CN113046380A - 一种基于σ因子作为转录元件的无细胞蛋白质合成方法 - Google Patents

一种基于σ因子作为转录元件的无细胞蛋白质合成方法 Download PDF

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CN113046380A CN202110297055.3A CN202110297055A CN113046380A CN 113046380 A CN113046380 A CN 113046380A CN 202110297055 A CN202110297055 A CN 202110297055A CN 113046380 A CN113046380 A CN 113046380A
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Abstract

本申请提供了一种基于细胞内源σ因子的，用于大肠杆菌无细胞蛋白质合成的方法，其特征在于：所述方法利用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌内源的σ因子以及对应的启动子组成的蛋白表达基因元件在无细胞蛋白合成体系中进行蛋白质表达。

Description

一种基于σ因子作为转录元件的无细胞蛋白质合成方法
技术领域
本发明属于合成生物学蛋白合成领域，具体涉及一种用于无细胞蛋白质合成表达元件的方法。
背景技术
在过去的几十年中，随着代谢工程和合成生物学的发展，微生物作为生产多种多样的(生物)化学品生产工厂，展现出巨大的潜力和应用前景。而无细胞蛋白合成(cell-free protein synthesis，CFPS)是一种新型的蛋白合成技术，在生物类产品生产上相比于全细胞工厂有着其合成的优势。这种技术主要是利用细胞提取物中转录翻译相关的催化酶组分联合外添加的能量再生系统，蛋白合成氨基酸底物，无机盐和辅因子等进行体外的蛋白质合成。无细胞合成能够在体外完成蛋白合成过程，而不需要活细胞的参与。因为没有细胞膜的限制，这个合成体系更加可控制，可以外添加特定试剂辅助蛋白的合成，例如通过调整氧化还原化合物的比例来促进二硫键的合成，添加表面活性剂及纳米圆盘等协助膜蛋白的合成，添加非天然氨基酸为蛋白进入特定的基团等。除此之外，无细胞体系的DNA模板不受限于环形的表达质粒或者基因组，纯化的线性DNA产物亦能在无细胞体系中有较高的表达效率。另外，无细胞体系中由于不涉及细胞生长，可以表达毒性蛋白。基于以上无细胞系统的优势，近年来有许多合成生物学相关应用被开发，包括传感器，药物制造，大分子生产，能源与储能，生物材料及人工细胞等技术。
尽管无细胞蛋白合成体系已发展六十余年，但是其可用的基因元件仍十分匮乏，主要是依赖噬菌体T7及T7 RNA聚合酶在体系中进行转录翻译。有限的噬菌体转录元件限制了无细胞体系中基因电路的开发及复杂体系的应用。近几年有相关研究利用大肠杆菌σ因子开发可用于无细胞蛋白合成体系的表达元件。此研究证明了内源性的表达元件在无细胞中的应用潜力。基于σ因子的表达系统主要是细胞内一类可以与核心酶结合形成聚合酶全酶后识别启动子中保守序列的转录因子，而启动子中非保守序列则会影响表达强度。在自然界中，σ因子及其启动子组成了庞大的转录元件库。而基于细胞提取物的无细胞体系中由于保留了大部分细胞中转录翻译的酶组分体系，在细胞提取物中便有足够的核心酶等转录元件。因此多种σ因子及其不同强度的启动子可以被发开利用在无细胞体系中。另外除了大肠杆菌中有σ因子系统，某些革兰氏阳性菌例如枯草芽孢杆菌，或革兰氏阴性菌谷棒杆菌中也有此转录系统。并且在物种间的核心酶功能口袋具有保守型，因此其余物种的σ因子仍适用于大肠杆菌无细胞体系。
发明内容
尽管已经有研究开发了基于σ因子的转录元件用于无细胞体系，但此开发仍是有限的，仍不能满足无细胞体系面对不同调控的需求。另外对于调控型的表达，调控元件与被调控元件之间需要有较好的正交性，即一个启动子只能被一种转录因子调控表达。因此需要开发更多的可用于无细胞体系并具有正交性表达元件。而自然界中的σ因子及其启动子仍有许多元件及在无细胞中的应用仍未被挖掘。表达调控元件在调控与被调控之间需要背景低以及调控专一性强等特点，所以外源枯草芽孢杆菌的元件库也是其中一种选择。
另外为了节省DNA模板设计构建的时间，使得无细胞体系更加适用于基因电路的设计及筛选工作，在无细胞中可以利用PCR纯化后的线性DNA作为模板进行蛋白表达与筛选。由于没有质粒构建过程，不仅仅减少设计构建时间，还可以避免σ因子在构建过程中的表达而影响宿主细胞大肠杆菌生长的问题。
本发明提供一种基于细胞内源σ因子用于大肠杆菌无细胞蛋白质合成的方法。在细胞里σ因子结合核心酶形成RNA聚合酶全酶能够使有特定序列的启动子启动转录过程，该方法主要使用内源组成型启动子P70在无细胞体系中表达具有正交性的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌σ因子后，结合了核心酶的σ因子与其对应启动子组成无细胞蛋白合成体系的转录元件，在无细胞蛋白合成的过程中担任转录的功能，并且此翻译转录元件以线性PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)产物的形式进行添加使用。本转录翻译体系利用内源转录元件而不受限于有限的噬菌体T7启动子和T7 RNA聚合酶。不同的σ因子及其启动特异性可实现对蛋白表达的多元控制。另外使用线性PCR产物使得基因元件设计更加灵活以及省去质粒构建时间。基于内源性σ因子的表达元件应用使得无细胞合成体系能够灵活应用在更加复杂的生物系统中，例如合成基因电路设计及功能验证，附加值生物产品的生产以及人工细胞等。
具体地：
一方面，本申请提供了一种基于细胞内源σ因子的，用于大肠杆菌无细胞蛋白质合成的方法，其特征在于：所述方法利用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌内源的σ因子以及对应的启动子组成的蛋白表达基因元件在无细胞蛋白合成体系中进行蛋白质表达。
进一步地，所述方法中σ因子表达DNA模板及启动子与目的蛋白DNA模板以线性PCR产物形式添加到无细胞蛋白合成体系中进行蛋白表达。
进一步地，所述方法中所使用的无细胞蛋白合成体系为基于大肠杆菌细胞提取物的无细胞体系。
进一步地，所述方法中的σ因子选自大肠杆菌σ因子σ24、σ28、σ32、σ38、σ54、σ70、枯草芽孢杆菌σ因子σA、σB、σD、σE、σF、σG、σH、σK、σW、σX和/或σL。
进一步地、启动子为能够被σ因子特定识别并且启动转录的大肠杆菌调控型启动子P24a、P24b、P24c、P24d、P28d、P32a、P32b、P32c、P32d、枯草芽孢杆菌调控型启动子PBb、PBc、PBe、PDa、PDb、PDc、PEa、PEb、PEc、PFd、PFe、PGc、PGd、PHd，或者不需要添加转录因子即可进行蛋白转录的组成型启动子P70f、PAc、PHe。
进一步地，所述方法中利用组成型启动子P70表达σ因子，σ因子与对应序列的启动子特异识别并且启动转录的过程。
另一方面，本申请提供了一种基于细胞内源σ因子的，用于大肠杆菌无细胞蛋白质合成的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)设计利用组成型启动子P70表达σ因子的表达模板，并PCR扩增所述表达模板；
(2)利用σ因子对应的启动子设计可调控的基因电路进行目的蛋白的表达；
(3)组装好无细胞体系后加入所述表达模板，同时或者可控时间加入对应启动子调控的目的基因表达的模板进行无细胞蛋白表达反应；无细胞反应表达一段时间后，可监测表达特性，产物特性或者所探究的生理特性。
进一步地，启动子为能够被σ因子特定识别并且启动转录的大肠杆菌调控型启动子P24a、P24b、P24c、P24d、P28d、P32a、P32b、P32c、P32d、枯草芽孢杆菌调控型启动子PBb、PBc、PBe、PDa、PDb、PDc、PEa、PEb、PEc、PFd、PFe、PGc、PGd、PHd，或者不需要添加转录因子即可进行蛋白转录的组成型启动子P70f、PAc、PHe
进一步地，无细胞反应表达中控制温度为15-37℃。
进一步地，无细胞反应表达时间为0.1-24h。
另一方面，本申请提供了上述方法在无细胞体系基因电路设计，附加值生物产物的生产以及细胞工厂中的应用。
本申请还提供了上述枯草芽孢杆菌的σ因子及其对应的启动子在无细胞蛋白合成中的应用。
本方法使用的无细胞体系是基于大肠杆菌提取物的体系来提供转录翻译所需的组合酶系，外添加能量再生系统(磷酸烯醇式丙酮酸)，19种氨基酸，无机盐及其余辅因子组成蛋白质合成体系。
σ因子能够识别启动子中的特定序列，为启动子中的保守序列。而启动子中的非保守序列则影响转录水平，因此每个σ因子都能有不同表达强度的启动子。对应的σ因子中都有3-5个不同强度的启动子被开发并表征在本方法中。
在无细胞体系中，PCR产物线性DNA片段能够作为模板使用。利用线性DNA可以加速基因电路设计，以及可以实现高通量筛选等功能。另外，由于σ因子是大肠杆菌内源调控因子，在质粒构建过程中组成型表达的σ因子影响宿主生长。所以利用PCR得到线性DNA模板方式也可以避免σ因子相关表达元件构建过程中使用大肠杆菌作为扩增宿主。利用overlapPCR(重叠延伸PCR)等技术设计得到组成型表达的σ因子DNA模板，其对应启动子则设计在目的基因上游以达到调控表达目的。
无细胞蛋白质合成的基本方法为：无细胞体系基本组分在冰上按照浓度进行组装混匀，并且加入调控表达的σ因子及目的基因表达模板等，在30℃培养箱0.5-24h进行蛋白质表达。
本发明的有益效果：
目前此类现有的技术主要是利用基于大肠杆菌的σ因子及其对应的少数的启动子，而专利中不仅扩充了大肠杆菌σ因子对应的启动子数量(σ因子对应着3-5个不同表达强度的启动子，可以用于不同强度的表达及调控需求)，并且还开发了枯草芽孢杆菌的σ因子及其对应的启动子在无细胞蛋白合成中的应用。在基于大肠杆菌细胞裂解物的无细胞中，枯草芽孢杆菌σ因子是外源蛋白，其在无细胞体系中内源背景低，所以枯草芽孢杆菌σ因子及其对应的启动子在此无细胞体系中有较好的正交性，相互干扰少。另外本专利应用了线性PCR产物作为表达模板，省去了质粒构建等步骤，加快基因电路的设计-构建-测试过程，以及有利于高通量筛选工作进行。
附图说明
图1A-C为σ因子及其对应启动子在无细胞中的调控特性及表达特性；
图2为利用σ因子及其对应启动子设计基因电路设计；
图3为一种基于细胞内源σ因子用于大肠杆菌无细胞蛋白质合成的方法的总示意图以及大肠杆菌及枯草芽孢杆菌的σ因子开发可用于基于大肠杆菌无细胞体系的表达元件；
图4为一种基于细胞内源σ因子用于大肠杆菌无细胞蛋白质合成的方法的合成流程图。
具体实施方式
本方法利用σ因子及其对应的启动子作为表达元件设计可用于无细胞体系中进行转录翻译的基因电路。下面结合具体实例对本发明提供的一种基于细胞内源σ因子用于大肠杆菌无细胞蛋白质合成的方法进行详细地描述和进一步说明，为了使技术人员能够更好地理解本发明，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
基本方法和结果：
启动子选择，克隆和线性模板：
大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的sigma因子选自可在线使用的DPInteract和DBTBS数据库。根据先前对大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的转录研究，选择了3-5种具有不同表达强度的启动子进行表征。从大肠杆菌和枯草芽孢杆菌克隆后，将σ因子插入质粒pET-21b中，在PT7启动子下在无细胞系统中表达。用分别为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌选择的σ因子特异性启动子修饰质粒pET-23a和pHT08。将荧光蛋白基因sfGFP插入到启动子下游的修饰质粒中。这些质粒的所有衍生物均在无缝连接反应中构建的。用Qiagen Plasmid Mini Kit提取质粒DNA，并保存在-20℃下以进行无细胞反应。通过两个合成寡核苷酸引物的重叠PCR扩增P70启动子序列。再利用前面设计的重叠序列将启动子P70与σ因子序列进行重叠PCR搭建扩增。
细胞提取物制备
对于标准的无细胞表达反应，将大肠杆菌Rosetta(DE3)在4L含氯霉素(34μg/ml)在37℃，300rpm下。在对数生长期后期(
Figure BDA0002984734500000051
OD600＝2)收获细胞。细胞沉淀用预冷S30A缓冲液(14mM谷氨酸镁；60mM谷氨酸钾；50mM Tris，pH 7.7)洗涤三次。将细胞重悬于S30A缓冲液(1g湿细胞的1ml缓冲液)中，在高压匀浆器(1000bar)中破碎。然后将裂解物在4℃下以12000xg离心10分钟。加入3mM DTT后，将上清液在37℃下孵育80分钟，然后在4℃下以12000xg离心10分钟。然后在磁力搅拌下于4℃在分子多孔膜管(6-8KD MWCO)中透析3小时。然后将透析液在4℃下以12000xg离心10分钟，快速冷冻并在-80℃下保存。
无细胞反应
按照常规方法，将用于标准无细胞反应的无细胞试剂组装在冰上，并立即在30℃下孵育。一般的无细胞反应混合物由以下成分组成：30％细胞提取物(v/v％)；20ng/μlDNA模板；175mM谷氨酸钾；10mM谷氨酸铵；2.7mM草酸钾一水合物；10mM谷氨酸镁；无谷氨酸的19个氨基酸各50mM；3mM丙酮酸苯酚(PEP)；1mM腐胺；1.5mM亚精胺；0.33mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)；1.2mM ATP；CTP，GTP和UTP各0.86mM；0.27mM辅酶A；170μg/mL的tRNA；亚叶酸34μg/mL；2％PEG8000；从BL21(DE3)细胞提取物中制备的T7 RNA聚合酶。
荧光蛋白定量和数据处理
对于荧光蛋白sfGFP的检测和定量，将无细胞样品稀释并在酶标仪(TECANinfinite M200Pro)中测量，激发波长为485nm，发射波长为520nm。将纯化的系列浓度的sfGFP用于制作标准曲线，酶标仪读取的荧光强度值与蛋白质浓度相关联以此计算无细胞中荧光蛋白浓度。
实施例1：
本方法表征的多种σ因子及其对应的启动子进行基因电路的设计，并且进行蛋白质生产表达。P70能够利用细胞提取物中的σ70进行后续蛋白的表达，把目的蛋白例如绿色荧光蛋白(sfGFP)设计在P70后面，在无细胞中可实现0.2mg/ml的蛋白产量。同时可设计二级调控的基因电路，利用组成型的启动子(PT7或者P70)表达σ因子例如σ24，σ24调控P24后续基因的表达，在无细胞中可实现0.01mg/ml的荧光蛋白(sfGFP)表达量，利用此二级调控电路可设计无细胞中的表达量。利用组成型T7表达σ因子，并且加入不同的σ因子对应的启动子表达的荧光蛋白质粒(如附图1A)。如附图1B和C所示，启动子P24a、P24b、P24c、P24d、P28d、P32a、P32b、P32c、P32d、PBb、PBc、PBe、PDa、PDb、PDc、PEa、PEb、PEc、PFd、PFe、PGc、PGd、PHd，只有在对应σ因子存在下，其下游目的基因(荧光蛋白)会有表达。而P70f、PAc、PHe则不需要对应σ因子存在下进行下游基因(sfGFP)的表达。
结果显示：
受σ24，σ28和σ32调节的构建体对产生了明显的荧光信号。σ32特异的启动子表现出高启动效率，最大蛋白质产量为0.126mg/mL。功能启动子的荧光结果与特定的σ因子一起孵育时具有良好的正交性，干扰很小。
除了特定调节的启动子外，σ70的启动子还可以通过内源性元素自发启动无细胞系统中的转录，显示出非σ因子特异性启动子。在这种情况下，与上面讨论的σ因子调控的启动子相比，这种不受调控的启动子可用作无细胞表达的组成型表达。
枯草芽孢杆菌启动子中，相对于σA的启动子对应于σA和σ70之间的高度共有的表达水平。除了对应于σA的启动子外，与大肠杆菌启动子保守序列不同的启动子在背景上方均未显示可测量的表达，由此可看出基于枯草芽孢杆菌的表达元件受内源性细胞提取物的影响较低。有几个启动子显示了σ因子与大肠杆菌σ因子或枯草芽孢杆菌σ因子之间的正交调控表达。
实施例2
此方法可以利用σ因子本身需要与核心酶结合发挥完整功能以及不同σ因子对核心酶竞争力不同的特性设计震荡的基因电路。
利用overlap PCR方式设计并得到以PH1为启动子表达σ32因子的DNA模板。sigH组成型表达(P70)。以P32为启动子表达荧光蛋白(sfGFP)作为报告基因来表示σ32的表达水平。将上述基因电路加入无细胞体系统中进行30℃反应，在反应过程中sigH调控σ32的表达。表达σ32后启动荧光蛋白的表达并且有信号的输出。但是由于sigH及σ32都需要与核心酶结合才能行使功能，故两个σ因子具有竞争关系。在σ32表达到一定水平时，核心酶渐渐被σ32竞争结合，导致亲和力较弱的sigH无法与核心酶结合，此时σ32的表达渐渐减少，由于σ32后面带有降解标签，所以σ32的浓度会渐渐减少，这时又释放出核心酶，sigH继续调控σ32的表达。在这组基因电路中，σ32的表达水平呈现一种震荡调控的状态，而这种表达量的水平可以通过荧光蛋白进行表征。详细基因电路设计图见图2
附表一：σ因子的DNA序列
Figure BDA0002984734500000071
Figure BDA0002984734500000081
Figure BDA0002984734500000091
Figure BDA0002984734500000101
Figure BDA0002984734500000111
Figure BDA0002984734500000121
附表二：σ因子调控对应启动子序列，斜体部分为启动子序列，其中下划线部分为保守序列。
Figure BDA0002984734500000122
Figure BDA0002984734500000131
Figure BDA0002984734500000141
Figure BDA0002984734500000151
Figure BDA0002984734500000161
Figure BDA0002984734500000171
Figure BDA0002984734500000181
序列表
<110> 清华大学
<120> 一种基于σ因子作为转录元件的无细胞蛋白质合成方法
<160> 88
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1842
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 1
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cagattgaag atatcatcca gatgatcaac gatatgggca ttcaggtgat ggaagaagcg 180
ccggatgcgg atgatctgat gctggcggaa aacaccgcgg atgaagatgc ggcagaagca 240
gcggcacaag ttttaagcag cgtggaaagc gaaattggcc gcaccactga tcctgtgcgc 300
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gcgaagcgca ttgaagatgg cattaaccag gtgcaatgca gcgtggcgga atatccggaa 420
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gatctgatta ccggctttgt ggacccgaac gcggaagaag atttagcgcc gaccgcgact 540
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gcggaacgcc tgggcattga tattgcggat tatcgccaga tgctgctgga taccaacaac 420
agccagctgt ttagctatga tgaatggcgc gaagaacatg gcgatagcat tgaactggtg 480
accgatgatc atcagcgcga aaacccttta cagcagctgc tggatagcaa cttacgccag 540
cgcgtgatgg aagcgattga aaccctgccg gaacgcgaaa aactggtgct gaccctgtat 600
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<213> E.coli
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atggctgata aacaaaccca cgagacagaa ttaacattcg accaagtaaa agagcaatta 60
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tagagaacta gtgcattagc ttattttaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 60
<210> 23
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 23
ttgtaaacca aattgaaaag atttaggtta ataattttgt ttaactttaa gaaggagata 60
ta 62
<210> 24
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 24
tgagctaaca ccgtgcgtgt tgacaatttt acctctggcg gtgataatgg ttgcaaataa 60
ttttgtttaa ctttaagaag gagatata 88
<210> 25
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 25
cggaacttta caaaaacgag acactctaac cctttgaata attttgttta actttaagaa 60
ggagatata 69
<210> 26
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 26
ttgaacttgt ggataaaatc acggtctgat aaaacaaata attttgttta actttaagaa 60
ggagatata 69
<210> 27
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 27
cggaacttca ggctataaaa cgaatctgaa gaacacaata attttgttta actttaagaa 60
ggagatata 69
<210> 28
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 28
tttacctttt gcagaaactt tagttcggaa cttcaggcta taaaacgaat ctgaagaaca 60
aataattttg tttaacttta agaaggagat ata 93
<210> 29
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 29
caggctgtcg tcagttttga cgtgacgaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 60
<210> 30
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 30
tgtcatttcg acatcatcga cattattaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 60
<210> 31
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 31
cgatgaaatg tcattttcga cactcataat aattttgttt aactttaaga aggagatata 60
<210> 32
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 32
caatttcgcg ggtggcatca gcaataaagt ttcccccctc cttgccgata acgagataat 60
aattttgttt aactttaaga aggagatata 90
<210> 33
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 33
cacattttta tcgtaattgc cctttaaaat tcggggcgcc gaccccatgt aataattttg 60
tttaacttta agaaggagat ata 83
<210> 34
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 34
aatttttcct ctattctcgg cgttgaatgt gggggaaaca tccccatata ataattttgt 60
ttaactttaa gaaggagata ta 82
<210> 35
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 35
aaaaaaagtc cgctgataag gcttgaaaag ttcatttcca gacccattta ataattttgt 60
ttaactttaa gaaggagata ta 82
<210> 36
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 36
cagaattttt tttctttttc ccccttgaag gggcgaagcc tcatccccat ttctctggtc 60
aataattttg tttaacttta agaaggagat ata 93
<210> 37
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 37
ctggcaccta ttacgtctcg cgctacaata ataattttgt ttaactttaa gaaggagata 60
ta 62
<210> 38
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 38
tctcacaaag cccaaaaagc gtctacgcta ataattttgt ttaactttaa gaaggagata 60
ta 62
<210> 39
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 39
ctgtcatgaa tccatggcag tgaccatact aataattttg tttaacttta agaaggagat 60
ata 63
<210> 40
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 40
ttgcttatgt tttcgctgat atcccgagcg gtttcaaaat tgtgatctat atttaacaaa 60
aataattttg tttaacttta agaaggagat ata 93
<210> 41
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 41
tggcacagat ttcgctaata attttgttta actttaagaa ggagatata 49
<210> 42
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 42
tggcacgcaa attgtaaata attttgttta actttaagaa ggagatata 49
<210> 43
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 43
tggcacaatt attgctaata attttgttta actttaagaa ggagatata 49
<210> 44
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 44
gcatgataac gccttttagg ggcaatttaa aagttggcac agatttcgct ttatcttttt 60
aataattttg tttaacttta agaaggagat ata 93
<210> 45
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 45
aaatattgta atgatatttc agtctagtta agattattga gtaagggccc aagttcactt 60
aaaaaggaga tcaacaatga aagcaatttt cgtactgaaa catcttaatc atgctatgga 120
ggttttcta 129
<210> 46
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 46
aaagtttgac tcggtatttt aactatgtta atattgtaaa atgccgggcc caagttcact 60
taaaaaggag atcaacaatg aaagcaattt tcgtactgaa acatcttaat catgctatgg 120
aggttttcta 130
<210> 47
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 47
tccttacatc gtattgacac ataatataac atcacctata atgaaactaa gttaagaaaa 60
ggaggagggc ccaagttcac ttaaaaagga gatcaacaat gaaagcaatt ttcgtactga 120
aacatcttaa tcatgctatg gaggttttct a 151
<210> 48
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 48
gcgtcttgtc ctttttatgc ggggggataa aatagtaagg aacatggggc ccaagttcac 60
ttaaaaagga gatcaacaat gaaagcaatt ttcgtactga aacatcttaa tcatgctatg 120
gaggttttct a 131
<210> 49
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 49
cttttcatac tattgctata cagccatgaa cagcataaaa tgaacgttat tacagttatc 60
accacatagg gcccaagttc acttaaaaag gagatcaaca atgaaagcaa ttttcgtact 120
gaaacatctt aatcatgcta tggaggtttt cta 153
<210> 50
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 50
aaaatcatct caaaaaaatg ggtctactaa aatattattc catctattac aataaattat 60
aaggacaaaa ggaggaattc aaa 83
<210> 51
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 51
ccctttaaaa tattgattat tttttaaata ttatatttac tataatataa ggacaaaagg 60
aggaattcaa a 71
<210> 52
<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 52
aaaatgtgta aaaacatatt gaaaagggta aatagagaat agtgggccca agttcactta 60
aaaaggagat caacaatgaa agcaattttc gtactgaaac atcttaatca tgctatggag 120
gttttcta 128
<210> 53
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 53
aacggattac ttttgctgac agcgggaatt aacggtaata tgggcccaag ttcacttaaa 60
aaggagatca acaatgaaag caattttcgt actgaaacat cttaatcatg ctatggaggt 120
tttcta 126
<210> 54
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 54
aagaggtttt agcgtacgat attaagggta tacatagtca tatagggccc aagttcactt 60
aaaaaggaga tcaacaatga aagcaatttt cgtactgaaa catcttaatc atgctatgga 120
ggttttcta 129
<210> 55
<211> 191
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 55
ttctagagca cagctaacac cacgtcgtcc ctatctgctg ccctactgtt cagctaaacc 60
atttttcgag gtttaaatcc ttatcgttat gggtattgtt tgtaatgggc ccaagttcac 120
ttaaaaagga gatcaacaat gaaagcaatt ttcgtactga aacatcttaa tcatgctatg 180
gaggttttct a 191
<210> 56
<211> 188
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 56
ttctagagca cagctaacac cacgtcgtcc ctatctgctg ccctatgttt aaaaaaatgt 60
cggagaacgt gtttattttt ttgaaaaagg gtatgtaact tgtagggccc aagttcactt 120
aaaaaggaga tcaacaatga aagcaatttt cgtactgaac atcttaatca tgctatggag 180
gttttcta 188
<210> 57
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 57
ataaagattc attttcaaaa acatacgccg atatattaat ttgagggagg gcccaagttc 60
acttaaaaag gagatcaaca atgaaagcaa ttttcgtact gaaacatctt aatcatgcta 120
tggaggtttt cta 133
<210> 58
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 58
cttctttggc tcaagaaatc gttacattga accgatcttt aaaataactg gaggggccca 60
agttcactta aaaaggagat caacaatgaa agcaattttc gtactgaaac atcttaatca 120
tgctatggag gttttcta 138
<210> 59
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 59
agaagctaaa tgattctgtt tttatgccga tataatcact agaaagggcc caagttcact 60
taaaaaggag atcaacaatg aaagcaattt tcgtactgaa acatcttaat catgctatgg 120
aggttttcta 130
<210> 60
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 60
tcctttactc ataacttctt ttgttcaggc atatgttgtg aagaaagggc ccaagttcac 60
ttaaaaagga gatcaacaat gaaagcaatt ttcgtactga aacatcttaa tcatgctatg 120
gaggttttct a 131
<210> 61
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 61
ttacgtctat tttaaaaaca tcccccatat acttgtaaca gatgccgggg cccaagttca 60
cttaaaaagg agatcaacaa tgaaagcaat tttcgtactg aaacatctta atcatgctat 120
ggaggttttc ta 132
<210> 62
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 62
ttgtgcatag cttggcccgt tcccgaataa attgtacaag ttacatgggc ccaagttcac 60
ttaaaaagga gatcaacaat gaaagcaatt ttcgtactga aacatcttaa tcatgctatg 120
gaggttttct a 131
<210> 63
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<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 63
tttggcagct gcgagtaaaa tttgaaaata acgggtataa tgcatgtaga aaaagcaagg 60
gggcccaagt tcacttaaaa aggagatcaa caatgaaagc aattttcgta ctgaaacatc 120
ttaatcatgc tatggaggtt ttcta 145
<210> 64
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 64
ctccttataa aaattacctt tcctgacaat catagtatga aagcgttggg cccaagttca 60
cttaaaaagg agatcaacaa tgaaagcaat tttcgtactg aaacatctta atcatgctat 120
ggaggttttc ta 132
<210> 65
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 65
cagttataaa taagccgtca gaaggcaaaa ttaaatgatg tagggcccaa gttcacttaa 60
aaaggagatc aacaatgaaa gcaattttcg tactgaaaca tcttaatcat gctatggagg 120
ttttcta 127
<210> 66
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 66
ttctagagca cagctaacac cacgtcgtcc ctatctgctg ccctattgct agattttttt 60
caccctgcac gtttatccca ggctctcctt gtccataata gggctagaag ggcccaagtt 120
cacttaaaaa ggagatcaac aatgaaagca attttcgtac tgaaacatct taatcatgct 180
atggaggttt tcta 194
<210> 67
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 67
ttctagagca cagctaacac cacgtcgtcc ctatctgctg ccctactaaa aaagtttttt 60
tggataggtt gtatatattt tcagaaaagt gttcagaatg ttgctgaggg ggcccaagtt 120
cacttaaaaa ggagatcaac aatgaaagca attttcgtac tgaaacatct taatcatgct 180
atggaggttt tcta 194
<210> 68
<211> 125
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 68
ggtgtatatt acatttgatg tgacggatac taatttcaag gggcccaagt tcacttaaaa 60
aggagatcaa caatgaaagc aattttcgta ctgaaacatc ttaatcatgc tatggaggtt 120
ttcta 125
<210> 69
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 69
tacaactcat atcctttccg cctagtgaga aaagtaacgt tagtagggcc caagttcact 60
taaaaaggag atcaacaatg aaagcaattt tcgtactgaa acatcttaat catgctatgg 120
aggttttcta 130
<210> 70
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 70
gcagtgcata tttttcccac ccaaggagat acttaacgtt gtacagcagc tcctgtaggg 60
ggcccaagtt cacttaaaaa ggagatcaac aatgaaagca attttcgtac tgaaacatct 120
taatcatgct atggaggttt tcta 144
<210> 71
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 71
ttctagagca cagctaacac cacgtcgtcc ctatctgctg ccctaattca aacaaacgat 60
gggaagaaat acatcaaagg ataagcggct gttcatacta atgattggga gggccaagtt 120
cacttaaaaa ggagatcaac aatgaaagca attttcgtac tgaaacatct taatcatgct 180
atggaggttt tcta 194
<210> 72
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 72
ttctagagca cagctaacac cacgtcgtcc ctatctgctg ccctatggcc aaagcgcgaa 60
tgaaaaaagt gcatgaatac ctgcccaaca gacagaataa gaagagttgg ggcccaagtt 120
cacttaaaaa ggagatcaac aatgaaagca attttcgtac tgaaacatct taatcatgct 180
atggaggttt tcta 194
<210> 73
<211> 142
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 73
gaatcagact gaactgtgaa gaaatgataa taaacgaact gaatgtatcc ttttgggggg 60
cccaagttca cttaaaaagg agatcaacaa tgaaagcaat tttcgtactg aaacatctta 120
atcatgctat ggaggttttc ta 142
<210> 74
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 74
aaaaaaagag atacatatat atagagttaa catttgggga ggaagggccc aagttcactt 60
aaaaaggaga tcaacaatga aagcaatttt cgtactgaaa catcttaatc atgctatgga 120
ggttttcta 129
<210> 75
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 75
ttataattaa aggaaatagg aaaatcaaac agaatacata caatactgct tagggcccaa 60
gttcacttaa aaaggagatc aacaatgaaa gcaattttcg tactgaaaca tcttaatcat 120
gctatggagg ttttcta 137
<210> 76
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 76
gtcacggtga aggaattcat tccgtcgaaa tcgaaacact catttaagga caaaaggagg 60
aattcaaa 68
<210> 77
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 77
tatttgatag gggaaaatat aaaatggagg aaatatggta cagtataagg acaaaaggag 60
gaattcaaa 69
<210> 78
<211> 140
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 78
actccaatac ttacgggagg aatacagctt gtcctttgag ggggcaaaag agaaagggcc 60
caagttcact taaaaaggag atcaacaatg aaagcaattt tcgtactgaa acatcttaat 120
catgctatgg aggttttcta 140
<210> 79
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 79
gttgtacact aagggcacag tacgataata tgttacatgg gcccaagttc acttaaaaag 60
gagatcaaca atgaaagcaa ttttcgtact gaaacatctt aatcatgcta tggaggtttt 120
cta 123
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<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 80
gtgaaagcaa gcgttattat tcctgcatat aattcgaagg agcgggccca agttcactta 60
aaaaggagat caacaatgaa agcaattttc gtactgaaac atcttaatca tgctatggag 120
gttttcta 128
<210> 81
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 81
actgtgttgg cacgatcctt gcattatata tggattaagg acaaaaggag gaattcaaa 59
<210> 82
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 82
taagagctgg catggaactt gcataataaa aggctaagga caaaaggagg aattcaaa 58
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<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 83
aaaattgaaa ccttttgaaa cgaagctcgt atacatacag accgggccca agttcactta 60
aaaaggagat caacaatgaa agcaattttc gtactgaaac atcttaatca tgctatggag 120
gttttcta 128
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<211> 128
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<213> 人工序列(original sequence)
<400> 84
gaatttgaaa cctgaagaga ttttaaacgt ataaataagt aaagggccca agttcactta 60
aaaaggagat caacaatgaa agcaattttc gtactgaaac atcttaatca tgctatggag 120
gttttcta 128
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<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 85
tctattgaaa catttttcaa tacattgccg tctagttggt accttgggcc caagttcact 60
taaaaaggag atcaacaatg aaagcaattt tcgtactgaa acatcttaat catgctatgg 120
aggttttcta 130
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<213> 人工序列(original sequence)
<400> 86
aaaatgaaac tttttgagca tctgatcgtc aaataatcat gtgattgtcg gggcccaagt 60
tcacttaaaa aggagatcaa caatgaaagc aattttcgta ctgaaacatc ttaatcatgc 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(original sequence)
<400> 87
aaaaatgaaa ccatggcgga agttcgcacg tctttataga tgtagggccc aagttcactt 60
aaaaaggaga tcaacaatga aagcaatttt cgtactgaaa catcttaatc atgctatgga 120
ggttttcta 129
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<213> 人工序列(original sequence)
<400> 88
tctattgaaa catttttcaa tacattgccg tctagttggt accttgggcc caagttcact 60
taaaaaggag atcaacaatg aaagcaattt tcgtactgaa acatcttaat catgctatgg 120
aggttttcta 130

Claims (11)

1.一种基于细胞内源σ因子的，用于大肠杆菌无细胞蛋白质合成的方法，其特征在于：所述方法利用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌内源的σ因子以及对应的启动子组成的蛋白表达基因元件在无细胞蛋白合成体系中进行蛋白质表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中σ因子表达DNA模板及启动子与目的蛋白DNA模板以线性PCR产物形式添加到无细胞蛋白合成体系中进行蛋白表达。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法中所使用的无细胞蛋白合成体系为基于大肠杆菌细胞提取物的无细胞体系。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中的σ因子选自大肠杆菌σ因子σ24、σ28、σ32、σ38、σ54、σ70、枯草芽孢杆菌σ因子σA、σB、σD、σE、σF、σG、σH、σK、σW、σX和/或σL。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中启动子为能够被σ因子特定识别并且启动转录的大肠杆菌调控型启动子P24a、P24b、P24c、P24d、P28d、P32a、P32b、P32c、P32d、枯草芽孢杆菌调控型启动子PBb、PBc、PBe、PDa、PDb、PDc、PEa、PEb、PEc、PFd、PFe、PGc、PGd、PHd，或者不需要添加转录因子即可进行蛋白转录的组成型启动子P70f、PAc、PHe。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中利用组成型启动子P70表达σ因子，σ因子与对应序列的启动子特异识别并且启动转录的过程。
7.一种基于细胞内源σ因子的，用于大肠杆菌无细胞蛋白质合成的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)设计利用组成型启动子P70表达σ因子的表达模板，并PCR扩增所述表达模板；
(2)利用σ因子对应的启动子设计可调控的基因电路进行目的蛋白的表达；
(3)组装好无细胞体系后加入所述表达模板，同时或者可控时间加入对应启动子调控的目的基因表达的模板进行无细胞蛋白表达反应；无细胞反应表达一段时间后，可监测表达特性，产物特性或者所探究的生理特性。
8.根据权利要求7所述的方法，其中启动子为能够被σ因子特定识别并且启动转录的大肠杆菌调控型启动子P24a、P24b、P24c、P24d、P28d、P32a、P32b、P32c、P32d、枯草芽孢杆菌调控型启动子PBb、PBc、PBe、PDa、PDb、PDc、PEa、PEb、PEc、PFd、PFe、PGc、PGd、PHd，或者不需要添加转录因子即可进行蛋白转录的组成型启动子P70f、PAc、PHe。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中无细胞反应表达中控制温度为15-37℃。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其中无细胞反应表达时间为0.1-24h。
11.根据权利要求1-0任一项所述的方法在无细胞体系基因电路设计，附加值生物产物的生产或细胞工厂中的应用。
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