测。

2、本发明提供的系统及方法能够获得更多和更准确的样品信息，相对于传统显微镜，除了能获得其形貌信息外，还能够获得每个藻体的光谱信息，并能够直观地将各种藻类的分布情况客观的显示在图片上，实现对每一种藻类的准确统计。此外，传统的化学方法虽然也能够区分藻体种类并能对个数进行统计，但也无法获得形貌信息，所获取信息量远低于本发明提供的系统及方法。

3、本发明提供的系统操作简单，检测准确快速，适用性强，对于自发荧光比较弱的藻类可采用透射光谱成像进行检测，对于色素较少，透明度较高的藻类可以采用荧光光谱成像进行检测，也可以分别采用这两种方法对样品进行检测，获得更多的信息和更高的准确率。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为本发明的光谱信息提取过程示意图；

图3为本发明的操作流程图；

图4为本发明中实施案例的鉴别结果展示图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

参照图1至图4所示，本发明中用于持续无干扰地监控复杂水体环境中藻类种类和增殖情况的显微系统包括照明光源1、三维可调载物台2、显微物镜3、二向分色镜4、第一45°反射镜5、45°半透半反镜6、第二45°反射镜7、液晶滤波器件8、第一成像透镜9、第二成像透镜10、灰度成像器件11、彩色成像器件12、激发光系统13以及准直透镜组14。

激发光系统13发射的光透过准直透镜组14射在二向分色镜4上，再经过二向分色镜4反射由下至上射入显微镜中。照明光源1射出的光投射在三维可调载物台2上，再透过载物台2上的样本，从上至下投射进显微镜中，并透过二向分色镜4投射在第一45°反射镜5上。第一45°反射镜5再将光线反射到45°半透半反镜6。反射到45°半透半反镜6上的光分为两路，一路光被45°半透半反镜6反射后穿过第一成像透镜9射入彩色成像器件12内；另一路光透过45°半透半反镜6后射在第二45°反射镜7上，经过第二45°反射镜7反射的光透过液晶滤波器件8和第二成像透镜10后，最终投入灰度成像器件11内。

其中，所述的激发光系统13为短波长(波长<410nm)光源，所述的激发光系统13的光源为紫外光灯、紫外LD以及紫外LED；所述反射镜反射的光的波段为可见光波段。所述的准直透镜组14有三个凸透镜组成，激发光系统13应位于前透镜焦点处，前透镜与中间透镜的距离不限，中间透镜与后透镜焦距为f₂和f₃，则两者距离为f₂+f₃，激发光通过该系统被放大的倍数为A＝f₂/f₃。

所述照明光源1可以是高压氙灯或者是卤素灯等宽光谱光源，以便于用作透射光谱成像。所述显微物镜3需要采用消色差无穷远系统显微物镜3，便于在光路中添加或者移除光学元件而不改变后续光路的成像面。所述的激发光系统13应该是短波长的蓝紫光或者紫外光，如紫外激光器，紫外LED或紫外灯等。所述二向分色镜4需采用对短于激发光波长的光进行反射，对于长于激发光波长的光进行透射，由于样品所发射的自发荧光的波长要比激发光系统13所发射的光波波长要长，因此二向分色镜4可以隔绝激发光进入后续光路系统，进入对荧光信号产生干扰。

由于本发明所采用的透射光谱成像和荧光光谱成像都是在可见光范围内，液晶滤波器件8应选用对可见光波段(400nm-700nm)进行滤波调节的。所述的液晶滤波器的光谱分辨率达到1nm，能够对第二反射镜反射进来的信号光进行滤波，从而输出单波长信号光并经过第二成像透镜10在灰度成像器件11中成单波长下的灰度图像。系统中需要同时设置一个灰度成像器件11为灰度CCD或者COMS相机，来配合液晶滤波器实现光谱成像，以及一个彩色成像器件12——彩色CCD或者COMS相机，以获得样品真实颜色下的成像。

用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的方法，包括以下步骤：

1)采用一种用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统获得样本的光谱显微图像；

2)将光谱显微图像通过二值化处理去除背景，并进行边缘检测，从而获得样本的光谱信息；

3)将光谱信息进行提取、鉴别，并统计藻类个数。

其中，采用一种用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统可获得两种光谱显微图像，一种是透射光谱成像，另一种是荧光光谱成像。

所述采用成像器件获得样本透射光谱成像的光谱显微图像的方法包括以下步骤：

1)将放在透明培养皿中的含水体的藻类样本放置在系统的载物台2上，开启照明光源1、液晶滤波器件8和成像器件，照明光源1发出的光通过样品后部分被吸收，形成带有藻类样本的信号光；

2)调节显微物镜3位置直至在灰度成像器件11和彩色成像器件12中均能观察到清晰的成像，从而获取透射光谱成像；

3)设置液晶滤波器件8滤波范围和扫描精度，设置成像器件曝光时间，开启连续扫描拍摄模式，获取一段光波波长区间下的一系列光谱显微图像，该光谱显微图像为透射光谱成像。

当关闭激发光系统13，仅开启白光照明系统，该照明光通过样品后，部分被吸收，形成带有吸收信息的信号光。此信号光被显微物镜3收集，通过二向分色镜4、反射镜和半透半反镜后被分为两路，一路经过成像透镜在彩色成像器件12中形成彩色图像。另一路信号光则被反射镜反射，进入液晶滤波器。液晶滤波器通过以1nm的光谱分辨率进行扫描，每转换一个滤波波长，通过成像透镜和灰度成像器件11进行一次成像，直至扫描整个可见光波段，获得每个波长下的灰度图像，即透射光谱成像。

所述采用成像器件获得样本荧光光谱成像的光谱显微图像的方法包括以下步骤：

1)将放在透明培养皿中的含水体的藻类样本放置在系统的载物台2上，开启激发光系统13、液晶滤波器件8和成像器件，照明光源1发出的光通过样品后部分被吸收，形成带有藻类样本的信号光；

2)调节显微物镜3位置直至在灰度成像器件11和彩色成像器件12中均能观察到清晰的成像，从而获取透射光谱成像；

3)设置液晶滤波器件8滤波范围和扫描精度，设置成像器件曝光时间，开启连续扫描拍摄模式，获取一段光波波长区间下的一系列光谱显微图像，该光谱显微图像为荧光光谱成像。

当关闭白光照明系统，仅开启激发光系统13，激发光将通过二向分色镜4反射至载物台2上的样品，并激发其自身的荧光，荧光信号被显微物镜3收集，通过二向分色镜4，反射镜和半透半反镜后被分为两路，一路经过成像透镜在彩色成像器件12中形成彩色图像。另一路信号光则被反射镜反射，进入液晶滤波器。液晶滤波器通过以1nm的光谱分辨率进行扫描，每转换一个滤波波长，通过成像透镜和灰度成像器件11进行一次成像，直至扫描整个可见光波段，获得每个波长下的灰度图像，即荧光光谱成像。

在获得样品光谱显微图像后，还需要经过背景去除、边沿检测、光谱信息提取、光谱信息鉴别、数量统计等步骤后，最终实现藻类种类的鉴别和藻类个数的统计。

具体而言，背景去除是为了在获取光谱显微成像后将藻类和背景分开，因此，需要对图像二值化处理并进行边沿检测。其中，二值化可采用OTSU算法实现。所述将光谱显微图像通过二值化处理去除背景的方法包括以下步骤：

1)先统计整幅光谱显微图像的灰度值直方图，再通过设置阈值将原图像分成前景，背景两个图象；

2)将背景设为0灰度值，将样品设为最高灰度值，从而将被测物与背景分离。

所述的边沿检测用于勾勒图像中每个藻体的轮廓，并将轮廓中所有像素点归为某一藻体的内部信息，从而可对每个藻体光谱信息进行合理提取，并可对藻体个数进行清点；所述的边沿检测以经过二值化后的图像为基础，通过背景与被测物之间的灰度差异进行边沿判断；所述边沿检测的方法包括：微分算子法、样板匹配法、小波检测法、神经网络法。

将某一光波长下所拍摄的光谱图像的像素点灰度值代表光强值，即可表示出该像素点在该波长下的透射或者荧光强度。一旦像素点选择为某个藻体内部，就可以知道这个藻体在该波长下的透射或者荧光强度。通过扫描所有波长下的光谱图像描绘波长与强度的光谱曲线，即可完成光谱信息提取。所述光谱信息提取的方法包括以下步骤：

1)提取目标像素点坐标，通过手动选择数据光谱图像对应的目标像素点的x轴和y轴坐标值，或者通过鼠标双击目标像素点，获取该点处对应的x轴和y轴坐标值；

2)获取目标像素点的坐标值后，读取每一个波长下光谱图片该坐标值处灰度值，该灰度值大小表示着该目标像素点处于该波长时的强度；

3)则在读取完所有波长下图片的该像素点灰度值数据后，以波长值为x轴，以灰度值为y轴可以描绘该像素点对应的光谱曲线；

所述的藻类鉴别方法是采用标准品的光谱曲线与目标测像素点的光谱曲线比较；所述目标像素点选择位于藻类边沿之内的像素点。

所述藻类的统计方法为对每个藻体进行种类鉴别后，在光谱显微图像中采用不同颜色对不同藻类进行标记，将位于藻类边沿之内的像素点计为一个藻体，并标记为同一种颜色，并统计相同颜色藻体个数。

可采用比值法、神经网络算法或者遗传算法等方法对光谱信息进行鉴别进而对藻类进行鉴别。在鉴别出各个藻体的类别后，按照边沿检测结果，结合藻体类别，对各种类别的藻类进行数量统计，在长期监控下变可研究各种藻类在水体中的繁殖情况。

实施例1

作为一种实施案例，本发明中采用小球藻和微绿球藻作为监测样本，在培养皿的水体中进行培养。这两种藻类形貌相似，体积细小，难以采用常规的显微镜进行鉴别，且两者所含荧光物质较少，因此本实施案例采用透光光谱成像方式进行测试。

本实施案例所选择的照明光源1为高压氙灯，采用CRi公司生产的VariSpecTM型液晶滤波器400-720nm进行滤波。此外，选择对400nm以下波长高反(99.2％的反射率)并对400nm以上波长增透(99.8％的透过率)的二向分色镜4。灰度成像器件11和彩色成像器件12分别选择灰度CCD和彩色CCD。

本实施案例中选择的半透半反镜对整个可见光波段(380nm～780nm)均半透半反，选择的第一45°反射镜和第二45°反射镜均对整个可见光波段高反(99.8％的反射率)。

本实施案例为了获得较大的观测范围，选择放大倍数为20倍的无穷远系统消色差显微物镜3。

本实施案例设置液晶滤波器件8的扫描范围为450nm～700nm，扫描精度为2nm。设置彩色CCD曝光时间是0.5ms，灰度CCD曝光时间是3ms。

本实施案例采用550nm波长下所拍摄的光谱图片以及OTSU算法进行二值化处理，采用样板匹配法进行边沿检测和勾勒，采并用比值法对光谱信息进行鉴别。

所述系统的运行机制如下：开启照明光源1后，宽带的照明光会穿过样品被显微物镜3收集。在穿过样品的过程中，因为藻类自身含有各种色素，所以部分照明光会被吸收，透射出来的光比进入样品前的光有较大损耗，而不通过样品仅仅从水体中透过的光则损耗较少。不同的藻类对不同波长的光有不同的吸收损耗，这些被吸收损耗后的光便带上了信息量，即其光谱信息。

光通过显微物镜3及二向分色镜4被45°反射镜反射并通过半透半反镜分别进入两个成像光路，一路直接通过成像透镜进行彩色成像，一路通过液晶滤波器件8滤波，仅让某一波长光进入成像透镜，并最终在灰度CCD内进行成像。由于灰度CCD每一次拍摄的都是某一波长下的图片，则其图片上各像素点的灰度值表示着该位置在该波长下显示的强度。假设某波长的光谱图片中无藻类背景灰度值是200，某样品上的像素点对应灰度值为100，则可以计算出该像素点对该波长的吸收率[(200-100)/200]*100％＝50％，通过统计该像素点所有扫描波长下的吸收率或者透过率则可以描绘出该对点所代表的物质所对应的吸收或透射光谱曲线。由于不同藻类具有不同的光吸收特性，因此通过吸收曲线或者透射曲线则可以对其种类进行鉴别，并最终分别统计其数量。

本实施案例按照上述设置以及图3所述流程即可获得如图4所述的鉴别结构图像，本实施案例中以两个伪灰度分别对两类不同的藻体进行标记，在左图中可以看到，从形貌无法鉴别两者，但通过对比两者光谱，可以进行鉴别，结果如右图所示。在获取鉴别结果后即可统计水体中各种藻类的个数。

综上所述，本发明首次将光谱成像技术与藻类鉴别结合起来，根据藻类细小需要显微系统进行成像，并需要通过光谱进行无损鉴别和计数的要求，提出了一种光谱显微成像系统，并针对该系统所获得数据提出了采用一种算法实现的、基于光谱信息比较的藻类种类鉴别和各种藻类个数统计的方法。

相对于采用传统显微镜观察藻类繁殖情况，本发明所采用的系统除了能够获取形貌信息外，还能获得更为客观的光谱信息。此外，本发明采用算法对观察范围内的藻类进行精密的个数统计，比通过显微镜观察进而人工计数或者化学方法进行鉴别更为准确。通过本系统及相应方法，可以获得藻类显微成像、光谱成像、各种藻类光谱曲线以及各种藻类的个数及分布情况等丰富的信息量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统，其特征在于，包括：照明光源、载物台、显微镜、反射镜、成像透镜和成像器件；所述照明光源射出的光投射在载物台上，再透过载物台投射进显微镜中；从显微镜中投射出来的光经过反射镜反射进入成像器件中。

2.根据权利要求1所述的用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统，其特征在于，所述反射镜为45°反射镜，包括第一45°反射镜和第二45°反射镜；所述成像透镜包括第一成像透镜和第二成像透镜；所述成像器件包括灰度成像透镜和彩色成像透镜；所述用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统还包括二向分色镜和液晶滤波器件；

照明光源射出的光投射在载物台上，再透过载物台，从上至下穿过显微镜中，并投射在第一45°反射镜上，第一45°反射镜再将光线反射到45°半透半反镜；反射到45°半透半反镜上的光分为两路，一路光被45°半透半反镜反射后穿过第一成像透镜射入彩色成像器件12内；另一路光透过45°半透半反镜后射在第二45°反射镜上，经过第二45°反射镜反射的光透过液晶滤波器件和第二成像透镜后，最终投入灰度成像器件内。

3.根据权利要求2所述的用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统，其特征在于，所述用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统还包括激发光系统、准直透镜组以及二向分色镜；

所述激发光系统发射的光透过准直透镜组射在二向分色镜上，再经过二向分色镜反射由下至上射入显微镜中；照明光源射出的光投射在载物台上，再透过载物台，从上至下投射进显微镜中，并透过二向分色镜投射在第一45°反射镜上，第一45°反射镜再将光线反射到45°半透半反镜；反射到45°半透半反镜上的光分为两路，一路光被45°半透半反镜反射后穿过第一成像透镜射入彩色成像器件内；另一路光透过45°半透半反镜后射在第二45°反射镜上，经过第二45°反射镜反射的光透过液晶滤波器件和第二成像透镜后，最终投入灰度成像器件内。

4.根据权利要求1所述的用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统，其特征在于，所述照明光源为宽光谱光源，所述照明光源为高压氙灯或者卤素灯。

5.根据权利要求1所述的用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统，其特征在于，所述显微物镜为消色差无穷远系统显微物镜。

6.根据权利要求3所述的用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统，其特征在于，所述二向分色镜需采用对短于激发光波长的光进行反射，对于长于激发光波长的光进行透射。

7.根据权利要求1所述的用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统，其特征在于，所述的准直透镜组有三个凸透镜组成，激发光系统应位于前透镜焦点处，前透镜与中间透镜的距离不限，中间透镜与后透镜焦距为f₂和f₃，则两者距离为f₂+f₃，激发光通过该系统被放大的倍数为A＝f₂/f₃。

8.根据权利要求3所述的用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统，其特征在于，所述液晶滤波器件对可见光波段进行滤波调节；所述的激发光系统为短波长光源，所述的激发光系统的光源为紫外光灯、紫外LD以及紫外LED；所述反射镜反射的光的波段为可见光波段。

9.根据权利要求8所述的用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统，其特征在于，所述的液晶滤波器的光谱分辨率达到1nm，能够对第二反射镜反射进来的信号光进行滤波，从而输出单波长信号光并经过第二成像透镜在灰度成像器件中成单波长下的灰度图像。

10.根据权利要求2所述的用于藻类鉴别和藻类增殖无损监测情况的系统，其特征在于，所述的灰色成像器件和彩色成像器件为CCD或CMOS器件。