CN113069457B - 用于治疗kras突变且同时具有myocd功能缺失肺癌的联合药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗K+/M‑肺癌的联合药物，旨在提供一种针对活化的信号通路，个体化治疗K+/M‑肺癌病人的联合治疗的药物；其技术要点是转化生长因子β受体I抑制剂、视黄酸受体RAR抑制剂和曲美替尼组成；属于医药生物技术领域。

Description

用于治疗KRAS突变且同时具有MYOCD功能缺失肺癌的联合 药物
技术领域
本发明涉及用于治疗肺癌的联合药物，特别涉及一种用于治疗K+/M-肺癌的联合药物，属于医药技术领域。
背景技术
我国每年新增肺癌病人约78.7万人，死亡约63.1万人，相当于每一分钟就有1.5人患上肺癌，约占所有恶性肿瘤新发病例的五分之一。目前已知肺癌的发生主要与基因的改变有关，抑癌基因失活和癌基因的激活共同驱动癌症的发生。
KRAS作为肺癌中最常见的突变致癌基因，KRAS常见的几种基因突变类型G12D、G12V、G12C和G13D突变，将KRAS锁定在结合GTP的构象中，并不断激活下游信号通路，促进恶性肿瘤的发展。目前有些药物可以与KRAS-G12C结合，使其丧失活性，另外还有一些针对MEK1/2的抑制剂也可以部分的消除KRAS突变的肿瘤，但是肺癌细胞很快对这些药物产生耐药性，因此在临床治疗中效果有待提高。KRAS近乎球形的结构使其成为一个非常光滑的靶点，除了G12C突变外，目前临床上没有有效的靶向药物，另外，KRAS突变的肺癌细胞也能耐受化疗。因次，KRAS突变被称为“最难对付的突变”。
心肌素(MYOCD)是一种有效的转录共激活因子，并在2001年验证了心肌素对大多数平滑肌细胞(SMC)的发育和分化都是必需的。MYOCD蛋白具有多个功能不同的结构域，包括氨基(N)末端，碱性结构域，亮氨酸拉链结构域，富含谷氨酰胺(Q)的区域和SAP结构域。MYOCD是一种有效的共转录激活剂，可调节心肌细胞和SMC谱系的发育和分化。最近的工作揭示了MYOCD能够促进胚胎血管发育，抑制血管炎症，抑制VSMC去分化，增殖以及调节脂质代谢等。另外有研究报道：MYOCD作为一个抑癌基因，其表达在恶性肿瘤转化过程中被频繁下调，导致癌变前间充质细胞分化缺陷以及恶性转化；MYOCD还可以通过诱导细胞周期延迟，抑制平滑肌肉瘤的生长；除此之外，MYOCD还通过抑制NF-KB依赖的细胞周期进而抑制细胞的增殖；在人鼻咽癌中，MYOCD被高度甲基化，MYOCD的表达被沉默。
TCGA数据库以及K-M生存曲线的分析表明：MYOCD在肺癌中是低表达的，且MYOCD的表达与病人的生存率正相关。这些数据说明MYOCD的功能缺失，可能是导致肺癌发病的原因之一。除此之外我们还发现大约32％的KRAS突变阳性肺癌患者同时存在MYOCD低表达。目前对于KRAS突变且同时具有MYOCD功能缺失的肺癌患者的最佳治疗仍然是一个悬而未决的问题。
发明内容
基于目前针对KRAS突变且同时具有MYOCD功能缺失的肺癌病人(称为K+/M-肺癌病人)缺乏指引性和有效的治疗手段，本发明的目的在于提供一种针对活化的信号通路，个体化治疗K+/M-肺癌病人的联合治疗的药物。
为此，本发明提供的技术方案是这样的：
一种用于治疗K+/M-肺癌的联合药物，主要由转化生长因子β受体I抑制剂SB525334，视黄酸受体RAR抑制剂WYC209和曲美替尼组成。
Figure GDA0003359645630000021
其中：WYC209，合成类维生素A，分子式：C20H20N2O3S，分子量：368.45g/mol,以肿瘤细胞的视黄酸受体为靶点,通过半胱氨酸蛋白酶-3信号通路来抑制恶性肿瘤干细胞的增生，杀死已经转移的癌细胞并抑制癌转移。SB525334,选择性TGFBR1(ALK5)抑制剂，分子式：C21H21N5，分子量：343.42,抑制TGF-b1诱导的Smad2/3磷酸化和核转位,进而抑制TGFB信号通路。
进一步的，上述的用于治疗K+/M-肺癌的联合药物，其特征在于，所述的TGF-β受体的抑制剂，维甲酸受体和曲美替尼按照质量比1：1：1组成。
进一步的，上述的用于治疗K+/M-肺癌的联合药物，其特征在于，所述的转化生长因子β受体I抑制剂给药剂量1mg/kg/天，视黄酸受体RAR抑制剂给药剂量1mg/kg/天和曲美替尼给药剂量1mg/kg/天。
进一步的，上述的用于治疗K+/M-肺癌的联合药物，其特征在于，所述的肺癌为MYOCD基因功能缺失或下调的肺癌。
进一步的，上述的用于治疗K+/M-肺癌的联合药物，其特征在于，所述的肺癌包括原位癌和转移癌。
本发明研究发现MYOCD的缺失可以导致KRAS突变的细胞A549干性增强，并且TGFB信号通路在MYOCD功能缺失的KRAS突变的肺癌细胞A549中异常激活。TGFB信号通路在肺癌的干性以及恶性转化中起非常重要的作用，因此，抑制TGFB信号可有效阻止肺癌细胞干性以及恶性转化。这些提示TGFB信号通路以及肺癌的干细胞的特性是MYOCD表达下调所引起的肺癌治疗的潜在靶点。因此，申请人了构建MYOCD表达缺失的KRAS突变的肺癌细胞系(K+M-)、小鼠移植瘤以及KRAS-G12D&MYOCD-KO小鼠原发肺癌的模型(K+M-)，用来模拟K+/M-肺癌病人，然后利用这些模型评价肿瘤干细胞抑制剂WYC209,转化生长因子β1受体(ALK5)抑制剂SB525334以及Trametinib单药，两两联合以及三药联合对携带KRAS突变同时MYOCD表达缺失的此类肺癌进行治疗。
在体外细胞实验中发现，WYC209,SB525334和Trametinib处理K+M-的肺癌细胞A549时，对K+M-的肺癌细胞的干性没有任何影响；当联合WYC209和SB525334，WYC209和Trametinib或者SB525334和Trametinib对K+M-的肺癌细胞处理时，有轻微的治疗效果；当联合WYC209,SB525334和Trametinib时，可以完全抑制K+M-的肺癌细胞的干性。同样的，在小动物模型中，包括小鼠的肺癌移植瘤模型以及原发瘤模型，我们也发现了更高剂量的单药治疗，或者联合WYC209和SB525334，WYC209和Trametinib或者SB525334和Trametinib对小鼠的肺癌的治疗都非常有限，只能轻微的抑制肺癌的增长；当联合WYC209,SB525334和Trametinib这三种药物时，小鼠的肺癌肿瘤几乎全部消退，包括，小鼠的移植瘤模型以及原发瘤模型。WYC209,SB525334和Trametinib三种药物的联合治疗达到了治愈K+M-这一类肺癌的目的。
附图说明
图1是MYOCD缺失KRAS-G12D突变的肺癌细胞模型的构建及MYOCD的缺失对KRAS-G12D突变肺癌细胞干性的影响；
其中，A：构建MYOCD缺失KRAS-G12D突变的(K+M-)的肺癌细胞系；A549细胞中MYOCD敲低效果的蛋白免疫印迹评价图；B:MYOCD的缺失增强KRAS-G12D的肺癌细胞的干性；在没敲低和敲低MYOCD的细胞中，K+M-肺癌细胞的干性的变化；C:在没敲低和敲低MYOCD的细胞中，克隆球的统计图；
图2是MYOCD缺失KRAS-G12D突变的的肺癌细胞A549对SB525334敏感性的评价图；
其中，A为SB525334对未敲低MYOCD和敲低MYOCD后KRAS突变细胞A549克隆球的抑制程度图；B为克隆球的统计图；
图3是MYOCD缺失KRAS-G12D突变的的肺癌细胞A549对WYC209敏感性的评价图；
其中，A为WYC209对未敲低MYOCD和敲低MYOCD后KRAS突变细胞A549克隆球的抑制程度图；B为克隆球的统计图；
图4是MYOCD缺失KRAS-G12D突变的的肺癌细胞A549对Trametinib敏感性的评价图；其中，A为Trametinib对未敲低MYOCD和敲低MYOCD后KRAS突变细胞A549克隆球的抑制程度图；B为克隆球的统计图；
图5是MYOCD缺失KRAS-G12D突变的的肺癌细胞A549对联合SB525334和WYC209敏感性的评价图；
其中，A为SB525334和WYC209对未敲低MYOCD和敲低MYOCD后KRAS突变细胞A549克隆球的抑制程度图；B为克隆球的统计图；
图6是MYOCD缺失KRAS-G12D突变的的肺癌细胞A549对联合SB525334和Trametinib敏感性的评价图；
其中，A为SB525334和Trametinib对未敲低MYOCD和敲低MYOCD后KRAS突变细胞A549克隆球的抑制程度图；B为克隆球的统计图；
图7是MYOCD缺失KRAS-G12D突变的的肺癌细胞A549对联合WYC209和Trametinib敏感性的评价图；
其中，A为WYC209和Trametinib对未敲低MYOCD和敲低MYOCD后KRAS突变细胞A549克隆球的抑制程度图；B为克隆球的统计图；
图8是WYC209，SB525334和Trametinib对MYOCD缺失KRAS-G12D突变的的肺癌细胞A549干性抑制的协同评价图；
其中，A为联合WYC209，SB525334和Trametinib对未敲低MYOCD和敲低MYOCD后KRAS突变细胞A549克隆球的抑制程度图；B为克隆球的统计图；
图9是SB525334对裸鼠皮下移植瘤中对肿瘤的生长抑制的评价图；
其中，A为SB525334治疗小鼠两周后，取出肿瘤的大小对比图；B为肿瘤重量统计图；
图10是Trametinib对裸鼠皮下移植瘤中对肿瘤的生长抑制的评价图；
其中，A为Trametinib治疗小鼠两周后，取出肿瘤的大小对比图；B为肿瘤重量统计图；
图11是WYC209对裸鼠皮下移植瘤中对肿瘤的生长抑制的评价图；其中，A为WYC209治疗小鼠两周后，取出肿瘤的大小对比图；B为肿瘤重量统计图；
图12是联合SB525334和Trametinib对裸鼠皮下移植瘤中对肿瘤的生长抑制的评价图；其中，A为联合SB525334和Trametinib治疗小鼠两周后，取出肿瘤的大小对比图；B为肿瘤重量统计图；
图13是联合WYC209和Trametinib对裸鼠皮下移植瘤中对肿瘤的生长抑制的评价图；
其中，A为联合WYC209和Trametinib治疗小鼠两周后，取出肿瘤的大小对比图；B为肿瘤重量统计图；
图14是联合SB525334和WYC209对裸鼠皮下移植瘤中对肿瘤的生长抑制的评价图；
其中，A为联合SB525334和WYC209治疗小鼠两周后，取出肿瘤的大小对比图；B为肿瘤重量统计图；
图15是联合SB525334，WYC209和低剂量的Trametinib对裸鼠皮下移植瘤中对肿瘤的生长抑制的协同作用评价图；
其中，A为联合联合SB525334，WYC209和Trametinib治疗小鼠两周后，取出肿瘤的大小对比图；B为肿瘤重量统计图；
图16是联合SB525334，WYC209和Trametinib对裸鼠皮下移植瘤中对肿瘤的生长抑制的协同作用评价图；
其中，A为联合联合SB525334，WYC209和Trametinib治疗小鼠两周后，取出肿瘤的大小对比图；B为肿瘤重量统计图；
图17是LSL-KRASG12D转基因小鼠模型中评价MYOCD缺失对肺癌进展以及所示药物协同治疗对肺癌原发瘤抑制的效果图；
其中，A和B为小鼠治疗前后的肺部CT图以及肺组织中肿瘤相对浸润面积统计图；C和D为药物治疗两周后肺部组织的石蜡切片HE染色(苏木精-伊红染色)以及平均肿瘤个数和相对肿瘤面积统计图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中SB525334是TGF-β受体的抑制剂；WYC209是视黄酸受体(RAR)激动剂，能有效抑制肿瘤细胞的干性；Trametinib是MEK1/2的抑制剂。
实施例1
MYOCD缺失KRAS-G12D突变的肺癌细胞模型的构建及MYOCD的缺失对KRAS-G12D突变肺癌细胞干性的影响。
一、实验方法
(A)A549细胞中构建MYOCD可诱导敲低的细胞系：A549细胞是带有KRAS-G12D突变的。首先将表达载体pLKO.1-teton-shMYOCD1(MYOCD-shRNA序列:GACTTGGTTAATATGCACAT)与慢病毒骨架载体psPAX和PM2.G共转293T细胞进行慢病毒包装。收集293T细胞产生的病毒感染A549细胞，然后用1μg/mL的Puromycin(MCE,HY-B1743A)进行筛选，一个星期后，将细胞传代到六孔板里，加或者不加四环素(Dox:1μg/mL)处理48小时，收细胞。收取的细胞用RIPA裂解液(碧云天)在冰上裂解30分钟后，加入5XSDSloading缓冲液，95℃煮样10分钟，12000g离心10分钟,取上清用于聚丙烯酰胺凝胶电泳(10％聚丙烯酰胺凝胶)。随后，经过转模，孵育一抗和二抗以及显影的步骤来评价MYOCD在细胞株A549中的敲低效果。这样，构建成的A549细胞就模拟了K+/M-肺癌病人的癌细胞，参阅图1A。
(B)Sphere细胞成球实验评价MYOCD敲低后，对肺癌干性及恶性程度的影响的评价。
分别将1000个细胞/孔接种于低吸附的6孔板(CORNING,3471)中，用无血清DMEM/F12培养基(Gibco,11330-032，含20μL/mLB27(ThermoFisher,17504044),20ng/mLbasicFGF(Pepro tech,AF-100-18B-100ug)和20ng/mLEGF(ThermoFisher,PHG0311)进行培养，同时加或不加四环素(Dox:1μg/mL)诱导，14天后，对细胞进行拍照，参阅图1B。
(C)对上述的细胞形成的克隆球进行统计和分析，参阅图1C。
二、实验结果及分析
蛋白印迹方法显示，与对照组相比，四环素Dox能成功诱导敲低A549细胞中MYOCD的表达。在检测细胞干性的成球实验中，Dox诱导的MYOCD敲低使A549肺癌细胞的干性能力显著增强。这样我们就成功构建模拟K+/M-肺癌病人的癌细胞模型，MYOCD的缺失增强KRAS-G12D突变的肺癌细胞的干性。
实施例2
SB525334对MYOCD缺失KRAS突变的肺癌细胞抑制性的研究。
一、实验方法
(A)Sphere细胞成球实验评价MYOCD缺失后，KRAS-G12D突变的细胞对SB525334的敏感性：分别将500个细胞/孔接种于低吸附的6孔板(CORNING,3471)中，用无血清DMEM/F12培养基(Gibco,11330-032)，含20μL/mLB27(ThermoFisher,17504044),20ng/mLbasicFGF(Peprotech,AF-100-18B-100ug)和20ng/mLEGF(ThermoFisher,PHG0311)进行培养，同时加或不加四环素(Dox:1μg/mL)处理3天后，分别用DMSO或者SB525334(1μM)处理，10天后对细胞进行拍照，参阅图2A。
(B)对上述的细胞形成的克隆球进行统计,对SB425334的药物作用进行评价和分析，参阅图2B。
二、实验结果及分析
在检测细胞干性的成球实验中，DOX诱导的MYOCD敲低，使A549肺癌细胞的干性能力显著增强，而SB525334单独处理对MYOCD下调的A549肺癌细胞的干性能力没有任何影响。
实施例3
WYC209对MYOCD缺失KRAS突变的肺癌细胞抑制性的研究。
一、实验方法
实验方法参照实施案例2，不同的是在于用同剂量的WYC209代替SB525334，参阅图3。
二、实验结果及分析
在检测细胞干性的成球实验中，DOX诱导的MYOCD敲低，使A549肺癌细胞的干性能力显著增强，而WYC209单独处理对MYOCD下调的A549肺癌细胞的干性能力没有任何影响。
实施例4
Trametinib对MYOCD缺失KRAS突变的肺癌细胞抑制性的研究。
一、实验方法
实验方法参照实施案例2.用于处理MYOCD缺失KRAS突变的肺癌细胞的曲美替尼Trametinib的浓度为0.2μM，参阅图4。
二、实验结果及分析
在检测细胞干性的成球实验中，DOX诱导的MYOCD敲低，使A549肺癌细胞的干性能力显著增强，而Trametinib单独处理，可以轻微的抑制MYOCD下调的A549肺癌细胞的干性。
实施例5
联合使用SB525334和WYC209对MYOCD缺失KRAS突变的肺癌细胞抑制性的研究。
一、实验方法
(A)Sphere细胞成球实验评价MYOCD缺失后，KRAS-G12D突变的细胞对联合使用SB525334和WYC209的敏感性：分别将500个细胞/孔接种于低吸附的6孔板(CORNING,3471)中，用无血清DMEM/F12培养基(Gibco,11330-032)，含20μL/mLB27(ThermoFisher,17504044),20ng/mLb asicFGF(Peprotech,AF-100-18B-100ug)和20ng/mLEGF(ThermoFisher,PHG0311)进行培养，同时加或不加四环素(Dox:1μg/mL)处理3天后，分别用DMSO处理或者联合SB525334(1μM)以及WYC209(1μM)共同处理，10天后对细胞进行拍照，参阅图5A。
(B)对上述的细胞形成的克隆球进行统计,对联合使用SB525334和WYC209的药物作用进行评价和分析，参阅图5B。
二、实验结果及分析
在检测细胞干性的成球实验中，DOX诱导的MYOCD敲低，使A549肺癌细胞的干性能力显著增强，而联合SB525334以及WYC209处理，可以轻微的抑制MYOCD下调的A549肺癌细胞的干性。
实施例6
联合使用SB525334和Trametinib对MYOCD缺失KRAS突变的肺癌细胞抑制性的研究。
一、实验方法
实验方法参照实施案例5。用于联合治疗，处理MYOCD缺失KRAS突变的肺癌细胞的Trametinib的浓度为0.2μM，参阅图6。
二、实验结果及分析
在检测细胞干性的成球实验中，DOX诱导的MYOCD敲低，使A549肺癌细胞的干性能力显著增强，而联合SB525334以及Trametinib处理，可以轻微的抑制MYOCD下调的A549肺癌细胞的干性。
实施例7
联合使用WYC209和Trametinib对MYOCD缺失KRAS突变的肺癌细胞抑制性的研究。
一、实验方法
实验方法参照实施案例5。用于联合治疗，处理MYOCD缺失KRAS突变的肺癌细胞的Trametinib的浓度为0.2μM，参阅图7。
二、实验结果及分析
在检测细胞干性的成球实验中，DOX诱导的MYOCD敲低，使A549肺癌细胞的干性能力显著增强，而联合WYC209和Trametinib处理，可以轻微的抑制MYOCD下调的A549肺癌细胞的干性。
实施例8
联合使用SB525334，WYC209和Trametinib对MYOCD缺失KRAS突变的肺癌细胞抑制性的研究。
一、实验方法
(A)Sphere细胞成球实验评价MYOCD缺失后，KRAS-G12D突变的细胞对联合使用SB525334和WYC209的敏感性：分别将500个细胞/孔接种于低吸附的6孔板(CORNING,3471)中，用无血清DMEM/F12培养基(Gibco,11330-032)，含20μL/mLB27(ThermoFisher,17504044),20ng/mLb asicFGF(Peprotech,AF-100-18B-100ug)和20ng/mLEGF(ThermoFisher,PHG0311)进行培养，同时加或不加四环素(Dox:1μg/mL)处理3天后，分别用DMSO处理或者联合SB525334(1μM)，WYC209(1μM)以及Trametinib(0.2μM)共同处理，10天后对细胞进行拍照，参阅图8A。
(B)对上述的细胞形成的克隆球进行统计,对联合SB525334(1μM)，WYC209(1μM)以及Trametinib(0.2μM)的药物作用进行评价和分析，参阅图8B。
二、实验结果及分析
在检测细胞干性的成球实验中，DOX诱导的MYOCD敲低，使A549肺癌细胞的干性能力显著增强，而联合SB525334(1μM)，WYC209(1μM)以及Trametinib(0.2μM)处理，几乎可以完全的抑制MYOCD下调的A549肺癌细胞的干性。
实施例9
SB525334对MYOCD缺失KRAS-G12D突变肺癌细胞皮下移植瘤的生长抑制的研究。
一、实验方法
(A)将MYOCD由Dox可诱导敲低的肺癌细胞A549-teton-shMYOCD(用以模拟K+/M-肺癌病人的肺癌细胞)重悬于PBS和Matrigel基质胶(CORNING,356237)为1:1比例的混合液中，使得每100μL混合液中含有2×106个细胞。将上述细胞和基质混合物接种到BALB/nude裸鼠的右侧腰背部皮下，每个接种点注射100μL含有细胞的基质胶混合液。裸鼠接种肿瘤细胞6天左右，待肿瘤固定后，将裸鼠随机分组，分别为空白组(给予普通粮食饲养，采用生理盐水进行治疗)；vehicle组(给予Dox粮食饲养，采用生理盐水进行治疗)；SB525334处理组(给予Dox粮食饲养，采用SB525334治疗)。每天进行灌胃给药，SB525334的给药剂量均为2.5mg/kg/天。治疗2周后对裸鼠进行安乐死，解剖肿瘤，进行拍照，参阅图9A。
(B)将上面解剖的肿瘤进行称量，并对肿瘤重量进行统计，对SB525334药物的疗效进行评价，参阅图9B。
二、实验结果及分析
与空白对照组相比，Dox诱导MYOCD1敲低的A549肺癌细胞的移植瘤生长速度更快，肿瘤体积更大。而与vehicle组(即Dox粮食饲养，生理盐水处理组)相比，SB525334单药治疗对肿瘤的生长有部分抑制作用。
实施例10
Trametinib对MYOCD缺失KRAS突变肺癌细胞皮下移植瘤的生长抑制的研究。
一、实验方法
实验方法参照实施案例9。每天进行灌胃给药，Trametinib的给药剂量均为2.5mg/kg/天，参阅图10。
二、实验结果及分析
与空白对照组相比，Dox诱导MYOCD1敲低的A549肺癌细胞的移植瘤生长速℃更快，肿瘤体积更大。而与vehicle组(即Dox粮食饲养，生理盐水处理组)相比，Trametinib单药治疗对肿瘤的生长有部分抑制作用。
实施例11
WYC209对MYOCD缺失KRAS突变肺癌细胞皮下移植瘤的生长抑制的研究。
一、实验方法
实验方法参照实施案例9。每天进行灌胃给药，WYC209的给药剂量均为2.5mg/kg/天，参阅图11。
二、实验结果及分析
与空白对照组相比，Dox诱导MYOCD1敲低的A549肺癌细胞的移植瘤生长速度更快，肿瘤体积更大。而与vehicle组(即Dox粮食饲养，生理盐水处理组)相比，WYC209单药治疗对肿瘤的生长有部分抑制作用。
实施例12
联合使用SB525334和Trametinib对MYOCD缺失KRAS突变肺癌细胞皮下移植瘤的生长抑制的研究。
一、实验方法
(A)将MYOCD由Dox可诱导敲低的肺癌细胞A549-teton-shMYOCD(用以模拟K+/M-肺癌病人的肺癌细胞)重悬于PBS和Matrigel基质胶(CORNING,356237)为1:1比例的混合液中，使得每100μL混合液中含有2×106个细胞。将上述细胞和基质混合物接种到BALB/cnude裸鼠的右侧腰背部皮下，每个接种点注射100μL含有细胞的基质胶混合液。裸鼠接种肿瘤细胞6天左右，待肿瘤固定后，将裸鼠随机分组，分别为空白组(给予普通粮食饲养，采用生理盐水进行治疗)；vehicle组(给予Dox粮食饲养，采用生理盐水进行治疗)；联合使用SB525334和Trametinib处理组(给予Dox粮食饲养，采用SB525334治疗)。每天进行灌胃给药，SB525334的给药剂量均为1mg/kg/天,Trametinib的给药剂量均为1mg/kg/天。治疗2周后对裸鼠进行安乐死，解剖肿瘤，进行拍照，参阅图12A。
(B)将上面解剖的肿瘤进行称量，并对肿瘤重量进行统计，对联合使用SB525334和Trametinib药物的疗效进行评价，参阅图12B。
二、实验结果及分析
与空白对照组相比，Dox诱导MYOCD1敲低的A549肺癌细胞的移植瘤生长速度更快，肿瘤体积更大。而与vehicle组(即Dox粮食饲养，生理盐水处理组)相比，联合使用SB525334和Trametinib治疗对肿瘤的生长有部分抑制作用。
实施例13
联合使用WYC209和Trametinib对MYOCD缺失KRAS突变肺癌细胞皮下移植瘤的生长抑制的研究。
一、实验方法
实验方法参照实施案例9。每天进行灌胃给药，WYC209的给药剂量均为1mg/kg/天,Trametinib的给药剂量均为1mg/kg/天，参阅图13。
二、实验结果及分析
与空白对照组相比，Dox诱导MYOCD1敲低的A549肺癌细胞的移植瘤生长速度更快，肿瘤体积更大。而与vehicle组(即Dox粮食饲养，生理盐水处理组)相比，联合使用WYC209和Trametinib治疗对肿瘤的生长有部分抑制作用。
实施例14
联合使用SB525334和WYC209对MYOCD缺失KRAS突变肺癌细胞皮下移植瘤的生长抑制的研究。
一、实验方法
实验方法参照实施案例9。每天进行灌胃给药，WYC209的给药剂量均为1mg/kg/天,SB525334的给药剂量均为1mg/kg/天，参阅图14。
二、实验结果及分析
与空白对照组相比，Dox诱导MYOCD1敲低的A549肺癌细胞的移植瘤生长速度更快，肿瘤体积更大。而与vehicle组(即Dox粮食饲养，生理盐水处理组)相比，联合使用SB525334和WYC209治疗对肿瘤的生长有部分抑制作用。
实施例15
SB525334，WYC209和低剂量Trametinib对MYOCD缺失KRAS突变肺癌细胞皮下移植瘤的生长抑制的研究。
一、实验方法
(A)将MYOCD由Dox可诱导敲低的肺癌细胞A549-teton-shMYOCD(用以模拟K+/M-肺癌病人的肺癌细胞)重悬于PBS和Matrigel基质胶(CORNING,356237)为1:1比例的混合液中，使得每100μL混合液中含有2×106个细胞。将上述细胞和基质混合物接种到BALB/cnude裸鼠的右侧腰背部皮下，每个接种点注射100μL含有细胞的基质胶混合液。裸鼠接种肿瘤细胞6天左右，待肿瘤固定后，将裸鼠随机分组，分别为空白组(给予普通粮食饲养，采用生理盐水进行治疗)；vehicle组(给予Dox粮食饲养，采用生理盐水进行治疗)；联合使用SB525334，WYC209和Trametinib处理组(给予Dox粮食饲养，采用SB525334，WYC209和Trametinib联合治疗)。每天进行灌胃给药，WYC209的给药剂量均为1mg/kg/天,SB525334的给药剂量均为1mg/kg/天,Trametinib的给药剂量均为0.2mg/kg/天。治疗2周后对裸鼠进行安乐死，解剖肿瘤，进行拍照，参阅图15A。
(B)将上面解剖的肿瘤进行称量，并对肿瘤重量进行统计，对联合使用SB525334，WYC209和低剂量Trametinib的药物疗效进行评价，参阅图15B。
二、实验结果及分析
与空白对照组相比，Dox诱导MYOCD1敲低的A549肺癌细胞的移植瘤生长速度更快，肿瘤体积更大。而与vehicle组(即Dox粮食饲养，生理盐水处理组)相比，当SB525334，WYC209，Trametinib三个药用药比列按照5:5:1进行联合治疗时，可发现肿瘤的生长受到抑制，但是对K+M-小鼠皮下移植瘤治疗效果并不理想。
实施例16
SB525334，WYC209和Trametinib对MYOCD缺失KRAS突变肺癌细胞皮下移植瘤的生长抑制的研究。
一、实验方法
(A)将MYOCD由Dox可诱导敲低的肺癌细胞A549-teton-shMYOCD(用以模拟K+/M-肺癌病人的肺癌细胞)重悬于PBS和Matrigel基质胶(CORNING,356237)为1:1比例的混合液中，使得每100μL混合液中含有2×106个细胞。将上述细胞和基质混合物接种到BALB/cnude裸鼠的右侧腰背部皮下，每个接种点注射100μL含有细胞的基质胶混合液。裸鼠接种肿瘤细胞6天左右，待肿瘤固定后，将裸鼠随机分组，分别为空白组(给予普通粮食饲养，采用生理盐水进行治疗)；vehicle组(给予Dox粮食饲养，采用生理盐水进行治疗)；联合使用SB525334，WYC209和Trametinib处理组(给予Dox粮食饲养，采用SB525334，WYC209和Trametinib联合治疗)。每天进行灌胃给药，WYC209的给药剂量均为1mg/kg/天,SB525334的给药剂量均为1mg/kg/天,Trametinib的给药剂量均为1mg/kg/天。治疗2周后对裸鼠进行安乐死，解剖肿瘤，进行拍照，参阅图16A。
(B)将上面解剖的肿瘤进行称量，并对肿瘤重量进行统计，对联合使用SB525334，WYC209和Trametinib的药物疗效进行评价，参阅图16B。
二、实验结果及分析
与空白对照组相比，Dox诱导MYOCD1敲低的A549肺癌细胞的移植瘤生长速度更快，肿瘤体积更大。而与vehicle组(即Dox粮食饲养，生理盐水处理组)相比，当SB525334，WYC209，Trametinib三个药用药比列按照1:1:1进行联合治疗时，可发现肿瘤的生长受到非常显著地抑制，并且肿瘤体积显著缩小，达到了治疗该类K+M-小鼠皮下移植瘤的目的。
实施例17
SB525334，WYC209和Trametinib三药联合能有效治疗KRAS-G12D突变且伴随MYOCD缺失的原位瘤。
小鼠的移植瘤模型在评价药物的治疗效果上，可以方便的观察肿瘤的生长，监测肿瘤的大小，小鼠的移植瘤模型，体系单一，能清晰的说明问题。但是，小鼠的移植瘤模型，不能很好的模拟肺癌复杂的发病、癌变以及恶化等过程。因此，对预测药物在病人体内的治疗能力较差。为此，本发明进一步
本发明进一步利用了LSL-KRASG12D转基因小鼠的肺癌原发瘤模型来评价SB525334，WYC209，Trametinib三药联合对MYOCD缺失的肺癌原位瘤的治疗效果。
一、实验方法
(A)1.病毒包装：分别将表达载体pSECC-sgTD(敲低TdTomato作为对照)和pSECC-sg MYOCD(sgRNA序列:ATGGATTCTTCCGTGAAAGA)与慢病毒骨架载体psPAX和PM2.G共转293T细胞(30个10cm大皿)，转染24小时后，更换新鲜的培养基。再过24小时，收取细胞上清，1500rpm离心5分钟，去掉细胞碎片等，然后吸取上清，用0.45μm的滤网进行过滤。将过滤后的上清进行进行超速离心(20000g,离心2小时)，浓缩病毒。
2.选择8周左右的LSL-KRASG12D的小鼠，分别将pSECC-sgTD(对照)和pSECC-sgMYOCD的病毒(病毒中含有Cre、Cas9、sgTD或sgMYOCD元件)通过经鼻腔滴注，使病毒进入到小鼠肺部，这能够将肺上皮细胞中的KRASG12D激活，同时敲除掉细胞中的MYOCD基因，从而模拟K+/M-肺癌病人的肿瘤发生。
3.计算机断层扫描(ComputerTomography,CT)记录肿瘤的大小及严重程度。
4.分别将pSECC-sgTD(对照)和pSECC-sgMYOCD1病毒感染后得肺癌的小鼠随机分成三组。分别为vehicle组(生理盐水进行治疗)；SB525334+WYC209组(SB525334和WYC209进行联合治疗)、三药联合组(SB525334，WYC209，Trametinib三药进行联合治疗)，进行为期两周的治疗，每天进行灌胃给药，SB525334，WYC209，trametinib的给药剂量均为1mg/kg/天。治疗后CT检测记录肿瘤大小变化情况，参阅图17A。
(B)对上面CT扫描小鼠肺部的阴影部分(肿瘤)进行数字化统计及分析(ImageJ软件)，对不治疗组，联合使用WYC209和SB525334以及联合使用WYC209和SB525334和Trametinib药物的疗效进行评价，参阅图17B。
(C)1.解剖上述治疗后的小鼠的肺部，将收集的小鼠肺组织浸泡入10％的福尔马林固定液中，置于摇床上固定24小时后，取出固定的肺组织，浸泡于自来水中大约30分钟后，依次放入配置好70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇中，每次30分钟。然后，将肺组织置于无水乙醇：二甲苯(1:1)Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ，每次15分钟，最后将肺组织放入石蜡Ⅰ(1小时)、石蜡Ⅱ(1小时)后，取出肺组织，等候组织块固定。2.利用冷冻切片机将上组固定好的石蜡组织块，切片3-5微米，放入烘箱烘干(60度，1小时)。首先对组织片进行脱蜡：二甲苯Ⅰ(5分钟)，二甲苯Ⅱ(5分钟)；其次，对组织片进行复水：无水乙醇Ⅰ(1分钟)，无水乙醇Ⅱ(1分钟)，90％乙醇(1分钟)，80％乙醇(1分钟)，70％乙醇(1分钟)，自来水浸泡(1分钟)；然后，对组织片进行染色：苏木素染色(8分钟)，自来水冲洗(1分钟)，1％盐酸酒精涮洗2-3次，自来水冲洗1分钟、1％氨水涮洗两次、自来水冲洗1分钟、伊红染色2分钟、自来水冲洗1分钟。然后，将组织篇一次放入75％乙醇，85％乙醇，95％乙醇，无水乙醇，各洗2次，再放入无水乙醇脱水2分钟。最后，对组织片进行透明处理：二甲苯Ⅰ1分钟，二甲苯Ⅱ1分钟后，用中性树胶进行封片，静置待树胶自然风干即可显微镜进行病理学观察，参阅图17C。
(D)对上面显微镜拍照后的组织切片，进行数字化统计及分析(ImageJ软件)，对不治疗组，联合使用WYC209和SB525334以及联合使用WYC209和SB525334和Trametinib药物的疗效进行评价，参阅图17D。
二、实验结果及分析
经过两周的治疗，用CT扫描不同治疗组小鼠肺部肿瘤情况，结果发现，与生理盐水治疗的对照组小鼠(肿瘤面积增加了约60％)相比，SB525334和WYC209进行联合治疗可部分抑制肿瘤的进展(sgTD对照病毒感染的肺癌小鼠肿瘤面积增加了约30％，sgMYOCD病毒感染的肺癌小鼠肿瘤面积增加约15％)，而SB525334，WYC209，Trametinib三个药进行联合治疗能进一步使肺部肿瘤发生消退(sgTD对照病毒感染的肺癌小鼠肿瘤面积减少约30％，sgMYOCD病毒感染的肺癌小鼠肿瘤面积减少约75％)。所以原位瘤模型的治疗效果进一步说明了SB525334，WYC209，Trametinib三药联合对MYOCD1缺失的肺癌原位瘤有更显著治疗效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.用于治疗KRAS突变且同时具有MYOCD功能缺失肺癌的联合药物，其特征在于，主要由转化生长因子β受体I抑制剂、视黄酸受体RAR抑制剂和曲美替尼组成；所述的转化生长因子β受体I抑制剂为SB525334；视黄酸受体RAR抑制剂为WYC209。
2.根据权利要求1所述的用于治疗KRAS突变且同时具有MYOCD功能缺失肺癌的联合药物，其特征在于，所述的转化生长因子β受体I抑制剂、视黄酸受体RAR抑制剂和曲美替尼按照质量比1：1：1组成。
3.根据权利要求1所述的用于治疗KRAS突变且同时具有MYOCD功能缺失肺癌的联合药物，其特征在于，所述的转化生长因子β受体抑制剂、视黄酸受体RAR抑制剂以及曲美替尼给药剂量均为1mg/kg/天。
4.根据权利要求1所述用于治疗KRAS突变且同时具有MYOCD功能缺失肺癌的联合药物，其特征在于，所述的肺癌为MYOCD基因功能缺失或下调的肺癌。
5.根据权利要求1所述的用于治疗KRAS突变且同时具有MYOCD功能缺失肺癌的联合药物，其特征在于，所述的肺癌包括原位癌和转移癌。
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