CN113063948A - Hmgb1在评估非小细胞肺癌病情和临床疗效方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于评估非小细胞肺癌病情和临床疗效的生物学标志物，所述生物学标志物为高迁移率族蛋白B1(HMGB1)。还公开了一种用于评估非小细胞肺癌病情和临床疗效的试剂盒及其使用方法，包括枸橼酸钠抗凝管、Trizol^TM试剂、逆转录试剂盒、HMGB1正向及反向引物、GAPDH正向及反向引物、裂解缓冲液、聚丙烯酰胺凝胶、PVDF膜、脱脂奶粉、兔抗人HMGB1单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、人HMGB1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、样品稀释液、POD‑溶剂、底物溶液、终止液。本发明发现HMGB1在非小细胞肺癌(NSCLC)进展过程中起重要作用，在NSCLC的诊断、病情和疗效的评估中有应用前景。

Description

HMGB1在评估非小细胞肺癌病情和临床疗效方面的应用

技术领域

本发明属于生物医疗领域，具体涉及HMGB1在评估非小细胞肺癌病情和临床疗效方面的应用。

背景技术

肺癌是严重威胁人类生存的主要恶性肿瘤之一。全球范围内，肺癌发病率与死亡率在男性人群中均处于各种恶性肿瘤的首位；女性人群中，肺癌的发病率位居第四，而死亡率高居第二。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌病例的85％，NSCLC主要包括腺癌和鳞状细胞癌两种组织学类型。尽管有多种治疗手段，如手术、化学疗法和靶向疗法等，但NSCLC患者的5年生存率仅为15％。NSCLC的高死亡率部分原因是肿瘤细胞的侵袭和转移，另一部分原因是缺乏有效的早期检测及评估预后的手段。因此，鉴定新的肿瘤生物标记物在NSCLC的临床诊断、病情评估及预后评估过程中显得尤为重要。

高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)是一种非组蛋白染色质结合蛋白，在真核细胞中广泛存在，其蛋白结构包含两个同源的DNA结合结构域(A和B盒)和一个C末端。细胞核内的HMGB1可以参与基因转录、DNA复制和基因表达调节，而释放到细胞外的HMGB1在炎症和肿瘤发生发展过程中起重要作用。研究表明，HMGB1在多种恶性肿瘤组织中高表达，与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移关系非常密切。近年来关于HMGB1在NSCLC中表达的研究仍存在争议。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在问题或不足，本发明提供HMGB1在评估非小细胞肺癌病情和临床疗效方面的应用。

为实现上述发明目的，本发明的实施例提供一种用于评估非小细胞肺癌病情和临床疗效的生物学标志物，其特征在于，所述生物学标志物为HMGB1。

本发明的实施例还提供一种用于评估非小细胞肺癌病情和临床疗效的试剂盒，其特征在于，包括用于采集血浆的3.2％枸橼酸钠抗凝管、用于实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测的Trizol^TM试剂、逆转录试剂盒、HMGB1正向及反向引物、GAPDH正向及反向引物、用于Western blot方法检测的含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液、10％聚丙烯酰胺凝胶、PVDF膜、5％脱脂奶粉、兔抗人HMGB1单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、用于酶联免疫吸附试验的人HMGB1 ELISA试剂盒、样品稀释液、POD-溶剂、底物溶液、终止液。

优选的，所述底物溶液包括A液和B液。

本发明的实施例另外还提供一种使用试剂盒进行非小细胞肺癌病情和临床疗效的评估方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)组织和血浆标本收集；(2)qRT-PCR方法检测肺癌组织和癌旁组织的HMGB1 mRNA水平；(3)Western blot方法检测肺癌组织和癌旁组织的HMGB1蛋白水平：(4)ELISA方法检测血浆HMGB1水平。

优选的，所述步骤(1)组织和血浆标本收集，具体包括以下过程：

(1-1)NSCLC患者手术后，收集肺癌肿瘤组织和癌旁组织距离癌组织边缘5cm，且病理证实为正常肺组织；-80℃保存；

(1-2)采集肘静脉血3mL，置于3.2％枸橼酸钠抗凝管内，混匀后4℃，2500g离心10分钟；保留血浆，-80℃保存。

优选的，所述步骤(2)实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测HMGB1 mRNA水平，具体包括以下过程：

(2-1)Trizol^TM试剂提取肺癌组织和癌旁组织的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书操作；将2μg总RNA逆转录为cDNA；

HMGB1引物正向序列：5’-TCAAAGGAGAACATCCTGGCCTGT-3’；

HMGB1引物反向序列：5’-CTGCTTGTCATCTGCAGCAGTGTT-3’；

GAPDH引物正向序列：5’-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’；

GAPDH引物反向序列：5’-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3’；

(2-2)SYBR Green混合液5μL、cDNA 0.5μL、HMGB1正向及反向引物各0.2μL、GAPDH正向及反向引物各0.2μL和4.1μL不含核酸酶的水组成总体积10μL的聚合酶链式反应；反应条件为：95℃10min一次循环初始变性，95℃15s变性40次循环，60℃30s退火，72℃30s延伸；GAPDH作为内参，2^-ΔΔCT方法计算基因表达水平；HMGB1/GAPDH比值表示HMGB1mRNA的相对表达量。

优选的，所述步骤(3)Western blot方法检测HMGB1蛋白水平，具体包括以下过程：

(3-1)肺癌组织和癌旁组织在含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中4℃裂解30分钟，12000g离心10min；

(3-2)10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离10μg总蛋白，在恒电流200mA下，转膜120min；

(3-3)PVDF膜用5％脱脂奶粉室温封闭1小时，兔抗人HMGB1单克隆抗体(1:10000)，4℃摇床过夜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(1:10000)，室温摇床孵育1h；

(3-4)采用增强的化学发光法进行检测；GAPDH作为内参，ImageJ图像软件分析，HMGB1/GAPDH比值表示HMGB1蛋白的相对表达量。

优选的，所述步骤(4)ELISA方法检测血浆HMGB1水平，具体包括以下过程：

(4-1)按照人HMGB1 ELISA试剂盒说明书操作，酶标板的每个孔中先加入100μL样品稀释液，再加入标准品和血浆样品10μL，37℃水浴24h；

(4-2)洗涤后每孔加入100μL POD-溶剂，室温2h；

(4-3)洗涤后每孔加入100μL底物溶液，100μL底物溶液包括50μL A液+50μL B液，室温避光孵育30min；

(4-4)加入100μL终止液，多功能酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明发现NSCLC组织中HMGB1表达高于癌旁组织，NSCLC患者血浆HMGB1的水平高于健康人群，术后明显下降，并且患者血浆HMGB1水平与肿瘤大小、临床分期及有无远处转移密切相关。因此，HMGB1在NSCLC进展过程中起重要作用，血浆HMGB1作为一类新型肿瘤生物学标志物，在NSCLC的诊断、病情和疗效的评估中有应用前景。

附图说明

图1为本发明的实施例中癌旁肺组织和肺癌组织中HMGB1 mRNA和蛋白表达水平情况图。图1A为qRT-PCR方法检测癌旁肺组织和肺癌组织中HMGB1 mRNA表达水平图；图1B为Western blot方法检测组织中HMGB1蛋白表达水平图；图1C为对图1B的定量分析图，图中，n＝5，与癌旁肺组织比较，^*P<0.05；^**P<0.01。

图2为本发明的实施例中NSCLC患者血浆HMGB1水平图。图2A为正常对照(n＝30)及NSCLC(n＝50)患者血浆HMGB1水平图，与正常对照组比较，^**P<0.01；图2B为NSCLC患者术前及术后血浆HMGB1水平图，n＝20，与术前比较，^**P<0.01。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

实施例1、检测方法

一、病例来源

本研究选取南通大学附属医院和苏州大学附属第二医院2015年10月至2017年10月收治的NSCLC患者50例，平均年龄64(45-83)，所有患者经病理检查确诊为非小细胞肺癌，未接受过化疗。对照组为正常体检人群30例，平均年龄62(42-79)。该研究得到医院伦理委员会的批准。研究对象在研究之前签署知情同意书。

二、组织和血浆标本收集

NSCLC患者手术后，收集肺癌肿瘤组织和癌旁组织距离癌组织边缘5cm，且病理证实为正常肺组织。-80℃保存。

研究对象空腹12小时，早晨采集肘静脉血3mL，置于3.2％枸橼酸钠抗凝管内(抗凝剂:全血＝1:9)，混匀后4℃，2,500g离心10分钟。保留血浆，-80℃保存。

三、实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测HMGB1 mRNA水平

Trizol^TM试剂提取肺癌组织和癌旁组织的总RNA，按照逆转录试剂盒(Fermentas,CA)说明书操作。将2μg总RNA逆转录为cDNA。HMGB1引物正向序列：5’-TCAAAGGAGAACATCCTGGCCTGT-3’

；反向序列：5’-CTGCTTGTCATCTGCAGCAGTGTT-3’。GAPDH引物正向序列：5’-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’；反向序列：5’-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3’。

SYBR Green混合液(ABI,USA)5μL、cDNA 0.5μL、正向及反向引物各0.2μL和4.1μL不含核酸酶的水组成总体积10μL的聚合酶链式反应。反应条件为：95℃10min一次循环初始变性，95℃15s变性40次循环，60℃30s退火，72℃30s延伸。GAPDH作为内参，2^-ΔΔCT方法计算基因表达水平。HMGB1/GAPDH比值表示HMGB1 mRNA的相对表达量。

四、Western blot方法检测HMGB1蛋白水平

肺癌组织和癌旁组织在裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)中4℃裂解30分钟，12,000g离心10min。10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离10μg总蛋白，在恒电流(200mA)下，转膜120min。PVDF膜用5％脱脂奶粉室温封闭1小时，兔抗人HMGB1单克隆抗体(1:10,000；Abcam,USA)，4℃摇床过夜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(1:10,000；Bioworld,USA)，室温摇床孵育1h。采用增强的化学发光法进行检测。GAPDH作为内参，ImageJ图像软件分析，HMGB1/GAPDH比值表示HMGB1蛋白的相对表达量。

五、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测血浆HMGB1水平

按照人HMGB1 ELISA试剂盒(Shino-Test,Japan)说明书操作。酶标板的每个孔中先加入100μL样品稀释液，再加入标准品和血浆样品10μL，37℃水浴24h。洗涤后每孔加入100μL POD-溶剂，室温2h。洗涤后每孔加入100μL底物溶液(50μL A液+50μL B液)，室温避光孵育30min。加入100μL终止液，多功能酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值。

六、统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。计量数据以平均值±标准差(SD)表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

实施例2、实验结果

一、HMGB1在NSCLC组织中表达增加

qRT-PCR结果显示，NSCLC组织中HMGB1 mRNA的表达水平是癌旁肺组织的2.98倍(如图1A所示)。Western blot结果显示，NSCLC组织中HMGB1蛋白表达水平是癌旁肺组织的1.83倍(如图1B及图1C所示)。

二、NSCLC患者血浆HMGB1水平升高，术后下降

ELISA方法检测血浆HMGB1实验结果：正常对照组血浆HMGB1水平2.27±0.63ng/mL，NSCLC患者血浆HMGB1水平5.86±1.60ng/mL。与正常对照组比较，NSCLC患者血浆HMGB1水平显著升高(P<0.01)(如图2A所示)。

测定20例NSCLC患者术前和术后血浆HMGB1实验结果：NSCLC患者血浆HMGB1水平在手术前为5.67±0.67ng/mL，术后为3.34±0.67ng/mL。与术前比较，NSCLC患者术后血浆HMGB1水平显著降低(P<0.01)(如图2B所示)。

三、血浆HMGB1水平与NSCLC临床特征的关系

NSCLC患者按照年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、临床分期及有无远处转移进一步分组，结果表明，肿瘤直径≥3cm的NSCLC患者血浆HMGB1水平明显高于肿瘤直径＜3cm的患者(P＜0.01)。临床分期Ⅲ-Ⅳ期的NSCLC患者血浆HMGB1水平明显高于Ⅰ-Ⅱ期的患者(P＜0.01)。有远处转移的NSCLC患者血浆HMGB1水平较无远处转移患者明显升高(P＜0.01)。而按照年龄、性别及病理分型分组比较，年龄＜60岁与≥60岁，男与女，腺癌组与鳞癌组的患者血浆HMGB1水平差异无显著性(P＞0.05，见表1)，提示肺癌患者血浆HMGB1水平与肿瘤大小、临床分期及有无转移有密切的关系，但与肺癌患者年龄、性别及病理分型无明显相关性，具体如下表1所示：

表1血浆HMGB1水平与NSCLC患者临床特征的关系

细胞外HMGB1作为一种细胞因子参与炎症和肿瘤发生发展过程中。目前越来越多的研究发现，HMGB1在乳腺癌、胃癌、肝细胞癌等多种类型的恶性肿瘤中表达增加并促进肿瘤的侵袭和转移。然而，由于检测方法，样本量大小及统计方法的不同，关于HMGB1在NSCLC中的表达是否升高，目前的结论不一致。本发明通过qRT-PCR和Western blot方法检测，发现NSCLC肿瘤组织表达的HMGB1 mRNA和HMGB1蛋白水平均较癌旁组织明显升高，这与以往免疫组织化学方法检测NSCLC肿瘤组织HMGB1蛋白表达的结果一致。

HMGB1释放到细胞外有两种可能的机制：激活的免疫细胞主动分泌或者从受损或坏死细胞被动释放并转移到细胞外。在化疗过程中，坏死的肿瘤细胞核内HMGB1被动释放增加。肿瘤细胞也可以在受到内源性或外源性刺激因素作用下主动分泌HMGB1。本发明发现NSCLC患者血浆HMGB1水平与对照组比较明显升高，此外患者肿瘤切除术后血浆HMGB1水平较术前明显降低。这些结果说明NSCLC患者血浆HMGB1的升高可能机制是肿瘤细胞表达和释放HMGB1增加，或者肺癌组织中心区域凋亡或坏死细胞分泌HMGB1增加。当肿瘤细胞分泌HMGB1时，会进一步促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、血管新生和转移。NSCLC患者血浆HMGB1水平升高可以促进病情恶化。检测患者血浆HMGB1水平可作为肺癌筛选和反映病情的指标之一。

本发明将NSCLC患者按照年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、临床分期及有无远处转移进一步分组。进一步分析发现，NSCLC患者血浆HMGB1水平与肿瘤大小、临床分期及有无远处转移有密切关系。随着肿瘤直径增大，临床分期的增加及远处转移的出现，患者血浆HMGB1水平明显升高。对于肺癌术后患者，血浆HMGB1的水平明显下降，结果提示血浆HMGB1的水平可间接反映肺癌患者体内的肿瘤负荷，同时可作为病情评估和临床疗效评估的重要指标。而对NSCLC患者不同病理类型血浆HMGB1水平进行分析发现，腺癌患者和鳞癌患者之间无明显差异，结果提示，血浆HMBG1水平与NSCLC病理类型之间并没有明显相关性，可能是因为释放HMGB1的细胞类型并没有选择性。本实验中患者血浆HMGB1水平与NSCLC临床特征之间的关系与已发现的肺癌组织中HMGB1的表达与临床特征之间的关系类似。

总之，本发明发现NSCLC组织中HMGB1表达高于癌旁组织，NSCLC患者血浆HMGB1的水平高于健康人群，术后明显下降，并且患者血浆HMGB1水平与肿瘤大小、临床分期及有无远处转移密切相关。因此，HMGB1在NSCLC进展过程中起重要作用，血浆HMGB1作为一类新型肿瘤生物学标志物，在NSCLC的诊断、病情和疗效的评估中有应用前景。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南通大学

<120> HMGB1在评估非小细胞肺癌病情和临床疗效方面的应用

<141> 2021-03-08

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> HMGB1 引物正向序列(HMGB1 -F)

<400> 1

tcaaaggaga acatcctggc ctgt 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> HMGB1引物反向序列(HMGB1-R)

<400> 2

ctgcttgtca tctgcagcag tgtt 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH引物正向序列(GAPDH-F)

<400> 3

ggtctcctct gacttcaaca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH引物反向序列(GAPDH-R)

<400> 4

agccaaattc gttgtcatac 20

Claims (8)

1.一种用于评估非小细胞肺癌病情和临床疗效的生物学标志物，其特征在于，所述生物学标志物为HMGB1。

2.一种用于评估非小细胞肺癌病情和临床疗效的试剂盒，其特征在于，包括用于采集血浆的3.2％枸橼酸钠抗凝管、用于实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测的Trizol^TM试剂、逆转录试剂盒、HMGB1正向及反向引物、GAPDH正向及反向引物、用于Westernblot方法检测的含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液、10％聚丙烯酰胺凝胶、PVDF膜、5％脱脂奶粉、兔抗人HMGB1单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、用于酶联免疫吸附试验的人HMGB1 ELISA试剂盒、样品稀释液、POD-溶剂、底物溶液、终止液。

3.根据权利要求2所述的一种用于评估非小细胞肺癌病情和临床疗效的试剂盒，其特征在于，所述底物溶液包括A液和B液。

4.一种使用权利要求2的试剂盒进行非小细胞肺癌病情和临床疗效的评估方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)组织和血浆标本收集；(2)qRT-PCR方法检测肺癌组织和癌旁组织的HMGB1 mRNA水平；(3)Western blot方法检测肺癌组织和癌旁组织的HMGB1蛋白水平：(4)ELISA方法检测血浆HMGB1水平。

5.根据权利要求4所述的试剂盒进行非小细胞肺癌病情和临床疗效的评估方法，其特征在于，所述步骤(1)组织和血浆标本收集，具体包括以下过程：

(1-1)NSCLC患者手术后，收集肺癌肿瘤组织和癌旁组织距离癌组织边缘5cm，且病理证实为正常肺组织；-80℃保存；

(1-2)采集肘静脉血3mL，置于3.2％枸橼酸钠抗凝管内，混匀后4℃，2500g离心10分钟；保留血浆，-80℃保存。

6.根据权利要求4所述的试剂盒进行非小细胞肺癌病情和临床疗效的评估方法，其特征在于，所述步骤(2)实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测HMGB1 mRNA水平，具体包括以下过程：

(2-1)Trizol^TM试剂提取肺癌组织和癌旁组织的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书操作；将2μg总RNA 逆转录为cDNA；

HMGB1引物正向序列：5’-TCAAAGGAGAACATCCTGGCCTGT-3’；

HMGB1引物反向序列：5’-CTGCTTGTCATCTGCAGCAGTGTT-3’；

GAPDH引物正向序列：5’-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’；

GAPDH引物反向序列：5’-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3’；

(2-2)SYBR Green混合液5μL、cDNA 0.5μL、HMGB1正向及反向引物各0.2μL、GAPDH正向及反向引物各0.2μL和4.1μL不含核酸酶的水组成总体积10μL的聚合酶链式反应；反应条件为：95℃10min一次循环初始变性，95℃15s变性40次循环，60℃30s退火，72℃30s延伸；GAPDH作为内参，2^-ΔΔCT方法计算基因表达水平；HMGB1/GAPDH比值表示HMGB1mRNA的相对表达量。

7.根据权利要求4所述的试剂盒进行非小细胞肺癌病情和临床疗效的评估方法，其特征在于，所述步骤(3)Western blot方法检测HMGB1蛋白水平，具体包括以下过程：

(3-1)肺癌组织和癌旁组织在含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中4℃裂解30分钟，12000g离心10min；

(3-2)10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离10μg总蛋白，在恒电流200mA下，转膜120min；

(3-3)PVDF膜用5％脱脂奶粉室温封闭1小时，兔抗人HMGB1单克隆抗体(1:10000)，4℃摇床过夜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(1:10000)，室温摇床孵育1h；

(3-4)采用增强的化学发光法进行检测；GAPDH作为内参，ImageJ图像软件分析，HMGB1/GAPDH比值表示HMGB1蛋白的相对表达量。

8.根据权利要求4所述的试剂盒进行非小细胞肺癌病情和临床疗效的评估方法，其特征在于，所述步骤(4)ELISA方法检测血浆HMGB1水平，具体包括以下过程：

(4-1)按照人HMGB1 ELISA试剂盒说明书操作，酶标板的每个孔中先加入100μL样品稀释液，再加入标准品和血浆样品10μL，37℃水浴24h；

(4-2)洗涤后每孔加入100μL POD-溶剂，室温2h；

(4-3)洗涤后每孔加入100μL底物溶液，100μL底物溶液包括50μL A液+50μL B液，室温避光孵育30min；

(4-4)加入100μL终止液，多功能酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值。

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