CN113056565A

CN113056565A - 以提高的产量合成dna

Info

Publication number: CN113056565A
Application number: CN201980067811.4A
Authority: CN
Inventors: 尼尔·波特; 保罗·詹姆斯·罗斯韦尔; S·格里克-詹尼尼; A·巴布拉; T·A·J·艾迪
Original assignee: Touchlight IP Ltd
Current assignee: Touchlight Genetics Ltd; Touchlight IP Ltd
Priority date: 2018-08-17
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2021-06-29
Also published as: CA3109755A1; BR112021002764A2; GB201813429D0; IL280817A; WO2020035698A1; US20210301312A1; EP3837382A1; JP2021534746A; SG11202101548YA; KR20210084431A; AU2019321778A1; MX2021001729A

Abstract

本发明涉及一种改进的合成脱氧核糖核酸(DNA)的方法，特别是无细胞酶促合成DNA，优选大规模地，该方法具有提高的产量和/或提高的效率。在核苷酸盐中作为抗衡离子存在的阳离子种类对于高产率酶促DNA合成反应的产量、效率和准确度至关重要。本文的方法使用替代性阳离子作为离子核苷酸的抗衡离子，从而允许在DNA合成中使用更高浓度的核苷酸，并进一步允许使用更有利的反应条件。

Description

以提高的产量合成DNA

领域

本发明涉及一种改进的合成脱氧核糖核酸(DNA)的方法，特别是DNA的无细胞酶促合成，优选以大的规模，该方法具有提高的产量和/或提高的效率。

背景

脱氧核糖核酸(DNA)的扩增可以通过使用基于细胞的方法来进行，例如通过在发酵罐中培养增殖待扩增的DNA的细菌。也已经描述了用于从起始模板扩增DNA的无细胞酶促方法，包括聚合酶链反应和链置换反应。

过去，已使用基于微滴定板和自动控制的移液管的装置添加所需的反应成分来实施测试规模的DNA扩增。这样的装置和方法适用于为了测试目的而生产少量的DNA分子，但不能提供用于其他目的的足够的量。特定核酸和蛋白质的大规模扩增和生产大部分是通过基于细胞的方法进行的。这样的方法通常对于非常大量产品的生产是有效的，但是制造成本很高。另外，出于临床和治疗目的，优选在无细胞环境中合成DNA。

使用化学合成例如亚磷酰胺方法的大规模DNA合成是已知的，但并非没有缺点。该反应通常必须在有机溶剂中进行，其中许多有机溶剂是有毒的或以其他方式有害的。化学合成的另一个缺点是它不是完全有效率的，因为每次添加核苷酸后，一定百分比的生长中的寡核苷酸链被封端，导致产量损失。因此，合成的核苷酸链的总产量损失随着向序列中添加的每个核苷酸而增加。化学合成寡核苷酸的这种固有的效率低下最终将能够有效生产的寡核苷酸的长度限制在具有50个或更少的核酸残基的寡核苷酸，并且进一步影响了合成的准确性。

迄今为止，生物催化剂例如聚合酶尚未被常规开发用于体外工业规模生产DNA产物，并且反应在很大程度上被限于微升规模的体积。使用酶促合成DNA的放大方法已被证明存在问题，尤其是DNA产物的产量令人失望。

本申请人先前已经解决了使用可商购获得的核苷酸放大的能力。如WO2016/034849中所述，开发了一种新方法，该方法涉及在新鲜核苷酸耗尽或产物浓度达到阈值时向反应混合物中添加新鲜核苷酸，该文献通过引用并入本文。但是，已经确定甚至可以实现更高的产量，并且发明人已经开发了本文所述的新方法以进一步提高酶促DNA合成的产量。

酶促DNA合成通常需要使用聚合酶或类似聚合酶的酶来催化将核苷酸添加至新生核酸链。通常，需要在反应中扩增的模板DNA。但是，也可以进行无模板DNA合成，其中从头进行整合。

注意到以下事实是重要的：由于核酸的带高电荷性质，它们经常被抗衡离子包围，以中和其大部分电荷，以减少序列各部分之间的静电排斥，因此能够将它们缩合成细胞中的整齐、紧凑的结构。核酸的构建模块(核苷酸)也是离子性物质，需要存在正抗衡离子才能保持电中性。因此，大多数(如果不是全部)核苷酸作为具有正抗衡离子的盐提供。由于核苷酸具有四个负电荷，因此通常用2个二价阳离子或4个一价阳离子制备盐。对于本领域技术人员显而易见的是，一旦核苷酸盐分散在水或其他溶剂中，该盐就可以在溶液中离解成阴离子和阳离子组分。

通常，核苷酸以锂盐或钠盐的形式提供用于DNA合成、扩增或测序。通常优选锂，因为这些盐比钠盐具有更大的溶解度以及对反复冻融循环的稳定性，并且由于锂对各种微生物的抑菌活性而保持无菌，从而提供了更高的可靠性和更长的保存期限。这些盐的使用是如此常规，以至于本领域技术人员似乎对与核苷酸一起存在的抗衡离子没有疑问。实际上，在WO2016/034849的实施例中使用的所有核苷酸都是核苷酸的锂盐，因为这些作为本领域技术人员的最佳选择已投入市场。

然而，本发明人已发现，存在于核苷酸盐中作为抗衡离子的阳离子物质对于高产量酶促DNA合成反应的产量、效率和准确度至关重要。这是相当出乎意料的，因为可商购获得的核苷酸通常仅以锂盐或钠盐形式可获得。然而，如从本文包括的实施例中可以看出的，使用替代阳离子作为离子核苷酸的抗衡离子可以对DNA合成反应具有很大的影响。这种效果是令人惊讶和出乎意料的，因为它挑战了对核苷酸盐使用的常规理解，并且需要设计和生产新的抗衡离子盐dNTP来进行实施例。

发明内容

本发明涉及无细胞生产或合成DNA的方法。与目前的方法相比，该方法可以实现升高的DNA生产，即与目前的方法所认为的相比，增加或更高的产量，更高效的方法或在具有更少的额外组分的环境中进行酶促DNA合成的能力。这显著提高了生产率，同时降低了合成DNA的成本，特别是在大规模生产中。

通常，本发明涉及使用聚合酶或其他DNA合成酶的酶促DNA合成，其中任何一种都可以任选地被工程化以赋予其特定的性质。

本发明总体上涉及扩增DNA的等温方法，其不需要在扩增过程中通过加热和冷却来使温度循环，而是可以允许使用热来使DNA模板最初变性。本发明优选地涉及能够独立地或在其他酶的帮助下通过链置换复制来复制DNA模板的聚合酶的使用。

本发明的方法涉及使用盐形式的核苷酸。盐包括正抗衡离子(阳离子)。优选该抗衡离子是一价阳离子，即其由于失去一个电子而具有单个正电荷。为了增加DNA合成的产量和/或效率，一价阳离子可以不仅仅为钠或锂离子或其混合物，但是至少一部分阳离子的离子半径大于钠离子的离子半径。通常可以容忍盐中或方法中存在一定比例的钠或锂，但是优选盐包含离子半径大于钠离子的离子半径的一价阳离子。应当理解，由于核苷酸具有四个负电荷，因此通常盐中将存在四个一价阳离子以保持电中性。

因此，提供了用于酶促合成DNA的无细胞方法，其包括使用作为盐提供的核苷酸，其中所述盐包含离子半径大于钠离子的离子半径的一价阳离子。

因此，提供了用于酶促合成DNA的无细胞方法，其包括使用盐形式的核苷酸，其中所述盐包含离子半径大于钠离子的离子半径的一价阳离子。

优选的是，酶促DNA合成用于以较大的规模生产DNA，即用于治疗或预防用途，而不是实验室规模的扩增。在实验室规模扩增的这种放大中，本发明人发现，它不是如提供更多的底物和其他组分那么简单，并且发现产量也是如此。对于含有钠和锂的核苷酸盐，发现它们在较高浓度下对DNA合成酶具有抑制作用。本发明人发现了围绕这种抑制的替代方式。本发明允许改变反应配置(set-up)，并因此允许使用浓度等于或大于10mM的核苷酸盐。因此，该方法包括以等于或大于10mM的浓度使用核苷酸盐，所述浓度在添加核苷酸时确定。确定在进行该方法的反应混合物中的浓度。因此，在添加核苷酸时确定反应混合物中核苷酸的浓度。因此，浓度是初始浓度或方法开始时的浓度。

因此，提供了用于酶促DNA合成的无细胞方法，该方法包括以至少10mM的浓度使用作为盐提供的核苷酸，其中所述盐包含离子半径大于钠离子的离子半径的一价阳离子。

因此，提供了用于酶促DNA合成的无细胞方法，该方法包括以至少10mM的浓度使用盐形式的核苷酸，其中所述盐包含离子半径大于钠离子的离子半径的一价阳离子。

如本文所述的任何核苷酸盐可以存在最多四个一价阳离子以维持电中性。

进一步地，可以在酶促DNA合成或无细胞方法中使用核苷酸盐的混合物。

因此，提供了用于酶促DNA合成的无细胞方法，该方法包括使用作为盐提供的核苷酸，其中所述核苷酸是：

(a)具有单一一价阳离子的盐的形式，该阳离子的离子半径大于钠离子的离子半径，或

(b)具有两种或更多种不同的一价阳离子的盐的形式，其中至少一种阳离子的离子半径大于钠离子的离子半径。

本方面中的核苷酸可以以大于10mM的浓度提供。

因此，提供了用于酶促DNA合成的无细胞方法，该方法包括使用盐形式的核苷酸，其中核苷酸是：

本方面中核苷酸以大于10mM的浓度存在。

如本文所用，“单一一价阳离子”是指单一一价阳离子种类，其中最多可以有四个用于抵消核苷酸离子上的负电荷。

或者，提供以下内容：

一种用于酶促合成DNA的无细胞方法，该方法包括使用盐形式的核苷酸，其中所述盐以至少10mM的浓度存在，并且为：

(a)包含一价阳离子的盐的形式，该阳离子的离子半径大于钠离子的离子半径，或

(b)两种或更多种盐的形式，每种盐包含不同的一价阳离子，其中至少一种阳离子的离子半径大于钠离子的离子半径。

酶促DNA合成可以涉及能够合成DNA的任何酶，包括聚合酶或改性的聚合酶。聚合酶可以来自DNA聚合酶的任何已知家族，包括家族A、B、C、D、X、Y和RT。来自X家族的DNA聚合酶的一个实例是末端脱氧核苷酸转移酶。

酶促DNA合成可以不使用模板而从头进行。

酶促DNA合成可以涉及模板，例如DNA模板。

酶促DNA合成可以在包含本文所述组分的反应混合物中进行。

或者，提供了一种用于合成DNA的无细胞方法，该方法包括在一种或多种为盐形式的核苷酸的存在下使DNA模板与至少一种聚合酶接触以形成反应混合物，其中所述核苷酸以至少10mM的浓度存在，并且为：

或者，核苷酸盐包括不仅仅是钠或锂的一价阳离子，而是很大比例是包括离子半径大于钠离子的离子半径的阳离子的核苷酸盐。因此，提供了一种合成DNA的无细胞方法，该方法包括在一种或多种为具有一价阳离子的盐形式的核苷酸的存在下，使DNA模板与至少一种聚合酶接触以形成反应混合物，其中所述核苷酸以至少10mM的浓度存在，并且不仅仅是钠或锂。

优选的是，当提及核苷酸或核苷酸盐的浓度时，这是方法开始时核苷酸(或其盐)的浓度，即核苷酸(或核苷酸盐)的起始或初始浓度。因此，它是加入到反应混合物后的浓度。应当理解，可以在该方法的过程中添加其他组分；这样的添加可以稀释核苷酸/核苷酸盐的浓度，除非提供另外的核苷酸以补充该浓度。此外，由于核苷酸/核苷酸盐将被该方法(即DNA合成反应)使用或消耗，核苷酸/核苷酸盐的浓度将随着该方法的进行而降低。在某些实施方案中，可以随着方法的进行添加另外的核苷酸/核苷酸盐，以补充用于酶促反应的底物。

发明人惊奇地发现，如果核苷酸盐包括离子半径大于钠离子的离子半径的一价阳离子，则合成中对二价阳离子的需求降低。常规规定，例如，镁(二价阳离子)在DNA合成反应中与核苷酸盐的最小比率为至少1：1。这是因为在某些聚合酶的活性位点需要镁；它可以在整合之前与核苷酸形成复合物，并且还可以与DNA合成过程中释放的磷酸根离子物质形成其自己的盐。然而，在某些条件下，本申请发明人开发了一种方法，其中对镁或其他二价阳离子的需求大大降低。这很重要，因为减少DNA合成中包括的组分明显降低成本，而且更高的镁浓度与DNA合成中的准确度降低有关。

二价阳离子可以包含选自以下列表的一种或多种金属：Mg²⁺、Be²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Mn²⁺或Zn²⁺，优选Mg²⁺或Mn²⁺。在反应混合物中，金属阳离子与核苷酸盐之间的比率可以为约1：1。低于1：1的比率是期望的，并且在DNA合成中是优选的，因为高于1：1的比率会导致DNA合成有些失真。可以以任何合适的盐的形式提供二价阳离子进行酶促DNA合成。

因此，本发明还涉及在减少二价阳离子的条件下进行的酶促DNA合成，其包括使用具有离子半径大于钠离子的离子半径的(一种或多种)一价阳离子的核苷酸盐。本情况下的减少是与在核苷酸盐中存在锂或钠离子的相同反应相比。

发明人惊奇地发现，在本发明的方法中使用具有替代的抗衡离子(例如铵和铯离子)的核苷酸盐减少了对酶促DNA合成中包括的缓冲剂的需求。这也是有利的，因为它降低了合成反应的成本并且对于用于治疗用途的DNA合成可能是有益的。

进一步地，关于存在的其他组分，本申请发明人在此开发的方法可以在大范围的条件下进行。这些条件的范围从常规的缓冲水平到不提供另外的缓冲剂，有效地在水中与所需的组分进行反应。所需的组分可以包括DNA合成酶(即聚合酶)、核苷酸盐和二价阳离子(作为盐)，根据反应条件所需的任选的其他成分，选自模板、变性剂、焦磷酸酶或一种或多种引物。这些组分可以形成反应混合物。

因此，向该方法(即反应混合物)提供至少一定比例的作为与一价正抗衡离子(阳离子)的盐的核苷酸是有利的，所述一价正抗衡离子(阳离子)的离子半径大于钠离子的离子半径，因为这令人惊奇地实现了以提高的DNA产量和/或提高的效率将核苷酸转化成DNA。可以将这些改进与类似的反应混合物进行比较，在类似的反应混合物中，所有核苷酸单独作为常规盐提供，例如作为仅锂盐或钠盐或这两种离子的混合物提供。提供与常规使用的那些核苷酸盐不同的核苷酸盐具有一些另外的令人惊奇的优点，例如能够降低反应混合物中缓冲剂的浓度(在某些情况下降低至零)，以及能够降低反应混合物对二价阳离子辅因子(最明显的是镁)的需要。

一方面，模板指导方法中的酶促DNA合成。此模板可以是DNA模板。模板的扩增优选通过链置换。模板的扩增优选是等温的，即，不需要在低温和高温之间循环以进行扩增。在这种情况下，如果需要，可以在开始时使用热使模板变性，或者可以通过化学方式使模板变性。然而，一旦模板已经变性，如果合适的话，以允许任何引物进入双链模板之间，则可以将温度维持在不影响模板和产物的变性的温度范围内。等温温度条件要求反应不加热到使模板和产物变性的点(与PCR相比，PCR需要热循环才能使模板和产物变性)。通常，取决于酶本身的偏好，此类反应在恒定温度下进行。该温度可以是任何适合该酶的温度。

无细胞方法优选地涉及通过链置换复制扩增模板。这种合成释放出单链DNA，进而可以使用聚合酶将其拷贝到双链DNA中。术语链置换描述了置换合成过程中遇到的下游DNA的能力，其中聚合酶打开双链DNA以延伸新生的单链。具有不同程度的链置换活性的DNA聚合酶是可商购获得的。或者，可通过提供DNA聚合酶和单独的解旋酶来实现链置换。复制解旋酶可以打开双螺旋DNA，并促进前导链聚合酶的前进。

独立地，本发明的任何方面的任选特征可以是：模板可以是环状的。所述DNA模板的链置换扩增可以通过滚环扩增(RCA)进行。聚合酶可以是Phi29或其变体。DNA的扩增可以是等温扩增，即在恒定温度下。一种或多种引物可以是随机引物。可以使用一对或一组引物。合成的DNA可以包含串联体，所述串联体包含从DNA模板扩增的DNA序列的串联单元。DNA模板可以是闭合的线性DNA；优选地，DNA模板在变性条件下孵育以形成闭合的环状单链DNA。

可以合成的DNA的量等于或高于3g/升反应混合物，特别是16g/l或更高，优选最高至30g/l及更高。

可以合成的DNA的量可以超过对反应混合物计算的最大产量的60％。优选地，可以合成的DNA的量可以超过计算的最大产量的80％。计算的最大产量是基于如果所有核苷酸都整合到产物中的理论产量，本领域技术人员可以对此进行计算。

由核苷酸(或核苷酸盐)合成DNA的效率可以描述为向反应混合物提供的在反应过程中成功地整合到产物中的核苷酸或其盐的百分比。

无细胞方法需要至少一个核苷酸。然后可以添加一个或多个另外的核苷酸。核苷酸或另外的核苷酸是脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)或其衍生物或修饰形式。核苷酸或另外的核苷酸是以下一种或多种：脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)及其衍生物。核苷酸或另外的核苷酸作为其盐提供。每个个体核苷酸盐可以包含至多四个一价阳离子以维持电中性。在该方法中使用的核苷酸盐可以包括一种或多种一价阳离子，即一个或多个一价阳离子种类，并且优选的是，大多数(如果不是全部的话)所述一价阳离子的离子半径大于钠离子的离子半径。应当理解，这些可以在溶液中解离，因此有助于该方法中阳离子的存在。

优选在该方法中，即在反应混合物中，核苷酸或其盐的浓度可以大于10mM且最高至至少100mM。这样的浓度对于以更高的产量生产DNA是重要的，在给出的两种浓度的情况下，其可以最高至3g/l至30g/l。优选所述的核苷酸或其盐的浓度是在该方法开始时，即是核苷酸或其盐在反应混合物中的起始或初始浓度，该反应混合物也包括DNA合成所必需的酶。随后添加另外的组分可以降低该浓度，并且DNA合成酶对其的使用也将从起始浓度降低浓度。本领域技术人员将知道，基于其他组分的体积和所用的核苷酸盐储备溶液/粉末，在制备过程时如何计算核苷酸/核苷酸盐的浓度。

术语核苷酸和核苷酸盐在本领域中可互换使用，因为所有核苷酸固有地作为盐提供。

该方法可以是分批方法或连续流方法。批料可以是封闭的批料(即，所有反应组分在DNA合成开始时提供)，或者可以根据方法过程中的需要将另外的组分提供给反应，例如WO2016/034849中所述，该专利通过引用并入本文中。如果需要另外的添加，这将稀释核苷酸或核苷酸盐的浓度，除非添加另外的核苷酸盐以补充该浓度。

本申请发明人已发现，每种不同的抗衡离子可以为酶促DNA合成反应添加特定的特征。例如，使用具有铯离子的核苷酸盐导致在减少的镁水平的存在下进行酶促DNA合成。进一步地，在核苷酸盐中使用铵离子已导致使用了一些高浓度的核苷酸，实施例显示了在80mM核苷酸浓度下的DNA合成。

发明人以前没有认识到在核苷酸盐中使用这些阳离子中的几种，这是由于缺少其从商业来源的即时可得性。如果需要，可以从核苷酸制造商定制订购这些核苷酸盐。

因此，在酶促无细胞合成DNA中使用包含铯、铵、铵衍生物或铷阳离子中的任一种的核苷酸盐构成本发明的一部分。因此，使用包含这些离子的核苷酸盐构成本发明的一部分。

可以在低水平的二价阳离子的存在下，小于约1：1，优选二价阳离子与核苷酸的比率为0.2：1至0.8：1，优选0.2：1至0.5：1，用此类离子进行DNA的酶促无细胞合成。离子是核苷酸盐中的抗衡离子。

可以在最少缓冲剂(minimal buffering agent)中用此类离子进行DNA的酶促无细胞合成，在缓冲剂中不添加已显示出增强DNA合成或促进引物结合的其他盐或洗涤剂。最少缓冲剂可以包含稳定pH的试剂(缓冲剂)。最少缓冲剂可以含有非常少量的阳离子，这些阳离子是由用于使模板变性的化学物质(例如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵)的存在而提供的。离子是核苷酸盐中的抗衡离子。

如果在酶促DNA合成中需要低水平的镁离子，则发明人已发现用于这种合成的可靠核苷酸是具有铯离子的核苷酸盐。

因此，本发明提供了DNA的酶促无细胞合成，其中需要将二价离子与核苷酸的比率保持在0.5∶1或更低，该方法包括使用包含铯离子的核苷酸盐。

另外的优点在下文中描述。

附图简要说明

下面将参考示例性实施方案和附图进一步描述本发明，其中：

图1A至1E是示出通过在DNA合成反应中使用具有不同抗衡离子的核苷酸盐的不同起始浓度和镁离子(作为MgCl₂)的不同初始/起始浓度的实验获得的结果的图。每个图显示了对应于总初始/起始核苷酸盐浓度(mM)的获得的原始DNA产量(g/l)与理论DNA产量(g/l)。在所有图上，虚线显示80％的核苷酸盐向DNA的转化效率，实线显示100％的转化效率。图1A描述了使用锂-dNTP获得的DNA合成结果；图1B是用钠-dNTP得到的结果，图1C是用钾-dNTP获得的结果，图1D是用铵-dNTP获得的结果，图1E是使用铯-dNTP时的结果；

图2是显示来自DNA合成实验的数据的图，并且是给出最大原始DNA产量的dNTP盐浓度(mM)相对于不同反应浓度的镁离子的图。显示了使用：锂、钠、钾、铵和铯作为抗衡离子的核苷酸盐的结果。该图分为三个部分，突出显示了镁离子与核苷酸盐的比率小于0.5的结果，比率为0.5和1的部分以及比率超过1的最终部分。还显示了这些部分的阈值——虚线表示0.5：1的镁离子与核苷酸(dNTP)比率，实线表示1：1的比率；

图2是显示从DNA合成实验获得的数据的图。在实施例中，测量了采用固定起始浓度的使用各种抗衡离子的核苷酸盐和增加浓度的氯化镁进行的各种DNA合成反应的DNA产量。该图显示了所有测试的核苷酸盐相对于氯化镁浓度绘制的原始DNA产量(g/l)；

图3是显示来自DNA合成反应的数据的图，所述DNA合成反应使用在最少缓冲液中使用不同的核苷酸盐起始浓度进行的滚环扩增。绘制了原始DNA产量(g/l)相对于初始/起始dNTP盐浓度(mM)的图；

图4是使用DNA模板的滚环扩增的DNA合成实验的图，在实验期间测试了反应混合物中另外的一价阳离子的存在是否会对DNA合成反应产生影响。在该实验中，使用了核苷酸铵盐，并且所示的一价阳离子氯化物盐也包括在反应混合物中。dNTP铵盐与一价氯化物盐的起始比率为1：4；因为为dNTP上存在的每个铵离子(其中有四个)提供一个一价阳离子。因此，铵离子(在dNTP盐上)与一价阳离子的起始比率为1：1。镁的起始浓度也是不同的，为5mM、10mM、20mM和40mM，分别对应于图中所示的铵抗衡离子dNTP的17.5mM、25mM、35mM和50mM浓度。绘制了在存在一价阳离子(包括锂、钠、钾、铵和铯)抗衡离子氯化物盐的情况下，所示浓度的铵抗衡离子dNTP(NH₄-dNTP)的原始DNA产量，而对照没有另外的盐。

图5a和6b是几个pH测定实验的结果，所述pH测定实验比较了在核苷酸盐的各种起始浓度下缺乏聚合酶、模板和引物的反应混合物的pH。使用可变的初始氯化镁(MgCl₂)浓度。该图显示了在所述的初始氯化镁浓度下，相对于核苷酸盐浓度测得的pH。没有发生DNA合成。图6a示出了铯-dNTP的数据图，图6b示出了铵-dNTP的数据图；和

图7是如实施例中使用的质粒图proTLx-K B5X4 LUX ST(AT)。显示的是加工位点(TelRL)、Luc 2报告基因、卡那霉素抗性基因、CMV启动子和pUC ori。

发明详述

本发明涉及大规模合成DNA的无细胞方法。本发明的方法可以允许DNA的高通量合成。

根据本发明合成的脱氧核糖核酸(DNA)可以是任何DNA分子。DNA可以是单链或双链的。DNA可以是线性的。DNA可以被加工，以形成环，尤其是微环、单链闭环、双链闭环、双链开环或闭合的线性双链DNA。DNA可以被允许形成或被加工而形成特定的二级结构，例如但不限于发夹环(茎环)、不完美型发夹环、假结体或各种类型的双螺旋(A-DNA、B-DNA或Z-DNA)中的任一种。DNA还可以形成发夹和适体结构。

合成的DNA可以具有任何合适的长度。使用本发明的方法，最高至或超过77千碱基的长度是可能的。更特别地，根据本发明的方法可以合成的DNA的长度可以是大约最高至60千碱基，或最高至50千碱基，或最高至40千碱基，或最高至30千碱基。优选地，所合成的DNA可以是100碱基至超过77千碱基、500碱基至60千碱基、200碱基至20千碱基，更优选地200碱基至15千碱基，最优选地2千碱基至15千碱基。

根据本发明的方法合成的DNA的量可以超过3g/l。优选的，所合成的DNA的量大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30g/l或更高。合成的DNA的优选量为5g/l。所生产的DNA的量可以被描述为大规模或大量生产的工业或商业量。通过本发明的方法生产的DNA在质量(即DNA长度和序列)方面可以是一致的。因此，该方法可以适合于大规模合成DNA。该方法在合成的准确度方面可以是一致的。

或者，合成反应中生产的DNA的量可以与理论最大产量相比，如果将100％核苷酸整合到合成的DNA中，将达到理论最大产量。本发明的方法不仅提高了获得的总产量，而且还提高了方法的效率，这意味着与以前的方法相比，更多的提供的核苷酸被整合到所合成的DNA产物中。通过本发明的方法可获得的产量超过理论最大值的50％，直至并超过理论最大值的90％。因此，通过本发明的方法达到的理论最大产量的比例包括50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％或更高。常规上，使用可商购获得的核苷酸盐，由于可能抑制该方法的离子的影响，所达到的产量是令人失望的。

通过酶促反应合成DNA。这种酶促合成可以涉及使用任何DNA合成酶，最明显的是聚合酶或修饰的聚合酶。这些将在下面进一步讨论。DNA合成可以从头开始，并且不需要模板。酶促合成也可以需要使用模板进行DNA合成。该模板可以是任何合适的核酸，取决于聚合酶，但是优选地是DNA模板。

模板可以是任何合适的模板，仅通过包括特定序列来提供DNA合成的说明。模板可以是单链的(ss)或双链的(ds)。模板可以是线性或环状的。模板可以包括天然、人工或修饰的碱基或其混合物。

模板可以包含任何天然来源或人工序列。

模板可以具有任何合适的长度。特别地，模板可以是最高至60千碱基，或最高至50千碱基，或最高至40千碱基，或最高至30千碱基。优选地，DNA模板可以是10碱基至100碱基、100碱基至60千碱基、200碱基至20千碱基，更优选是200碱基至15千碱基，最优选是2千碱基至15千碱基。

可以通过本领域已知的任何方法以足以在该方法中使用的量提供模板。例如，可以通过PCR产生模板。

在方法中可以扩增模板的全部或选定部分。

模板可以包含表达序列。DNA可以用于在细胞中表达(即体外或体内转染的细胞)，或者可以用于在无细胞系统中表达(即蛋白质合成)。表达序列可以用于治疗目的，即DNA疫苗的基因疗法。表达序列可以是基因，所述基因可以编码DNA疫苗、治疗性蛋白质等。该序列可以包含转录成活性RNA形式(即小干扰RNA分子(siRNA))的序列。

如果需要，可以使模板与至少一种聚合酶接触，如下所述。

酶促DNA合成反应可以需要至少一种DNA合成酶。优选地，酶是聚合酶。聚合酶将核苷酸连接在一起以形成DNA聚合物。可以使用一种、两种、三种、四种或五种不同的酶和/或聚合酶。聚合酶可以是来自任何聚合酶家族的任何合适的聚合酶，以使其合成DNA的聚合物。聚合酶可以是DNA聚合酶。可以使用任何DNA聚合酶，包括任何可商业上获得的DNA聚合酶。可以使用两种、三种、四种、五种或更多种不同的DNA聚合酶，例如一种提供校对功能，其他一种或多种不提供校对功能。可以使用具有不同机制的DNA聚合酶，例如链置换型聚合酶和通过其他方法复制DNA的DNA聚合酶。不具有链置换活性的DNA聚合酶的一个合适实例是T4DNA聚合酶。可以使用不依赖模板的聚合酶，例如末端转移酶。

也可以使用修饰的聚合酶。这些可以已被工程化以改变其特性，例如消除其对模板的依赖性，改变其温度依赖性或稳定酶供体外使用。

聚合酶可以是高度稳定的，以使在加工条件下长时间孵育不会实质性降低其活性。因此，该酶优选在包括但不限于温度和pH的一系列工艺条件下具有长的半衰期。还优选聚合酶具有一种或多种适合于制造方法的特征。聚合酶优选例如通过具有校对活性而具有高准确度。此外，优选聚合酶显示出持续合成能力高、链置换活性高和对于dNTP和DNA的K_m低。聚合酶可以能够使用环状和/或线性DNA作为模板。聚合酶可以能够使用dsDNA或ssDNA作为模板。优选聚合酶不显示与其校对活性无关的DNA核酸外切酶活性。

本领域技术人员可以通过与可商购获得的聚合酶(例如，Phi29(New EnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MA,US)、Deep

(New England Biolabs,Inc.)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus，Bst)DNA聚合酶I(New England Biolabs,Inc.)、DNA聚合酶I的Klenow片段(New England Biolabs,Inc.)、M-MuLV逆转录酶(New EnglandBiolabs,Inc.)、

(exo-minus)DNA聚合酶(New England Biolabs,Inc.)、

DNA聚合酶(New England Biolabs,Inc.)、Deep

(exo-)DNA聚合酶(NewEngland Biolabs,Inc.)和Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs,Inc.))显示的性质进行比较来确定给定的聚合酶是否显示如上定义的特征。当提及持续合成能力高时，这通常表示每次与模板的结合/解离时由聚合酶添加的核苷酸的平均数目，即，从单个结合事件获得的新生延伸的长度。

链置换型聚合酶是优选的。优选的链置换型聚合酶是Phi29、Deep Vent和Bst DNA聚合酶I或其任一种的变体。“链置换”描述了聚合酶在合成期间遇到双链DNA区时置换互补链的能力。因此，通过置换互补链并合成新的互补链来扩增模板。因此，在链置换复制期间，新复制的链将被置换，为聚合酶复制另一条互补链让路。当引物或单链模板的3'游离末端退火至模板上的互补序列(二者均为引发事件)时，扩增反应启动。当DNA合成进行时，如果其遇到退火至模板的另外的引物或其他链，则聚合酶将其置换并继续其链延伸。链置换可以释放单链DNA，其可以充当更多引发事件的模板。新释放的DNA的引发可能导致超支化以及产物的高产量。应当理解，链置换扩增方法与基于PCR的方法的不同之处在于，变性循环对于高效的DNA扩增不是必不可少的，因为双链DNA不是继续合成新DNA链的障碍。如果使用引物，链置换扩增可以仅需要进行初始的一轮加热，以使初始模板(如果其是双链的)变性，从而使引物退火至引物结合位点。这之后，由于不需要进一步的加热或冷却，因此可以将扩增描述为等温的。相比之下，PCR方法在扩增过程期间需要进行变性循环(即，将温度升高至94摄氏度或更高)，以解链双链DNA并提供新的单链模板。在链置换期间，聚合酶将置换已经合成的DNA链。此外，它将使用新合成的DNA作为模板，确保DNA的快速扩增。

在本发明的方法中使用的链置换聚合酶优选具有至少20kb、更优选至少30kb、至少50kb或至少70kb或更大的持续合成能力。在一个实施方案中，链置换DNA聚合酶具有与phi29 DNA聚合酶相当或更高的持续合成能力。

因此，链置换复制是优选的。在链置换复制期间，通过置换已复制的链(其已在聚合酶的作用下合成)，进而置换另一条链(其可以是双链模板的原始互补链或新合成的互补链，后者是通过聚合酶对退火至模板的在先引物的作用而合成的)来扩增模板。因此，模板的扩增可以通过另一条链的链置换复制来置换已复制的链而发生。这一方法可以描述为链置换扩增或链置换复制。

优选的链置换复制方法是环介导的等温扩增或LAMP。LAMP通常使用4-6个引物来识别模板DNA的6-8个不同区域。简而言之，置换链的DNA聚合酶启动合成，并且引物中的两个形成环结构以促进随后的扩增轮次。含有目标DNA的有义链和反义链序列的内引物启动LAMP。以下由外引物引发的链置换DNA合成释放单链DNA。这用作由与目标另一末端杂交的第二内引物和外引物引发的DNA合成的模板，产生茎环DNA结构。在随后的LAMP循环中，一个内引物与产物上的环杂交，并启动置换DNA合成，从而产生原始的茎-环DNA和具有两倍长度的茎的新的茎-环DNA。在需要较少的内引物的情况下，也可以采用改良的LAMP程序。

优选的链置换复制方法是滚环扩增(RCA)。术语RCA描述RCA型聚合酶围绕环状DNA模板链连续进行，同时延伸杂交引物的能力。这导致形成具有多个重复的扩增的DNA的线性单链产物。环状模板(单一单元)的序列在线性产物内多次重复。对于环状模板，链置换扩增的初始产物是单链的多联体，其为有义或反义的，取决于模板的极性。这些线性单链产物用作多次杂交、引物延伸和链置换事件的基础，导致形成多联体双链DNA产物，再次包含多个重复的扩增的DNA。因此，在多联体双链DNA产物中存在每个扩增的“单一单元”DNA的多个拷贝。特别优选将RCA聚合酶用于本发明的方法。RCA型链置换复制方法的产物可能需要加工，以释放单一单元DNA。如果需要DNA的单一单元，则这是期望的。使用Phi29 DNA聚合酶的典型链置换条件包括高水平的镁离子，例如10mM的镁(通常为氯化物盐)，以及0.2至4mM核苷酸。

为了允许扩增，根据一些方面，酶促DNA合成也可能需要一种或多种引物。如果不使用模板，则引物将为DNA合成提供起点，并设计为开始合成反应。如果使用模板，则引物可以是非特异性的(即序列随机)或可以对模板内包含的一个或多个序列具有特异性。或者，可以提供引物酶以从头生成引物。如果引物具有随机序列，则它们允许在模板上的任何位点进行非特异性启动。这允许通过来自每个模板链的多个启动反应进行高效扩增。随机引物的实例是六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或更长的序列，例如长度为12、15、18、20或30个核苷酸的序列。随机引物的长度可以是6至30、8至30或12至30个核苷酸。通常以寡核苷酸的混合物的形式提供随机引物，其代表模板中的例如六聚体、七聚体、八聚体或九聚体的所有潜在的组合。

在一个实施方案中，引物或引物中的一种或多种是特异性的。这意味着它们具有与模板中期望启动扩增的序列互补的序列。在该实施方案中，可以使用一对引物来特异性扩增DNA模板的一部分，该部分在两个引物结合位点内部。或者，可以使用单个特异性引物。可以使用一组引物。

引物可以是任何核酸组合物。引物可以是未标记的，或可以包含一种或多种标记，例如放射性核素或荧光染料。引物也可以包含化学修饰的核苷酸。例如，可以将引物加帽以防止DNA合成的启动，直到帽被移开为止，即通过化学或物理手段。通常可以基于温度考虑来选择引物长度/序列，即能够在扩增步骤中使用的温度下结合至模板。

在某些方面，可以在促进引物退火至模板的条件下进行模板与聚合酶和一种或多种引物的接触。条件包括存在允许引物杂交的单链核酸。常规地，条件还包括允许引物退火至模板的温度和缓冲液。可以根据引物的性质选择适当的退火/杂交条件。可以在本发明中使用的常规退火条件的一个实例包括缓冲液，其包含30mM Tris-HCl pH 7.5、20mM KCl、8mM MgCl₂。然而，本发明人在本文中描述了缓冲液和二价金属离子组分减少的条件，这些条件仍然允许引物结合，并且这些将在下面进一步讨论。可以在使用热量变性之后进行退火，然后逐渐冷却至期望的反应温度。

但是，也可以在没有引物的情况下使用链置换复制进行扩增，因此不需要发生杂交和引物延伸。相反，单链模板通过形成发夹而自引发，该发夹具有可用于延伸的游离3'-末端。扩增的其余步骤保持相同。

模板和/或聚合酶也与作为核苷酸盐的核苷酸接触。DNA模板、聚合酶和核苷酸盐的组合可以描述为形成反应混合物。反应混合物还可以包含一种或多种引物或引物酶。反应混合物还可以独立地包括一种或多种二价金属阳离子。反应混合物可以进一步包含化学变性剂。这样的变性剂可以是氢氧化钾、氢氧化铵或氢氧化钠。反应混合物可以进一步包含另外的酶，例如解旋酶或焦磷酸酶。反应混合物可以含有pH缓冲剂，并且在某些方面，它不含有pH缓冲剂。

核苷酸是核酸的单体或单一单元，并且核苷酸由含氮碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)和至少一个磷酸盐基团组成。可以使用任何合适的核苷酸。

核苷酸作为与一价阳离子的盐存在。一价阳离子是具有单个正电荷的离子物质，因此通常在核苷酸盐中最多存在四个。优选一价阳离子的离子半径大于钠离子的离子半径。离子半径是离子晶体结构中离子的半径。离子半径通常以皮米(pm)或埃

为单位给出。离子半径不是给定离子的固定性质，而是随各种参数(包括配位数和自旋状态)而变化。但是，离子半径值足够不同，以允许识别出原子离子的周期趋势，而离子半径随周期表族的下降而增加。对于相同的离子，离子半径随着配位数的增加而增加，并且低自旋状态下的离子将小于高自旋状态下的同一离子。通常，离子半径随着正电荷的增加而减小。因此，当在本文中提及离子半径时，它可以是该离子的任何可能的离子半径。示例性离子半径列于表6。

核苷酸可以包括一价金属离子的盐，包括但不限于碱金属(1族)：锂(Li⁺)、钠(Na⁺)、钾(K⁺)、铷(Rb⁺)、铯(Cs⁺)或钫(Fr⁺)。替代地或另外，一价金属离子可以是过渡金属(11族)：铜(Cu⁺)、银(Ag⁺)、金(Au⁺)或

(Rg⁺)。碱金属是优选的，因此优选的抗衡离子可以是钾(K⁺)、铷(Rb⁺)、铯(Cs⁺)或钫(Fr⁺)。

核苷酸可以包括多原子一价离子的盐。多原子离子是含有多于1个原子的离子。这将多原子离子与仅含有一个原子的单原子离子区分开来。示例性的一价多原子阳离子包括铵(NH₄ ⁺)和水合氢离子(H₃O⁺)，其中铵是特别优选的。在所有条件下，铵的离子半径均大于钠。还包括铵的衍生物，这些的示例性清单包括：单烷基铵、二烷基铵、三烷基铵、胆碱、季铵和咪唑鎓。本领域技术人员将意识到带有单个正电荷的铵的其他衍生物，其适合用作核苷酸盐上的抗衡离子。

含氮碱基可以是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。含氮碱基还可以是修饰的碱基，例如5-甲基胞嘧啶(m5C)、假尿苷(Ψ)、二氢尿苷(D)、肌苷(I)和7-甲基鸟苷(m7G)。含氮碱基可以进一步是人工碱基。核苷酸盐的浓度可以包括各种含氮碱基的任何组合。

优选五碳糖是脱氧核糖，使得核苷酸是脱氧核苷酸。

核苷酸可以是脱氧核苷三磷酸(称为dNTP)的形式。这是本发明优选的实施方案。合适的dNTP可以包括dATP(脱氧腺苷三磷酸)、dGTP(脱氧鸟苷三磷酸)、dTTP(脱氧胸苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)、dCTP(脱氧胞苷三磷酸)、dITP(脱氧肌苷三磷酸)、dXTP(脱氧黄苷三磷酸)及其衍生物和修饰的形式。优选dNTP包含dATP、dGTP、dTTP或dCTP中的一种或多种或其修饰的形式或衍生物。优选使用dATP、dGTP、dTTP和dCTP或其修饰的形式的混合物。根据反应需要，可以使用这些dNTP的任何合适的比例。

核苷酸或核苷酸盐可以是溶液的形式，或者可以需要作为固体例如作为粉末提供。核苷酸或核苷酸盐可以包含修饰的核苷酸。核苷酸或核苷酸盐可以以一种或多种合适的碱基的混合物提供，优选地，腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)中的一种或多种。在合成DNA的方法中使用两种、三种或者优选全部四种核苷酸(A、G、T和C)。这些核苷酸或核苷酸盐可以全部以基本上相等的量存在，或者取决于要合成的DNA的性质，一种或两种可以提供得更多。

核苷酸可以均为天然核苷酸(即，未修饰的)，它们可以是修饰的核苷酸，其像天然核苷酸一样起作用，并且是生物活性的(即，LNA核苷酸–锁核酸)，它们可以是修饰的且生物上无活性的，或者它们可以是未修饰的和修饰的核苷酸的混合物，和/或生物活性的和生物上无活性的核苷酸的混合物。核苷酸的每种类型(即，碱基)可以以一种或多种形式提供，即，未修饰的和修饰的，或者生物活性的和生物上无活性的。所有这些核苷酸都能够形成适当的盐。

在本发明的一方面，核苷酸或核苷酸盐以至少10mM的浓度存在。根据这一方面，核苷酸或核苷酸盐可以以下列浓度存在于反应混合物中：大于10mM、大于15mM、大于20mM、大于25mM、大于30mM、大于35mM、大于40mM、大于45mM、大于50mM、大于55mM、大于60mM、大于65mM、大于70mM、大于75mM、大于80mM、大于85mM、大于90mM、大于95mM或大于100mM。这样的浓度在该方法启动或开始时作为核苷酸盐的浓度给出。在添加核苷酸/核苷酸盐之后给出浓度，其中可以向反应混合物中添加。核苷酸盐可以是具有不同含氮碱基的核苷酸盐的任何适当的混合物。浓度适用于在该方法开始时存在的核苷酸盐的总和，无论其组成如何。因此，例如，10mM浓度的核苷酸盐可以是用适当的一价阳离子作为抗衡离子的dCTP、dATP、dGTP和dTTP的任何混合物。

将理解，作为盐提供的核苷酸可以在水和其他溶剂中解离以形成阴离子核苷酸实体和阳离子。

核苷酸盐由离子半径大于钠离子离子半径的抗衡离子形成是本发明任何方面的优选部分。然而，聚合酶或DNA合成酶可能耐受某些浓度的锂和/或钠核苷酸盐。因此，在本发明的方法中可以包括一部分核苷酸盐，其中抗衡离子是钠和/或锂。这部分优选小于25％，任选地20％、15％、10％、5％、1％或更少。聚合酶或DNA合成酶也可以耐受来自其他来源(例如变性剂)的钠和/或锂。优选反应混合物中锂离子的总浓度不超过15mM，优选不超过10mM，甚至更优选不超过5mM、4mM、3mM、2mM、1mM或更少。由于锂似乎更具抑制性，因此优选将该离子从反应混合物中基本排除。在钠离子的情况下，因为通常使用氢氧化钠作为变性剂，因此可以耐受钠离子的存在。

因此，在本发明的方法中使用的核苷酸盐可以包括不同核苷酸盐的混合物，例如钾-核苷酸盐和铯-核苷酸盐的混合物。可以使用许多不同的盐。优选至少75％的盐具有离子半径大于钠离子的离子半径的抗衡离子，任选地80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。可以期望使用不同盐的混合物，以使DNA的产量最大化并利用各种抗衡离子的不同特性。或者，提供了一种用于合成DNA的无细胞方法，该方法包括在一种或多种盐形式的核苷酸的存在下，使DNA模板与至少一种聚合酶接触，以形成反应混合物，其中所述核苷酸为两种或更多种盐的形式，每种盐包含不同的一价阳离子，其中至少一种阳离子的离子半径大于钠离子的离子半径。因此，在本发明的方法中可以使用两种或更多种不同的核苷酸盐，所述盐由于使用不同的抗衡离子而不同。可以优选所有的盐都需要使用离子半径大于钠离子的离子半径的抗衡离子。

可以在促进DNA合成的条件下维持酶促DNA合成，这将取决于所选择的特定方法。

通过链置换进行模板的扩增是优选的。优选地，所述条件促进所述模板通过另一条链的链置换复制来置换已复制的链而扩增。条件包括使用任何允许DNA扩增的温度，通常在20至90摄氏度的范围内。优选的温度范围可以是约20至约40或者约25至约35摄氏度。对于LAMP扩增，优选的温度是约50至约70摄氏度。

通常，基于具体的聚合酶具有最佳活性的温度来选择适当的用于酶促DNA合成的温度。这一信息是普遍可得的，且构成本领域技术人员通常知识的一部分。例如，在使用phi29 DNA聚合酶的情况下，合适的温度范围是约25至约35摄氏度，优选约30摄氏度。然而，可以在较高的恒定温度下操作热稳定的phi29。本领域技术人员通常能够识别根据本发明的方法有效扩增的合适温度。例如，可以在一定的温度范围内进行该方法，并且可以监测扩增的DNA的产量，以识别对于给定聚合酶最佳的温度范围。扩增可以在恒定的温度下进行，且优选该方法是等温的。因为链置换扩增是优选的，所以不要求改变温度来分离DNA链。因此，该方法可以是等温方法。

常规认为促进DNA合成的其他条件包括存在合适的缓冲剂/pH和酶性能或稳定性所需的其他因素。合适的常规条件包括本领域已知的用于提供聚合酶活性的任何条件。

例如，反应混合物的pH可以在3至10的范围内，优选5至8或约7，例如约7.5。可以通过使用一种或多种缓冲剂使pH保持在该范围内。这样的缓冲剂包括但不限于MES、Bis-Tris、ADA、ACES、PIPES、MOBS、MOPS、MOPSO、Bis-Tris丙烷、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、Trizma、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、三(羟甲基)甲基甘氨酸、Gly-Gly、N,N-二羟乙基甘氨酸、HEPBS、TAPS、AMPD、TABS、AMPSO、CHES、CAPSO、AMP、CAPS、CABS、磷酸盐、柠檬酸-磷酸氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸钠-乙酸、咪唑和碳酸钠-碳酸氢钠。

缓冲液通常由反应组分的混合物定义。通常包括保持稳定pH的缓冲剂；一种或多种另外的由阳离子和阴离子物质组成的盐，即氯化钠、氯化钾；和/或确保酶的最佳活性或稳定性的去污剂(例如Triton-X-100)。最少缓冲液仅由缓冲试剂组成，不提供另外的盐或去污剂，条件是在需要化学变性的DNA合成中可能存在少量的阳离子物质。令人惊讶地，在本发明的方法中使用更高浓度的核苷酸盐允许使用这些最少缓冲液。

“无缓冲液”体系在反应组分的混合物中缺少所提供或定义的pH缓冲剂，并且缺少另外的盐或去污剂。这种“无缓冲液”体系仅含有单独的DNA合成所需的反应组分，并含有提供用于化学变性或仅作为核苷酸盐抗衡离子的阳离子物质。因此，在该体系中，除了在DNA合成反应中用于特定目的的那些离子外，没有添加另外的离子。与核苷酸一起提供的抗衡离子(作为盐)用于在该方法中使用之前稳定核苷酸。

虽然使用施加热(暴露于95℃几分钟)来使双链DNA变性，但也可以使用更适合用于DNA合成的其他方法。通过暴露于高或低pH环境，或在阳离子不存在或以非常低的浓度存在(例如在去离子水中)，可以很容易使双链DNA变性。聚合酶需要将短的寡核苷酸引物序列与DNA模板的单链区域结合，以启动其复制。这种相互作用的稳定性以及因此DNA合成的效率可能特别受到金属阳离子尤其是二价阳离子例如Mg²⁺离子的浓度的影响，这可以看作是该方法的不可缺少的一部分。

酶促DNA合成也可能需要二价金属离子。该方法可以包括使用二价金属离子的盐：镁(Mg²⁺)、锰(Mn²⁺)、钙(Ca²⁺)、铍(Be²⁺)、锌(Zn²⁺)和锶(Sr²⁺)。DNA合成中最常用的二价离子是镁或锰。

酶促DNA合成可以在比以前认为可能的浓度更低的二价金属离子浓度下进行。传统上认为至多2：1的二价阳离子与核苷酸的比例是需要的或最佳的，并且如实施例中的数据所示，这尤其适用于具有锂离子的核苷酸盐，特别是锂离子为主要使用形式。然而，如果在这些盐中使用替代离子，则对二价离子(特别是镁)的需求急剧下降，使得离子与核苷酸盐的比例为约1.5：1或约1：1或更低。甚至获得了镁与核苷酸盐的比例为0.2：1的结果，这些结果是采用具有铯的核苷酸盐获得的。这些比例在较高的核苷酸盐浓度(即20mM或更高)时特别明显。因此，本发明还涉及其中镁离子与核苷酸盐的比例为1：1或更低的DNA合成，其特征在于核苷酸盐包含离子半径大于钠离子的离子半径的抗衡离子，以及核苷酸盐的浓度为大于25mM、大于30mM、大于35mM、大于40mM、大于45mM、大于50mM、大于55mM、大于60mM、大于65mM、大于70mM、大于75mM、大于80mM、大于85mM、大于90mM、大于95mM或大于100mM。

在合成期间，聚合酶从整合到不断生长的DNA链中的核苷酸释放焦磷酸盐。焦磷酸盐对镁离子具有类似于核苷三磷酸的结合亲和力，因此该过程不释放游离的镁离子。在合成期间使用高起始浓度核苷酸的结果是游离镁离子水平降低。因为这些离子可能是聚合酶催化活性所必需的，因此通常认为由与磷酸盐或磷酸根基团相互作用引起的亚最佳水平可能不利于高效扩增。因此，认为足够高并因此过量的镁离子浓度对DNA的产量和扩增至关重要。因此，降低镁水平同时保持产量的能力是相对于现有技术的令人兴奋的改进。

因此，本发明提供了一种在降低二价阳离子与dNTP的比例的条件下进行的酶促DNA合成，其包括使用具有离子半径大于钠离子的离子半径的一种或多种一价阳离子的核苷酸盐。

采用包含铵和铯或其混合物的核苷酸盐，效果是特别明显的。

在某些方面，反应混合物中还可以包括去污剂。适合的去污剂的实例包括TritonX-100^TM、Tween 20^TM和其中任一种的衍生物。反应混合物中还可以包括稳定剂。可以使用任何合适的稳定剂，尤其是牛血清白蛋白(BSA)和其他稳定化蛋白质。还可以通过添加使DNA松弛和使模板变性更容易的试剂来改进反应条件。这样的试剂包括例如二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、甘油和甜菜碱。反应混合物中还可以包括DNA浓缩剂。这样的试剂包括例如聚乙二醇或阳离子脂质或阳离子聚合物。

然而，在某些实施方案中，例如在最少缓冲液体系或无缓冲液体系中，可以从反应混合物中减少或除去这些组分。

应当理解，本领域技术人员能够基于其通常的知识，使用这些另外的成分和条件来修改并优化用于本发明的方法的合成条件。类似地，可以基于本领域先前的实例来选择特定试剂的具体浓度，并基于通常的知识进一步优化。

作为一个实例，本领域中基于RCA的方法中所用的合适的反应缓冲液是50mM TrisHCl，pH 7.5、10mM MgCl₂、20mM(NH₄)₂SO₄、5％甘油、0.2mM BSA、1mM dNTP。本发明的RCA扩增中使用的优选的反应缓冲液是30mM Tris-HCl，pH 7.9、30mM KCl、7.5mM MgC1₂、10mM(NH₄)₂SO₄、4mM DTT、2mM dNTP。这种缓冲液尤其适合用于与Phi29DNA聚合酶一起使用。

与本发明的核苷酸盐一起使用的合适的反应缓冲液是30mM Tris HCl，pH 7.9、5mM(NH₄)₂SO₄和30mM KCl。在某些情况下，酶促DNA合成可以在水中(“无缓冲液”)进行。

酶促DNA合成还可以包括使用一种或多种另外的蛋白质。DNA模板可以在至少一种焦磷酸酶例如酵母无机焦磷酸酶的存在下扩增。可以使用两种、三种、四种、五种或更多种不同的焦磷酸酶。这些酶能够使在链复制期间通过聚合酶由dNTP产生的焦磷酸盐降解。焦磷酸盐在反应中的累积可导致DNA聚合酶的抑制，并降低DNA扩增的速度和效率。焦磷酸酶可将焦磷酸盐分解成非抑制性的磷酸盐。用于本发明的方法的合适的焦磷酸酶的一个实例是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)焦磷酸酶，其可从New England Biolabs,Inc.商购获得。

在本发明的方法中可以使用任何单链结合蛋白质(SSBP)，以稳定单链DNA。SSBP是活细胞的必需组分，并且参与所有涉及ssDNA的过程，例如DNA复制、修复和重组。在这些过程中，SSBP与短暂形成的ssDNA结合，并有助于稳定ssDNA结构。用于本发明的方法的适合的SSBP的一个实例是T4基因32蛋白质，其可从New England Biolabs,Inc.商购获得。

反应的产量与合成的DNA的量有关。根据本发明的方法的预期产量可以超过3g/l。优选合成的DNA的量大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30g/l或更高。优选的合成的DNA的量为5g/l。本发明提高了酶促合成DNA的可能的产量。本发明的一个目标是提高无细胞酶促DNA合成方法的产量，从而能够以成本有效的方式大规模合成DNA。本发明允许使用被DNA合成酶或聚合酶催化的酶促方法以工业规模经济地制造/合成DNA。本发明的方法允许将核苷酸高效地整合到DNA产物中。认为本发明的方法允许反应混合物被放大至数升，包括数十升。可以将提高的产量、生产率或持续合成能力与其中所有的核苷酸作为常规盐(钠和/或锂)提供的相同反应混合物进行比较。

在一个实施方案中，本发明涉及一种增强DNA的合成的方法。可以将这种增强与除了所使用的所有核苷酸盐仅是钠或锂或其混合物之外相同的反应混合物相比。

在一方面，本发明提供了用于合成DNA的无细胞方法，该方法包括在一种或多种为具有一种或多种一价阳离子的盐的形式的核苷酸的存在下，使DNA模板与至少一种聚合酶接触以形成反应混合物，其中所述核苷酸以至少10mM的浓度存在，并且所述阳离子不全都为钠或锂。

或者，用于合成DNA的无细胞方法包括在一种或多种盐形式的核苷酸的存在下使DNA模板与至少一种聚合酶接触以形成反应混合物，其中所述核苷酸以至少10mM的浓度存在，并且为：

(a)具有单一一价阳离子的盐的形式，所述一价阳离子的离子半径大于钠离子的离子半径，或

优选本文提及的核苷酸浓度是在方法开始时核苷酸的起始浓度，即在形成反应混合物时的初始浓度。

本发明还可以涉及用于合成DNA的无细胞方法，该方法包括在一种或多种核苷酸的存在下使DNA模板与至少一种聚合酶接触，所述核苷酸为具有钠离子的盐的形式，浓度为10至20mM，或最高至30mM。本发明提供了用于酶促合成DNA的无细胞方法，该方法包括使用作为盐提供的核苷酸，其中所述盐包含离子半径大于钠离子的离子半径的一价阳离子，优选地，其中所述核苷酸盐以大于10mM的浓度提供或存在。

本发明进一步提供了在二价阳离子优选镁减少的条件下进行的酶促DNA合成，包括使用核苷酸盐，所述核苷酸盐具有一种或多种离子半径大于钠离子的离子半径的一价阳离子。

或者，可以使用具有抗衡离子的核苷酸盐来进行本发明，所述抗衡离子的离子半径大于钾离子的离子半径，任选地，其中所述核苷酸盐的浓度为大于25mM，大于30mM，大于35mM，大于40mM，大于45mM，大于50mM，大于55mM，大于60mM，大于65mM，大于70mM，大于75mM，大于80mM，大于85mM，大于90mM，大于95mM或大于100mM。

盐形式的核苷酸在本文中也称为核苷酸盐。

现在将参考几个非限制性实施例描述本发明。

实施例

材料和方法

试剂

在所提供的实施例中使用了以下试剂：

dNTP盐锂盐，储备浓度100mM(Bioline)

dNTP盐钠、钾、铯、铵盐，储备浓度100mM(合同合成)

Phi29 DNA聚合酶，储备浓度2.4g/l(内部生产)

热稳定焦磷酸酶，储备浓度2000U/ml(Enzymatics)

DNA引物，储备浓度5mM(Oligofactory)

质粒模板：ProTLx-K B5X4 LUX 15-0-15-10-15AT-STEM，储备浓度0.1g/l(内部生产)

无核酸酶的水(Sigma Aldrich)

氯化镁，储备浓度2M(Sigma Aldrich)

Tris-碱(Thermo Fisher Scientific)

Tris-HCl(Sigma Aldrich)

NaCl(Sigma Aldrich)

EDTA，储备浓度0.5M(Sigma Aldrich)

PEG 8000(Applichem)

乙醇(Thermo Fisher Scientific)

GeneRuler 1kb+DNA梯状条带(Thermo Fisher Scientific)

20倍储备的TAE缓冲液(Thermo Fisher Scientific)

氯化钾(Sigma Aldrich)

氯化锂(Sigma Aldrich)

氯化铯(Sigma Aldrich)

氯化铵(Sigma Aldrich)

硫酸铵(Thermo Fisher Scientific)

实施例1

在不同浓度的镁离子和核苷酸盐(dNTP盐)(用锂、钠、钾、铯和铵阳离子作为抗衡离子)下的滚环扩增(RCA)反应；对DNA产量的影响。

介绍

反应缓冲液中镁离子的浓度对于通过DNA聚合酶最佳合成DNA至关重要。据报道，低镁离子浓度可导致合成很少的DNA或不合成DNA，而高浓度通常会导致产生非特异性产物，并引起dNTP的错误整合以及随后的复制错误增加。因为镁与每个dNTP的磷酸盐部分结合，因此通常的实践是使用等于或高于所用dNTP浓度的镁离子浓度(Dean,F.B.,Nelson,J.R.,Giesler,T.L.,&Lasken,R.S.(2001).Rapid Amplification of Plasmid and PhageDNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling CircleAmplification.Genome Research,11(6),1095–1099.http://doi.org/10.1101/gr.180501)。镁-dNTP是通过DNA聚合酶进行高准确度DNA合成的绝对要求。镁还与DNA结合，并且可影响结构变化并在高于DNA合成所需浓度的浓度下在单独的链之间形成交联。

为了以工业上相关的量酶促生产DNA，必须最大化反应中使用的dNTP的浓度，以实现最高的DNA产量。另外，反应需要既高效又准确。可商购获得的dNTP是钠盐或锂盐，通常每分子具有4个金属一价阳离子。关于DNA合成的大多数出版物都忽略了抗衡离子的性质及其对镁-dNTP形成的可能影响。如果在反应中增加dNTP的浓度，一价抗衡离子的浓度可增加4倍，因此它们对DNA扩增反应有潜在的影响。

因此，了解DNA合成中的镁-一价镁抗衡离子动力学对于在可能最低的镁浓度下最大化DNA产量以实现DNA产物的最高准确性至关重要。

以下实验评估了递增的初始镁浓度(5mM、10mM、20mM和40mM)和dNTP的不同盐对通过RCA(滚环扩增)扩增的DNA的产量的影响。

反应设置

如下在100μl规模上设置反应：制备变性混合物，并置于室温下，同时组装反应混合物。然后将它们混合，并加入DNA聚合酶和焦磷酸酶。表1示出了实验方案。

在处理之前，将RCA反应在30℃孵育最少48小时。

表1-RCA反应组分

样品处理程序

RCA 48小时后，向MgCl₂加入1.5倍摩尔过量的EDTA，并用水使反应达到800μl体积。将它们剧烈振摇15分钟，并置于旋转器上，直到反应完全混合。然后通过加入200μl 5MNaCl使反应在1M NaCl中达到1ml。然后通过进一步添加100μl 50％(w/v)PEG 8000使多连体DNA沉淀。将混合物剧烈振摇15分钟以确保完全沉淀，然后在台式离心机中以13,000rpm旋转10分钟。小心倒出上清液，并用500μl 100％乙醇洗涤沉淀。将沉淀在台式离心机中以13,000rpm再次离心10分钟，然后小心倒出乙醇上清液。将沉淀干燥5分钟以蒸发残留的乙醇，将其重悬于1ml水中，并置于旋转器上过夜。

使用Implen NP80超微量分光光度计(nanophotometer)根据UV吸收测量结果量化反应DNA浓度。校正了反应体积的10倍增加的数据，浓度以相对于所用的dNTP浓度的g/l原始体积表示。

结果

表2至5和图1和2表明，镁的初始浓度和不同dNTP盐的初始浓度影响原始DNA的产量。括号中的值表示每种类型的dNTP盐达到最高DNA产量时镁/dNTP的比例。

表2-反应浓度为5mM MgCl₂。峰值产量以粗体突出显示，括号中的数字是镁/dNTP的比例：

表3-反应浓度为10mM MgCl₂。峰值产量以粗体突出显示，括号中的数字是镁/dNTP的比例：

表4-反应浓度为20mM MgCl₂。峰值产量以粗体突出显示，括号中的数字是镁/dNTP的比例：

表5-反应浓度为40mM MgCl₂。峰值产量以粗体突出显示，括号中的数字是镁/dNTP的比例：

表2至表5中的数据表明，使用非商购获得的钾、铵和铯dNTP盐获得最高的DNA产量。通过使用这些dNTP盐抗衡离子并将镁浓度提高到40mM，可以使用起始浓度最高至50mM的dNTP，并通过Phi29 DNA聚合酶实现高效转化成DNA。

锂-dNTP是较差的用于DNA合成的底物，与其他一价阳离子相比，其所需的镁水平高得多。实际上，在仅20mM dNTP的浓度下就发生40mM镁时的DNA峰值产量(4.328g/l)。钠-dNTP的性能优于锂等同物，采用30mM dNTP达到40mM镁时的DNA峰值产量(6.897g/l)。

铵是最好的dNTP抗衡离子，在起始浓度最高的dNTP(50mM dNTP和40mM MgCl₂)下达到最高的DNA产量(13.44g/l)，同时保持镁/dNTP的比例为0.8。数据趋势表明，通过进一步增加MgCl₂的浓度，应当可以进一步提高铵-dNTP的起始浓度及其整合到DNA中。

钾-dNTP在高dNTP浓度(50mM和40mM MgCl₂)下达到的DNA的产量和镁/dNTP的比例为0.80方面也优于其锂和钠对应物。在反应条件下，钾-dNTP的性能几乎与铵-dNTP相当。

在该方法中，在5mM和10mM的MgCl₂浓度下，采用铯-dNTP在起始浓度为25mM和30mM时，分别达到最高的DNA产量(5.719g/l和8.262g/l)。在5mM MgCl₂和25mM dNTP时镁/dNTP的比例为0.2，是所有显示数据中最低的。因此，在以下条件下使用铯-dNTP是有利的：当有益于(有益于DNA扩增过程的结果)使用最低可能浓度的镁离子，同时仍能产生高产量时。

在所研究的其他单阳离子中，铵离子是独特的，因为它是多原子的并且完全是非金属的。它可充当pH缓冲剂，并且在其pKa为9.24时，它作为50％氨(NH₃)的水溶液存在。NH₃的挥发性允许使用对于金属单阳离子是不可能的DNA处理技术，例如低压蒸发。

图1是表2至5中显示的数据的图形表示，并示出了对应于在不同浓度的氯化镁下总初始/起始核苷酸盐浓度(mM)的所获得的原始DNA产量(g/l)相对于理论DNA产量(g/l)的图。

图2是给出最大原始DNA产量的dNTP盐浓度(mM)相对于不同镁离子反应浓度的图。它清楚地表明，锂-dNTP和钠-dNTP对镁的依赖性最高，但是其他抗衡离子对镁的依赖性降低。

表6包括在不同的配位数时一价抗衡离子的离子半径。抗衡离子的尺寸(相对于镁)与利用高水平的dNTP所需的镁浓度之间存在明确的关系。较大的阳离子(例如钾、铯和铵)远优于钠，尤其远优于锂。

表6-抗衡离子的原子半径：

参考：http://abulafia.mt.ic.ac.uk/shannon/ptable.php,Shriver&Atkins

因此，通过选择性使用dNTP盐抗衡离子，可以提高工业过程中的DNA产量。这可以通过抗衡离子对dNTP、DNA和释放的磷酸根(PO₄ ^3-)阴离子的亲和力差异以及如实施例6所示的与二价镁阳离子的竞争动力学来介导。

实施例2

在不同浓度的镁离子和固定浓度的dNTP盐(采用锂、钠、钾、铯和铵阳离子作为抗衡离子)下的滚环扩增(RCA)反应；对DNA产量的影响。

介绍&反应设置

设计这一实验以确定开始时在该方法中整合固定量的dNTP(10mM)所需的最低镁离子浓度。RCA反应和处理如实施例1中所述来进行。在开始时，在该方法中将dNTP(作为锂、钠、钾、铯和铵盐)的浓度固定为10mM，并在实施例1所用的标准RCA缓冲液中在补充有2mM、4mM、6mM、8mM和10mM MgCl₂的情况下进行反应。

结果

结果表明，与广泛持有的观点相反，有效的dNTP整合所需的镁/dNTP的比例为至少1：1，当更换为具有与锂不同的抗衡离子的dNTP时，可以将RCA反应中的镁水平降低到远低于这一比例的水平，同时额外地提高DNA产量。

从图3可以看出，钠-dNTP和锂-dNTP的产量都强烈依赖于镁水平。尽管钾-dNTP在2mM MgCl₂下产生的DNA略有减少，但是这种形式的dNTP盐以及铯-dNTP和铵-dNTP对镁离子浓度的依赖性较低。这表明，在不考虑dNTP抗衡离子类型的情况下，最佳镁/dNTP的比例为1：1的一般假设具有误导性。数据表明，使用锂和钠的替代抗衡离子可将这一比例降低至0.2：1。

实施例3

在最少缓冲液中在固定水平的镁离子和递增浓度的dNTP盐(用锂、钠、钾和铵阳离子作为抗衡离子)下进行滚环扩增(RCA)反应；对DNA产量的影响。

介绍&反应设置

为了消除可能的缓冲液组分的抗衡离子作用，接下来在最少缓冲液中进行实验，最少缓冲液仅由补充有5mM MgCl₂的30mM Tris HCl(pH7.9)组成。这些反应考查了递增的起始dNTP盐浓度(从2.5mM到20mM dNTP，其作为锂、钠、钾或铵盐提供)在含有5mM MgCl₂的反应中的影响。

表7-具有最少缓冲液的RCA反应组分

如实施例1所述进行DNA处理和定量。

结果如图4所示。

数据显示，在不存在标准反应缓冲液中存在的30mM KCl和5mM(NH₄)₂SO₄的情况下，RCA进行。观察到的相对于具有可变抗衡离子的dNTP盐浓度产量增加的趋势与实施例1中给出的数据一致，确定铵-dNTP的性能优于其他抗衡离子dNTP盐。

图4证实，改变dNTP盐抗衡离子能够使RCA在更高浓度的dNTP下进行，并相应地提高产量。

表8-在5mM MgCl₂下在最少缓冲液中进行的各种抗衡离子dNTP的原始DNA产量。峰值产量以粗体突出显示，镁/dNTP的比例显示在括号中：

实施例4

在不同浓度的镁离子和铵-dNTP下的滚环扩增(RCA)反应来确定最高的原始DNA产量

介绍&反应设置

这些反应旨在扩展实施例3(图4)中所示的实验数据，并通过在不同镁浓度下增加铵-dNTP的浓度来找到DNA产量的极限。基本上如实施例3中所述，在最少缓冲液中进行RCA反应和DNA处理。

结果

表9-在不同MgCl₂浓度下在最少缓冲液中进行的铵-dNTP的原始DNA产量。峰值产量以粗体突出显示，括号中的数字为镁/dNTP的比例：

数据表明，通过使用铵抗衡离子dNTP，可以进一步提高反应中dNTP的起始浓度(多达80mM)并产生非常高水平的DNA。通过在最少缓冲液中显著增加MgCl₂的浓度至80mM，实现这一点。即使在80mM MgCl₂和80mM铵-dNTP下，也很明显未达到DNA的峰值产量。添加更多的dNTP应进一步提高DNA产量。在预期镁/dNTP的比例将<1的条件下，MgCl₂和铵-dNTP的浓度增加(超过80mM)应产生更高水平的DNA。

实施例5

测定在水-氯化镁混合物中RCA的生产率极限。

介绍&反应设置

然后在不含有Tris缓冲剂或其他常规上对于最佳DNA扩增必不可少的盐的反应培养基中，在10mM、20mM和40mM浓度的MgCl₂和一定范围的钾-、铯-和铵-dNTP下进行DNA扩增实验。此时，省去了锂和钠-dNTP，因为筛选时的其他阳离子均胜过这两种阳离子。除了镁和dNTP抗衡离子外，反应中仅有的其他阳离子还包含来自用于模板变性的NaOH的5mM钠离子。进行实验以确定dNTP本身和反应的磷酸盐副产物是否能够维持促进Phi29 DNA聚合酶活性的pH水平和有效DNA引发所需的物理化学条件。

结果

表10-不含Tris缓冲剂的RCA反应组分

基本上按照实施例1所述进行DNA处理和定量。

表11-含10mM MgCl₂的无缓冲液培养基。峰值产量以粗体突出显示，括号中的数字为镁/dNTP的比例：

表12-含20mM MgCl₂的无缓冲液培养基。峰值产量以粗体突出显示，括号中的数字为镁/dNTP的比例：

表13-含40mM MgCl₂的无缓冲液培养基。峰值产量以粗体突出显示，括号中的数字为[Mg]/[dNTP]的比例：

实验数据表明，在不存在Tris缓冲液的情况下，用钾-dNTP进行的反应给出了可变的结果。另一方面，采用递增浓度的镁离子和dNTP，铯-dNTP和铵-dNTP给出逐渐更高的DNA产量。与标准缓冲环境相比，铯-dNTP在这些无缓冲条件下的性能显著更好(参见表5)。在40mM MgCl₂和50mM铯-dNTP(镁/dNTP的比例为0.80)下记录到高的DNA产量。在缓冲或无缓冲条件下使用铵-dNTP的DNA产量之间没有显著差异。在40mM MgCl₂和60mM铵-dNTP下观察到高的DNA产量(镁/dNTP的比例为0.67)。

实施例6

其他抗衡离子盐对使用铵-dNTP的DNA扩增的影响

介绍&反应设置

进行这一实验以证明锂、钠和钾阳离子对通过使用铵-dNTP的RCA获得的DNA产量的影响。

表14-反应组分：

如表14所示建立反应。进行了四组实验，分别含有起始浓度为17.5mM、25mM、35mM和50mM铵-dNTP以及5mM、10mM、20mM和40mM MgCl₂。向每组分别以70mM、100mM、140mM和200mM的总浓度添加LiCl、NaCl、KCl或NH₄Cl。这导致了与dNTP铵抗衡离子浓度竞争的另外的阳离子浓度。此外，添加NH₄Cl时铵的浓度增加了一倍。每组实验的镁/dNTP的比例为低于1.0。

基本上如实施例1所述进行DNA处理和定量。

结果如图5所示。

图5显示，使用铵-dNTP时，铯、铵和钾离子对DNA的合成不具有抑制作用。此外，铵浓度甚至可以加倍而不影响DNA产量。

相比之下，锂和钠具有抑制作用，锂比钠更具抑制作用。在此基础上，在工业DNA生产过程中应避免锂和钠的存在，这些过程需要高浓度的dNTP以实现高DNA产量。

实施例7

研究dNTP对DNA合成反应的缓冲作用

介绍&反应设置

进行这一实验以观察在没有任何具体缓冲剂的情况下dNTP盐缓冲反应混合物的能力。

表15-在10mM MgCl₂中进行pH测量的实验设置

表16-在20mM MgCl₂中进行pH测量的实验设置

表17在30mM MgCl₂中进行pH测量的实验设置

将反应组分按上表所示的比例混合，使最终体积为50μl。然后使用配备有

Micro pH电极的Mettler Toledo SevenCompact^TMS220pH计测量混合物的pH。

图6显示了在10mM、20mM和40mM MgCl₂的存在下一系列dNTP浓度(铯盐和铵盐)的测量的pH值。NaOH浓度是用于使DNA合成反应中使用的模板DNA变性的浓度。出于本实验的目的，所有其他DNA合成反应组分均已省略，因为已知它们不影响起始pH。在所有情况下，都未添加特定的pH稳定缓冲液(例如Tris)。在dNTP盐浓度小于30mM时，铵dNTP相对于铯dNTP具有更大的缓冲能力是明显且预期的。有趣的是，在dNTP盐浓度大于30mM时，铯dNTP反应和铵dNTP反应的平均pH值是相似的，分别为约7和7.5。数据表明，当以足够的浓度存在时，dNTP的磷酸根基团本身用于将pH调节至约7。因为DNA聚合酶可以在约7的pH值下有效运行，因此这对于需要使用高浓度dNTP盐的工业规模合成反应而言是一种优势。重要的是，它表明对于工业规模的反应，DNA合成可以在无或低浓度的特定缓冲液的情况下进行以实现高生产率。

Claims

1.一种用于酶促合成DNA的无细胞工艺方法，其包括使用核苷酸盐，其中所述盐包含离子半径大于钠离子的离子半径的一价阳离子。

2.根据权利要求1所述的无细胞工艺方法，其中所述核苷酸盐以大于10mM的浓度存在。

3.一种用于酶促合成DNA的无细胞工艺方法，其包括使用核苷酸盐，其中所述核苷酸盐以至少10mM的浓度存在，并且为：

(a)核苷酸盐，其包含离子半径大于钠离子的离子半径的一价阳离子，或

(b)两种或更多种核苷酸盐，每种盐包含不同的一价阳离子，其中至少一种阳离子的离子半径大于钠离子的离子半径。

4.根据任一前述权利要求所述的无细胞工艺方法，其中所述核苷酸盐以至少15mM、至少20mM、至少25mM、至少30mM、至少35mM或至少40mM的浓度存在。

5.根据任一前述权利要求所述的无细胞工艺方法，其中所述一种或多种一价阳离子独立地选自碱土金属、过渡金属或多原子离子。

6.根据权利要求5所述的无细胞工艺方法，其中所述一种或多种一价阳离子独立地选自以下列表，其包括钾、铵、铵的衍生物、铷、铯或钫。

7.根据任一前述权利要求所述的无细胞工艺方法，其中所述无细胞工艺方法还包括使用一种或多种引物或引物酶。

8.根据任一前述权利要求所述的无细胞工艺方法，其中所述无细胞工艺方法还包括使用模板。

9.根据任一前述权利要求所述的合成DNA的无细胞工艺方法，其中所述无细胞工艺方法还包括使用一种或多种二价金属阳离子，所述二价金属阳离子优选选自以下列表，其包括镁、锰、钙、铍、锌和锶。

10.根据权利要求9所述的无细胞工艺方法，其中在反应混合物中所述二价金属阳离子与核苷酸的比例等于或小于1：1，优选小于1：1。

11.根据任一前述权利要求所述的无细胞工艺方法，其中所述工艺方法使用最大浓度为10mM的核苷酸钠和/或锂盐。

12.根据任一前述权利要求所述的无细胞工艺方法，其中所述工艺方法还包括使用化学变性剂，优选氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵，以及焦磷酸酶。

13.根据权利要求12所述的无细胞工艺方法，其中，不向该工艺方法中添加pH缓冲剂，并且优选地，不添加另外的盐或去污剂。

14.根据权利要求13所述的无细胞工艺方法，其中所述核苷酸盐包含铯离子。

15.根据权利要求12所述的无细胞工艺方法，其中添加pH缓冲剂，但不添加另外的盐或去污剂。

16.根据权利要求15所述的无细胞工艺方法，其中所述核苷酸盐包含铵离子。

17.根据任一前述权利要求所述的无细胞工艺方法，其中所述工艺方法用于大规模合成DNA，优选至少3g/l。

18.包含铯阳离子的核苷酸盐在酶促无细胞合成DNA中的用途。

19.根据权利要求18所述的用途，其中酶促无细胞合成DNA是在低水平的二价阳离子的存在下进行的，任选地，二价阳离子与核苷酸的比例为0.2：1至0.8：1，优选0.2：1至0.5：1。

20.根据权利要求18所述的用途，其中无细胞合成DNA是在最少缓冲剂中进行的，所述缓冲剂任选地仅包含pH缓冲剂，不含去污剂或另外的盐。

21.一种使用DNA聚合酶扩增DNA模板的方法，其中需要将反应混合物中二价阳离子与核苷酸的比例保持在0.5：1或更低，所述方法包括使用包含铯离子的核苷酸盐。

22.包含铷阳离子的核苷酸盐在酶促无细胞合成DNA中的用途。

23.一种扩增DNA模板的无细胞方法，所述方法包括使所述模板和DNA聚合酶与盐形式的核苷酸接触，所述核苷酸的量等于或大于40mM，优选大于60mM或任选地大于80mM，其中所述盐包含铵离子。

24.一种酶促DNA合成，其是在二价阳离子优选镁的浓度降低的条件下进行的，包括使用盐形式的核苷酸，所述盐包含离子半径大于钠离子的离子半径的一价阳离子。

25.根据任一前述权利要求所述的无细胞工艺方法、用途、方法、无细胞方法或酶促合成，其中酶是DNA聚合酶，任选地是链置换型聚合酶。