CN113056455A - 异噁唑甲酰胺化合物及其用途 - Google Patents

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CN113056455A CN201980075886.7A CN201980075886A CN113056455A CN 113056455 A CN113056455 A CN 113056455A CN 201980075886 A CN201980075886 A CN 201980075886A CN 113056455 A CN113056455 A CN 113056455A
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Abstract

提供了已表明可用于治疗听觉损失或平衡障碍的具有式(I)的化合物或或其药学上可接受的盐：式(I)，其中R1和Y如本文所定义。

Description

异噁唑甲酰胺化合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年9月21日提交的国际申请专利申请号PCT/CN2018/106939的优先权权益，所述申请的内容通过引用并入本文。
技术领域
本披露涉及化合物、包含此类化合物的组合物、及其用于治疗听觉损失或平衡障碍的用途。
背景技术
内耳中的毛细胞对于听觉和平衡是必不可少的。如果毛细胞以任何方式受损，人类将遭受听觉损失或平衡障碍。人在出生时内耳的每个耳蜗仅包含约15,000个毛细胞，尽管这些细胞可能由于各种遗传或环境因素而损失，但无法偿还这些损失或损伤的细胞。然而，转录因子Atoh1的过表达可以从耳蜗的感觉器官和科尔蒂(Corti)器官中的上皮细胞诱导感觉毛细胞(Zheng和Gao,Nat Neurosci[自然神经科学]2000；3:580-586；Kawamoto等人,J Neurosci[神经科学杂志]2003；23:4395-4400；Izumikawa M等人,Nat Med.[自然医学]2005；11:271-276；Gubbels等人,Nature[自然]2008；455:537-541)。因此，需要找到诱导Atoh1表达并促进哺乳动物毛细胞再生的治疗组合物和方法。
发明内容
本披露提供了化合物、其药学上可接受的盐、其药物组合物及其组合，它们可用于治疗听觉损失或平衡障碍。本披露进一步提供了治疗听觉损失或平衡障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本披露的化合物或其药学上可接受的盐。
本披露的一个方面提供了具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003070730780000021
其中：
R1选自：
Figure BDA0003070730780000022
Y选自
Figure BDA0003070730780000023
RYA和RYB独立地选自H、-S(＝O)2NH(R2)、-(C＝O)NH(R2)、-NH(C＝O)OCH2(C＝O)NH(R2)、-CH2OH、-CH3和-OH；
RYC和RYD独立地选自H、-CN、-OH、-(C＝O)NH2和-S(＝O)2NH(R2)；
RYE和RYF独立地选自H、-CN、-(C＝O)NH(R2)、-OH和-S(＝O)2NH(R2)；
RYG选自H、-CN、-OH、-F、-(C＝O)NH(R2)和-S(＝O)2NH(R2)；
RYH选自-CH3、-(X1)-(C＝O)NH(R2)和-(X1)-S(＝O)2NH(R2)；
RYI选自-H和-(C＝O)NH(R2)；
X1是C0-2亚烷基，任选地被-OH取代；
R2独立地选自H、-CH3、-CH(CH3)CN、-CH2CH2CN、
Figure BDA0003070730780000024
Figure BDA0003070730780000025
并且
W是O或CH2。
本披露的另一个方面提供了药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或其子式、以及一种或多种药学上可接受的载体。
在本披露的又另一个方面，提供了药物组合，所述药物组合包含治疗有效量的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或其子式、以及一种或多种治疗活性剂。
在本披露的又另一个方面，提供了用于治疗听觉损失或平衡障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或其子式。
在本披露的又另一个方面，提供了用于制备具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或其子式的方法。
具体实施方式
本文描述了本披露的各种(列举的)实施例。将认识到的是，每个实施例中指定的特征可以与其他指定的特征组合，以提供本披露的另外的实施例。
实施例1：一种具有式(I)的化合物
Figure BDA0003070730780000031
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1选自：
Figure BDA0003070730780000032
Y选自
Figure BDA0003070730780000033
RYA和RYB独立地选自H、-S(＝O)2NH(R2)、-(C＝O)NH(R2)、-NH(C＝O)OCH2(C＝O)NH(R2)、-CH2OH、-CH3和-OH；
RYC和RYD独立地选自H、-CN、-OH、-(C＝O)NH2和-S(＝O)2NH(R2)；
RYE和RYF独立地选自H、-CN、-(C＝O)NH(R2)、-OH和-S(＝O)2NH(R2)；
RYG选自H、-CN、-OH、-F、-(C＝O)NH(R2)和-S(＝O)2NH(R2)；
RYH选自-CH3、-(X1)-(C＝O)NH(R2)和-(X1)-S(＝O)2NH(R2)；
RYI选自-H和-(C＝O)NH(R2)；
X1是C0-2亚烷基，任选地被-OH取代；
R2独立地选自H、-CH3、-CH(CH3)CN、-CH2CH2CN、
Figure BDA0003070730780000041
Figure BDA0003070730780000042
并且
W是O或CH2；
其中当R1是：
Figure BDA0003070730780000043
Y不是：
Figure BDA0003070730780000044
Figure BDA0003070730780000051
当R1是：
Figure BDA0003070730780000052
Y不是：
Figure BDA0003070730780000053
Figure BDA0003070730780000061
Figure BDA0003070730780000062
并且
当R1是：
Figure BDA0003070730780000063
Y不是：
Figure BDA0003070730780000064
实施例2：一种具有式(I)的化合物
Figure BDA0003070730780000065
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1选自：
Figure BDA0003070730780000066
Y选自
Figure BDA0003070730780000067
RYA和RYB独立地选自H、-S(＝O)2NH(R2)、-(C＝O)NH(R2)、-NH(C＝O)OCH2(C＝O)NH(R2)、-CH2OH、-CH3和-OH；
RYC和RYD独立地选自H、-CN、-OH、-(C＝O)NH2和-S(＝O)2NH(R2)；
RYE和RYF独立地选自H、-CN、-(C＝O)NH(R2)、-OH和-S(＝O)2NH(R2)；
RYG选自H、-CN、-OH、-F、-(C＝O)NH(R2)和-S(＝O)2NH(R2)；
RYH选自-CH3、-(X1)-(C＝O)NH(R2)和-(X1)-S(＝O)2NH(R2)；
RYI选自-H和-(C＝O)NH(R2)；
X1是C0-2亚烷基，任选地被-OH取代；
R2独立地选自H、-CH3、-CH(CH3)CN、-CH2CH2CN、
Figure BDA0003070730780000071
Figure BDA0003070730780000072
并且
W是O或CH2；
其中所述化合物不是：
Figure BDA0003070730780000073
Figure BDA0003070730780000081
Figure BDA0003070730780000091
实施例3：如权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
RYG选自H、-CN、-OH、-F、-(C＝O)NH2和-S(＝O)2NH2；
RYH选自-CH3、-(X1)-(C＝O)NH2和-(X1)-S(＝O)2NH2；
RYI选自-H和-(C＝O)NH2；
X1是C1-2亚烷基，任选地被-OH取代。
实施例4：如实施例1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是：
Figure BDA0003070730780000092
实施例5：如实施例1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是：
Figure BDA0003070730780000101
实施例6：如实施例1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是：
Figure BDA0003070730780000102
实施例7：如实施例1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
Y是
Figure BDA0003070730780000103
实施例8：如实施例1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
Y是
Figure BDA0003070730780000104
实施例9：如实施例1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
Y是
Figure BDA0003070730780000105
实施例10：如实施例1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
Y是
Figure BDA0003070730780000106
实施例11：如实施例1所述的化合物或其药学上可接受的盐，选自：N-(5-((3S,4S)-4-氨基甲酰基-3-氰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3S,4R)-4-氰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-(N-(氧杂环丁烷-3-基)氨磺酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-(N-(2-氰基乙基)氨磺酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；2-(甲基氨基)-2-氧代乙基(1-(5-(5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺基)戊基)氮杂环丁烷-3-基)氨基甲酸酯；N-(5-(3-氨磺酰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨磺酰基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基-3-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基-3-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-氨磺酰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；5-(4-氟苯基)-N-(5-(4-氨磺酰基哌啶-1-基)戊基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4R)-4-氰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-(3-氨基-3-氧代丙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-(2-氨基-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-(2-氨磺酰基乙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-氨基甲酰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基-3-羟基氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；5-(5-氟噻吩-2-基)-N-(5-(3-(甲基氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(5-氟噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-((1-氰基乙基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基-4-甲基哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-氨基甲酰基-4-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；5-(4-氟苯基)-N-(5-(3-(((1S,2R)-2-羟基环戊基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4S)-4-氨基甲酰基-3-氟哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺和N-(5-((3S,4S)-4-氨基甲酰基-3-氟哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4S)-3-氨基甲酰基-4-氰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-氨基甲酰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-氨基甲酰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3S,4S)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3S,4R)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4S)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4R)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3S,4S)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4S)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4R)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3S,4R)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3S,4R)-3-氰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺和N-(5-((3S,4S)-3-氰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4S)-3-氨基甲酰基-4-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺和N-(5-((3R,4R)-3-氨基甲酰基-4-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-((4-羟基四氢呋喃-3-基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-(3-氨基-2-羟基-3-氧代丙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺。
实施例12：如实施例1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自任一个或多个例示的实例。
实施例13：一种药物组合物，所述药物组合物包含：
治疗有效量的如实施例1-12中任一项所述的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、以及
一种或多种药学上可接受的载体。
实施例14：一种药物组合，所述药物组合包含：
治疗有效量的如实施例1-12中任一项所述的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、以及
一种或多种治疗活性剂。
实施例15：一种治疗听觉损失或平衡障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如实施例1-12中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
实施例16：如实施例15所述的方法，其中所述受试者患有部分或完全听觉损失。
实施例17：如实施例15或16所述的方法，其中所述听觉损失是获得性听觉损失。
实施例18：如实施例15-17中任一项所述的方法，其中所述听觉损失是感觉神经性听觉损失。
实施例19：如实施例15-18中任一项所述的方法，其中所述听觉损失或平衡障碍与感觉毛细胞的损伤或损失有关。
实施例20：如实施例15-19中任一项所述的方法，其中所述听觉损失或平衡障碍是由急性或慢性暴露于耳毒性化合物、急性或慢性暴露于噪音、衰老、自身免疫性疾病、物理创伤、炎症或病毒引起的。
实施例21：如实施例15-20中任一项所述的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐促进、刺激或诱导感觉毛细胞再生。
实施例22：如实施例1-12中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，用作药物。
实施例23：如实施例1-12中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制造用于治疗听觉损失或平衡障碍的药物中的用途。
本披露的其他特征在示例性实施例的以上描述中应变得显而易知，这些示例性实施例为了说明本披露而给出，且不旨在对其进行限制。
定义
出于解释本说明书的目的，将应用下面的定义，并且在适宜的情况下，以单数形式使用的术语还包括复数形式。除非上下文中另有明确说明，否则本说明书中使用的术语具有以下含义。
在本文描述的所有方法能够以任何适合顺序进行，除非本文另外指示或另外与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“如”)的应用仅旨在更好地说明本披露，而不对另外要求保护的本披露范围做出限制。
术语“一个/种(a/an)”、“所述(the)”以及在本披露的上下文中使用的类似术语(特别是在权利要求的上下文中)应被解释为涵盖单数和复数二者，除非本文另外指示或与上下文明显矛盾。
如本文所用，术语“杂原子”是指氮(N)、氧(O)或硫(S)原子，尤其是氮或氧。
除非另外指示，否则假定具有不饱和价数的任何杂原子具有足以满足价数的氢原子。
如本文所用，术语“烷基”是指具有通式CnH2n+1的烃基。烷烃基团可以是直链的或支链的。例如，术语“C1-C6烷基”或“C1至C6烷基”是指含有1至6个碳原子的单价、直链或支链脂族基团(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、新戊基、3,3-二甲基丙基、己基、2-甲基戊基等)。
术语“C0-C6亚烷基”是指键(当碳原子数目为0)或含有1至6个碳原子的二价亚烷基基团(可以是直链或支链的)(例如，亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚正丙基(-CH2CH2CH2-)、亚异丙基(-CH(CH3)CH2-)、亚正丁基(-CH2CH2CH2CH2-)、亚异丁基、亚叔丁基、亚正戊基、亚异戊基、亚新戊基、亚正己基等)。
术语“烷氧基”是指连接至氧的烷基，其还可表示为-O-R或-OR，其中R表示烷基基团。“C1-C6烷氧基”或“C1至C6烷氧基”旨在包括C1、C2、C3、C4、C5和C6烷氧基基团。烷氧基基团的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如，正丙氧基和异丙氧基)和叔丁氧基。类似地，“烷硫基”或“硫代烷氧基”表示经由硫桥附接的具有指定碳原子数的如上文所定义的烷基基团；例如甲基-S-和乙基-S-。
“卤素”或“卤代”可以是氟、氯、溴或碘(作为取代基优选的卤素是氟和氯)。
“卤代烷基”旨在包括被一种或多种卤素取代的、具有指定碳原子数的支链和直链饱和脂族烃基。因此，“C1-C6卤代烷基”或“C1至C6卤代烷基”旨在包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氯甲基、五氟乙基、五氯乙基、2,2,2-三氟乙基、七氟丙基和七氯丙基。
“卤代烷氧基”表示被由氧桥附接的具有指定碳原子数的如上文所定义的卤代烷基。例如，“C1-C6卤代烷氧基”或“C1至C6卤代烷氧基”旨在包括但不限于三氟甲氧基、二氟甲氧基、2,2,2-三氟乙氧基和五氟乙氧基。类似地，“卤代烷基硫基”或“硫代卤代烷氧基”表示具有经由硫桥附接的指定碳原子数的、如上文所定义的卤代烷基基团；例如三氟甲基-S-和五氟乙基-S-。
术语“环烷基”是指作为完全氢化的环的非芳香族碳环，包括具有指定碳原子数的单环、双环或多环的环系统。因此，“C3-C8环烷基”或“C3至C8环烷基”旨在包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基和降莰基。
术语“芳基”是指6元至10元芳香族碳环部分，所述部分具有单环系统(例如苯基)或稠环系统(例如萘)。典型的芳基基团是苯基基团。
术语“杂芳基”是指在5元至10元芳香族环系统内含有至少一个杂原子(例如，氧、硫、氮或其组合)的芳香族部分(例如，吡咯基、吡啶基、吡唑基、吲哚基、吲唑基、噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、噁唑基、异噁唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、三嗪基、嘧啶基、吡嗪基、噻唑基、嘌呤基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、苯并吡喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、1H-苯并[d][1,2,3]三唑基等)。杂芳香族部分可以由单环或稠合环系统组成。典型的单杂芳基环是含有一至三个独立地选自氧、硫和氮的杂原子的5至6元环，并且典型的稠合杂芳基环体系是含有一至四个独立地选自氧、硫和氮的杂原子的9至10元环体系。稠合杂芳基环体系可以由稠合在一起的两个杂芳基环或稠合至芳基(例如苯基)的杂芳基组成。
术语“杂环基”是指饱和或部分饱和的(但非芳族的)环或环体系，其包括具有指定的环原子数目的单环、稠合环、桥环和螺环。例如，杂环基包括但不限于5至6元杂环基、4至10元杂环基、4至14元杂环基和5至14元杂环基。除非另有指定，否则杂环基含有1至7个、1至5个、1至3个或1至2个独立地选自由氮、氧和硫组成的组的杂原子作为环成员，其中N和S也可以任选地被氧化成各种氧化态。杂环基团可以附接在杂原子或碳原子上。此类杂环基的实例包括但不限于氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、哌啶、哌嗪、吡咯啉、吡咯烷、咪唑烷、咪唑啉、吗啉、四氢呋喃、四氢噻吩、四氢噻喃、四氢吡喃、1,4-二噁烷、1,4-氧硫杂环己烷、六氢嘧啶基、3-氮杂双环[3.1.0]己烷、氮杂环庚烷、3-氮杂双环[3.2.2]壬烷、十氢异喹啉、2-氮杂螺[3.3]庚烷、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷、2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷、8-氮杂-双环[3.2.1]辛烷、3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷、3-氧杂-8-氮杂-双环[3.2.1]辛烷、8-氧杂-3-氮杂-双环[3.2.1]辛烷、2-氧杂-5-氮杂-双环[2.2.1]庚烷、2,5-二氮杂-双环[2.2.1]庚烷、1,4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸烷、3-氧杂-1,8-二氮杂螺[4.5]癸烷、八氢吡咯并[3,2-b]吡咯等。
如本文所指，术语“取代的”意指至少一个氢原子被非氢基团替代，条件是维持正常的化合价并且取代产生稳定的化合物。当取代基是酮基(即，＝O)时，则原子上的2个氢被替代。酮基取代基不存在于芳香族部分上。
在本披露化合物上存在氮原子(例如胺)的情况下，可以通过用氧化剂(例如，mCPBA和/或过氧化氢)处理将其转化为N-氧化物以提供本披露的其他化合物。因此，所示和要求保护的氮原子被视为涵盖所示的氮及其N-氧化物(N→O)衍生物两者。
当任何变量在化合物的任何成分或化学式中出现不止一次时，则每次出现时其定义独立于其他每次出现时的其定义。因此，例如，如果显示一个基团经0-3个R基团取代，则所述基团可以未经取代的或经至多三个R基团取代，并且在每次出现时，R是独立于R的定义选择的。
当显示连至取代基的键与连接环中两个原子的键交叉时，则此类取代基可键合至所述环上的任何原子。当在未指示取代基中键合至具有给定式的化合物的其余部分的原子的情况下列出取代基时，则这种取代基可经由这种取代基中的任何原子键合。
取代基和/或变量的组合仅在此类组合产生稳定化合物的情况下是容许的。
如本领域普通技术人员将能够理解，例如，分子中的酮(-CH-C＝O)基团可以互变异构成其烯醇形式(-C＝C-OH)。因此，本披露旨在覆盖所有可能的互变异构体，即使当结构仅描述其中之一时也是如此。
短语“药学上可接受的”指示必须与包含配制品的其他成分和/或正用其治疗的哺乳动物在化学上和/或毒理学上相容的物质或组合物。
除非另外规定，否则术语“本披露的化合物”是指具有式(I)及其子式的化合物，以及异构体，例如立体异构体(包括非对映异构体、对映异构体和外消旋体)、几何异构体、构象异构体(包括旋转异构体和阻转异构体)、互变异构体、同位素标记的化合物(包括氘取代)、和固有形成的部分(例如，多晶型物、溶剂化物和/或水合物)。当存在能够形成盐的部分时，则同样包括盐，特别是药学上可接受的盐。
本领域普通技术人员将认识到，本披露的化合物可以含有手性中心，因此可以按不同的异构体形式存在。如本文所用，术语“异构体”是指具有相同分子式但原子的排列和构型不同的不同化合物。
“对映异构体”是一对立体异构体，它们是彼此不可重叠的镜像。对映异构体对的1:1混合物是“外消旋”混合物。所述术语用于在适当时指定外消旋混合物。当指定本披露化合物的立体化学时，使用常规的RS系统指定具有两个手性中心的已知相对和绝对构型的单一立体异构体(例如(1S,2S))；具有已知相对构型但绝对构型未知的单一立体异构体用星号表示(例如(1R*,2R*))；和具有两个字母的外消旋体(例如(1RS,2RS))是(1R,2R)和(1S,2S)的外消旋混合物；(1RS,2SR)是(1R,2S)和(1S,2R)的外消旋混合物)。“非对映异构体”是具有至少两个非对称原子，但其彼此非镜像的立体异构体。绝对立体化学根据Cahn-lngold-Prelog R-S系统指定。当化合物是纯的对映异构体时，每个手性碳的立体化学可以由R或S表示。未知绝对构型的拆分化合物可以取决于其在钠D线的波长处使平面偏振光旋转的方向(右旋或左旋)来指定(+)或(-)。可替代地，可以通过手性HPLC通过相应的对映异构体/非对映异构体的各自保留时间来定义拆分的化合物。
本文描述的某些化合物含有一个或多个非对称中心或轴，并且因此可以生成对映异构体、非对映异构体、以及可根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-的其他立体异构形式。
当化合物包含双键或一些其他赋予分子一定量的结构刚性的特征时，可能出现几何异构体。如果化合物含有双键，则取代基可以是E或Z构型。如果化合物含有二取代的环烷基，则环烷基取代基可以具有顺式或反式构型。
构象的异构体(或构象异构体)是可以绕一个或多个键旋转而不同的异构体。旋转异构体是通过仅绕一个键旋转而不同的构象异构体。
术语“阻转异构体”是指基于分子中受限制的旋转而产生的轴向或平面手性的结构异构体。
除非另外规定，否则本披露化合物意指包括所有此类可能的异构体，包括外消旋混合物、光学纯形式以及中间体混合物。光学活性(R)-和(S)-异构体可使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术(例如使用适当的溶剂或溶剂混合物在手性SFC或HPLC色谱柱(诸如大赛璐公司(DAICEL Corp.)提供的
Figure BDA0003070730780000191
和
Figure BDA0003070730780000192
或其他等效柱)上分离以实现良好分离)拆分。
本披露的化合物能以光学活性形式或外消旋形式分离。光学活性形式可以通过拆分外消旋形式或由光学活性起始材料合成来制备。用于制备本披露的化合物和其中产生的中间体的所有方法均被认为是本披露的一部分。当制备对映异构体或非对映异构体产物时，它们可以通过常规方法分离，例如通过色谱法或分步结晶法。
取决于工艺条件，本披露的终产物以游离(中性)或盐形式获得。这些终产物的游离形式和盐均在本披露的范围内。如果有此需要，可将化合物的一种形式转化成另一种形式。游离碱或酸可转化成盐；盐可转化成游离化合物或另一种盐；本披露的异构体化合物的混合物可分离成单独的异构体。
药学上可接受的盐是优选的。然而，其他盐可能适用，例如适用于可在制备期间采用的分离或纯化步骤，并因此被认为在本披露的范围内。
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所披露的化合物的衍生物，其中通过制成其酸盐或碱盐对母体化合物进行修饰。例如，药学上可接受的盐包括但不限于乙酸盐、抗坏血酸盐、己二酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、癸酸盐、氯化物/盐酸盐、氯脲鎓酸盐(chlortheophyllonate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、谷氨酸盐、戊二酸盐、羟乙酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐/羟基丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、黏酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八烷酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、苯乙酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、氨基磺酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐或昔萘酸盐形式。
可以用无机酸和有机酸形成药学上可接受的酸加成盐。可以衍生出盐的无机酸包括，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可衍生出盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。
可以用无机碱和有机碱形成药学上可接受的碱加成盐。可以衍生出盐的无机碱包括例如铵盐和来自元素周期表第I至XII列的金属。在某些实施例中，盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别合适的盐包括铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。可以衍生出盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺；取代的胺(包括天然存在的取代的胺)；环胺；碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙胺、苄星、胆碱盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇。
本披露的药学上可接受的盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱的形式与化学计算量的适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或者在两者的混合物中进行反应来制备；通常，非水性介质像醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇、或乙腈是优选的。合适的盐的清单见于Allen,L.V.,Jr.编,Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践],第22版,Pharmaceutical Press,London,UK[英国伦敦市医药出版社](2012)，该文献的披露内容通过引用特此并入。
含有能够充当氢键的供体和/或受体的基团的本披露化合物可与合适的共晶形成体形成共晶。这些共晶可通过已知的共晶形成程序由本披露化合物制备。此类程序包括在溶液中使本披露化合物与共晶形成体在结晶条件下研磨、加热、共升华、共熔或接触并分离借此形成的共晶。合适的共晶形成体包括WO 2004/078163中描述的那些。因此，本披露进一步提供了包含本披露化合物的共晶。
本文给出的任何式也旨在表示化合物的未标记形式以及同位素标记形式。同位素标记的化合物具有由本文给出的式描绘的结构，除了一个或多个原子被具有所选择的原子质量或质量数的原子替代。可以掺入本披露化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素，例如，分别是2H、3H、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl、123I、124I、125I。本披露包括如本文所定义的各种同位素标记的化合物，例如其中存在放射性同位素(如3H和14C)的那些化合物，或其中存在非放射性同位素(如2H和13C)的那些化合物。此类同位素标记的化合物可用于代谢研究(用14C)、反应动力学研究(例如用2H或3H)、检测或成像技术(如正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)，包括药物或底物组织分布测定)，或用于患者的放射性治疗。特别地，18F或标记的化合物对于PET或SPECT研究可能是特别期望的。
此外，用较重的同位素，特别是氘(即，2H或D)取代可以提供来源于更大的代谢稳定性(例如，体内半衰期延长或剂量需求减少或治疗指数改进)的某些治疗优点。应当理解，在此上下文中氘被认为是本披露的化合物的取代基。这种较重的同位素(特别是氘)的浓度可以由同位素富集因子来定义。如本文所用的术语“同位素富集因子”是指同位素丰度与指定同位素的天然丰度之间的比率。如果本披露化合物中的取代基指示氘，这样的化合物具有针对每个指定的氘原子的同位素富集因子为至少3500(在每个指定的氘原子上52.5％氘掺入)、至少4000(60％氘掺入)、至少4500(67.5％氘掺入)、至少5000(75％氘掺入)、至少5500(82.5％氘掺入)、至少6000(90％氘掺入)、至少6333.3(95％氘掺入)、至少6466.7(97％氘掺入)、至少6600(99％氘掺入)或至少6633.3(99.5％氘掺入)。
本披露的同位素标记的化合物通常可通过本领域技术人员已知的常规技术或者通过以下描述的方案或实例和制备中所披露的方法(或与本文描述的那些类似的方法)，通过用适当或容易获得的同位素标记的试剂取代在其他情况下使用的非同位素标记的试剂来制备。此类化合物具有多种潜在用途，例如作为测定潜在药物化合物与靶蛋白或受体结合的能力的标准品及试剂，或用于在体内或体外对结合于生物受体的本披露化合物成像。
术语“溶剂化物”是指本披露化合物与一种或多种溶剂分子(不论有机或无机)的物理性缔合。此物理性缔合包括氢键合。在某些情况下，溶剂化物能够分离(例如当一种或多种溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时)。溶剂化物中的溶剂分子可以规则排列和/或无序排列存在。溶剂化物可包含化学计量量或非化学计量量的溶剂分子。“溶剂化物”涵盖溶液相和可分离的溶剂化物两者。示例性溶剂化物包括但不限于水合物、乙醇化物、甲醇化物和异丙醇化物。溶剂化方法一般在本领域中是已知的。
如本文所用，“一种或多种多晶型物”是指一种或多种具有相同化学结构/组成但形成晶体的分子和/或离子的空间排列不同的结晶形式。本披露的化合物能够以无定形固体或结晶固体提供。可采用冻干以提供呈固体的本披露化合物。
术语“听觉损失”是指受试者的听力突然或逐渐降低。
术语“平衡障碍”是指控制平衡系统(其使受试者知道他/她的身体在环境中的位置)的迷路(内耳器官)的破坏。这种破坏通常使受试者感到不稳和/或头晕。
术语“部分或完全听觉损失”是指感知声音的能力的不同程度的降低。
术语“获得性听觉损失”是指在生命周期的某一时间发生或发展但在出生时不存在的听觉损失。
术语“感觉神经性听觉损失”是指由对内耳的感觉细胞和/或神经纤维的损伤引起的听觉损失。
如本文所用，术语“患者”涵盖所有的哺乳动物物种。
如本文所用，术语“受试者”是指动物。典型地，动物是哺乳动物。受试者也是指例如灵长类动物(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在某些实施例中，受试者为灵长类。在又其他的实施例中，受试者是人。示例性受试者包括具有癌症疾病风险因素的任何年龄的人。
如本文所用，如果受试者(优选人)将在生物学上、在医学上或在生活质量上从治疗中获益，则该受试者是“需要”这种治疗的。
如本文所用，术语“抑制(inhibit、inhibition或inhibiting)”是指减少或抑制给定的病症、症状或障碍、或疾病，或在生物活性或过程的基线活性方面的显著降低。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”任何疾病/障碍是指治疗哺乳动物(特别是人)的疾病/障碍，并且包括：(a)改善疾病/障碍(即，减慢或遏制或减缓疾病/障碍、或其至少一种临床症状的发展)；(b)减轻或调节疾病/障碍(即，使疾病/障碍身体上消退(例如，使可辨别的症状稳定)、生理学上消退(例如，使身体参数稳定)或两者皆有)；(c)缓解或改善至少一个身体参数，其包括可能不由受试者可辨别的那些参数；和/或(d)预防或延迟疾病或障碍的起始或发展或进展出现在哺乳动物中，特别地，在此类哺乳动物易患有疾病或障碍但又尚未诊断为患有该疾病或障碍时进行预防或延迟。
本披露化合物的术语“治疗有效量”是指将引起受试者的生物学或医学应答(例如，酶或蛋白质活性的降低或抑制)或改善症状，减轻病症，减慢或延迟疾病进展，或预防疾病等的本披露化合物的量。在一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指本披露化合物在向受试者施用时有效地至少部分地减轻、抑制、预防和/或改善听觉损失和/和平衡障碍的量。
有效量可以取决于如受试者的大小和体重、疾病的类型、或本披露的特定化合物之类的因素而变化。本领域普通技术人员将能够研究本文中所包含的因素，并且无需过多实验即可确定本披露的化合物的有效量。
施用方案可影响有效量的构成。可以在听觉损失和/或平衡障碍发作之前或之后向受试者施用本披露的化合物。此外，可以每天或顺序施用几个分开的剂量以及间隔的剂量，或者可连续地输注该剂量，或者可以是推注。此外，本披露的一种或多种化合物的剂量可以根据治疗或预防的情形的紧急程度成比例地增加或降低。
化合物的制备
考虑到本文提供的方法、反应方案和实例，可以以有机合成领域的技术人员已知的多种方式制备本披露化合物。本披露化合物可以使用下文所述的方法、以及合成有机化学领域中已知的合成方法或本领域技术人员所理解的其变体来合成。优选的方法包括但不限于下文所述的那些。反应在适合于所用试剂和材料并且适于实现转化的溶剂或溶剂混合物中进行。有机合成领域的技术人员应当理解，分子上存在的官能团应与所提出的转化一致。这有时将需要判断以修改合成步骤的顺序或选择一种特定的工艺方案而不是另一种，以便获得本披露所希望的化合物。
起始材料通常可从商业来源获得，例如西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)或其他商业供应商，或如本披露所述进行制备，或者使用本领域技术人员熟知的方法容易地制备(例如通过一般描述于以下中的方法制备：Louis F.Fieser和Mary Fieser,Reagentsfor Organic Synthesis[用于有机合成的试剂],第1-19卷,Wiley[威利出版社],纽约(1967-1999编辑)；Larock,R.C.,Comprehensive Organic Transformations[综合有机转化],第2版,Wiley-VCH[威利-VCH出版社]Weinheim[韦因海姆],德国(1999)；或BeilsteinsHandbuch der organischen Chemie[贝尔斯坦有机化学手册],4,Aufl.编辑Springer-Verlag[斯普林格出版社],柏林,包括增刊(也可以经由Beilstein在线数据库获得))。
为了说明的目的，下面描述的反应方案提供了合成本披露化合物以及关键中间体的潜在途径。有关各个反应步骤的详细说明，请参见下面的实例部分。本领域技术人员将理解，可以使用其他合成路线来合成本发明化合物。尽管在方案中描述了具体的起始材料和试剂，并在下面进行了讨论，但是可以容易地替换其他起始材料和试剂以提供各种衍生物和/或反应条件。另外，根据本披露，可以使用本领域技术人员熟知的常规化学进一步修饰通过下述方法制备的许多化合物。
在本披露化合物的制备中，可能需要保护中间体的远端官能性。对这种保护的需要将根据远端官能性的性质和制备方法的条件而变化。对这种保护的需要是本领域技术人员容易确定的。有关保护基团及其使用的一般说明，参见Greene,T.W.等人,ProtectingGroups in Organic Synthesis[有机合成中的保护基团],第4版,Wiley[威利出版社](2007)。在本披露化合物的制备中引入的保护基团(如三苯甲基保护基团)可以显示为一个区域异构体，但是也可以作为区域异构体的混合物存在。
下文使用的以下缩写具有对应的含义：
Figure BDA0003070730780000251
Figure BDA0003070730780000261
Figure BDA0003070730780000271
实例的表征中采用的LC/MS方法
使用带有Waters Micromass ZQ的Agilent 1100HPLC系统或者带有Waters SQ检测器或带有Waters ACQUITY QDa检测器的Waters ACQUITY UPLC记录LC/MS数据。
实例的表征中采用的NMR
用布鲁克傅里叶(Bruker Fourier)变换光谱仪在如下频率下操作获得1H NMR光谱：1H NMR：400MHz(布鲁克)。13C NMR：100MHz(布鲁克)。光谱数据按以下格式报道：化学位移(多重性，氢的数目)。化学位移在四甲基硅烷内标(δ单位，四甲基硅烷＝0ppm)的ppm低场中指定和/或参考溶剂峰，在1H NMR光谱中，CD3SOCD3的溶剂峰出现在2.50ppm处、CD3OD的溶剂峰出现在3.31ppm处、CD3CN的溶剂峰出现在1.94ppm处、D2O的溶剂峰出现在4.79ppm处、CD2Cl2的溶剂峰出现在5.32ppm处、且CDCl3的溶剂峰出现在7.26ppm处；并且在13C NMR光谱中，CD3SOCD3的溶剂峰出现在39.7ppm处、CD3OD的溶剂峰出现在49.0ppm处、CD3CN的溶剂峰出现在1.32和/或118.26ppm处、CD2Cl2的溶剂峰出现在53.84ppm处、且CDCl3的溶剂峰出现在77.0ppm处。所有13C NMR光谱均经质子解耦。
实例的纯化中采用的方法
通过正相或反相色谱法进行中间体和终产物的纯化。正相色谱法使用预填充的SiO2小柱(例如来自特利丹蒂斯科公司(Teledyne Isco,Inc.)的
Figure BDA0003070730780000272
Rf柱)，用适当的溶剂体系的梯度洗脱(例如己烷和乙酸乙酯；DCM和MeOH；或除非另外指示)来进行。使用单个示例性实验程序(具有关于柱、碱性/中性/酸性条件和乙腈梯度范围的相应信息)中所述的方法进行反相制备型HPLC。
通用合成方案
方案1-3(下文所示)描述了用于制备本披露化合物(包括具有式(I)及其子式的化合物)的可能途径。用于以下反应方案的起始材料是可商购获得的，或者可以根据本领域技术人员已知的方法或通过本文所披露的方法制备。具有式(I)的化合物可通过使用基本上光学纯的起始材料或通过分离色谱法、重结晶或本领域中熟知的其他分离技术来制备为基本上光学纯的。对于更详细的描述，参见以下实例部分。
方案1
Figure BDA0003070730780000281
如方案1所示，将芳香族甲基酮1用强碱(例如t-BuOK)和草酸二乙酯处理，以产生α-酮基酯2，将其用羟胺盐酸盐环化，以给出异噁唑酯3。随后通过LiOH水解化合物3提供酸4，将该酸经草酰氯转化为相应的酸性氯化物，然后与5-氨基戊-1-醇偶联以生成酰胺5。化合物5的醇进一步被戴斯-马丁过碘烷氧化以给出醛6，该醛在NaCNBH3或NaBH(OAc)3的存在下与不同的胺9(R'和R”各自代表胺9的N上的不同取代基)进行还原胺化以生成相应的叔胺7。取决于胺9的结构，化合物7可以通过保护基团和/或官能团操作来提供目标分子8。
方案2
Figure BDA0003070730780000291
可替代地，在方案2中，醇5经由NBS转化为相应的溴化物10，该溴化物在弱碱(例如K2CO3)的存在下与不同的胺11进行烷基化以提供目标分子8。
方案3
Figure BDA0003070730780000301
此外，如方案3所示，仲胺9(R'和R”各自代表胺9的N上的不同取代基)在碱(例如Cs2CO3)的存在下与2-(5-溴戊基)异吲哚啉-1,3-二酮进行烷基化，或在催化性碘化亚铜的存在下与2-(丁-3-炔-1-基)异吲哚啉-1,3-二酮和甲醛进行三组分偶联反应，以形成叔胺12。将化合物12用肼脱保护以提供伯胺13，然后将该伯胺在一般的酰胺偶联条件下(例如HATU、EDCI/HOBt等)与酸4反应以提供叔胺7。取决于胺9的结构，化合物7可以通过保护基团和/或官能团操作来提供目标分子8。
药物组合物和组合
将本披露化合物典型地用作药物组合物(例如本披露化合物和至少一种药学上可接受的载体)。“药学上可接受的载体(稀释剂或赋形剂)”是指在本领域中普遍接受的用于向动物(特别是哺乳动物)递送生物活性剂的介质，包括普遍认为安全(GRAS)的溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、粘合剂、缓冲剂(例如马来酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、碳酸氢钠、磷酸钠等)、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等，及其组合，如本领域技术人员已知的(参见例如Allen,L.V.,Jr.等人,Remington:The Science and Practice ofPharmacy[雷明顿：药学科学与实践](第2卷),第22版,Pharmaceutical Press[医药出版社](2012))。
在一个方面，本披露提供了药物组合物，所述药物组合物包含本披露的化合物或其药学上可接受的盐、以及药学上可接受的载体。在另一个实施例中，组合物包含至少两种药学上可接受的载体，例如本文所述的那些。出于本披露的目的，除非另有指定，否则溶剂化物和水合物通常被认为是组合物。优选地，药学上可接受的载体是无菌的。可以将药物组合物配制成用于特定的施用途径，如口服施用、肠胃外施用和直肠施用等。另外，本披露的药物组合物可以固体形式(包括但不限于胶囊、片剂、丸剂、颗粒、粉末或栓剂)、或以液体形式(包括但不限于溶液、悬浮液或乳液)制成。可以对药物组合物进行常规的制药操作，如灭菌和/或可以使其含有常规的惰性稀释剂、润滑剂或缓冲剂，以及辅助剂(如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂和缓冲液等)。典型地，药物组合物是包含活性成分及以下中的一种或多种的片剂或明胶胶囊：
a)稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸；
b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬酯酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；就片剂而言还包含
c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯基吡咯烷酮；如果希望的话
d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐，或泡腾混合物；和
e)吸附剂、着色剂、调味剂及甜味剂。
片剂可根据本领域已知的方法添加薄膜包衣或肠溶包衣。
合适的用于口服施用的组合物包括有效量的本披露化合物，其形式为片剂、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散粉剂或颗粒、乳液、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。将旨在用于口服使用的组合物根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且为了提供药学上精致的并且适口的制剂，此类组合物可以包含一种或多种选自下组的试剂，该组由以下组成：甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂。片剂可含有与适用于制造片剂的非毒性药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂是，例如，惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂及崩解剂，例如，玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如，淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂是不添加包衣或借由已知技术添加包衣以延迟在胃肠道中的分解及吸收且借此提供长期持续作用。例如，可采用时间延迟材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。用于口服使用的配制品可以呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分是与惰性固体稀释剂(例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或呈现为软明胶胶囊，其中活性成分是与水或油培养基(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
某些可注射的组合物是水性等渗溶液或悬浮液，并且栓剂有利地由脂肪乳液或悬浮液制备。所述组合物可以是灭菌的和/或含有辅助剂(例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲液)。另外，它们还可以含有其他有治疗价值的物质。所述组合物分别根据常规的混合、制粒或包衣方法制备，并含有约0.1％-75％，或含有约1％-50％的活性成分。
用于透皮应用的合适组合物包括有效量的本披露化合物和合适的载体。适于透皮递送的载体包括可吸收的药理学上可接受的溶剂，以帮助通过宿主的皮肤。例如，透皮装置呈绷带的形式，该绷带包括衬件、含有化合物并任选地含有载体的贮库、任选地在延长的一段时间内以受控且预定的速率将化合物递送至宿主皮肤的控速屏障、以及将该装置固定至皮肤的器具。
适用于局部应用(例如，应用至皮肤和眼睛)的组合物包括水溶液、悬浮液、软膏剂、霜剂、凝胶或可喷雾配制品，例如，用于通过气溶胶等递送。此类局部递送系统将尤其适用于真皮应用，例如，用于防晒霜、洗剂、喷雾等中的预防用途。因此它尤其适用于局部中的用途，包括本领域中熟知的化妆品、配制品。此类系统可含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲液和防腐剂。
如本文所用，局部应用还可以涉及吸入或鼻内应用。它们可以在使用或不使用适用于推进剂的情况下自干燥粉末吸入器以干燥粉末的形式(单独的作为混合物，例如与乳糖的干燥掺混物，或经混合的组分颗粒，例如与磷脂混合的组分颗粒)或自加压容器、泵、喷雾、雾化器或喷雾器以气溶胶喷雾形式便利地递送。
本披露进一步提供了包含本披露化合物作为活性成分的无水药物组合物和剂型，因为水可以促进某些化合物的降解。
本披露的无水药物组合物和剂型可以使用无水或含水量低的成分和低水分或低湿度条件来制备。无水药物组合物可经制备及储存使得保持其无水性质。因此，无水组合物是使用已知可防止暴露在水中的材料进行包装的，使得它们可包括在合适的规定试剂盒中。适合的包装的实例包括但不限于经气密密封的箔、塑料、单位剂量容器(例如，小瓶)、泡罩包装、及条形包装。
本披露进一步提供了药物组合物和剂型，其包含一种或多种药剂，这些药剂降低本发明化合物作为活性成分分解的速率。这些药剂(本文中称为“稳定剂”)包括(但不限于)抗氧化剂(如抗坏血酸)、pH缓冲液或盐缓冲液等。
本披露化合物典型地被配制成药物剂型，以提供可易于控制的药物剂量，并为患者提供优雅且易于处理的产品。当然，本披露化合物的剂量方案将根据已知因素而变化，例如特定试剂的药效学特征及其施用方式和途径；接受者的物种、年龄、性别、健康、医疗状况和体重；症状的性质和程度；并行治疗的种类；治疗频率；施用途径、患者的肾和肝功能以及所希望的效果。本披露化合物可以以单个日剂量施用，或总日剂量可以以每天两次、三次或四次的分开的剂量施用。
本披露进一步提供了可以向受试者局部递送的药物组合物，包括以固体、半固体、液体、凝胶和微球等的形式施用至外耳、中耳或内耳。可以通过足以将组合物递送至内耳的多种方法来施用本披露的组合物。此类方法包括但不限于耳部施用(例如，通过经鼓室芯或导管)、耳内施用、鼓室内施用、耳蜗内施用、前庭内施用和迷路内施用。
如本文所用，术语“耳部施用”是指使用导管或芯装置跨鼓膜向受试者的内耳施用组合物的方法。为了促进芯或导管的插入，可以使用适当大小的注射器刺穿鼓膜。还可以使用本领域技术人员已知的任何其他方法来插入装置，例如，通过手术植入该装置。在特定的实施例中，芯或导管装置可以是独立装置，这意味着将其插入受试者的耳中，然后将组合物可控地释放到内耳中。在其他特定的实施例中，芯或导管装置可以连接或结合至允许施用另外的组合物的泵或其他装置。可以自动编程泵以递送剂量单位，或者可以由受试者或医疗专业人员控制。
如本文所用，术语“耳内”施用是指通过直接注射组合物而将组合物施用于受试者的外耳、中耳或内耳。“鼓室内”施用是指注射或灌注组合物穿过鼓膜到中耳内，使得该组合物可以穿过圆窗膜扩散到内耳中。“耳蜗内”施用是指将组合物直接递送到耳蜗中。“前庭内”施用是指将组合物直接递送到前庭器官中。“迷路内”施用是指将组合物直接递送到内耳液隔室中以使内耳(包括半规管、前庭和耳蜗)暴露于该组合物。
在一个实施例中，使用注射器和针头装置使用耳部施用向受试者施用组合物。使用适当大小的针头刺穿鼓膜，并将包含组合物的芯或导管插入刺穿的鼓膜并使其进入受试者的中耳。可以插入该装置，使得其与圆窗接触或紧邻圆窗。用于耳部施用的示例性装置包括但不限于：经鼓室芯、经鼓室导管、经鼓室泵、圆窗微导管(将药物递送到圆窗的小导管)和Silverstein MicrowicksTM(带有“芯”的小管，通过该管到达圆窗，允许受试者或医疗专业人员进行调节)。
在另一个实施例中，使用注射器和针头装置向受试者施用组合物进入中耳和/或内耳。可以将配制品通过鼓室内注射直接施用到圆窗膜上，或者可以通过耳蜗内注射直接施用到耳蜗，或者通过前庭内注射直接施用到前庭器官，或者通过迷路内注射直接施用到半规管、前庭和耳蜗。
在又另一个实施例中，递送装置可以是设计用于将组合物施用至中耳和/或内耳的设备。仅举例来说：GYRUS医疗公司(GYRUS Medical Gmbh)提供微型耳镜，用于可视化圆窗龛并将药物递送到圆窗龛；Arenberg在美国专利号5,421,818；5,474,529；和5,476,446中描述了将流体递送到内耳结构的医学治疗装置，将这些文献各自针对此披露内容通过引用并入本文。美国专利申请公开2007/0167918进一步描述了用于经鼓室流体采样和药物应用的组合式耳吸引器和药物分配器，将该文献针对此披露内容通过引用并入本文。
在一个实施例中，可以向受试者局部施用组合物。在另一个实施例中，可以通过耳部施用向受试者施用组合物。在又另一个实施例中，可以通过耳内施用向受试者施用组合物。在又另一个实施例中，可以通过鼓室内施用向受试者施用组合物。在又另一个实施例中，可以通过耳蜗内施用向受试者施用组合物。在又另一个实施例中，可以通过前庭内施用向受试者施用组合物。在又另一个实施例中，可以通过迷路内施用向受试者施用组合物。
在一个实施例中，组合物包含一种或多种组分，该一种或多种组分增强耳蜗对组合物的活性成分的可用性，和/或使组合物的活性成分延长释放或立即释放到内耳。在一个实施例中，该一种或多种组分是药学上可接受的载体。
在另一个实施例中，组合物包含一种或多种药学上可接受的载体，该载体将促进组合物穿过分开中耳和内耳的生物屏障(例如，圆窗)的递送，从而有效地将治疗有效量的组合物递送至内耳。期望有效递送至耳蜗、科尔蒂器官、前庭器官和/或内耳外淋巴或内淋巴液空间，因为这些组织/器官包含支持细胞，当用本披露的组合物治疗或与其接触时，这些支持细胞促进感觉毛细胞的再生。
鼓室内递送至内耳可以通过将组合物注射或灌注至中耳来进行，目的在于使组合物通过圆窗膜扩散到内耳中。适用于鼓室内施用的递送系统是熟知的，并且可以发现于例如Liu等人,Acta Pharmaceutica Sinica[中国药学学报]B 2013；3(2):86-96；Kechai等人,International Journal of Pharmaceutics[国际药剂学杂志]2015；494:83-101；以及Ayoob等人,Expert Opinion on Drug Delivery[对药物递送的专家意见],2015；12(3):465-479。
在某些情况下，将本披露化合物与一种或多种治疗活性剂(例如，与相关毛细胞发育/再生途径有关的那些治疗活性剂)组合施用可能是有利的，这些毛细胞发育/再生途径包括但不限于Notch信号传导、FGF信号传导、Wnt信号传导、Shh信号传导、细胞周期/干细胞衰老、miRNA和表观遗传调控。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗本披露中所描述的治疗性疾病、障碍或病症。这种施用涵盖以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，如以具有固定比率的活性成分的单个胶囊施用。可替代地，这种施用涵盖在多个容器中或在每种活性成分的独立容器(例如，胶囊、粉末和液体)中共同施用。本披露化合物和另外的治疗剂可以通过相同施用途径或通过不同的施用途径施用。可以将粉末和/或液体在施用之前重构或稀释到所希望的剂量。另外，这类施用也涵盖在大致相同的时间或在不同的时间顺序使用每种类型的治疗剂。在任何一种情况下，治疗方案将在治疗本文所述的疾病、病症或障碍方面提供药物组合的有益作用。
在一个实施例中，本披露提供了药物组合物，单独地或与一种或多种和上文所述的那些相关毛细胞发育/再生途径有关的其他治疗活性剂一起，这些药物组合物包含至少一种本披露的化合物或其药学上可接受的盐以及适合向人或动物受试者施用的药学上可接受的载体。
在另一个实施例中，本披露提供了治疗人或动物受试者的听觉损失或平衡障碍的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本披露的化合物或其药学上可接受的盐，单独地或与一种或多种和上文所述的那些相关毛细胞发育/再生途径有关的其他治疗活性剂一起。
特别地，组合物可以作为组合治疗剂配制在一起或分开施用。
在用于治疗听觉损失或平衡障碍的组合疗法中，本披露化合物和一种或多种其他治疗活性剂可以同时、并行或顺序(没有特定的时间限制)施用，其中这种施用在受试者的体内提供治疗有效水平的这两种化合物。
在优选的实施例中，本披露化合物和一种或多种其他治疗活性剂通常通过输注、口服或局部以任何次序顺序地施用。给药方案可以根据疾病的阶段、患者的身体健康、单个药物的安全性、单个药物的耐受性、以及施用该组合的主治医师和一个或多个执业医师熟知的其他标准而变化。本披露化合物和一种或多种其他治疗活性剂可以在彼此分开的数分钟、数小时、数天或甚至数周内施用，这取决于用于治疗的特定周期。另外，该周期可包括在治疗周期期间比另一种药物更频繁地施用一种药物，并且每次施用药物时的剂量不同。
在本披露的另一个方面，提供了试剂盒，该试剂盒包含两种或更多种分开的药物组合物，其中至少一种药物组合物含有本披露的化合物。在一个实施例中，该试剂盒包含用于分别保留所述组合物的装置(例如容器、分开的瓶子、或分开的箔包)。这种试剂盒的实例是泡罩包装，如典型地用于片剂、胶囊及类似物的包装。
本披露的试剂盒可用于施用不同剂型(例如，口服及肠胃外)，用于以不同剂量间隔施用分开的组合物、或用于相对彼此滴定分开的组合物。为了有助于依从性，本披露的试剂盒通常包含用于施用的用法说明书。
在本披露的组合疗法中，本披露化合物和其他治疗剂可以由相同或不同的制造商生产和/或配制。此外，可以将本披露化合物和另一种治疗剂(或药剂)一起形成组合疗法：(i)在向医师发布组合产品(例如，在包含本披露化合物和另一种治疗剂的试剂盒的情况下)之前进行；(ii)在施用前不久，由医师自己(或在医师的指导下)进行；(iii)在患者自身中，例如在顺序施用本披露化合物和另一种治疗剂期间。
用于施加的药物组合物(或配制品)可以根据用于施用药物的方法而以多种方式包装。一般来说，用于分配的物件包括药物配制品以适当形式在其内贮存的容器。适合的容器对于本领域的技术人员是熟知的并且包括材料例如瓶(塑料和玻璃)、小袋、安瓿、塑料袋、金属圆筒及其类似物。容器还可以包括防干扰组件，以防止不小心接触到包装的内容物。另外，容器设有描述容器的内容物的标签。标签还可以包括适当的警示语。
对于约50-70kg的受试者，本披露的药物组合物或组合可以是约1-10000mg的一种或多种活性成分的单位剂量，或约1-500mg或约1-250mg或约1-150mg或约0.5-100mg、或约1-50mg的活性成分的单位剂量。化合物、药物组合物、或其组合的治疗有效剂量取决于受试者的物种、体重、年龄和所治疗的个体病症、障碍或疾病或其严重程度。具有普通技能的医师、临床医生或兽医可以容易地确定预防、治疗或抑制障碍或疾病进展所必需的每种活性成分的有效量。
可以使用有利的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、狗、猴)或其分离的器官、组织和制品在体外和体内测试中证明上述剂量特性。本披露化合物可以以溶液形式(例如水溶液)体外应用，并且可以肠内、肠胃外、有利地静脉内，例如作为悬浮液或在水溶液中应用。体外剂量可以在约10-3摩尔浓度和10-9摩尔浓度之间的范围内。取决于施用途径，体内治疗有效量可以在约0.1-500mg/kg之间、或约1-100mg/kg之间的范围内。
药理学和效用
本披露总体上涉及化合物、组合物和方法，它们通过增加、促进、刺激或诱导内耳中感觉毛细胞的再生用于治疗与内耳中感觉毛细胞的损伤或损失有关的听觉损失和平衡障碍。因此，简要回顾耳朵的解剖结构可能有助于理解本披露。
耳朵的解剖结构是本领域普通技术人员熟知的(参见例如，Gray's Anatomy[格雷氏解剖学],修订的美国版(1977),第859-867页)。耳朵通常分为三个部分：外耳、中耳和内耳。外耳由耳廓(auricle/pinna)、耳道和鼓膜(耳鼓膜)的向外部分组成。外耳的部分功能是收集声波，并将声波通过耳道引导至鼓膜和中耳。
中耳是一个充满空气的腔，包括鼓室，三个听小骨(ear bones/auditoryossicles)：锤骨、砧骨和镫骨，卵圆窗，以及圆窗(将中耳和内耳连接起来)。听小骨被布置成在鼓膜和卵圆窗之间提供机械连接，以连接到充满液体的内耳，在此处声音被转换并传导到内耳以进一步处理。
内耳包含针对听觉和平衡的感觉器官。耳蜗感觉声音；平衡器官包括半规管，其感觉角加速度；和耳石器官(椭圆囊和球囊)，其感觉线性加速度。圆窗连接耳蜗到中耳。在这些感官部位的每一个中，特化的感觉毛细胞排列在一层或多层内耳支持细胞上。支持细胞作为基底，至少部分围绕并物理支持内耳中的感觉毛细胞。响应于声音或运动，感觉毛细胞上的静纤毛发生物理偏转，并且将其偏转传递到神经，这些神经会将神经冲动发送到大脑进行处理和判读。
特别地，耳蜗包括主要负责感觉声音的科尔蒂器官。科尔蒂器官包括基底膜，在基底膜上分布着各种支持细胞，包括边缘细胞、内柱细胞、外柱细胞、内指细胞、迪特氏(Dieter's)细胞和亨森氏(Hensen's)细胞。支持细胞围绕并分离内毛细胞和外毛细胞。盖膜位于内毛细胞和外毛细胞上方。
听觉损失和平衡障碍主要是由耳蜗内感觉毛细胞的损伤或损失引起的。在哺乳动物中，感觉毛细胞的损失或损伤导致永久性听觉损失或平衡障碍，因为在哺乳动物一生中它们仅在胚胎发育期间产生并且在损伤或细胞损失后不能自发再生。众所周知，尽管内耳中存在能够产生感觉毛细胞的细胞，但是内耳中自然的感觉毛细胞再生较低(Li等人,Trends Mol.Med.[分子医学趋势],10,309-315(2004)；Li等人,Nat.Med.[自然医学],9,1293-1299(2003)；Rask-Andersen等人,Hear.Res.[听觉研究],203,180-191(2005))。结果是，损失或损伤的感觉毛细胞可能不能被自然的生理过程(例如，细胞分化)充分偿还，并且发生毛细胞的损失。在许多个体中，这种感觉毛细胞损失可能导致例如感觉神经性听觉损失和平衡障碍。因此，增加内耳中感觉毛细胞的数目的治疗策略将使患有感觉毛细胞损失或损伤的患者受益。
内耳中感觉毛细胞的命运决定由特定基因和途径控制。无调蛋白同源物1(Atoh1或atonal)是内耳毛细胞发育和再生的主要调节物。Atoh1在毛细胞产生中的重要性已被充分证实。例如，毛细胞的发育以及内耳祖细胞分化为内耳支持细胞和/或感觉毛细胞需要Math1(小鼠中的Atoh1同源物)(Bermingham等人,Science[科学],284:1837-1841,1999)。此外，腺病毒介导的Math1在成熟豚鼠内淋巴中的过表达导致成熟耳蜗中的非感觉细胞分化为未成熟的毛细胞(Kawamoto等人,J.Neurosci.[神经科学杂志],23:4395-4400,2003)。这些研究的意义是双重的。首先，它们证明了成熟的耳蜗的非感觉细胞保留了分化为感觉细胞(例如感觉毛细胞)的能力。其次，他们证明了Math1的过表达是引导支持细胞转分化为毛细胞的必要且充分条件。后来的研究通过证明腺病毒介导的Atoh1过表达诱导实验性耳聋动物模型中的感觉毛细胞再生并大大改善了听阈而促进了这些发现(Izumikawa等人,Nat.Med.[自然医学],11:271-276,2005)。
这表明，尽管哺乳动物的耳蜗感觉上皮已丧失自发再生能力，但诱导毛细胞命运所需的分子活性仍然存在，并且在成熟的支持细胞中具有功能。这些发现还表明，通过药理学干预激活内源性Atoh1表达可能是刺激感觉毛细胞再生以治疗听觉损失和平衡障碍的有效方法。
本披露提供了能够增加受试者中的Atoh1表达和/或活性的化合物、组合物和方法。本披露还提供了可以增加或促进感觉毛细胞再生的化合物、组合物和方法。本披露还提供了可以增加受试者内耳中的感觉毛细胞数目的化合物、组合物和方法。因此，本文所述的化合物、组合物和方法可用于在受试者中治疗由感觉毛细胞的损伤或损失引起的听觉损失和/或平衡障碍。
处于游离形式或药学上可接受的盐形式的本披露化合物表现出有价值的药理性质，这至少可以通过使用以下测试程序中的任一种来证实。评估本披露的化合物在小鼠小脑神经前体细胞中增加Atoh1表达的能力。使用具有毛细胞损伤的出生后6天的小鼠耳蜗外植体，在离体毛细胞诱导测定中评估本披露化合物诱导新的毛细胞形成的能力。
实例
已经使用本文披露的方法制备、分离和表征了以下实例。下列实例说明了本披露的部分范围，并不意味着限制本披露的范围。
除非另有说明，否则起始材料通常可从非限制性商业来源获得，例如TCI精细化学品公司(TCI Fine Chemicals)(日本)、上海凯米有限公司(Shanghai Chemhere Co.,Ltd.)(上海，中国)、奥罗拉精细化学品公司(Aurora Fine Chemicals LLC)(圣地亚哥，加利福尼亚州)、FCH集团(FCH Group)(乌克兰)、奥德里奇化学公司(Aldrich Chemicals Co.)(密尔沃基，威斯康星州)、兰斯特合成公司(Lancaster Synthesis,Inc.)(温厄姆，新罕布什尔州)、阿克洛斯有机公司(Acros Organics)(费尔劳恩，新泽西州)、美桥化工有限公司(Maybridge Chemical Company,Ltd.)(康沃尔，英格兰)、泰格科学公司(TygerScientific)(普林斯顿，新泽西州)、阿斯利康制药公司(AstraZeneca Pharmaceuticals)(伦敦，英国)、康侨公司(Chembridge Corporation)(美国)、美奇丝科学公司(MatrixScientific)(美国)、卡耐儿化学制药公司(Conier Chem&Pharm Co.,Ltd)(中国)、安娜敏公司(Enamine Ltd)(乌克兰)、Combi-Blocks公司(Combi-Blocks,Inc.)(圣地亚哥，美国)、奥克伍德公司(Oakwood Products,Inc.)(美国)、阿波罗科学公司(Apollo ScientificLtd.)(英国)、艾莉化学公司(Allichem LLC.)(美国)和乌克罗公司(Ukrorgsyntez Ltd)(拉脱维亚)。
中间体
中间体A：5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酸
Figure BDA0003070730780000421
步骤1：乙基2,4-二氧代-4-(噻吩-2-基)丁酸酯
Figure BDA0003070730780000422
在15℃-25℃，向1-(噻吩-2-基)乙-1-酮(50g，396.2mmol，1.0当量)和(COOEt)2(72.39g，495.3mmol，1.25当量)在无水THF(2.0L)中的溶液分小批添加t-BuOK(57.8g，515.1mmol，1.3当量)。然后将混合物在rt搅拌2小时。将混合物倾倒入水(800mL)中，用1NHCl酸化至pH 2，并且然后将混合物用乙酸乙酯(3*500mL)萃取。将有机层分离并用盐水(1L)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并浓缩以给出呈黄色固体的粗制标题产物(100g)，将其不经进一步纯化即使用。
步骤2：乙基5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000423
向化合物A-1(89g，393.3mmol，1.0当量)在无水乙醇(2L)中的溶液添加化合物NH2OH.HCl(54.64g，786.7mmol，2当量)。将混合物在60℃搅拌16小时。将反应混合物浓缩。添加水(200mL)，并将混合物用EtOAc(3*200mL)萃取。将有机层在真空下浓缩，以得到粗制标题产物(90g)，将其不经进一步纯化即使用。
步骤3：5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酸
Figure BDA0003070730780000424
向化合物A-2(80g，358.3mmol，1.0当量)在THF(200mL)中的溶液添加LiOH.H2O(17.16g，716.6mmol，2.0当量)在水(358.3mL)中的溶液。将所得混合物在15℃-22℃拌2小时。将反应混合物在减压下浓缩以除去THF。将残余物用1N HCl酸化至pH 1并用EtOAc(3*300mL)萃取。将合并的有机层在真空下浓缩。将固体用EtOAc研磨，过滤并干燥，以给出呈白色固体的标题化合物(42.6g，60.9％产率)。1H NMR(400M Hz,CDCl3)δppm 7.60-7.59(dd,J＝3.6,1.2Hz,1H),7.54-7.52(dd,J＝4.8,1.2Hz,1H),7.18-7.16(dd,J＝4.8,3.6Hz,1H),6.84(s,1H)。
中间体B：N-(5-氧代戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000431
步骤1：N-(5-羟基戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000432
在N2保护下，向化合物中间体A(10g，51.23mmol，1.0当量)在无水CH2Cl2(100mL)中的溶液逐滴添加(COCl)2(19.5g 13.1mL，153.6mmol，3.0当量)，然后在0℃添加一滴DMF。将混合物在rt搅拌2小时。然后将混合物在真空下浓缩并将残余物用CH2Cl2(50mL)稀释，然后在0℃，将混合物逐滴添加至5-氨基戊-1-醇(7.93g，76.85mmol，1.5当量)和Et3N(15.5g，153.69mmol，3.0当量)在CH2Cl2(100mL)中的溶液。将所得混合物在rt搅拌1小时。然后将反应用水(50mL)淬灭并用CH2Cl2(3*50mL)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩，以得到呈白色固体的标题化合物(12.5g，87.03％产率)。MS(ESI)m/z 302.9[M+Na]+。
步骤2：N-(5-氧代戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000433
向化合物B-1(10g，35.67mmol，1.0当量)在CH2Cl2(200mL)中的溶液添加NaHCO3(13.48g，160.5mmol，4.5当量)，随后添加DMP(22.69g，53.5mmol，1.5当量)。将所得混合物在rt搅拌3小时。将混合物缓慢倾倒入饱和NaHCO3水溶液(100mL)中，并用CH2Cl2(3*100mL)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩，并将残余物通过硅胶色谱法(用从100/0至1/1的石油醚/EtOAc洗脱)纯化，以给出呈白色固体的标题化合物(4.5g，45.3％产率)。MS(ESI)m/z 300.9[M+Na]+。
中间体C：5-(4-氟苯基)-N-(5-氧代戊基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000441
使用与中间体B相似的程序，通过用5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酸(使用与中间体A相似的方法制备)替换中间体A来制备标题化合物，28％产率，呈白色固体。MS(ESI)m/z312.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 9.81(t,J＝1.2Hz,1H),7.82-7.78(m,2H),7.23-7.16(m,2H),6.92(s,1H),3.50(q,J＝6.4Hz,2H),2.59-2.50(m,2H),1.80-1.64(m,4H)。
中间体D：氮杂环丁烷-3-磺酰胺
Figure BDA0003070730780000442
步骤1：苄基3-(乙酰基硫代)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000443
在-78℃，向PPh3(7.91g，30.16mmol，1.25当量)在THF(30mL)中的溶液添加在THF(20mL)中的DIAD(5.95g，29.44mmol，1.22当量)。搅拌10min后，添加在THF(20mL)中的硫代乙酸(2.39g，2.24mL，31.37mmol，1.3当量)。再搅拌10min后，添加苄基3-羟基氮杂环丁烷-1-甲酸酯(5g，24.13mmol，1.0当量)在THF(30mL)中的溶液。将反应在-78℃搅拌1小时，并且然后加温至25℃，持续14小时。将反应混合物用盐水(30mL)淬灭。将水相用EtOAc(3*20mL)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用从50/1至5/1的石油醚/EtOAc洗脱)纯化，以得到呈浅黄色油状物的标题化合物(2.0g，31％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.38-7.28(m,5H),5.11(s,2H),4.49-4.45(m,2H),4.24-4.21(m,1H),3.94-3.90(m,2H),2.35(s,3H)。
步骤2：苄基3-(氯磺酰基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000451
向化合物D-1(1.1g，4.15mmol，1.0当量)在CH2Cl2(20mL)中的溶液添加水(5mL)。将混合物冷却至0℃，并在0℃-5℃在搅拌下将氯气鼓泡通过，持续1小时。将各层分离，并将含有化合物D-2(4.15mmol)的DCM层直接在下一步骤中使用。
步骤3：苄基3-氨磺酰基氮杂环丁烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000452
在0℃-5℃，向NH3.H2O(40mL，0.34mol，28％wt，82.7当量)的溶液添加化合物D-2(4.15mmol，1.0当量)在CH2Cl2(20mL)中的溶液。将混合物在26℃搅拌14小时。将水相用CH2Cl2(2*40mL)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，浓缩。将残余物通过酸性制备型HPLC(Boston Green ODS 150*30 5u，梯度：22％-32％B(A＝0.1％TFA/水，B＝CH3CN)，流速：30mL/min)纯化，以得到呈浅黄色固体的标题化合物(0.35g，31.2％产率)。MS(ESI)m/z292.9[M+23]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.36-7.31(m,5H),5.13(s,2H),5.10(s,2H),4.32-4.22(m,4H),4.02-4.00(m,1H)。
步骤4：氮杂环丁烷-3-磺酰胺
Figure BDA0003070730780000453
向化合物D-3(0.35g，1.29mmol，1.0当量)在MeOH(3mL)中的溶液添加Pd/C(0.1g，10％wt)。将混合物在25℃在氢气气氛(15psi)下搅拌4小时。将混合物过滤，并将滤饼用MeOH(2*5mL)洗涤。将滤液浓缩以给出呈浅黄色固体的标题化合物(160mg，90.7％产率)。MS(ESI)m/z 136.9[M+1]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 6.90(brs,2H),4.10-4.04(m,1H),3.74-3.70(m,2H),3.60-3.56(m,2H)。
实例1：N-(5-((3S,4S)-4-氨基甲酰基-3-氰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000461
步骤1：甲基1-苄基-3-羟基哌啶-4-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000462
在0℃，向化合物1-1(3.7g，14.96mmol，1.0当量)在EtOH(60mL)中的混合物分批添加NaBH4(1.13g，29.92mmol，2.0当量)。将混合物在0℃搅拌2小时。将混合物在减压下浓缩。向混合物中添加水(300mL)和EA(300mL)。将EA层分离并用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩，以给出呈黄色油状物的标题化合物(3.8g，粗品)。
步骤2：甲基1-苄基-3-((甲基磺酰基)氧基)哌啶-4-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000463
在0℃，向化合物2-2(1g，4.01mmol，1.0当量)在DCM(20mL)中的混合物分批添加MsCl(918.96mg，8.02mmol，2.0当量)。将混合物加温至15℃并搅拌16h。向水(200mL)中添加混合物。将所得混合物用DCM(200mL)萃取。将DCM层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩，以给出呈黄色油状物的标题化合物(1.5g，粗品)，其通过LCMS确认。LC-MS：[M+H]+＝328.3。
步骤3：甲基1-苄基-3-氰基哌啶-4-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000471
将化合物1-3(1.5g，4.58mmol，1.0当量)、TMSCN(681.79mg，6.87mmol，1.5当量)和TBAF(6.87mL，1M)在MeCN(30mL)中的混合物在80℃搅拌16h。将混合物在减压下浓缩以给出残余物。将残余物通过硅胶柱色谱法(PE:EA＝20:1-10:1)纯化以得到峰1(350mg，90％)和峰2(100mg，99％纯度)。通过LCMS(C-05663-135-P1B2)和HNMR(C-05663-135-P1A)确认峰1。通过LCMS(C-05663-135-P1B3)确认峰2。LC-MS：[M+H]+＝259.3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm7.32-7.14(m,5H),3.87(m,0.5H),3.67(d,J＝11.7Hz,3H),3.50-3.44(m,1H),3.38(m,0.5H),3.04-2.91(m,2H),2.87(m,0.5H),2.61-2.45(m,1.5H),2.42-2.17(m,1H),2.16-1.92(m,2.5H),1.79-1.64(m,0.5H)。
步骤4：1-苄基-3-氰基哌啶-4-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000472
在10℃-15℃，向化合物1-4(峰1，300mg，1.16mmol，1.0当量)在MeOH(0.5mL)中的混合物添加NH3.H2O(5mL，37％)。将混合物在8℃-15℃搅拌16h。向混合物中添加EA(50mL)和水(30mL)。将水层用EA(20mL x 2)萃取。将合并的EA层用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩，以给出呈黄色油状物的化合物5(230mg，粗品)。LC-MS：[M+H]+＝244.1。
步骤5：3-氰基哌啶-4-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000481
在15℃，向化合物1-5(230mg，0.945mmol，1.0当量)在MeOH(4mL)中的混合物添加Pd/C(湿，10％，100mg)。将混合物在15℃在H2(50psi)下搅拌40小时。将混合物过滤并将滤液在减压下浓缩，以给出呈黄色油状物的标题化合物(70mg，粗品)。
步骤6：N-(5-((3S,4S)-4-氨基甲酰基-3-氰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000482
在25℃，向化合物1-6(200mg，粗品)和中间体B(196.23，705.04μmol，0.9当量)在MeOH(5mL)中的混合物添加HOAc(47.04mg，783.38μmol，1.0当量)和NaHB(OAc)3(332.06mg，1.57μmol，2.0当量)。将混合物在25℃搅拌3h。向混合物中添加H2O(1mL)。过滤混合物。将滤液通过制备型HPLC(碱性)纯化并用MeOH(3mL)研磨，以给出呈白色固体的标题化合物(25.91mg，100％纯度)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.74-7.64(m,2H),7.23(dd,J＝3.8,5.0Hz,1H),6.93(s,1H),3.42(t,J＝7.1Hz,2H),3.22(d,J＝11.7Hz,1H),3.00(d,J＝11.2Hz,1H),2.56-2.35(m,3H),2.23(dd,J＝2.3,11.6Hz,1H),2.09(dt,J＝3.5,10.8Hz,1H),2.03-1.86(m,2H),1.76-1.53(m,4H),1.52-1.38(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝416.4。
实例2：N-(5-((3S,4R)-4-氰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：(3R,4S)-1-苄基-4-氰基哌啶-3-基4-硝基苯甲酸酯
Figure BDA0003070730780000491
在0℃，向化合物2-1(1.1g，5.09mmol，1.0当量)、化合物2-1A(849.97mg，5.09mmol，1.0当量)和PPh3(1.6g，6.10mmol，1.2当量)在THF(10mL)中的混合物添加DIAD(1.23g，6.10mmol，1.2当量)。将混合物在30℃搅拌3小时。将混合物在减压下浓缩。向混合物中添加水(100mL)和EA(100mL)。将EA层经Na2SO4干燥并在减压下浓缩以给出残余物。向残余物中添加HCl(1M，50mL)和MTBE(50mL)。将混合物过滤并将滤饼在减压下浓缩，以给出呈白色固体的标题化合物(1.3g，粗品)。LC-MS：[M+H]+＝366.2。
步骤2：(3R,4S)-1-苄基-3-羟基哌啶-4-甲腈
Figure BDA0003070730780000492
在25℃，向2-2(1g，2.74mmol，1.0当量)在MeOH(10mL)中的混合物添加K2CO3(756.5mg，5.47mmol，2.0当量)(756.5mg，5.47mmol，2.0当量)。将混合物在25℃搅拌40小时。向水(100mL)中添加该混合物和EA(100mL)。将有机层用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩，以给出呈黄色油状物的标题化合物(500mg，粗品)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 7.37-7.28(m,5H),4.06-3.94(m,1H),3.57-3.49(m,1H),3.46-3.40(m,1H),3.07(mz,1H),2.87-2.71(m,2H),2.46-2.32(m,1H),2.14-1.54(m,3H)。
步骤3：(3R,4S)-3-羟基哌啶-4-甲腈
Figure BDA0003070730780000493
在25℃，向化合物2-3(200mg，924.73umol，1.0当量)在MeOH(4mL)中的混合物添加Pd/C(湿，100mg，10％)。将混合物在25℃在H2(15psi)下搅拌2h。将混合物过滤并将滤液在减压下浓缩，以给出呈黄色油状物的标题化合物(130mg，粗品)。
步骤4：N-(5-((3S,4R)-4-氰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000501
在25℃，向化合物2-4(65mg，粗品)和中间体C(92.04mg，317.07μmol，0.8当量)在MeOH(2mL)中的混合物添加HOAc(23.8mg，396.33μmol，1.0当量)和NaHB(OAc)3(168.0mg，792.67μmol，2.0当量)。将混合物在25℃搅拌1h。过滤混合物。将滤液通过制备型HPLC(先用碱，然后用TFA)纯化并且然后通过SFC纯化，以给出均呈白色固体的两个峰。通过LCMS、HNMR、2D_NMR和SFC确认标题化合物(峰1)(10.27mg)。LCMS：RT＝0.950min[M+H]+＝401.4；1HNMR(400MHz,甲醇-d4,C-05763-051-P1B1)δ＝7.89-7.75(m,2H),7.18(t,J＝8.8Hz,2H),6.95(s,1H),3.57-3.49(m,1H),3.46-3.38(m,1H),3.30(t,J＝7.1Hz,2H),3.10(ddd,J＝2.3,7.3,9.5Hz,1H),2.99-2.91(m,1H),2.80-2.69(m,1H),2.64(dt,J＝3.7,6.1Hz,1H),2.37(dt,J＝7.6,9.7Hz,1H),2.26(m,1H),2.13-2.00(m,1H),1.93(m,1H),1.63-1.41(m,4H),1.41-1.24(m,2H)
实例3：N-(5-(3-(N-(氧杂环丁烷-3-基)氨磺酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：苄基3-(乙酰基硫代)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000502
向PPh3(15.82g，60.32mmol，1.25当量)在-78℃的THF(60mL)中的溶液添加在THF(40mL)中的DIAD(11.9g，58.87mmol，1.22当量)。10min后，添加在THF(40mL)中的硫代乙酸(4.78g，4.48mL，62.73mmol，1.3当量)，随后在10min后添加在THF(60mL)中的化合物3-1(10g，48.26mmol，1.0当量)。将混合物在-78℃搅拌1小时，并且然后加温至23℃并搅拌14小时。TLC(己烷/EtOAc 3:1)显示反应完成。将反应用盐水(100mL)淬灭。将各层分离。将水相用EtOAc(20mL*3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤。将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(PE/EA 20:1至5:1)纯化，以得到呈浅黄色油状物的化合物3-2(4.0g，31.2％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.37～7.34(m,5H),5.10(s,2H),4.48-4.44(m,2H),4.24-4.21(m,1H),3.93-3.89(m,2H),2.34(s,3H)。
步骤2：苄基3-(N-(氧杂环丁烷-3-基)氨磺酰基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000511
向化合物3-2(1.5g，5.65mmol，1.0当量)在CH2Cl2(20mL)中的溶液添加水(5mL)。将混合物冷却至0℃，并在0℃-10℃在搅拌下将氯气鼓泡通过，持续3小时。TLC(石油醚/EtOAc3:1)显示反应完成。将各层分离。将有机相用盐水(20mL*3)洗涤。将有机相不经进一步纯化直接用于下一步骤。在0℃，向在CH2Cl2(10mL)中的此粗品溶液(相当于207mg，2.83mmol，3当量)中添加Et3N(477mg，4.71mmol，5当量)，随后添加在CH2Cl2(10mL)中的氨基氧杂环丁烷(0.273g，0.942mmol，1当量)。将混合物在20℃-24℃搅拌14小时。LCMS显示反应完成。将挥发物在减压下除去，将残余物通过制备型HPLC(柱：Xtimate C18 150*25mm*5um，梯度：20％-50％B(A＝0.05％氢氧化铵，B＝CAN)，流速：25mL/min)纯化，以得到呈浅黄色油状物的标题化合物(160mg，52.03％产率)。LC-MS：[M+Na]+＝349.1。
步骤3：N-(氧杂环丁烷-3-基)氮杂环丁烷-3-磺酰胺
Figure BDA0003070730780000512
向高压釜中添加化合物3-3(160mg，0.490mmol，1当量)和MeOH(15mL)，随后在N2下添加Pd/C(104mg，5％wt)。将反应在19℃-23℃在H2(15psi)下搅拌18小时。LCMS显示起始物质被消耗。将悬浮液通过硅藻土垫过滤并将垫用MeOH(10mL*4)洗涤。将合并的滤液浓缩至干燥，以给出呈无色油状物的产物3(92mg，97.62％产率)。LC-MS：[M+Na]+＝193.1。
步骤4：N-(5-(3-(N-(氧杂环丁烷-3-基)氨磺酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000521
在0℃，向化合物3-4(92mg，478.58umol，1.3当量)在DCE(5mL)和MeOH(1mL)中的溶液添加中间体B(100mg，0.359mmol，1当量)和HOAc(22mg，0.359mmol，1.0当量)，随后添加NaBH(OAc)3(114mg，0.538mmol，1.5当量)，并将反应在16℃-21℃搅拌18小时。LCMS显示反应完成。将反应用水(1mL)淬灭并浓缩。将残余物用MeOH(3mL)溶解并通过制备型HPLC(柱：Kromasil 150*25mm*10um，梯度：25％-55％B(A＝(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速(mL/min)30)纯化，以给出呈白色固体的实例3(22.8mg，13.96％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.56(dd,J＝0.8,3.6Hz,1H),7.51(dd,J＝0.8,5.2Hz,1H),7.16(dd,J＝3.6,4.8Hz,1H),6.95(brs,1H),6.85(s,1H),5.23-5.15(m,1H),4.92-4.88(m,2H),4.75-4.65(m,1H),4.62-4.57(m,2H),3.95-3.85(m,1H),3.60-3.52(m,2H),3.50-3.42(m,2H),3.40-3.35(m,2H),2.49-2.46(m,2H),1.68-1.55(m,2H),1.45-1.35(m,4H)。LC-MS：[M+H]+＝455.1。
实例4：N-(5-(3-(N-(2-氰基乙基)氨磺酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：N-(5-(3-氨磺酰基氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000531
在12℃-16℃，向中间体B(200mg，0.719mmol，1.0当量)在MeOH(4mL)中的混合物添加中间体D(98mg，0.719mmol，1.0当量)、HOAc(43mg，0.719mmol，1.0当量)、NaBH(OAc)3(305mg，1.44mmol，2.0当量)。将混合物在12℃-16℃搅拌14小时。LCMS显示反应完成。进行两个相同规模的平行反应。将反应混合物通过碱性制备型HPLC(Xtimate C18 150*25mm*5um，梯度：26％-56％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：25mL/min)纯化，以得到标题化合物。(209.2mg，73.1％产率，呈白色固体)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.69-7.66(m,2H),7.21(dd,J＝4.8Hz,8.8Hz,1H),6.91(s,1H),4.05-4.03(m,1H),3.65-3.63(m,2H),3.47-3.45(m,2H),3.39-3.37(m,2H),2.56-2.52(m,2H),1.67-1.60(m,2H),1.42-1.39(m,4H)。LC-MS：[M+H]+＝399.0。
步骤2：N-(5-(3-(N-(2-氰基乙基)氨磺酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000532
在8℃-14℃，向化合物4-1(80mg，0.201mmol，1当量)在DMF(4.4mL)和化合物4-2(10.7mg，0.201mmol，1当量)中的悬浮液添加Cs2CO3(327mg，1.0mmol，5当量)。将反应容器密封并通过微波在100℃加热20min。LCMS显示反应完成。将反应过滤。将滤液通过制备型HPLC(柱Xtimate C18 150*25mm*5um，梯度：26％-56％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝MeCN)，流速＝25ml/min)纯化，以给出呈灰白色固体的标题化合物(13mg，14.34％产率)。1HNMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.71-7.68(m,2H),7.21(dd,J＝4.0,5.2Hz,1H),6.93(s,1H),4.17-4.12(m,1H),3.68-3.60(m,2H),3.48-3.31(m,6H),2.66(t,J＝6.4Hz,2H),2.57-2.49(m,2H),1.69-1.59(m,2H),1.48-1.37(m,4H)。LC-MS：[M+H]+＝452.1。
实例5：2-(甲基氨基)-2-氧代乙基(1-(5-(5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺基)戊基)氮杂环丁烷-3-基)氨基甲酸酯
步骤1：叔丁基(1-(5-(5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺基)戊基)氮杂环丁烷-3-基)氨基甲酸酯
Figure BDA0003070730780000541
向化合物5-1A(900mg，4.31mmol，1.2当量)在MeOH(20mL)中的混合物添加Et3N(473mg，4.67mmol，1.3当量)和中间体B(1.0g，3.59mmol，1.0当量)。将混合物在26℃搅拌1小时。在0℃-5℃添加NaBH3CN(452mg，7.19mmol，2.0当量)。将混合物在25℃搅拌14小时。LCMS指示反应完成。将混合物用CH2Cl2(40mL)稀释。将有机相用10mL水洗涤。将水层用CH2Cl2(20mL*3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤。将滤液浓缩以给出残余物，将残余物通过硅胶柱色谱法(PE/EA 10:1至1:1)纯化，以得到呈浅黄色固体的标题化合物(0.81g，51.9％产率)。LC-MS：[M+H]+＝435.1。
步骤2：N-(5-(3-氨基氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000542
向化合物5-2(0.475g，1.09mmol，1当量)在CH2Cl2(12mL)中的溶液添加TFA(4mL)。将混合物在26℃-35℃搅拌18小时。LCMS指示反应完成。将挥发物在减压下除去以得到化合物5-3(粗品，100％产率)，将其不经进一步纯化即用于下一步骤。LC-MS：[M+H]+＝335.1。
Figure BDA0003070730780000551
向化合物5-3(100mg，0.299mmol，1.0当量)在THF(3mL)中的溶液添加Et3N(151mg，1.50mmol，5当量)和CDI(485mg，2.99mmol，10.0当量)。将混合物在26℃-35℃搅拌1小时。添加化合物5-3C(266mg，2.99mmol，10.0当量)。将混合物在60℃搅拌15小时。LCMS显示反应完成。将挥发物在减压下除去。将残余物通过碱性制备型HPLC(Xtimate C18 150*25mm*5um，梯度：16％-46％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v))纯化，以得到呈白色固体的标题化合物(18.3mg，13.39％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.71-7.68(m,2H),7.21(t,J＝4.0Hz,1H),6.93(s,1H),4.48(s,2H),4.26-4.25(m,1H),3.71-3.70(m,2H),3.42-3.40(m,2H),3.10-3.04(m,2H),2.78(s,3H),2.51-2.49(m,2H),1.65-1.63(m,2H),1.44-1.43(m,4H)。LC-MS：[M+H]+＝450.2。
实例6：N-(5-(3-氨磺酰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：苄基3-((甲基磺酰基)氧基)哌啶-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000552
在0℃，向化合物6-1(5.0g，21.25mmol，1.0当量)在CH2Cl2(50mL)中的溶液添加Et3N(2.37g，23.38mmol，1.1当量)和MsCl(2.68g，23.38mmol，1.10当量)。添加后，将反应混合物缓慢加温至7℃-16℃并在7℃-16℃搅拌18小时。LCMS显示反应完成。将有机相用饱和水性NaHCO3(30mL)和盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥并过滤。将滤液浓缩以给出呈棕色油状物的标题化合物(5.4g，粗品)。LC-MS：[M+Na]+＝336.0。
步骤2：苄基3-(乙酰基硫代)哌啶-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000561
在0℃，将化合物6-2A(1.97g，25.85mmol，1.5当量)添加至K2CO3(4.76g，34.46mmol，2.0当量)在DMF(50mL)中的悬浮液，随后添加化合物2(5.40g，17.23mmol，1.0当量)。将所得混合物在55℃加热14小时。LCMS显示反应完成。将混合物倾倒入水(150mL)中并用EtOAc(200mL)萃取。将有机层用水(100mL*2)和盐水(100mL)洗涤。将有机层浓缩并通过硅胶柱色谱法(PE/EA 50:1至1:1)纯化，以得到呈棕色油状物的标题化合物(2.1g)。LC-MS：[M+H]+＝294.1。
步骤3：苄基3-(氯磺酰基)哌啶-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000562
在0℃，向化合物6-3(2.1g，7.15mmol，1.0当量)在CH2Cl2(40mL)中的溶液添加水(8mL)，并使反应混合物鼓泡通过氯气，持续3.5小时。TLC(石油醚/EtOAc 5:1)显示大部分化合物6-3被消耗。将有机层分离并经Na2SO4干燥，过滤。将滤液作为溶液直接用于下一步骤。
步骤4：苄基3-氨磺酰基哌啶-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000563
在0℃，向化合物6-4(7.15mmol，1.0当量)在CH2Cl2(40mL)中的溶液添加NH3.H2O(100mL)。将反应混合物在13℃-17℃搅拌18小时，如通过LCMS所监测的。将混合物在真空中浓缩。将残余物溶解于MeOH(90mL)并通过酸性制备型HPLC(柱Boston Green ODS 150*305u，梯度：20％-50％B(A＝水(0.1％TFA v/v)，B＝CH3CN)，流速30ml/min)纯化，以得到呈浅黄色固体的标题化合物(210mg，41.3％产率)。LC-MS：[M+H]+＝299.0。
步骤5：哌啶-3-磺酰胺
Figure BDA0003070730780000571
在N2下，向化合物6-5(136mg，0.456mmol，1.0当量)在MeOH(10mL)中的搅拌溶液添加Pd/C(100mg，10％wt，湿)。将反应在13℃-19℃在氢气气氛(15psi)下搅拌14小时。LCMS显示起始物质被消耗。将悬浮液通过硅藻土垫过滤，并将垫用MeOH(10mL*3)洗涤。将合并的滤液浓缩至干燥，以给出呈白色固体的化合物6-6(78mg)。LCMS：5-95AB_220&254色谱(MK RP-18e 25-2mm)。
步骤6：N-(5-(3-氨磺酰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000572
在0℃，向化合物6-6(78mg，0.475mmol，1当量)在MeOH(2mL)中的溶液添加中间体B(132mg，0.475mmol，1当量)和HOAc(29mg，0.475mmol，1.0当量)，随后添加NaBH(OAc)3(151mg，0.712mmol，1.5当量)，并将反应加温至8℃-14℃，并且然后将其在8℃-14℃搅拌18小时。LCMS显示反应完成。将反应用水(1mL)淬灭并浓缩。将残余物用MeOH(2mL)稀释并通过制备型HPLC(柱Xtimate C18 150*25mm*5um，梯度：25％-55％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CAN)，流速(ml/min)25)纯化，以给出呈白色固体的标题化合物(69mg，34.06％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.71-7.68(m,2H),7.23(dd,J＝4.0,5.2Hz,1H),6.93(s,1H),3.43-3.33(m,3H),3.15-3.05(m,1H),2.98-2.94(m,1H),2.49-2.43(m,2H),2.25-2.17(m,1H),2.10(t,J＝10.8Hz,1H),1.99-1.90(m,1H),1.88-1.80(m,1H),1.70-1.35(m,8H)。LC-MS：[M+H]+＝427.2。
实例7：N-(5-(3-氨磺酰基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：苄基3-((甲基磺酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000581
在0℃-5℃，向化合物7-1(1.0g，4.52mmol，1.0当量)在CH2Cl2(15mL)中的溶液添加Et3N(572mg，5.65mmol，1.25当量)和MsCl(622mg，5.42mmol，1.20当量)。将混合物在11℃-13℃搅拌14小时。TLC(PE/EA 3:1)显示反应完成。将有机相用盐水(20mL*3)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥，过滤。将滤液在减压下浓缩，以得到呈浅黄色油状物的标题化合物(1.5g，100％产率，90％wt)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.30～7.30(m,5H),5.07(s,2H),3.78-3.68(m,1H),3.66-3.58(m,3H),3.57-3.56(m,1H),3.04(s,3H),2.32-2.27(m,1H),2.18-2.15(m,1H)。
步骤2：苄基3-(乙酰基硫代)吡咯烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000582
向化合物7-2(1.5g，4.51mmol，1.0当量)在DM(15mL)中的溶液添加K2CO3(935mg，6.76mmol，1.5当量)和硫代乙酸(515mg，6.76mmol，1.5当量)。将所得混合物在70℃加热14小时。TLC(己烷/EtOAc 3:1)显示反应完成。将溶剂在减压下除去。将残余物在EtOAc(20mL)和水(20mL)之间分配。将水相用EtOAc(20mL*3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤。将滤液浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(PE/EA 30:1至3:1)纯化，以得到两个具有相同HNMR的、呈巧克力棕色油状物的斑点。(斑点1(0.3g)和斑点2(0.2g)，总产率：39.6％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.37～7.32(m,5H),5.15(s,2H),4.01-3.98(m,1H),3.87-3.82(m,1H),3.54-3.50(m,2H),3.34-3.31(m,1H),2.34(s,3H),2.33-2.27(m,1H),1.92-1.89(m,1H)。
步骤3：苄基3-(氯磺酰基)吡咯烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000591
向化合物7-3(0.5g，1.79mmol，1.0当量)在CH2Cl2(20mL)中的溶液添加水(5mL)。将混合物冷却至0℃，并将氯气在搅拌下鼓泡通过，持续3.5小时。TLC(石油醚/EtOAc 3:1)指示反应完成。将混合物用盐水(20mL*3)洗涤。将各层分离以得到在CH2Cl2(20mL)中的含有化合物4(1.79mmol，100％产率)的浅黄色溶液，将其用于下一步骤。
步骤4：苄基3-氨磺酰基吡咯烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000592
在0℃-5℃，向NH3.H2O(50mL，0.359mol，28％wt，D＝0.9，200当量)溶液添加化合物7-4(1.79mmol，1.0当量)在CH2Cl2(20mL)中的溶液。将混合物在16℃-22℃搅拌48小时。LCMS显示反应完成。将挥发物在减压下除去。将残余物通过酸性制备型HPLC(Boston Green ODS150*30 5u，梯度：23％-33％B(A＝水(0.1％TFA)，B＝CH3CN)，流速：30mL/min)纯化，以得到呈浅黄色固体的标题化合物(210mg，41.3％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.36～7.33(m,5H),5.14(s,2H),4.92(brs,1H),4.79(brs,1H),3.82-3.71(m,4H),3.54-3.51(m,1H),3.20-3.10(m,1H),2.35-2.33(m,1H)。LC-MS：[M+H]+＝285.0。
步骤5：吡咯烷-3-磺酰胺
Figure BDA0003070730780000593
向化合物7-5(0.21g，0.738mmol，1.0当量)在MeOH(10mL)中的溶液添加Pd/C(100mg，10％wt，湿)。将混合物在氢气气氛(15psi)下在4℃-9℃搅拌14小时。LCMS显示反应完成。将混合物过滤，并将滤饼用MeOH(10mL*2)洗涤。将合并的有机相在减压下浓缩，以得到呈白色固体的标题化合物(100mg，90.2％产率)。
步骤6：N-(5-(3-氨磺酰基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000601
在7℃-13℃，向中间体B(0.1g，0.359mmol，1.0当量)在MeOH(2mL)中的溶液添加化合物7-6(54mg，0.359mmol，1.0当量)、HOAc(22mg，0.359mmol，1.0当量)、NaBH(OAc)3(152.3mg，0.718mmol，2.0当量)，持续14小时。LCMS显示反应完成。将反应通过水(0.5mL)淬灭。将混合物通过碱性制备型HPLC(Xtimate C18 150*25mm*5um，梯度：26％-56％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：25mL/min)纯化，以得到呈浅棕色固体的标题化合物(53.6mg，36.1％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.69-7.66(m,2H),7.21(dd,J＝4.8Hz,8.4Hz,1H),6.92(s,1H),4.20-3.96(m,2H),3.85-3.75(m,1H),3.67-3.46(m,1H),3.47-3.35(m,2H),3.30-3.20(m,3H),2.70-2.55(m,1H),2.45-2.35(m,1H),1.85-1.80(m,2H),1.75-1.65(m,2H),1.52-1.39(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝413.2。
实例8：N-(5-(3-氨基甲酰基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000602
向化合物8-1A(75mg，0.496mmol，1.2当量)在MeOH(2mL)中的溶液添加Et3N(54mg，0.537mmol，1.3当量)，随后在5℃-11℃添加中间体C(120mg，0.413mmol，1.0当量)。将混合物搅拌1小时。添加NaBH3CN(52mg，0.826mmol，2.0当量)并将反应在5℃-11℃搅拌18小时。LCMS显示反应完成。将反应用水(2mL)淬灭并用MeOH(2mL)稀释。将混合物通过碱性制备型HPLC(柱Kromasil 150*25mm*10um，梯度：20％-50％B(A＝(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：30ml/min)纯化，以得到呈白色固体的标题化合物(11.4mg，7.1％产率)。1HNMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.95-7.92(m,2H),7.30-7.26(m,2H),7.06(s,1H),3.42-3.38(m,2H),3.05-2.90(m,2H),2.85-2.75(m,1H),2.65-2.45(m,4H),2.15-1.95(m,2H),1.70-1.55(m,4H),1.48-1.38(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝389.2。
实例9：N-(5-(3-氨基甲酰基-3-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：二乙基2,2-双(羟甲基)丙二酸酯
Figure BDA0003070730780000611
在0℃，向KHCO3(500mg，4.99mmol，0.08当量)在水性CH2O(37％，16mL)中的混合物添加化合物9-1(10g，62.43mmol，1.0当量)。将混合物在28℃搅拌16小时。向混合物中添加水(50mL)和EtOAc(50mL)。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，以给出呈黄色油状物的标题化合物(13g，粗品)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 4.34-4.19(m,4H),4.17-4.06(m,4H),1.36-1.19(m,6H)。
步骤2：二乙基1-苄基氮杂环丁烷-3,3-二甲酸酯
Figure BDA0003070730780000612
在-20℃，向化合物9-2(8g，36.33mmol，1.0当量)在MeCN(160mL)中的混合物添加Tf2O(21.52g，76.29mmol，2.1当量)，随后添加DIEA(23.48g，181.64mmol，5.0当量)。0.5h后，在-20℃添加BnNH2。将混合物在70℃搅拌2h。添加EA(200mL)和盐水(100mL)。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩成残余物。将残余物通过硅胶柱色谱法(PE:EA＝20:1)纯化，以给出标题化合物(2.7g)。LC-MS：[M+H]+＝292.3。
步骤3：乙基1-苄基-3-(羟甲基)氮杂环丁烷-3-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000621
在0℃，向化合物9-3(2.5g，8.58mmol，1.0当量)在THF(50mL)中的溶液添加LiAlH(Ot-Bu)3(10.91g，42.90mmol，5.0当量)。将混合物在30℃搅拌7h。向饱和NH4Cl(500mL)中添加该混合物和EA(250mL)。将水层用EA(100mL)萃取。将合并的EA层用盐水(200mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩成残余物。将残余物通过硅胶柱色谱法(PE:EA＝10:1至1:1)纯化，以给出呈黄色油状物的标题化合物(1.2g，49％产率)。LC-MS：[M+H]+＝250.3。
步骤4：1-苄基-3-(羟甲基)氮杂环丁烷-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000622
将在密封管中的化合物9-4(500mg，2.21mmol，1.0当量)在NH3/MeOH(15M，20mL)中的混合物在20℃搅拌16小时并在35℃搅拌24小时。将混合物在减压下浓缩以给出呈黄色油状物的化合物5(500mg，粗品)，其通过LCMS确认。LCMS：tR＝0.686min MS(ESI)m/z 221.3[M+H]+。
步骤5：3-(羟甲基)氮杂环丁烷-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000623
在30℃，向化合物9-5(500mg，2.27mmol，1.0当量)在MeOH(10mL)中的混合物添加Pd/C(200mg，湿，10％)。将混合物在30℃在H2(15psi)下搅拌4小时。将混合物过滤并将滤液在减压下浓缩，以给出呈黄色油状物的标题化合物(300mg，粗品)。
步骤6：N-(5-(3-氨基甲酰基-3-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000631
在30℃，向化合物9-6(150mg，粗品)、中间体B(213.86mg，768.37umol，1.0当量)和AcOH(46.14mg，768.37umol，1.0当量)在MeOH(4mL)中的混合物添加NaBH(OAc)3(325.7mg，1.54mmol，2.0当量)。将混合物在30℃搅拌3h。向混合物中添加饱和NaHCO3(0.5mL)。将混合物过滤并将滤液通过制备型HPLC(碱性)纯化，以给出呈白色固体的标题化合物(108.93mg，100％纯度，36.1％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.69(m,2H),7.23(dd,J＝3.7,4.9Hz,1H),6.92(s,1H),3.88(s,2H),3.44-3.36(m,4H),3.34(m,2H),2.51(t,J＝7.1Hz,2H),1.65(quin,J＝7.0Hz,2H),1.50-1.30(m,4H)。LC-MS：[M+H]+＝393.3。
实例10：N-(5-(3-氨基甲酰基-3-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000632
在30℃，向化合物9-6(150mg，粗品)、中间体C(223.05mg，768.37umol，1.0当量)和AcOH(46.14mg，768.37umol，1.0当量)在MeOH(4mL)中的混合物添加NaBH(OAc)3(325.7mg，1.54mmol，2.0当量)。将混合物在30℃搅拌3h。向混合物中添加饱和NaHCO3(0.5mL)。将混合物过滤并将滤液通过制备型HPLC(碱性)纯化，以给出呈白色固体的标题化合物(85.96mg，99％纯度，27.5％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 8.00-7.88(m,2H),7.36-7.23(m,2H),7.07(s,1H),3.88(s,2H),3.45-3.36(m,4H),3.36-3.33(m,2H),2.51(t,J＝7.1Hz,2H),1.66(m,2H),1.51-1.31(m,4H)。LC-MS：[M+H]+＝405.4。
实例11：N-(5-(3-氨基甲酰基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：1-苄基3-乙基3-甲基氮杂环丁烷-1,3-二甲酸酯
Figure BDA0003070730780000641
在-70℃，向化合物11-1(1g，4.01mmol，1.0当量)和MeI(1.14g，8.02mmol，2.0当量)在THF(20mL)中的溶液添加LiHMDS(1M，8mL)。将混合物加温至25℃并搅拌16h。向饱和NH4Cl(200mL)中添加该混合物和EA(150mL)。将有机层用盐水(100mL)洗涤，经干燥Na2SO4，过滤。将滤液在减压下浓缩以给出呈黄色油状物的化合物11-2(550mg，粗品)。LCMS：tR＝0.882min MS(ESI)m/z 264.0[M+H]+。
步骤2：苄基3-氨基甲酰基-3-甲基氮杂环丁烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000642
在25℃，向化合物11-2(550mg，2.09mmol)中添加NH3/MeOH(7M，30mL)。将混合物在25℃搅拌16h并在35℃搅拌6h。将混合物在减压下浓缩以给出呈黄色油状物的化合物11-3(500mg，粗品)。LCMS：tR＝0.761min[M+Na]+270.9。
步骤3：3-甲基氮杂环丁烷-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000643
在25℃，向化合物11-3(500mg，20.01mmol)在MeOH(10mL)中的溶液添加Pd/C(湿，10％，1g)。将混合物在25℃在15psi的H2下搅拌16小时。过滤混合物。将滤液在减压下浓缩以给出呈黄色油状物的标题化合物(250mg，粗品)。
步骤4：N-(5-(3-氨基甲酰基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000651
在25℃，向化合物11-4(120mg，粗品)和中间体B(146.3mg，525.64umol，1.0当量)在MeOH(3mL)中的混合物添加HOAc(31.57mg，525.64umol，1.0当量)和NaHB(OAc)3(222.81g，1.05mmol,2.0当量)。将混合物在25℃搅拌3h。向反应中添加水(0.5mL)。将混合物过滤并将滤液通过碱性制备型HPLC(Phenomenex Gemini 150*25mm*10um，梯度：24％-54％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：25mL/min)纯化，以给出呈白色固体的标题化合物(43.99mg，100％，22％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.69(m,2H),7.23(dd,J＝3.8,5.0Hz,1H),6.92(s,1H),3.45(d,J＝8.3Hz,2H),3.40(t,J＝7.0Hz,2H),3.18(d,J＝8.3Hz,2H),2.49(br t,J＝7.2Hz,2H),1.65(m,2H),1.53(s,3H),1.48-1.33(m,4H)。LC-MS：[M+H]+＝377.4。
实例12：N-(5-(3-氨基甲酰基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000652
在25℃，向化合物11-4(120mg，粗品)和中间体C(152.59mg，525.64umol，1.0当量)在MeOH(3mL)中的混合物添加HOAc(31.57mg，525.64umol，1.0当量)和NaHB(OAc)3(222.81g，1.05mmol，2.0当量)。将混合物在25℃搅拌3h。向反应中添加水(0.5mL)。将混合物过滤并将滤液通过碱性制备型HPLC(Phenomenex Gemini 150*25mm*10um，梯度：26％-56％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：25mL/min)纯化，以得到呈白色固体的标题化合物(65.5mg，100％，32％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 8.00-7.89(m,2H),7.35-7.24(m,2H),7.07(s,1H),3.49-3.37(m,4H),3.18(d,J＝8.0Hz,2H),2.49(t,J＝7.2Hz,2H),1.65(m,2H),1.53(s,3H),1.49-1.33(m,4H)。LC-MS：[M+H]+＝389.4。
实例13：N-(5-(3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：叔丁基3-氰基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000661
将在150mL的EtOH中的化合物13-1冷却至0℃。向此溶液中分批添加NaBH4(1.08g，28.54mmol，2.0当量)。将混合物在0℃搅拌30min。将混合物在减压下浓缩。将残余物用EA(100mL)稀释。向混合物中添加水(50mL)。将EA层用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩以给出标题化合物(3.0粗品)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝4.54(m,1H),3.87-3.63(m,2H),3.46-3.21(m,1H),3.08-2.90(m,1H),2.67(s,1H),1.46-1.31(s,9H)。LC-MS：[M-55]+＝157.1。
步骤2：叔丁基3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000662
在10℃，向化合物13-2在水性NaOH(1N，20mL)和MeOH(40mL)的混合物中的溶液添加H2O2。将混合物在10℃搅拌16小时。然后将饱和NH4Cl(50mL)添加至混合物中。将所得混合物用EA(500mLx4)萃取。将有机层用盐水(500mL)洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩，以给出呈白色固体的标题化合物(1g，粗品)。LC-MS：[M+Na]+＝253.3。
步骤3：4-羟基吡咯烷-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000671
在10℃，向化合物13-3在DCM(15mL)中的混合物添加TFA(3mL)。将混合物在10℃-15℃搅拌16小时。将混合物在减压下浓缩以给出呈黄色油状物的标题化合物(380mg，粗品)。LC-MS：[M+H]+＝131.1。
步骤4：N-(5-(3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000672
在10℃，向化合物13-4(350mg，2.69mmol，1.0当量)、中间体B(748.51mg，2.69mmol，1.0当量)和HOAc(161.5mg，2.69mmol，1.0当量)在MeOH(15mL)中的混合物添加NaBH(OAc)3(1.14g，5.38mmol，2.0当量)。将混合物在10℃-15℃搅拌6小时。向混合物中添加饱和NaHCO3(5mL)。将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPCL(碱性)(柱：Phenomenex Gemini C18 250*50mm*10um，梯度：20％-45％B(A＝水/0.05％氨，B＝CH3CN)，流速：100mL/min)纯化，以给出呈白色固体的标题化合物(230mg，92％纯度，21.7％产率)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ＝7.69(m,2H),7.22(dd,J＝3.8,5.0Hz,1H),6.92(s,1H),4.53-4.42(m,1H),3.41(m,2H),3.15-3.05(m,1H),3.05-2.80(m,2H),2.76-2.70(m,1H),2.63-2.39(m,3H),1.73-1.53(m,4H),1.51-1.36(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝393.4。
实例14：N-(5-(4-氨磺酰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：苄基4-氨磺酰基哌啶-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000681
在0℃，向化合物14-1(0.5g，1.57mmol，1.0当量)在THF(10mL)中的混合物鼓泡NH3，持续10min。将混合物浓缩。将残余物溶解于EA(50mL)。将EA层用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，以得到呈白色固体的标题化合物。LC-MS：[M+Na]+＝321.1。
步骤2：哌啶-4-磺酰胺
Figure BDA0003070730780000682
将化合物14-2(480mg，1.61mmol，1.0当量)和Pd/C(100mg，10％，湿)在MeOH(10mL)中的混合物在50psi的H2下在30℃搅拌6h。LCMS显示检测到所希望的质量。将混合物过滤并浓缩以给出呈白色固体的化合物14-3(180mg，粗品)，将其直接用于下一步骤。
步骤3：N-(5-(4-氨磺酰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000683
在10℃-15℃，向化合物14-3(160mg，574.86μmol，1.0当量)和中间体B(94.41mg，574.86μmol，1.0当量)在MeOH(4mL)中的混合物添加AcOH(34.52，574.86μmol，1.0当量)和NaBH(OAc)3(243.67，1.15mmol，2.0当量)。将混合物在8℃-15℃搅拌16h。向反应中添加饱和NaHCO3(1mL)和MeOH(50mL)。将混合物过滤并将滤液在减压下浓缩以给出粗产物。将粗产物通过碱性制备型HPLC(Phenomenex Gemini 150*25mm*10um，梯度：33％-63％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：25mL/min)纯化，以得到呈白色固体的标题化合物(97.3mg，38.6％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.81(t,J＝5.9Hz,1H),7.88(dd,J＝1.0,5.0Hz,1H),7.80(dd,J＝1.1,3.6Hz,1H),7.28(dd,J＝3.8,5.0Hz,1H),7.18(s,1H),6.70(s,2H),3.25(q,J＝6.9Hz,2H),2.95(d,J＝11.0Hz,2H),2.75(m,1H),2.26(t,J＝7.3Hz,2H),1.95(d,J＝10.5Hz,2H),1.86(t,J＝11.9Hz,2H),1.66-1.49(m,4H),1.45(m,2H),1.36-1.22(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝427.3。
实例15：5-(4-氟苯基)-N-(5-(4-氨磺酰基哌啶-1-基)戊基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000691
在10℃-15℃，向中间体C(160mg，551.17μmol，1.0当量)和化合物14-3(90.52mg，551.17μmol，1.0当量)在MeOH(4mL)中的混合物添加AcOH(33.10mg，551.17μmol，1.0当量)和NaBH(OAc)3(233.63mg，1.10mmol，2.0当量)。将混合物在8℃-15℃搅拌16h。向反应中添加饱和NaHCO3(1mL)和MeOH(20mL)。将混合物过滤并将滤液在减压下浓缩以给出粗产物。将粗产物通过碱性制备型HPLC(Phenomenex Gemini 150*25mm*10um，梯度：35％-65％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：25mL/min)纯化，以得到呈白色固体的标题化合物(117.66mg，48.7％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.82(t,J＝5.8Hz,1H),8.06-7.94(m,2H),7.48-7.38(m,2H),7.35(s,1H),6.70(br s,2H),3.30-3.21(m,2H),2.95(d,J＝11.3Hz,2H),2.82-2.70(m,1H),2.26(t,J＝7.2Hz,2H),1.95(d,J＝12.3Hz,2H),1.86(t,J＝11.9Hz,2H),1.68-1.50(m,4H),1.49-1.39(m,2H),1.36-1.23(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝439.3。
实例16：N-(5-((3R,4R)-4-氰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：3-苄基-7-氧杂-3-氮杂双环[4.1.0]庚烷
Figure BDA0003070730780000701
将化合物16-1(6.60g，38.9mmol，1.0当量)逐滴添加至三氟乙酸(4.34g，38.9mmol，1.0当量)和水(70mL)的混合物中，并在26℃搅拌。将所得悬浮液搅拌15min，将NBS(8.81g，49.52mmol，1.3当量)经10min分批添加至混合物，在此期间，温度升至30℃-35℃。在26℃搅拌16h后，将20％水性NaOH(70mL)逐滴添加至溶液中，并且然后将混合物搅拌2h。将反应混合物用EtOAc(200mL*3)萃取，经Na2SO4干燥，将有机层浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(PE/EA＝10:1)纯化以得到标题化合物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm7.22-7.17(m,5H),3.37(s,2H),3.15-3.11(m,2H),2.92-2.91(m,1H),2.61-2.58(d,J＝13.3Hz,1H),2.28-2.22(m,1H),2.15-2.09(m,1H),1.95-1.90(m,2H)。
步骤2：1-苄基-3-羟基哌啶-4-甲腈
Figure BDA0003070730780000702
将化合物16-2(2.0g，10.57mmol，1.0当量)和NaCN(1.04g，21.14mmol，2.0当量)在EtOH/H2O＝5/1(24mL)中的溶液在30℃搅拌16h。TLC(PE:EA＝2:1)显示起始材料(Rf＝0.6)仍存留，并且形成2个斑点(Rf＝0.4和Rf＝0.2)。并将所得悬浮液在50℃搅拌16h。TLC(PE:EA＝2:1)显示少量起始材料存留，然后停止反应。将混合物倾倒入水(10mL)中，并用EA(60mL)萃取，将有机层用盐水(40mL)洗涤，经Na2SO4干燥。将滤液通过硅胶快速柱色谱法(PE/EA＝10:1)纯化，以给出呈无色油状物的标题化合物(550mg，产率25％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 7.3-7.21(m,5H),5.52-5.51,(d,J＝5.99,1H),3.56-3.51(m,2H),2.88-2.85(dd,J＝10.94,1H),2.70-2.67(m,2H),2.47-2.45(m,1H),2.00-1.97(m,1H),1.89-1.88(m,1H),1.74-1.66(m,2H)。
步骤3：(3R,4R)-3-羟基哌啶-4-甲腈
Figure BDA0003070730780000711
向化合物16-3(100.0mg，0.46mmol，1.0当量)在MeOH(5mL)中的溶液添加Pd/C(10mg)。将混合物用H2气体(50psi)吹扫，并在25℃搅拌16小时。TLC(PE/EA＝3:1)显示起始材料(Rf＝0.5)消失并形成新的斑点(Rf＝0.1)，将有机层过滤并在真空中干燥以给出粗产物(20mg)，34％产率，将其通过nmr确认。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 3.88-3.84(m,1H),3.26-3.20(m,1H),3.00-2.97(m,1H),2.72-2.69(m,2H),2.15-2.10(m,2H),1.80-1.76(m,1H)。
步骤4：N-(5-((3R,4R)-4-氰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000712
向10ml舒仑克管(schlenk tube)中，将化合物16-4(40mg，0.3mmol，1.0当量)和中间体B(88.mg，0.3mmol，1.0当量)、HOAc(19.4mg，0.3mmol，1.0当量)溶解于3ml MeOH，并将NaHB(OAc)3(201mg，0.9mmol，3.0当量)添加至混合物，在25℃搅拌30min。TLC(PE/EA＝1:1)显示起始材料(Rf＝0.5)消失并且形成新的斑点(Rf＝0.1)。LCMS显示检测到所希望的质量。将残余物通过制备型HPLC(碱性条件)纯化，以得到呈白色粉末的标题化合物。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.70-7.66(m,2H),7.23-7.21(dd,J＝5.01,1H),6.91(s,1H),3.75-3.69(m,1H),3.42-3.39(t,J＝7.09,2H),3.04(m,1H),2.86(m,1H),2.50-2.39(m,3H),2.14-2.08(m,1H),2.03-1.95(m,1H),1.91-1.76(m,2H),1.70-1.63(m,2H),1.61-1.54(m,2H),1.45-1.379(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝389.2。
实例17：N-(5-(4-(3-氨基-3-氧代丙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：叔丁基4-(3-氨基-3-氧代丙基)哌嗪-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000721
向化合物17-1(200mg，1.07mmol，1.0当量)在MeOH(2mL)中的混合物添加化合物17-1A(99.22mg，1.40mmol，1.3当量)和K2CO3(222.61mg，1.61mmol，1.5当量)，将反应混合物在25℃搅拌5h。TLC(DCM:MeOH 10:1)显示A(Rf＝0.5)完全消耗，并检测到新的斑点(Rf＝0.55)。将混合物在真空中浓缩。将水(10ml)和EA(10ml)添加至混合物，将有机层经Na2SO4干燥并在真空中浓缩，以得到标题化合物(150mg，粗品)。将其直接用于下一步骤。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.81(s,1H),5.59(s,1H),3.50-3.43(t,J＝4.8 4H),2.71-2.62(t,J＝5.6,2H),2.51-2.38(m,6H),1.47(s,9H)。
步骤2：3-(哌嗪-1-基)丙酰胺
Figure BDA0003070730780000722
向化合物17-2(150mg，582.91umol，1.0当量)在DCM(1mL)中的溶液添加TFA(0.2ml)。将混合物在25℃搅拌1h。TLC(MeOH:DCM＝1:10)显示A(RF＝0.55)完全消耗并检测到新的斑点(RF＝0)。将混合物在真空中浓缩。获得呈无色油状物的化合物17-3(120mg，粗品)，其将在下一步骤中确认。
步骤3：N-(5-(4-(3-氨基-3-氧代丙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000723
向化合物17-3(120mg，763.29umol，1.0当量)在MeOH(1mL)中的混合物添加中间体B(233.69mg，839.62umol，1.1当量)、NaBH(CH3COO)3(323.55mg，1.53mmol，2.0当量)和CH3COOH(45.84mg，763.29umol，1.0当量)。将混合物在20℃搅拌1小时。LCMS C-05708-28-P1A1显示检测到所希望的质量。将反应混合物在真空中浓缩。将MeOH(2ml)和NaHCO3(0.1g)添加至混合物，并将混合物过滤，将粗品通过制备型HPLC(NH3H2O)纯化，以在冻干后得到呈白色固体的标题化合物(58mg，100％纯度，18.11％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 8.20(s,1H),7.57(dd,J＝1.0,3.6Hz,1H),7.52(dd,J＝1.0,5.0Hz,1H),7.17(dd,J＝3.6,5.0Hz,1H),6.97-6.81(m,1H),6.84(s,1H),5.31(s,1H),3.48(m,2H),2.74-2.32(m,14H),1.72-1.66(m,2H),1.60-1.52(m,2H),1.49-1.38(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝420.4。
实例18：N-(5-(4-(2-氨基-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：苄基4-(2-氨基-2-氧代乙基)哌嗪-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000731
将化合物18-1(300mg，1.36mmol，1.0当量)、2-溴乙酰胺(206.69mg，1.50mmol，1.1当量)、K2CO3(282.35mg，2.04mmol，1.5当量)和KI(113.05mg，680.99μmmol，0.5当量)在DMF(5mL)中的混合物在50℃搅拌2小时。将混合物倾倒入水(50mL)中并用EA(50mL x 2)萃取。将合并的有机相用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩成白色固体的标题化合物(250mg)，将其直接用于下一步骤。
步骤2：2-(哌嗪-1-基)乙酰胺
Figure BDA0003070730780000741
将化合物18-2(0.25g，901.49μmol)和Pd/C(50mg，湿，10％)在MeOH(5mL)中的混合物在15psi的H2下在10℃-15℃搅拌4小时。将混合物过滤并将滤液浓缩以给出粗产物(140mg)。LC-MS：[M+H]+＝144.2。
步骤3：N-(5-(4-(2-氨基-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000742
在10℃，向中间体B(225mg，808.40μmol，1.0当量)、化合物18-3(115.75mg，808.40μmol，1.0当量)和HOAc(48.55mg，808.40μmol，1.0当量)在MeOH(5mL)中的混合物添加NaBH(OAc)3(342.67mg，1.62mmol，2.0当量)。将混合物在10℃-15℃搅拌16小时。向混合物中添加Na2CO3(5mL)和MeOH(50mL)。将所得混合物过滤并浓缩以给出残余物。将残余物通过制备型HPLC(碱性)(柱：Phenomenex Gemini C18 250*50mm*10um，梯度：32％-62％B(A＝水/0.05％氨，B＝CH3CN)，流速：25mL/min)纯化，以给出呈白色固体的标题化合物(169.21mg，49％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.80(t,J＝5.8Hz,1H),7.88(dd,J＝1.3,5.0Hz,1H),7.80(dd,J＝1.1,3.6Hz,1H),7.28(dd,J＝3.5,5.0Hz,1H),7.18(s,1H),7.10(s,2H),3.25(q,J＝6.8Hz,2H),2.82(s,2H),2.49-2.29(m,8H),2.25(t,J＝7.3Hz,2H),1.53(m,2H),1.44(m,2H),1.35-1.23(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝406.3。
实例19：N-(5-(4-(2-氨磺酰基乙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：乙烯磺酰胺
Figure BDA0003070730780000751
在0℃，将氨气鼓泡通过化合物19-1(2.5g，15.34mmol)在THF(40mL)中的溶液，持续15min，然后将水(20mL)添加至反应混合物。将所得溶液用EA(50mL*4)萃取。将合并的有机层用盐水(40mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，以得到呈黄色油状物的标题化合物(800mg，粗品)。将残余物不经纯化用于下一步骤。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 7.05(s,2H),6.85-6.73(m,1H),5.98(d,J＝16.4Hz,1H),5.83(d,J＝10.0Hz,1H)。
步骤2：叔丁基4-(2-氨磺酰基乙基)哌嗪-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000752
向化合物19-2(200mg，粗品)和化合物19-2A(268mg，1.44mmol)在MeOH(4mL)中的溶液添加K2CO3(298mg，2.16mmol)。将反应混合物在25℃搅拌16小时。TLC(PE:EA＝5:1)显示大部分起始材料(Rf＝0.1)被消耗并观察到一个新的斑点(Rf＝0.5)，将反应混合物用水(10mL)稀释，用EA(10mL*5)萃取。将有机相用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，PE:EA＝50:1至1:1)纯化，以得到呈黄色固体的标题化合物(310mg，73％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 5.26(br s,2H),3.47-3.40(m,4H),3.31-3.16(m,2H),2.99-2.83(m,2H),2.55-2.42(m,4H),1.45(s,9H)。
步骤3：2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-磺酰胺
Figure BDA0003070730780000753
向化合物19-3(300mg，1.02mmol)在DCM(4mL)中的混合物添加TFA(1ml)。将反应混合物在20℃搅拌4小时。TLC(EA)显示化合物19-3(Rf＝0.7)完全消耗，并观察到一个新的斑点(Rf＝0.05)。将反应混合物浓缩以给出呈黄色油状物的标题化合物(400mg，粗品)。将残余物不经纯化直接用于下一步骤。
步骤4：N-(5-(4-(2-氨磺酰基乙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000761
向化合物18-4(400mg，粗品)和中间体19(258mg，926μmol)在MeOH(9mL)中的混合物添加NaBH(OAc)3(393mg，1.85mmol)和AcOH(56mg，926μmol)。将反应混合物在20℃搅拌5小时。LCMS(C-05668-99-P1A1)显示化合物19-4几乎完全消耗，观察到所希望的MW。将反应混合物通过水(20ml)淬灭，用EA(20ml*3)萃取，将有机层用盐水(40ml)洗涤，经Na2SO4干燥。将残余物通过制备型HPLC(碱性)纯化，以给出呈白色固体的标题化合物(69.98mg，16％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.57(d,J＝3.20Hz,1H),7.52(d,J＝5.20Hz,1H),7.18(t,J＝4.00Hz,1H),6.88-6.85(m,1H),6.84(s,1H),5.34(s,2H),3.54-3.43(m,2H),3.25(t,J＝7.50Hz,2H),2.94(m,J＝6.40Hz,2H),2.76-2.39(m,8H),2.36(t,J＝7.20Hz,2H),1.70-1.67(m,2H),1.58-1.51(m,2H),1.47-1.37(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝456.3。
实例20：N-(5-(4-氨基甲酰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000762
在0℃，向化合物20-1(300mg，2.34mmol，1.0当量)和中间体B(651mg，2.34mmol，1.0当量)在MeOH(8mL)中的溶液添加HOAc(140mg，2.34mmol，1.0当量)、NaBH(OAc)3(992mg，4.68mmol，2.0当量)。将反应混合物在15℃搅拌16小时。LCMS显示大部分中间体B被消耗并观察到所希望的MW(作为主峰)。将反应混合物用饱和水性NaHCO3(20mL)淬灭并用EA(10mL*3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过制备型HPLC(NH3.H2O)纯化，以得到呈白色固体的标题化合物(161mg，18％产率，99％纯度)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.79(m,1H),7.88(d,J＝4.8Hz,1H),7.80(d,J＝2.8Hz,1H),7.29-7.27(m,1H),7.17(s,2H),6.69(s,1H),3.27-3.22(m,2H),2.84(d,J＝11.6Hz,2H),2.22(t,J＝6.8Hz,2H),2.02-1.92(m,1H),1.81(t,J＝10.4Hz,2H),1.64(m,2H),1.58-1.40(m,6H),1.35-1.16(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝391.3。
实例21：N-(5-(3-氨基甲酰基-3-羟基氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：
Figure BDA0003070730780000771
在0℃，向化合物21-1(5g，20.89mmol，1.0当量)和Na2CO3(8.78g，104.47mmol，5.0当量)在DCM(100mL)中的溶液添加戴斯-马丁(17.8g，41.8mmol，2.0当量)。将混合物加温至30℃并搅拌3h。将有机层分离，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩以给出残余物，将残余物通过MPLC纯化，以得到呈黄色油状物的标题化合物21-2(1.8g，粗品)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.56-7.43(m,5H),7.36-7.28(m,5H),4.64(s,1H),4.06(s,4H)。
步骤2：1-二苯甲基-3-((三甲基甲硅烷基)氧基)氮杂环丁烷-3-甲腈
Figure BDA0003070730780000772
在30℃，向在DCM(1mL)中的化合物21-2(200mg，842.83ummol，1.0当量)和Et3N(127.93mg，1.26mmol，1.5当量)添加TMSCN(209.03mg，2.11mmol，2.0当量)。将混合物在30℃搅拌3h。将混合物在减压下浓缩以得到呈黄色固体的标题化合物21-3(350mg，粗品)。LC-MS：[M+H]+＝337.3。
步骤3：1-二苯甲基-3-羟基氮杂环丁烷-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000781
在0℃，向化合物21-3(350mg，粗品)在DCM(2mL)中的溶液添加H2SO4(0.2mL)。将混合物加温至30℃并搅拌2h。向混合物中添加NH3.H2O至PH＝11。将混合物在减压下浓缩以给出残余物，将其通过制备型HPLC(碱性)纯化，以给出呈白色固体的标题化合物(58mg，98％纯度)。LC-MS：[M+H]+＝283.3。
步骤4：3-羟基氮杂环丁烷-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000782
在30℃，向化合物21-4(58mg，205.43umol)在MeOH(1mL)中的溶液添加Pd(OH)2(湿，10％，50mg)。将混合物在30℃在45psi的H2下搅拌5小时。过滤混合物。将滤液在减压下浓缩以给出呈白色固体的化合物21-5(20mg，粗品)。
Figure BDA0003070730780000783
在30℃，向化合物21-5(20mg，粗品)和中间体B(47.94mg，172.24umol，1.0当量)在MeOH(1mL)中的混合物添加HOAc(10.34mg，172.24umol，1.0当量)和NaHB(OAc)3(73.01mg，344.48umol，2.0当量)。将混合物在30℃搅拌16h。向反应中添加饱和NaHCO3(1mL)。将混合物浓缩并将残余物通过碱性制备型HPLC(碱性)纯化，以得到呈白色固体的标题化合物(18.55mg，98.9％纯度)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.71-7.67(m,2H),7.23(dd,J＝3.7,4.9Hz,1H),6.92(s,1H),3.63(d,J＝9.3Hz,2H),3.40(t,J＝7.1Hz,2H),3.27(d,J＝9.0Hz,2H),2.57(t,J＝7.2Hz,2H),1.66(m,2H),1.52-1.32(m,4H)。LC-MS：[M+H]+＝379.3。
实例22：5-(5-氟噻吩-2-基)-N-(5-(3-(甲基氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：5-氟-N-甲氧基-N-甲基噻吩-2-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000791
在氮气气氛下在0℃，向化合物22-1(2.0g，13.69mmol，1.0当量)在THF(150mL)中的溶液添加MeNHOMe HCl盐(2.67g，27.37mmol，2.0当量)、HOBt(1.85g，13.69mmol，1.0当量)、DIEA(8.84g，68.43mmol，5.0当量)，随后添加EDCI(5.25g，27.37mmol，2.0当量)。将混合物加温至25℃并在25℃搅拌14小时。TLC(PE/EA 3:1)显示反应完成。将反应用50mL水性饱和NaHCO3淬灭。将各层分离。将水相用EtOAc(30mL*3)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥，过滤。将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:EtOAc＝20:1至1:1)纯化，以得到呈浅黄色油状物的标题化合物(2.5g，96.5％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.68(t,J＝4.0Hz,1H),6.55(dd,J＝1.6Hz,J＝4.0Hz,1H),3.79(s,3H),3.36(s,3H)。
步骤2：1-(5-氟噻吩-2-基)乙-1-酮
Figure BDA0003070730780000792
在0℃在N2气氛下，经20分钟的时间段向化合物22-2(2.5g，13.2mmol，1.0当量)在THF(30mL)中的搅拌溶液添加MeMgCl(6.6mL，19.8mmol，在THF中的3M溶液，1.5当量)，同时保持内部温度低于10℃。添加后，将混合物在25℃搅拌2小时。LCMS显示反应完成。将反应混合物倾倒入水性饱和NH4Cl(30mL)中。将各层分离。将水层用EtOAc(20mL*3)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥，过滤。将滤液在减压下浓缩以给出残余物，将残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:EtOAc＝20:1至5:1)纯化，以得到呈浅黄色油状物的标题化合物(1.6g，84.2％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.39(t,J＝4.0Hz,1H),6.55(dd,J＝0.8Hz,4.0Hz,1H),2.49(s,3H)。LC-MS：[M+H]+＝144.8。
步骤3：乙基4-(5-氟噻吩-2-基)-2,4-二氧代丁酸酯
Figure BDA0003070730780000801
在25℃，向化合物22-3(1.6g，11.1mmol，1.0当量)在THF(30mL)中的溶液添加t-BuOK(1.49g，13.32mmol，1.2当量)和(CO2Et)2(1.95g，13.32mmol，1.2当量)。将混合物在25℃搅拌3小时。TLC(PE/EA 5:1)显示反应完成。将反应用1N HCl淬灭以调节pH至1-2。将各层分离。将水相用EtOAc(20mL*3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤。将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(PE/EA20:1至1:1)纯化，以得到呈浅黄色油状物的标题化合物(2.0g，73.8％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.57(t,J＝4.4Hz,1H),6.85(s,1H),6.62(d,J＝3.2Hz,1H),4.40(q,J＝7.2Hz,2H),1.42(t,J＝7.2Hz,3H)。
步骤4：乙基5-(5-氟噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000802
向化合物22-4(2.0g，8.19mmol，1.0当量)在EtOH(20mL)中的溶液添加NH2OH.HCl(683mg，9.83mmol，1.2当量)。将混合物在回流下搅拌14小时。LCMS指示反应完成。将溶剂在减压下除去。将残余物在水性饱和NaHCO3(20mL)和EtOAc(20mL)之间分配。将各层分离。将水层用EtOAc(20mL*3)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥，过滤。将滤液浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(PE/EA＝20:1至3:1)纯化，以给出呈浅黄色固体的化合物22-5(1.6g，80.8％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.22(t,J＝4.4Hz,1H),6.70(s,1H),6.58(t,J＝2.0Hz,1H),4.47(q,J＝7.2Hz,2H),1.43(t,J＝7.2Hz,3H)。LC-MS：[M+H]+＝241.9。
步骤5：5-(5-氟噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酸
Figure BDA0003070730780000811
向化合物22-5(1.6g，6.63mmol，1.0当量)在THF(10mL)中的溶液添加LiOH.H2O(557mg，13.26mmol，2.0当量)在水(5mL)中的溶液。将混合物在25℃搅拌3小时。TLC(PE/EA5:1)显示反应完成。将溶剂除去。将水相用EtOAc(20mL*3)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥，过滤。将滤液在减压下浓缩，以得到呈黄色固体的标题化合物(1.2g，66.7％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.24(t,J＝4.0Hz,1H),6.76(s,1H),6.60(dd,J＝1.2Hz,4.0Hz,1H)。
步骤6：5-(5-氟噻吩-2-基)-N-(5-羟基戊基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000812
在25℃，向化合物22-6(0.8g，3.75mmol，1当量)在CH2Cl2(10mL)中的溶液添加草酰氯(715mg，5.63mmol，1.5当量)和2滴DMF。将混合物在25℃搅拌2小时。将挥发物在减压下除去。将残余物溶解于CH2Cl2(10mL)，在0℃-5℃，将其逐滴转移到化合物22-6A(774mg，7.51mmol，1.5当量)和Et3N(1.9g，18.76mmol，5.0当量)在CH2Cl2(20mL)中的溶液。将混合物在25℃搅拌14小时。LCMS显示反应完成。将反应用水性饱和NaHCO3(10mL)淬灭。将各层分离。将水相用CH2Cl2(10mL*3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤。将滤液在减压下浓缩以给出呈浅黄色固体的标题化合物(1g，89.2％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.60(t,J＝3.6Hz,1H),6.88(s,1H),6.73(dd,J＝2.0Hz,4.0Hz,1H),3.56(t,J＝6.4Hz,2H),3.39(t,J＝7.2Hz,2H),1.67-1.57(m,4H),1.46-1.44(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝299.0。
步骤7：N-(5-溴戊基)-5-(5-氟噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000821
在0℃-5℃，向化合物22-7(1g，3.35mmol，1当量)在CH2Cl2(20mL)中的溶液添加PPh3(1.06g，4.02mmol，2.0当量)和NBS(0.72g，4.02mmol，2.0当量)。将混合物加温至25℃并搅拌14小时。LCMS显示反应完成。将反应用水性饱和NaHCO3(20mL)淬灭。将各层分离。将水相用CH2Cl2(20mL*3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤。将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(PE/EA30:1至5:1)纯化，以得到呈浅黄色固体的标题化合物(0.85g，70.2％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.19(t,J＝4.0Hz,1H),6.85(brs,1H),6.74(s,1H),6.57(dd,J＝1.6Hz,4.4Hz,1H),3.50-3.41(m,4H),1.94-1.90(m,2H),1.67-1.65(m,2H),1.57-1.55(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝360.9,362.9。
步骤8：甲基1-(5-(5-(5-氟噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺基)戊基)氮杂环丁烷-3-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000822
在0℃，向化合物22-8(400mg，1.11mmol，1当量)在CH3CN(8mL)中的悬浮液添加K2CO3(459mg，3.32mmol，3当量)和KI(184mg，1.11mmol，1当量)。添加10min后，添加化合物22-8a(335mg，2.21mmol，2.0当量)并在24℃-30℃搅拌18h。LCMS显示反应完成。过滤混合物。将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝50:1至10:1)纯化，以得到呈无色油状物的标题化合物(355mg，81.07％产率)。LC-MS：[M+H]+＝396.1。
步骤9：1-(5-(5-(5-氟噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺基)戊基)氮杂环丁烷-3-甲酸
Figure BDA0003070730780000831
在0℃，向化合物22-9(200mg，0.505mmol，1.0当量)在MeOH(5mL)中的溶液添加水(2.5mL)和LiOH.H2O(64mg，1.52mmol，3.0当量)。将混合物在17℃-20℃搅拌18小时。LCMS显示反应完成。将混合物用水性HCl(1.0M)酸化以调节pH至3-4并在减压下除去THF，并将残余的水性溶液冻干，以给出呈黄色固体的化合物22-10(190mg，100％产率)。LC-MS：[M+H]+＝382.1。
步骤10：5-(5-氟噻吩-2-基)-N-(5-(3-(甲基氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000832
在18℃-22℃，向化合物22-10(180mg，0.471mmol，1.0当量)在DMF(2mL)中的搅拌溶液添加DIEA(305mg，2.36mmol，5当量)和化合物22-10a(95.6mg，1.42mmol，3当量)。然后将混合物搅拌3min，添加HATU(359mg，0.943mmol，2当量)。添加后，将反应在18℃-22℃搅拌18小时。LCMS显示反应完成。将混合物用DMF(3mL)稀释并通过制备型HPLC(Kromasil 150*25mm*10um，梯度：25％-55％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：25mL/min)纯化，以得到呈黄色固体的标题化合物(40mg，21.49％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm7.35(t,J＝4.0Hz,1H),6.90(s,1H),6.72(dd,J＝2.8Hz,4.4Hz,1H),3.50-3.49(m,2H),3.36-3.34(m,2H),3.29-3.22(m,3H),2.70(s,3H),2.48-2.45(m,2H),1.62-1.59(m,2H),1.38-1.37(m,4H)。LC-MS：[M+H]+＝381.1。
实例23：N-(5-(3-氨基甲酰基氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(5-氟噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000841
在0℃，向化合物21-9(150mg，0.379mmol，1.0当量)在MeOH(1mL)中的溶液添加NH3.H2O(1mL)。然后将混合物加温至17℃-20℃并搅拌18小时。LCMS显示反应完成。将混合物用MeOH(3mL)稀释并通过制备型HPLC(Xtimate C18 150*25mm*5um，梯度：9％-39％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：25mL/min)纯化，以得到呈白色固体的标题化合物(43mg，29.8％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.35(t,J＝4.0Hz,1H),6.90(s,1H),6.75(dd,J＝2.0Hz,4.4Hz,1H),3.56-3.54(m,2H),3.39-3.33(m,2H),3.29-3.28(m,3H),2.53-2.49(m,2H),1.66-1.63(m,2H),1.42-1.41(m,4H)。LC-MS：[M+H]+＝381.1。
实例24：N-(5-(3-((1-氰基乙基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：苄基3-((1-甲氧基-1-氧代丙-2-基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000842
在4℃-9℃，向化合物24-1(2.0g，8.5mmol，1.0当量)在THF(50mL)中的溶液添加化合物24-1A(2.37g，17mmol，2.0当量)、DIEA(5.49g，42.5mmol，5.0当量)、HATU(6.47g，17mmol，2.0当量)。将混合物在4℃-9℃搅拌14小时。LCMS显示反应完成。将反应通过50mL的饱和水性NaHCO3淬灭。将各层分离。将水相用EtOAc(30mL*3)萃取。将合并的有机相用水性HCl(1M，50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥，过滤。将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2/MeOH 50:1至10:1)纯化，以得到呈浅黄色固体的标题化合物(2.2g，86.8％产率)。LC-MS：[M+Na]+＝343.0。
步骤2：苄基3-((1-氨基-1-氧代丙-2-基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000851
在7℃-14℃，向化合物24-2(1.0g，3.12mmol，1.0当量)在MeOH(15mL)中的混合物添加NH3.H2O(30mL，192.6mmol，61.7当量，25％wt)。将混合物在25℃-30℃搅拌14小时。LCMS显示反应完成。将挥发物在减压下除去。将残余物通过酸性制备型HPLC(Agela ASB150*25mm*5um，梯度：20％-40％B(A＝水(0.05％TFA v/v)，B＝CH3CN)，流速：25mL/min)纯化，以得到呈白色固体的标题化合物(350mg，36.7％产率)。LC-MS：[M+H]+＝306.1。
步骤3：苄基3-((1-氰基乙基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000852
在1℃-8℃，向化合物24-3(168mg，0.55mmol，1.0当量)在THF(2mL)中的混合物添加Et3N(78mg，0.77mmol，1.4当量)。在1℃-8℃，向混合物中添加TFAA(150.2mg，0.715mmol，1.3当量)。将混合物在1℃-8℃搅拌4小时。LCMS显示形成约55％的所希望的产物，并且25％的起始材料存留。将混合物用10mL盐水淬灭。将水溶液用EtOAc(10mL*3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤。将滤液在减压下浓缩，以得到呈浅黄色固体的化合物24-4(0.3mmol，粗品)。LC-MS：[M+Na]+＝309.9。
步骤4：N-(1-氰基乙基)氮杂环丁烷-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000861
在氮气气氛下，向高压釜中装入化合物24-4(0.3mmol，粗品)、Pd/C(50mg，10％wt，湿)、THF(10mL)。将混合物在3℃-8℃在氢气气氛(15psi)下搅拌4小时。LCMS显示大部分起始材料被消耗。将混合物过滤，并将滤饼用THF(2mL*2)洗涤。将滤液在减压下浓缩，以得到呈无色油状物的化合物24-5(0.3mmol)。
步骤5：N-(5-(3-((1-氰基乙基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000862
在3℃-9℃，向化合物24-5(0.3mmol，1.0当量)在MeOH(2mL)中的混合物添加中间体C(100mg，0.345mmol，1.15当量)、HOAc(18mg，0.3mmol，1.0当量)、NaBH(OAc)3(127.3mg，0.6mmol，2.0当量)。将混合物在3℃-9℃搅拌14小时。LCMS显示反应完成。将反应通过水(0.5mL)淬灭。将混合物分别通过碱性制备型HPLC(Kromasil 150*25mm*10um，梯度：33％-43％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：30mL/min)和酸性制备型HPLC(Boston Green ODS 150*30 5u，梯度：16％-46％B(A＝水(0.05％TFA v/v)，B＝CH3CN)，流速：30mL/min)纯化，以得到呈白色固体的实例24(18.4mg，14.3％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.95-7.91(m,2H),7.31-7.26(m,2H),7.07(s,1H),4.42-4.38(m,2H),4.20-4.05(m,2H),3.70-3.40(m,4H),3.28-3.25(m,2H),1.80-1.64(m,4H),1.53(d,J＝7.6Hz,3H),1.47-1.35(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝428.3。
实例25：N-(5-(3-氨基甲酰基-4-甲基哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：哌嗪-2-甲腈
Figure BDA0003070730780000871
在0℃，经30min向化合物25-1(5.15g，85.71mmol，1.5当量)在THF(15mL)中的混合物逐滴添加化合物25-1A(5g，57.14mmol，1.0当量)。将混合物在10℃-15℃搅拌16小时。过滤混合物。将滤液通过35％HCl酸化至PH＝4。将混合物过滤并将残余物溶解于20％HCl。将所得混合物倾倒入THF(300mL)中并过滤，以得到呈白色固体的标题化合物(3.8g，57％产率)。1H NMR：(400MHz,D2O)δppm 4.83-4.75(m,1H),3.74-3.52(m,2H),3.49-3.21(m,4H)。
步骤2：4-苄基哌嗪-2-甲腈
Figure BDA0003070730780000872
将化合物25-2(3.5g，18.89mmol，1.0当量)、BnCl(2.39g，18.89mmol，1.0当量)和NaHCO3(7.14g，85.02mmol，4.5当量)在EtOH(150mL)中的混合物加热至85℃并在85℃搅拌1小时。将混合物过滤并将滤液浓缩以给出残余物。将残余物通过反相快速色谱法(碱性)纯化，以得到呈黄色油状物的标题化合物(1.5g，90％纯度，35.5％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.45-7.29(m,5H),3.98(t,J＝3.4Hz,1H),3.67-3.60(d,1H),3.59-3.51(d,1H),3.26-3.24(m,1H),2.92(m,1H),2.88-2.81(m,1H),2.74(d,J＝11.0Hz,1H),2.55-2.42(m,1H),2.41-2.27(m,1H),1.91(br s,1H)。
步骤：4-苄基-1-甲基哌嗪-2-甲腈
Figure BDA0003070730780000873
在10℃，向化合物25-3(1.4g，6.96mmol，1.0当量)、水性HCHO(37％，6mL)和AcOH(417.72mg，6.96mmol，1.0当量)在MeOH(30mL)中的溶液添加NaBH3(CN)(874.25mg，13.91mmol，2.0当量)。将混合物在10℃-15℃搅拌16h。将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPCL(碱性)纯化，以得到呈黄色油状物的标题化合物(450mg，89％纯度，26.7％产率)。LC-MS：[M+H]+＝216.3。
步骤4：4-苄基-1-甲基哌嗪-2-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000881
在30℃，向化合物25-4(450mg，2.09mmol，1.0当量)在t-BuOH(9mL)中的混合物添加t-BuOK(938.17mg，8.36mmol，4.0当量)。将混合物在30℃搅拌40h。向混合物中添加饱和NH4Cl(50mL)和EA(50mL)。将水层用EA(50mL)萃取。将合并的EA层用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，以得到呈黄色固体的标题化合物(430mg，粗品)。LC-MS：[M+H]+＝234.3。
步骤5：1-甲基哌嗪-2-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000882
在10℃，向化合物25-5(230mg，985.82μmol，1.0当量)在MeOH(5mL)中的混合物添加Pd/C(湿，10％，50mg)。将混合物在10℃-15℃在50psi的H2下搅拌48小时。TLC显示化合物25-5被消耗。将混合物过滤并将滤液在减压下浓缩，以得到呈黄色油状物的标题化合物(140mg，粗品)。
步骤6：N-(5-(3-氨基甲酰基-4-甲基哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000891
在10℃-15℃，向化合物25-6(140mg，977.74μmol，1.0当量)和中间体B(244.92mg，879.97μmol，0.9当量)在MeOH(5mL)中的混合物添加AcOH(58.72mg，977.74μmol，1.0当量)和NaBH(OAc)3(414.452mg，1.96mmol，2.0当量)。将混合物在8℃-15℃搅拌16h。向混合物中添加饱和NaHCO3(1mL)。过滤混合物。将滤液通过制备型HPLC(碱性)(Phenomenex Gemini150*25mm*10um，梯度：28％-58％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：30mL/min)纯化，以得到呈白色固体的标题化合物(130mg，98％纯度，32％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.69(m,2H),7.23(dd,J＝3.8,5.0Hz,1H),6.93(s,1H),3.41(t,J＝7.0Hz,2H),2.97(d,J＝11.0Hz,1H),2.86(d,J＝9.0Hz,2H),2.75(dd,J＝3.1,10.4Hz,1H),2.45-2.38(m,2H),2.37-2.29(m,1H),2.29-2.21(m,4H),2.18(t,J＝10.9Hz,1H),1.67(m,2H),1.59(m,2H),1.48-1.37(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝406.4。
实例26：N-(5-(4-氨基甲酰基-4-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：1-苄基-4-羟基哌啶-4-甲腈
Figure BDA0003070730780000892
在25℃，向化合物25-1(4g，21.14mmol，1.0当量)在NMP(40mL)中的混合物逐滴添加TMSCN(4.19g，42.27mmol，2.0当量)。将混合物在25℃搅拌4小时。TLC(PE:EA＝10:1，Rf＝0.35)显示化合物26-1被消耗并出现新的点。向混合物中添加水(20mL)并用EA(20mL*3)萃取。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以给出残余物，将残余物通过硅胶柱色谱法(PE:EA＝50:1-20:1)纯化，以得到呈黄色油状物的标题化合物(2.5g，54.7％产率)。
步骤2：1-苄基-4-羟基哌啶-4-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000901
在0℃，向化合物26-2(2.0g，9.25mmol，1.0当量)和在H2SO4:H2O(8mL，v/v＝9:1)中的混合物。将混合反应物在25℃搅拌16h。将混合反应物倾倒入水(10mL)中并用EA(15mL*3)萃取。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以给出残余物，将残余物通过硅胶柱色谱法(PE:EA＝2:1-1:1)纯化，以得到呈白色固体的标题化合物(800mg，纯的)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.36-7.27(m,5H),6.53(br s,1H),5.41(br s,1H),3.55(s,2H),2.85-2.77(m,2H),2.67(br s,1H),2.36-2.25(m,2H),2.24-2.13(m,2H),1.64(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝235.1。
步骤3：4-羟基哌啶-4-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000902
向化合物26-3(650mg，2.77mmol，1.0当量)在MeOH(13mL)中的溶液添加Pd/C(130mg)，在25℃搅拌2h。TLC(DCM:MeOH＝5:1，Rf＝0.05)显示化合物26-3被消耗并出现新的点。将混合反应物过滤并在真空中浓缩成白色固体的标题化合物(600mg，粗品)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm2.97-2.83(m,4H),2.05-1.95(m,2H),1.54-1.44(m,2H)。
步骤4：N-(5-(4-氨基甲酰基-4-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000903
向化合物26-4(100mg，693.62umol，1.0当量)、中间体B(96.53mg，346.81umol，0.5当量)在MeOH(2mL)中的溶液逐滴添加HOAc(41.65mg，693.62umol，1.0当量)。然后添加NaBH4(52.48mg，1.39mmol，2.0当量)溶液，将混合反应物在25℃搅拌2h。TLC(DCM:MeOH＝5:1，Rf＝0.35)显示中间体B被消耗并出现新的点。向混合反应物中添加水(5mL)并用EA(10mL*3)萃取。将合并的有机层用盐水(5mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以给出残余物，将残余物通过制备型HPLC(碱性)纯化，以得到呈白色固体的标题化合物(50.27mg，99.5％纯度)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.67(ddd,J＝1.0,4.4,9.1Hz,2H),7.21(dd,J＝3.8,5.0Hz,1H),6.91(s,1H),3.40(t,J＝7.0Hz,2H),2.85-2.80(m,2H),2.48-2.35(m,4H),2.20-2.10(m,2H),1.70-1.55(m,6H),1.46-1.35(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝407.3。
实例27：5-(4-氟苯基)-N-(5-(3-(((1S,2R)-2-羟基环戊基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：N-((1S,2S)-2-羟基环戊基)乙酰胺(反式相关)
Figure BDA0003070730780000911
在0℃，将起始材料化合物27-1(2.5g，24.72mmol，1.0当量)悬浮于24mL丙酮中，并且然后添加24mL水性10％Na2CO3并随后缓慢添加Ac2O(2.52g，24.72mmol，1当量)。然后经1小时将反应加温至20℃-26℃并再搅拌2小时，在此期间溶液变得均匀。将反应用各自10mL的NaHCO3(饱和)和NaCl(饱和)稀释。然后将溶液用(CH2Cl2:i-PrOH＝9:1)萃取(5x10mL)。将合并的有机提取物经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，以得到呈无色油状物的标题化合物(1.60g，45.21％产率)。LC-MS：[M+H]+＝144.1。
步骤2：(3aS,6aR)-2-甲基-3a,5,6,6a-四氢-4H-环戊[d]噁唑(顺式相关)
Figure BDA0003070730780000921
在0℃，向化合物27-2(1.60g，11.17mmol，1.0当量)在CH2Cl2(10mL)中的搅拌溶液缓慢添加纯SOCl2(5.32g，44.7mmol，4当量)。经1小时将反应加温至19℃-26℃并再搅拌2小时。将粗制混合物在真空中浓缩，以得到呈棕色油状物的标题化合物(1.4g，100％产率)。1HNMR(400MHz,CD3OD)δppm 5.78-5.75(m,1H),4.87-4.84(m,1H),2.43(s,3H),2.20-2.10(m,1H),2.00-1.87(m,4H),1.70-1.60(m,1H)。
步骤3：(1R,2S)-2-氨基环戊-1-醇盐酸盐(顺式相关)
Figure BDA0003070730780000922
将化合物27-3(1.40g，9.78mmol，1.0当量)在15mL的1.3N HCl中的溶液在105℃搅拌1小时。将冷却的溶液在真空中浓缩并将所得残余物溶解于1:1MeOH:CH2Cl2(50mL)并经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩成棕色固体的标题化合物(500mg，40.85％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.93(brs,3H),5.40(brs,1H),4.09-4.07(m,1H),3.24(m,1H),1.89-1.48(m,6H)。
步骤4：5-(4-氟苯基)-N-(5-(3-(((1S,2R)-2-羟基环戊基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000923
使用与实例22步骤6至9相应的程序，与化合物22-10类似地制备化合物27-5，但用5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酸代替化合物22-6。在18℃-22℃，向化合物27-5(200mg，0.533mmol，1.0当量)在DMF(3mL)中的搅拌溶液添加DIEA(344mg，2.66mmol，5当量)和化合物27-4(219.9mg，1.60mmol，3当量)。然后将混合物在18℃-22℃搅拌3min，添加HATU(405mg，1.07mmol，2当量)。添加后，将反应在18℃-22℃搅拌18小时。LCMS显示反应完成。将混合物用DMF(2mL)稀释并通过制备型HPLC(Kromasil 150*25mm*10um，梯度：25％-55％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：25mL/min)纯化，以得到呈白色固体的标题化合物(89mg，36.43％产率)。LCMS：在5-95AB_220&254色谱(MK RP-18e 25-2mm)中tR＝0.692min，MS(ESI)m/z 459.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm7.93-7.89(m,2H),7.28-7.24(m,2H),7.03(s,1H),4.10-4.07(m,1H),3.97-3.94(m,1H),3.54-3.52(m,2H),3.43-3.39(m,2H),3.37-3.35(m,1H),3.30-3.28(m,2H),2.48-2.47(m,2H),1.87-1.82(m,3H),1.64-1.60(m,5H),1.40-1.38(m,4H)。LC-MS：[M+H]+＝459.3。
实例28：N-(5-((3R,4S)-4-氨基甲酰基-3-氟哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺(实例28-顺式)
N-(5-((3S,4S)-4-氨基甲酰基-3-氟哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺(实例28-反式)
步骤1：甲基1-苄基-3-氟哌啶-4-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000931
在-60℃，向化合物28-1(5g，20.06mmol，1.0当量)在DCM(100mL)中的混合物添加DAST(8.08，50.14mmol，2.5当量)。将混合物加温至0℃并搅拌3h。将混合物在15℃搅拌16h。向饱和NaHCO3(250mL)中添加该混合物。将DCM层用盐水(100mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱法(PE:EA＝50:1至20:1)纯化成黄色油状物的标题化合物(1.1g，94％纯度，20％产率)。LC-MS：[M+H]+＝252.3。
步骤2：1-苄基-3-氟哌啶-4-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000941
将化合物28-2(1.1g，4.38mmol，1.0当量)和NH3.H2O(25％，200mL)在MeOH(20mL)中的混合物在15℃搅拌26h。将混合物用EA(100mL x 2)萃取。将EA层用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩以给出残余物，将残余物通过硅胶柱色谱法(PE:EA＝1:1)纯化，以得到呈黄色固体的标题化合物(340mg，34％产率)。LC-MS：[M+H]+＝237.2。
步骤3：3-氟哌啶-4-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000942
将化合物28-3(340mg，1.44mmol，1.0当量)和Pd/C(150mg，10％，湿)在MeOH(6mL)中的混合物在50psi的H2下在15℃搅拌6h。将混合物过滤并浓缩成黄色油状物的标题化合物(170mg，粗品)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 3.58-3.46(m,1H),3.11-3.03(m,1H),2.97-2.90(m,1H),2.76-2.66(m,1H),2.61-2.46(m,2H),2.12(m,1H),2.05-1.95(m,1H)。
步骤4：N-(5-(4-氨基甲酰基-3-氟哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000943
在20℃，向化合物28-4(160mg，1.09mmol，1.0当量)和中间体B(274.21mg，985.2μmol，0.9当量)在MeOH(5mL)中的混合物添加AcOH(65.74，1.09mmol，1.0当量)和NaBH(OAc)3(464.01mg，2.19mmol，2.0当量)。将混合物在20℃搅拌4h。向反应中添加H2O(1mL)。过滤混合物。将滤液通过碱性制备型HPLC(Phenomenex Gemini 150*25mm*10um，梯度：25％-55％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：30mL/min)纯化，以得到均呈白色固体的实例28-顺式(71.74mg，99％纯度)和实例28-反式(39.32mg，98.6％纯度)。均通过LCMS、SFC和HNMR确认实例28-顺式和实例28-反式。
实例28-顺式：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.72-7.65(m,2H),7.22(dd,J＝3.8,5.0Hz,1H),6.92(s,1H),4.55-4.50(m,0.5H),4.43-4.38(m,0.5H),3.46-3.37(m,2H),3.20-3.12(m,1H),3.04-2.85(m,2H),2.85-2.74(m,1H),2.55-2.44(m,1H),2.44-2.18(m,2H),2.14-1.92(m,2H),1.81-1.53(m,4H),1.51-1.36(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝409.3。
实例28-反式：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 8.80(br t,J＝5.7Hz,1H),7.87(dd,J＝1.1,5.0Hz,1H),7.80(dd,J＝1.2,3.7Hz,1H),7.46(br s,1H),7.27(dd,J＝3.7,4.9Hz,1H),7.18(s,1H),6.95(br s,1H),4.70(m,1H),4.58(m,1H),3.25(q,J＝6.7Hz,2H),3.20-3.10(m,1H),2.78(d,J＝8.8Hz,1H),2.39-2.18(m,3H),1.95-1.69(m,3H),1.61-1.37(m,5H),1.36-1.19(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝409.3。
实例29：N-(5-((3R,4S)-3-氨基甲酰基-4-氰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：甲基1-苄基-4-氧代哌啶-3-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000951
在90℃，向化合物29-1A(19.04g，211.36mmol)、t-BuOK(29.65g，264.20mmol)在甲苯(250mL)中的溶液添加化合物29-1(20g，105.68mmol)，并在90℃搅拌2小时。TLC(PE:EA＝2:1，Rf＝0.7)显示化合物29-1被消耗。将混合物过滤，将有机层用NH4Cl(水性)(300mL)稀释，用EA(100mL*3)萃取并在真空中浓缩，以得到呈黄色油状物的标题化合物(30g，粗品)。LC-MS：[M+H]+＝248.3。
步骤2：甲基1-苄基-4-羟基哌啶-3-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000961
在0℃，向化合物28-2(30g，121.32mmol)在MeOH(300mL)中的溶液添加NaBH4(6.88g，181.97mmol)，并在0℃搅拌1小时。TLC(PE:EA＝2:1，Rf＝0.1)指示化合物29-2被消耗。将混合物通过H2O(100mL)淬灭，在真空中浓缩以除去MeOH，用EA(100mL*3)萃取并在真空中浓缩，以得到标题化合物(16g，粗品)。LC-MS：[M+H]+＝250.4。
步骤3：甲基1-苄基-4-((甲基磺酰基)氧基)哌啶-3-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000962
在0℃，向化合物28-3(15g，60.17mmol)在DCM(150mL)中的溶液添加Et3N(24.35g，240.67mmol)、MsCl(13.78g，120.33mmol)，并在25℃搅拌16小时。TLC(PE:EA＝2:1，Rf＝0.6)指示化合物29-3被消耗，将混合物用NH4Cl(水性)(100mL*5)洗涤并在真空中浓缩，以给出呈黄色油状物的化合物29-4(20g，粗品)，将其直接用于下一步骤。
步骤4：甲基(3S,4R)-1-苄基-4-氰基哌啶-3-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000963
向化合物29-4(20g，61.09mmol)在MeCN(200mL)中的溶液添加TBAF(91.63mL，91.63mmol)、TMSCN(9.09g，91.63mmol)，并在80℃搅拌16小时。TLC(PE:EA＝2:1，Rf＝0.6、0.4)指示化合物29-4被消耗，将混合物在真空中浓缩以给出残余物，然后将残余物用H2O(150mL)稀释，用EA(100mL*3)萃取，在真空中浓缩以给出残余物(12g，粗品)。将残余物通过柱色谱法(PE:EA＝100:1至10:1)纯化以给出化合物29-5A(3.0g，16.9％产率，89％纯度)和化合物29-5B(2.5g，13.4％产率，85％纯度)。
化合物29-5A：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.42-7.20(m,5H),3.70(s,3H),3.58-3.47(m,2H),3.02(d,J＝3.3Hz,1H),2.97-2.82(m,2H),2.81-2.67(m,1H),2.45-2.19(m,2H),2.17-2.05(m,1H),1.89-1.75(m,1H)。LC-MS：[M+H]+＝259.2。
化合物29-5B：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.38-7.21(m,5H),3.71(s,3H),3.62-3.49(m,2H),3.37(m,1H),3.10-2.88(m,2H),2.81-2.64(m,1H),2.57-2.26(m,2H),2.12-1.99(m,1H),1.95-1.83(m,1H)。LC-MS：[M+H]+＝259.2。
步骤5：(3S,4R)-1-苄基-4-氰基哌啶-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000971
将化合物29-5A(2.0g，7.74mmol)在MeOH(2mL)和NH3·H2O(20mL，25％纯度)中的溶液在25℃搅拌16小时。TLC(PE:EA＝2:1，Rf＝0.4)指示化合物29-5A被消耗，将混合物用EA(15mL*5)萃取，在真空中浓缩以给出残余物。将残余物通过柱色谱法(PE:EA＝10:1至0:1)纯化以得到标题化合物(750mg，39.81％产率)。LC-MS：[M+H]+＝244.3。
步骤6：(3S,4R)-4-氰基哌啶-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000972
向化合物29-6(200mg，0.822mmol)在MeOH(2mL)中的溶液添加Pd/C(200mg，10％纯度)并在H2(15psi)下在25℃搅拌5小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.2)指示化合物29-6被消耗，将混合物过滤并在真空中浓缩，以得到标题化合物(120mg，粗品)，将其直接用于下一步骤。
步骤7：N-(5-((3R,4S)-3-氨基甲酰基-4-氰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000981
向化合物29-7(120mg，0.783mmol)在MeOH(2mL)中的溶液添加中间体B(218.04mg，0.783mmol)、AcOH(47.04mg，0.783mmol)、NaBH(OAc)3(332.06mg，1.57mmol)，并在25℃搅拌16小时。LCMS显示38.7％的中间体B存留，检测到21％的实例29。将混合物在真空中浓缩以给出残余物。将残余物通过制备型HPLC(TFA条件)纯化以给出残余物，将残余物用水性NaHCO3(10mL)稀释，用EA(10mL*3)萃取，将有机层在真空中浓缩，以得到标题化合物(53.45mg，16.42％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.71-7.63(m,2H),7.21(t,J＝4.5Hz,1H),6.90(s,1H),3.39(t,J＝7.0Hz,2H),3.05(dd,J＝11.7Hz,1H),2.97-2.82(m,2H),2.72(dt,J＝3.7,10.7Hz,1H),2.44-2.36(m,2H),2.16-2.02(m,3H),1.88-1.76(m,1H),1.65(m,2H),1.61-1.51(m,2H),1.46-1.36(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝416.3。
实例30：N-(5-(4-氨基甲酰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：甲基1-苄基-3-氧代哌啶-4-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000982
在0℃，向化合物30-1(14g，74mmol，1当量)在30-1A(100mL)中的溶液添加NaH(7.6g，190mmol，2.5当量)，将反应混合物在75℃搅拌1h。TLC(PE:EA＝1:1)显示大部分起始材料(Rf＝0.7)被消耗并且观察到一个新的斑点(Rf＝0.8，与C-05663-028-P1相同)。将反应混合物用水(200mL)稀释并用EA(30mL*3)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，以得到标题化合物(15g，粗品，80％纯度)，其以深色油状物获得并直接用于下一步骤。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.38-7.28(m,5H),3.78(s,3H),3.61(s,2H),3.13(s,2H),2.61(t,J＝5.6Hz,2H),2.37-2.33(m,2H)。
步骤2：甲基1-苄基-3-羟基哌啶-4-甲酸酯
Figure BDA0003070730780000991
在0℃，向化合物30-2(3g，12mmol，1.0当量)在MeOH(20mL)中的溶液添加NaBH4(229mg，6mmol，0.5当量)。将反应混合物在15℃搅拌1h。TLC(PE:EA＝1:1)显示大部分起始材料(Rf＝0.8)被消耗并且观察到一个新的斑点(Rf＝0.4，与C-05663-039-P1相同)。将反应混合物通过2M HCl淬灭以调节pH＝7，并且然后用EA(20mL*3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，以得到标题化合物(2.6g，粗品，80％纯度)，其以深色油状物获得并直接用于下一步骤。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.34-7.29(m,5H),3.74(s,3H),3.56(s,2H),3.04-2.96(m,1H),2.90(m,1H),2.47-2.38(m,1H),2.28-2.19(m,1H),2.15-1.88(m,2H),1.84-1.72(m,2H)。
步骤3：1-苄基-3-羟基哌啶-4-甲酰胺
Figure BDA0003070730780000992
向化合物30-3(2g，8mmol，1当量)在MeOH(1mL)中的混合物添加NH3.H2O(20mL)。将反应混合物在15℃搅拌16小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1)显示大部分起始材料(Rf＝0.6)被消耗并且观察到一个新的斑点(Rf＝0.25，与C-05665-022-P1相同)。将反应混合物在真空中浓缩，将残余物用EA(10mL)稀释并用盐水(50mL)洗涤。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，以得到呈黄色油状物的标题化合物(1.3g，粗品，85％纯度)，将其直接用于下一步骤。LC-MS：[M+H]+＝235.4。
步骤4：3-羟基哌啶-4-甲酰胺
Figure BDA0003070730780001001
向化合物30-4(1g，4.27mmol，1.0当量)在MeOH(8mL)中的混合物添加Pd/C(0.6g，10％)，将反应混合物在H2(50Psi)下在15℃搅拌6小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1)显示大部分起始材料(Rf＝0.25)被消耗并且观察到一个新的斑点(Rf＝0.01，与C-05663-085-P1相同)。将反应混合物过滤并将有机相在真空中浓缩，以得到呈黄色油状物的标题化合物(350mg，粗品，85％纯度)，将其直接用于下一步骤。
步骤5：
N-(5-((3R,4R)-4-氨基甲酰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺(顺式)
N-(5-((3S,4R)-4-氨基甲酰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺(反式)
Figure BDA0003070730780001002
在15℃，向化合物30-5(300mg，2.08mmol，1.0当量)在MeOH(8mL)中的混合物添加中间体B(579mg，2.08mmol，1.0当量)和HOAc(125mg，2.08mmol，1.0当量)，随后添加NaBH(OAc)3(881mg，4.16mmol，2.0当量)。将反应混合物在15℃搅拌6小时。LCMS(C-05665-047-P1A2)显示化合物30-5被完全消耗，观察到所希望的MW(作为主峰)。将反应混合物通过饱和水性NaHCO3(100mL)淬灭并用EA(20mL*3)萃取。将有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过制备型HPLC(NH3.H2O)纯化以得到呈白色固体的标题化合物(80mg顺式，16mg反式)。
实例30(顺式)：1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 8.80(m,1H),7.88(dd,J＝1.2,5.2Hz,1H),7.80(dd,J＝1.2,3.6Hz,1H),7.28(dd,J＝3.6,5.2Hz,1H),7.21(s,1H),7.18(s,1H),6.87(s,1H),4.55(d,J＝5.6Hz,1H),3.93(s,1H),3.25(m,2H),2.69-2.68(m,1H),2.26-2.22(m,2H),2.18-2.16(m,1H),2.09-2.05(m,1H),1.97-1.87(m,2H),1.58-1.41(m,5H),1.34-1.22(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝407.3。
实例30(反式)：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.81(m,1H),7.88(dd,J＝1.2,5.2Hz,1H),7.80(dd,J＝1.2,3.6Hz,1H),7.28(dd,J＝3.6,5.2Hz,1H),7.21(s,1H),7.18(s,1H),6.73(s,1H),4.79(d,J＝4.4Hz,1H),3.29-3.21(m,3H),3.18(d,1H),2.90(m,1H),2.78(m,1H),2.27-2.21(m,2H),1.95-1.85(m,1H),1.76-1.62(m,2H),1.60-1.53(m,2H),1.50-1.43(m,2H),1.41-1.25(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝407.3。
实例31：N-(5-(4-氨基甲酰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780001011
向化合物30-5(140mg，0.971mmol，1当量)在MeOH(3mL)中的溶液添加中间体C(281.89Mg，0.971mmol，1当量)、AcOH(58.31mg，0.971mmol，1当量)和NaBH(OAc)3(411.62mg，1.94mmol，2当量)。将混合物在25℃搅拌16小时。LCMS(C-05664-110-P1A)显示27％的3A存留，检测到66％的4。将反应过滤并在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC(碱性条件)纯化，以得到呈黄色固体的标题化合物的相关外消旋体(250mg，61.5％产率)，将其通过SFC分离。
Figure BDA0003070730780001021
将实例31进一步通过SFC(柱：IC 250mm*30mm，10um，条件：0.1％NH3H2O MeOH，流速：70mL/min)纯化，以得到实例31-顺式和实例31-反式。
获得呈黄色固体的实例31-顺式(126.17mg，96.78％纯度，48.84％产率)。实例30-顺式为IC中的峰2，并且实例31-反式为IC中的峰2。峰1：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 8.47(s,1H),7.92(dd,J＝5.3,8.8Hz,2H),7.28(t,J＝8.7Hz,2H),7.06(s,1H),4.03(s,1H),3.51-3.35(m,4H),3.04-2.92(m,2H),2.88-2.58(m,2H),2.42(s,1H),2.11(d,J＝13.2Hz,1H),1.98-1.83(m,1H),1.81-1.64(m,3H),1.73-1.64(m,1H),1.46(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝419.4。
峰2：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.96-7.89(m,2H),7.28(t,J＝8.7Hz,2H),7.05(s,1H),4.10(br s,1H),3.40(t,J＝7.0Hz,2H),3.02-2.87(m,2H),2.50-2.33(m,3H),2.28(br d,J＝11.6Hz,1H),2.23-2.06(m,2H),1.71-1.62(m,3H),1.62-1.54(m,2H),1.42(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝419.4。
实例32：N-(5-(3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：叔丁基3-氰基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780001022
在0℃，向化合物32-1(3g，14.27mmol，1.0当量)在EtOH(60mL)中的混合物添加NaBH4(1.08g，28.54mmol，2.0当量)并搅拌1h。将混合物浓缩。将残余物溶解于EA(50mL)。将EA层用水(50mL)和盐水(100mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，以得到呈黄色油状物的标题化合物(3.3g，粗品)。LC-MS：[M+H-56]+＝157.1。
步骤2：叔丁基3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780001031
在15℃，向化合物32-2(1.5g，7.07mmol，1.0当量)在MeOH(30mL)中的溶液添加水性NaOH(15mL，1M)和H2O2(7.5mL)并搅拌6h。向混合物中添加饱和NH4Cl(200mL)和EA(150mL)。将水层用EA(150mL)萃取。将合并的EA层用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩，以给出呈黄色油状物的标题化合物(800mg，粗品)，将其直接用于下一步骤。LC-MS：[M+Na]+＝253.1。
步骤3：4-羟基吡咯烷-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780001032
在15℃，向化合物32-3(800mg，3.47mmol，1.0当量)在DCM(15mL)中的混合物添加TFA(5mL)并搅拌6h。将混合物浓缩以给出呈黄色油状物的化合物32-4(1.6g，粗品)，将其直接用于下一步骤。LC-MS：[M+H]+＝131.1。
步骤4：
Figure BDA0003070730780001033
在15℃，向化合物32-4(800mg，粗品)和中间体C(446.1mg，1.54mmol，1.0当量)在MeOH(15mL)中的混合物添加AcOH(92.28mg，1.54mmol，1.0当量)和NaBH(OAc)3(651.4mg，3.07mmol，2.0当量)。将混合物在15℃搅拌16h。向反应中添加饱和NaHCO3(1.5mL)。将混合物过滤并将滤液通过碱性制备型HPLC(Phenomenex Gemini150*25mm*10um，梯度：22％-52％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：30mL/min)和两次SFC纯化，以得到均呈白色固体的实例32的四个峰。
实例32(峰1)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 8.00-7.89(m,2H),7.34-7.25(m,2H),7.07(s,1H),4.57-4.45(m,1H),3.42(t,J＝7.0Hz,2H),3.17-3.07(m,1H),3.06-2.92(m,3H),2.66-2.52(m,3H),1.76-1.55(m,4H),1.51-1.36(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝405.3。
实例32(峰2)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.93-7.73(m,2H),7.27-7.10(m,2H),6.95(s,1H),4.46-4.32(m,1H),3.31(t,J＝7.0Hz,2H),3.08-2.85(m,4H),2.61-2.49(m,3H),1.63-1.44(m,4H),1.41-1.27(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝405.3。
实例32(峰3)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 8.01-7.84(m,2H),7.29(t,J＝8.8Hz,2H),7.07(s,1H),4.46(q,J＝4.9Hz,1H),3.42(t,J＝7.1Hz,2H),3.10(t,J＝8.8Hz,1H),2.85(m,1H),2.75(d,J＝5.1Hz,2H),2.65-2.37(m,3H),1.74-1.52(m,4H),1.52-1.39(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝405.3。
实例32(峰4)：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 8.01-7.84(m,2H),7.39-7.20(m,2H),7.07(s,1H),4.47(q,J＝4.7Hz,1H),3.42(t,J＝7.0Hz,2H),3.16(dd,J＝8.3,9.5Hz,1H),2.88(m,1H),2.81(d,J＝4.9Hz,2H),2.74-2.47(m,3H),1.74-1.54(m,4H),1.52-1.36(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝405.3。
实例33N-(5-(3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺：
Figure BDA0003070730780001041
在30℃，向化合物32-4(1.5g，粗品)、中间体B(1.5g，5.38mmol，1.0当量)和HOAc(323mg，5.38mmol，1.0当量)在MeOH(30mL)中的混合物添加NaBH(OAc)3(2.28g，10.76mmol，2.0当量)。将混合物在30℃搅拌2小时。向混合物中添加饱和NaHCO3(10mL)。将混合物在减压下浓缩。将残余物通过MPLC纯化以给出呈白色固体的实例33(1.3g，100％纯度)，将其通过LCMS和SFC进行分析。将产物通过SFC纯化以给出四个峰，并且然后通过制备型HPLC(碱性)纯化以给出峰1(119.34mg，100％纯度)、峰2(80.94mg，100％纯度)、峰3(55.48mg，100％纯度)和峰4(154.01mg，100％纯度)。
峰1：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.69(m,2H),7.23(dd,J＝3.8,5.0Hz,1H),6.92(s,1H),4.50(dt,J＝3.8,6.1Hz,1H),3.41(t,J＝7.0Hz,2H),3.10(dd,J＝5.6,10.5Hz,1H),3.05-2.89(m,3H),2.63-2.50(m,3H),1.75-1.53(m,4H),1.52-1.37(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝393.3。
峰2：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.69(m,2H),7.23(dd,J＝3.8,5.0Hz,1H),6.93(s,1H),4.50(dt,J＝4.0,5.8Hz,1H),3.42(t,J＝7.1Hz,2H),3.15-3.08(m,1H),3.06-2.92(m,3H),2.65-2.52(m,3H),1.75-1.54(m,4H),1.51-1.37(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝393.3。
峰3：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.69(m,2H),7.23(dd,J＝3.8,5.0Hz,1H),6.93(s,1H),4.50-4.41(m,1H),3.41(t,J＝7.1Hz,2H),3.10(t,J＝9.0Hz,1H),2.85(dt,J＝4.6,8.1Hz,1H),2.74(d,J＝5.6Hz,2H),2.65-2.41(m,3H),1.75-1.53(m,4H),1.51-1.36(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝393.3。
峰4：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.69(m,2H),7.23(dd,J＝3.7,5.1Hz,1H),6.93(s,1H),4.51-4.40(m,1H),3.41(t,J＝7.1Hz,2H),3.09(t,J＝8.8Hz,1H),2.84(dt,J＝4.6,8.1Hz,1H),2.78-2.69(m,2H),2.64-2.38(m,3H),1.76-1.52(m,4H),1.51-1.36(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝393.3。
实例34：
N-(5-((3S,4R)-3-氰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺(实例33-顺式)
N-(5-((3S,4S)-3-氰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺(实例33-反式)
步骤1：4-羟基吡咯烷-3-甲腈
Figure BDA0003070730780001061
向化合物32-2(1.5g，7.07mmol)在DCM(9mL)中的溶液添加TFA(3mL)并在25℃搅拌1小时。TLC(PE:EA＝2:1，Rf＝0.1)指示化合物32-2被消耗。将混合物在真空中浓缩以给出标题化合物(2.1g，粗品)，将其直接用于下一步骤。
步骤2：N-(5-(3-氰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780001062
向中间体B(992.87mg，3.57mmol)在MeOH(15mL)中的溶液添加化合物34-2(1.0g，8.92mmol)、AcOH(535.56mg，8.92mmol)、NaBH(OAc)3(3.78g，17.84mmol)，并在25℃搅拌16小时。LCMS显示中间体B被消耗，将混合物过滤并在真空中浓缩以给出残余物。将残余物通过制备型HPLC(碱性条件)纯化以给出呈白色粉末的标题化合物(顺式)(94.06mg，7.00％产率)和(反式)(193.83mg，14.28％产率)。
实例34-顺式：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.72-7.61(m,2H),7.20(m,1H),6.90(s,1H),4.47-4.38(m,1H),3.43-3.34(m,2H),3.30-3.25(m,1H),3.11-2.97(m,2H),2.78(m,1H),2.57-2.41(m,3H),1.65(m,2H),1.55(m,2H),1.42(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝375.3。
实例34-反式：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.58(m,2H),7.13(s,1H),6.82(s,1H),4.40(s,1H),3.31-3.27(m,1H),3.23(s,1H),3.00-2.90(m,1H),2.90-2.77(m,2H),2.65(m,1H),2.50-2.30(m,3H),1.58(m,2H),1.46(m,2H),1.34(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝375.3。
实例35：
N-(5-((3R,4S)-3-氨基甲酰基-4-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺(顺式)
N-(5-((3R,4R)-3-氨基甲酰基-4-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺(反式)
步骤1：甲基1-苄基-4-氧代哌啶-3-甲酸酯
Figure BDA0003070730780001071
在90℃，向碳酸二甲酯(4.76g，52.84mmol，2.0当量)和t-BuOK(6.67g，29.44mmol，2.25当量)在甲苯(60mL)中的混合物逐滴添加化合物35-1(5g，26.42mmol，1.0当量)的溶液。将混合物在90℃搅拌2小时。向反应混合物中添加AcOH(2.35当量)和水(100mL)。将有机层分离并用盐水(50mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥并在减压下浓缩以给出呈黄色油状物的标题化合物(7g，粗品)。LC-MS：[M+H]+＝248.2。
步骤2：甲基1-苄基-4-羟基哌啶-3-甲酸酯
Figure BDA0003070730780001072
在0℃，向化合物35-2(2.0g，8.09mmol，1.0当量)在MeOH(40mL)中的混合物添加NaBH4(611.95mg，16.18mmol，2.0当量)。将混合物在0℃搅拌2小时。将混合物在减压下浓缩以给出残余物。向残余物中添加EA(50mL)和水(50mL)。将EA层用盐水(50ml)洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩，以给出呈黄色油状物的化合物35-3(1.8g，粗品)。LC-MS：[M+H]+＝250.3。
步骤3：1-苄基-4-羟基哌啶-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780001081
将化合物35-3在NH3/MeOH(7M，20mL)中的混合物在10℃搅拌16h并在30℃搅拌120h。LCMS(C-05663-131-P1B4)显示少量的化合物35-3存留并检测到所希望的质量。将混合物在减压下浓缩以给出呈黄色油状物的标题化合物(1g，粗品)。LC-MS：[M+H]+＝235.3。
步骤4：4-羟基哌啶-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780001082
在15℃，向化合物35-4(1.0g，4.27mmol)在MeOH(20mL)中的混合物添加Pd/C(湿，10％，200mg)。将混合物在15℃在50psi的H2下搅拌16h。将混合物过滤并将滤液在减压下浓缩，以得到呈黄色油状物的标题化合物(600mg，粗品)。LC-MS：[M+H]+＝145.1。
步骤5：N-(5-(3-氨基甲酰基-4-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780001083
在10℃-15℃，向化合物35-5(300mg，2.08mmol，1.0当量)和中间体B在MeOH(10mL)中的混合物添加HOAc(112.46mg，1.87mmol，0.9当量)和NaHB(OAc)3(882.03mg，4.16mmol，2.0当量)。将混合物在10℃-15℃搅拌16h。向混合物中添加饱和NaHCO3(2mL)。将混合物在减压下浓缩以给出残余物。将残余物通过制备型HPLC(碱性)(Phenomenex Gemini 150*25mm*10um，梯度：22％-52％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：30mL/min)纯化，以给出呈白色粉末的标题化合物(反式)(102.45mg)和(顺式)(122.73mg)。
实例35-反式：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.69(m,2H),7.23(dd,J＝3.7,4.9Hz,1H),6.92(s,1H),3.74(m,1H),3.41(t,J＝7.1Hz,2H),3.08-2.91(m,2H),2.48-2.36(m,3H),2.21-2.06(m,2H),2.01-1.89(m,1H),1.74-1.53(m,5H),1.49-1.35(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝407.3。
实例35-顺式：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.69(m,2H),7.23(dd,J＝3.8,5.0Hz,1H),6.92(s,1H),4.15(br s,1H),3.42(t,J＝7.1Hz,2H),2.82-2.49(m,5H),2.48-2.36(m,2H),1.86-1.76(m,2H),1.74-1.55(m,4H),1.50-1.37(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝407.3。
实例36：N-(5-(3-((4-羟基四氢呋喃-3-基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：甲基1-(5-(5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺基)戊基)氮杂环丁烷-3-甲酸酯
Figure BDA0003070730780001091
在0℃，向化合物36-1(968mg，2.82mmol，1当量)在CH3CN(15mL)中的悬浮液添加K2CO3(1.17g，8.45mmol，3当量)和KI(467mg，2.82mmol，1当量)。添加后，添加化合物36-1A(512mg，3.38mmol，1.2当量)并将反应混合物在9℃-16℃搅拌18小时。LCMS显示反应完成。过滤混合物。将滤液在减压下浓缩并将残余物通过硅胶柱(DCM:MeOH＝50:1至10:1)纯化，以得到呈浅黄色油状物的化合物(1.05g，粗品)。LC-MS：[M+H]+＝378.2。
步骤2：1-(5-(5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺基)戊基)氮杂环丁烷-3-甲酸
Figure BDA0003070730780001092
在0℃，向化合物36-2(1.05g，2.78mmol，1.0当量)在H2O/THF(8mL/16mL)中的搅拌溶液添加LiOH.H2O(350mg，8.35mmol，3.0当量)。然后将混合物在12℃-19℃搅拌18小时。LCMS显示反应完成。在摇动下通过添加1N HCl酸化反应混合物来调节pH至5-6，并且然后在减压下除去THF，并将残余的水性溶液冻干，以得到呈黄色胶状物的标题化合物(2.78mmol)。LC-MS：[M+H]+＝364.1。
Figure BDA0003070730780001101
在11℃-14℃，向化合物36-3(110mg，0.302mmol，1.0当量)在DMF(1mL)中的搅拌溶液添加DIEA(196mg，1.51mmol，5当量)和化合物36-3A(127mg，0.908mmol，3当量)。然后将混合物在11℃-14℃搅拌3min，添加HATU(230mg，0.605mmol，2当量)。添加后，将反应在11℃-14℃搅拌18小时。LCMS显示反应完成。将混合物用DMF(1.5mL)稀释并通过碱性制备型HPLC(柱Xtimate C18150*25mm*5um，梯度：22％-52％B(A＝水(0.05％氢氧化铵v/v)，B＝CH3CN)，流速：25ml/min)纯化，以得到呈白色固体的标题化合物(42mg，96.06％纯度)。1HNMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.69-7.66(m,2H),7.21(dd,J＝4.0,4.8Hz,1H),6.88(s,1H),4.18-4.09(m,2H),4.07-4.01(m,1H),3.96-3.91(m,1H),3.67-3.60(m,2H),3.55-3.49(m,2H),3.38(t,J＝6.8Hz,2H),3.29-3.25(m,3H),2.55-2.47(m,2H),1.69-1.57(m,2H)1.45-1.35(m,4H)。LC-MS：[M+H]+＝449.2。
实例37：N-(5-(4-(3-氨基-2-羟基-3-氧代丙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
步骤1：叔丁基4-(2-羟基-3-甲氧基-3-氧代丙基)哌嗪-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780001102
在20℃，向化合物37-1(1.0g，5.37mmol)和化合物37-1A(657.75mg，6.44mmol，1.2当量)在DMF(10ml)中的溶液添加DIPEA(2.08g，16.11mmol，3.0当量)。然后，将反应加热至80℃持续16小时。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示所有起始材料被消耗，并发现了新的主要斑点。将反应用EA(100ml)稀释，用水(30ml)洗涤。将有机层在真空中浓缩以给出呈黄色油状物的化合物37-2(1.4g，粗品)。将其直接用于下一步骤。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 4.23(dd,J＝4.0,7.6Hz,1H),3.72(s,3H),3.40-3.31(m,4H),2.75-2.58(m,2H),2.56-2.46(m,2H),2.42-2.33(m,2H),1.45-1.34(s,9H)
步骤2：叔丁基4-(3-氨基-2-羟基-3-氧代丙基)哌嗪-1-甲酸酯
Figure BDA0003070730780001111
将化合物37-2(200mg，693.63umol)在NH3.MeOH(10ml，4N)中的溶液在20℃搅拌16小时。LCMS显示所希望的产物为主峰。将反应在真空中浓缩以给出呈白色固体的化合物37-3(200mg，粗品)。将粗产物不经纯化直接用于下一步骤。LC-MS：[M+H]+＝274.3。
步骤3：2-羟基-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺
Figure BDA0003070730780001112
在20℃，向化合物37-3(200mg，731.72umol)在DCM(4ml)中的溶液添加TFA(2ml)，并将其在20℃搅拌3小时。将反应混合物在真空中浓缩以给出呈黄色油状物的化合物37-4(200mg，粗品)。将粗产物不经纯化直接用于下一步骤。
步骤4：N-(5-(4-(3-氨基-2-羟基-3-氧代丙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780001113
在20℃，向化合物37-4(200mg，742.88umol)、中间体B(206.76mg，742.88umol)和AcOH(44.61mg，742.88mg)在MeOH(10ml)中的溶液添加NaBH(OAc)3(472.34mg，2.23mmol)，并将其在20℃搅拌16小时。LCMS显示所有起始材料被消耗，并发现所希望的产物。将反应用EA(20ml)和水(10ml)稀释。将有机层分离并在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC(碱性)纯化以给出呈白色固体的实例37(16.3mg，5.06％产率)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.71-7.68(m,2H),7.23(dd,J＝3.8,4.9Hz,1H),6.92(s,1H),4.17(dd,J＝3.5,8.3Hz,1H),3.41(t,J＝7.1Hz,2H),2.78-2.47(m,10H),2.45-2.35(m,2H),1.75-1.54(m,4H),1.48-1.36(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝436.4。
(R)-N-(5-(4-(3-氨基-2-羟基-3-氧代丙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
(S)-N-(5-(4-(3-氨基-2-羟基-3-氧代丙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺
Figure BDA0003070730780001121
实例37-R：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.69(ddd,J＝1.0,4.4,9.2Hz,2H),7.22(dd,J＝3.8,5.0Hz,1H),6.92(s,1H),4.17(dd,J＝3.6,8.3Hz,1H),3.41(t,J＝7.1Hz,2H),2.77-2.46(m,10H),2.44-2.36(m,2H),1.73-1.54(m,4H),1.49-1.37(m,2H)。C-05707-094-P2A。LC-MS：[M+H]+＝436.0。
实例37-S：1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.57(ddd,J＝1.1,4.3,9.2Hz,2H),7.11(dd,J＝3.7,5.0Hz,1H),6.80(s,1H),4.05(dd,J＝3.6,8.3Hz,1H),3.29(t,J＝7.0Hz,2H),2.66-2.33(m,10H),2.32-2.24(m,2H),1.61-1.42(m,4H),1.36-1.25(m,2H)。LC-MS：[M+H]+＝436.0。
实例38：小鼠小脑神经前体细胞(NPC)中的Atoh1诱导测定
用从新生的转基因Atoh1-GFP小鼠分离的体外培养的小脑神经前体细胞进行Atoh1诱导测定。主要通过增强子调节Atoh1的表达，并且由在Atoh1的3’处克隆的增强子序列驱动核GFP，所述序列在哺乳动物中具有高度保守性。因此，可以通过小脑神经前体细胞中的GFP激活来反映Atoh1的诱导(Helms等人,Development[发育]2000；127:1185-1196；Lumpkin等人,Gene Expression Patterns[基因表达模式]2003；3:389-395)。解剖出生后3天的幼崽进行小脑组织分离。将小脑组织切成小块，并在37℃用0.05％胰蛋白酶解离约10分钟，然后用70uM细胞过滤器过滤。前2天，在具有1％P/S、20ng/ml rhFGF2和20ng/mlrhEGF的DMEM/F12+1％N2&2％B27的超低吸附培养皿/孔板(R&D系统公司(R&D Systems))中，将细胞培养为神经球。然后将这些球接种到涂布有基质胶(在DMEM/F12中以1:30稀释)的组织培养皿中进行单层培养。在体外培养4.5-5.5天(DIV)后，将细胞用0.05％胰蛋白酶解离为单个细胞，并在计算细胞数后冷冻。
将小脑神经前体细胞(NPC)从库存中重新解冻，再培养2天，然后用于Atoh1诱导测定。在测定的第一天，将NPC以2500个细胞/孔接种到涂布有基质胶的384孔板(黑色观察板，PE)中。过夜培养后，将NPC用以1:2连续稀释的本披露的代表性化合物进行10个剂量(50μM至200nM)的处理，并将DMSO作为阴性对照。在不改变培养基的情况下处理72小时后，将细胞用4％福尔马林固定以进行染色。将测定板用GFP抗体(艾博抗公司(Abcam)，#13970，1:1000)染色，以扩增内源性GFP信号，然后通过Cellomics读取。计算由DAPI染色定义的细胞核中测试化合物的GFP平均强度，将其与DMSO对照进行比较，并根据(测试化合物的GFP平均强度/DMSO对照)方程，以倍数差异形式表示差异。下表1中描述了每种测试化合物相对于DMSO对照的最大倍数差异(参见标题为“倍数差异”的列)。注意，在该方程中DMSO对照的值为1，并且任何大于5的倍数差异都被认为是显著差异。如表1所示，所有测试的本披露化合物在GFP平均强度方面相对于DMSO对照均表现出显著的倍数差异。因此，所有测试的化合物都具有激活Atoh1的活性，并显著增加Atoh1的表达。
表1通过本披露化合物的处理而进行的Atoh1激活(小脑NPC中的Atoh1-GFP报告基因测定)
实例 倍数差异* 实例 倍数差异* 实例 倍数差异*
DMSO 1.0 26 16.3 23 24.3
3 11.2 28-反式 16.8 9 24.4
34顺式 11.2 22 16.8 33峰3 27.3
2 11.5 5 17.2 35反式 24.8
28-顺式 11.9 7 17.2 32峰3 27.6
1 12.7 24 18.3 37 27.6
34反式 13.1 15 18.9 33峰2 35.6
25 13.1 10 19.1 37R 29.2
27 13.5 6 20.1 13 32.5
36 13.6 18 20.4 33峰1 34.8
8 14.6 17 20.4 37S 31.5
31 14.7 21 20.8 16 32.3
20 14.7 12 22.4 35顺式 33.2
4 18.3 19 16.3 11 33.3
29 15.4 32峰4 23.2 33峰4 33.7
30 16.1 14 23.8
*Atoh1-GFP平均强度_FC与DMSO_Max的比率
使用出生后6天的具有毛细胞损伤的小鼠耳蜗外植体进行离体毛细胞诱导测定
在本测定中使用P6(出生后6天)Atoh1-GFP小鼠，与之前描述的用于Atoh1诱导测定的小鼠品系相同。将耳囊暴露，并对耳蜗进行微解剖。从科尔蒂器官中分离基底膜，并在湿润空气/5％CO2的标准气体气氛下于37℃在无血清培养基(培养基：DMEM/F12+1％N2+2％B27+5μg/ml氨苄青霉素)中进行体外培养。通过1mM新霉素处理1.25h而使内耳毛细胞受损。新霉素处理后，在所选择的化合物的处理之前，将外植体在空白培养基中培养7天。
对于化合物施用，将耳蜗外植体用3至10μM的本披露化合物(以DMSO作为阴性对照)处理8天，其中改变一次化合物/培养基。处理8天后，除去测试化合物。将外植体在空白培养基中再培养4天。然后将耳蜗外植体培养物用4％w/v福尔马林固定并使用兔抗Myo7a抗体(Protus Biosci#25-6790，在含3％BSA的PBS中以1:250稀释)处理以进行Myo7a免疫荧光法(Myo7a是感觉毛细胞的特异性标记物)。将罗丹明标记的山羊抗兔IgG(分子探针公司(Molecular Prob.)#R6394，在含3％BSA的PBS中以1:1000稀释)用作第二抗体以可视化Myo7a阳性细胞。使用EVOS图像系统(赛默飞世尔科技公司(Thermo-Fisher Scientific))收集并分析图像。发现用测试化合物处理显著增加了Atoh1-GFP和Myo7a阳性细胞的数量。通过用多种毛细胞标记物对细胞进行染色来确认异位形成细胞的毛细胞身份。
由化合物处理后在损伤的整个外植体中Atoh1和Myo7a双阳性细胞的响应长度百分比来代表该测定中毛细胞诱导的功效。根据公式((具有Atoh1和Myo7a双阳性细胞的外植体长度/耳蜗外植体的全长)*100％)计算响应长度百分比。注意，由于毛细胞全部受损，DMSO对照的值为0％，并且任何超过20％的响应长度百分比都被认为是显著的毛细胞诱导。如表2所示，本披露的代表性化合物已显示显著的毛细胞诱导。
表2.通过本披露化合物(最终浓度为10μM)的处理，耳蜗外植体中的Atoh1-GFP/Myo7a细胞诱导，平均值±SD。
Figure BDA0003070730780001151
Figure BDA0003070730780001161
注意：响应长度％是平均值±SD。SD：标准偏差

Claims (16)

1.一种具有式(I)的化合物
Figure FDA0003070730770000011
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1选自：
Figure FDA0003070730770000012
Y选自
Figure FDA0003070730770000013
RYA和RYB独立地选自H、-S(＝O)2NH(R2)、-(C＝O)NH(R2)、-NH(C＝O)OCH2(C＝O)NH(R2)、-CH2OH、-CH3和-OH；
RYC和RYD独立地选自H、-CN、-OH、-(C＝O)NH2和-S(＝O)2NH(R2)；
RYE和RYF独立地选自H、-CN、-(C＝O)NH(R2)、-OH和-S(＝O)2NH(R2)；
RYG选自H、-CN、-OH、-F、-(C＝O)NH(R2)和-S(＝O)2NH(R2)；
RYH选自-CH3、-(X1)-(C＝O)NH(R2)和-(X1)-S(＝O)2NH(R2)；
RYI选自-H和-(C＝O)NH(R2)；
X1是C0-2亚烷基，任选地被-OH取代；
R2独立地选自H、-CH3、-CH(CH3)CN、-CH2CH2CN、
Figure FDA0003070730770000014
Figure FDA0003070730770000015
并且
W是O或CH2；
其中当R1是：
Figure FDA0003070730770000021
Y不是：
Figure FDA0003070730770000022
Figure FDA0003070730770000031
当R1是：
Figure FDA0003070730770000032
Y不是：
Figure FDA0003070730770000033
Figure FDA0003070730770000034
并且
当R1是：
Figure FDA0003070730770000035
Y不是：
Figure FDA0003070730770000041
2.一种具有式(I)的化合物
Figure FDA0003070730770000042
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1选自：
Figure FDA0003070730770000043
Y选自
Figure FDA0003070730770000044
RYA和RYB独立地选自H、-S(＝O)2NH(R2)、-(C＝O)NH(R2)、-NH(C＝O)OCH2(C＝O)NH(R2)、-CH2OH、-CH3和-OH；
RYC和RYD独立地选自H、-CN、-OH、-(C＝O)NH2和-S(＝O)2NH(R2)；
RYE和RYF独立地选自H、-CN、-(C＝O)NH(R2)、-OH和-S(＝O)2NH(R2)；
RYG选自H、-CN、-OH、-F、-(C＝O)NH(R2)和-S(＝O)2NH(R2)；
RYH选自-CH3、-(X1)-(C＝O)NH(R2)和-(X1)-S(＝O)2NH(R2)；
RYI选自-H和-(C＝O)NH(R2)；
X1是C0-2亚烷基，任选地被-OH取代；
R2独立地选自H、-CH3、-CH(CH3)CN、-CH2CH2CN、
Figure FDA0003070730770000045
Figure FDA0003070730770000046
并且
W是O或CH2；
其中所述化合物不是：
Figure FDA0003070730770000051
Figure FDA0003070730770000061
Figure FDA0003070730770000071
3.如权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
RYG选自H、-CN、-OH、-F、-(C＝O)NH2和-S(＝O)2NH2；
RYH选自-CH3、-(X1)-(C＝O)NH2和-(X1)-S(＝O)2NH2；
RYI选自-H和-(C＝O)NH2；
X1是C1-2亚烷基，任选地被-OH取代。
4.如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是：
Figure FDA0003070730770000072
5.如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是：
Figure FDA0003070730770000073
6.如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是：
Figure FDA0003070730770000074
7.如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
Y是
Figure FDA0003070730770000075
8.如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
Y是
Figure FDA0003070730770000081
9.如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
Y是
Figure FDA0003070730770000082
10.如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
Y是
Figure FDA0003070730770000083
11.如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，选自以下：N-(5-((3S,4S)-4-氨基甲酰基-3-氰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3S,4R)-4-氰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-(N-(氧杂环丁烷-3-基)氨磺酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-(N-(2-氰基乙基)氨磺酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；2-(甲基氨基)-2-氧代乙基(1-(5-(5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺基)戊基)氮杂环丁烷-3-基)氨基甲酸酯；N-(5-(3-氨磺酰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨磺酰基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基-3-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基-3-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-氨磺酰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；5-(4-氟苯基)-N-(5-(4-氨磺酰基哌啶-1-基)戊基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4R)-4-氰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-(3-氨基-3-氧代丙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-(2-氨基-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-(2-氨磺酰基乙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-氨基甲酰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基-3-羟基氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；5-(5-氟噻吩-2-基)-N-(5-(3-(甲基氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(5-氟噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-((1-氰基乙基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-氨基甲酰基-4-甲基哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-氨基甲酰基-4-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；5-(4-氟苯基)-N-(5-(3-(((1S,2R)-2-羟基环戊基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4S)-4-氨基甲酰基-3-氟哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺和N-(5-((3S,4S)-4-氨基甲酰基-3-氟哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4S)-3-氨基甲酰基-4-氰基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-氨基甲酰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-氨基甲酰基-3-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3S,4S)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3S,4R)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4S)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4R)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(4-氟苯基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3S,4S)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4S)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4R)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3S,4R)-3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3S,4R)-3-氰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺和N-(5-((3S,4S)-3-氰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-((3R,4S)-3-氨基甲酰基-4-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺和N-(5-((3R,4R)-3-氨基甲酰基-4-羟基哌啶-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(3-((4-羟基四氢呋喃-3-基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺；N-(5-(4-(3-氨基-2-羟基-3-氧代丙基)哌嗪-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺。
12.如权利要求11所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述N-(5-(3-氨基甲酰基-4-羟基吡咯烷-1-基)戊基)-5-(噻吩-2-基)异噁唑-3-甲酰胺选自以下：
Figure FDA0003070730770000101
13.一种药物组合物，所述药物组合物包含：治疗有效量的如权利要求1至12中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、以及一种或多种药学上可接受的载体。
14.一种药物组合，所述药物组合包含：治疗有效量的如权利要求1至12中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、以及一种或多种治疗活性助剂。
15.如权利要求14所述的药物组合，其中所述助剂选自调节Notch信号传导、FGF信号传导、Wnt信号传导、Shh信号传导、细胞周期/干细胞衰老、miRNA和表观遗传调控的活性剂。
16.一种治疗听觉损失或平衡障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如权利要求1至12中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
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