CN113025683B - 一种细菌耐氯性的快速评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细菌耐氯性的快速评价方法，先对细菌进行驯养，利用流式细胞仪对驯养后的菌液进行计数，制备适宜菌细胞浓度的污染样品，然后进行氯消毒试验，流式细胞术进行消毒后菌细胞活性的检测，最终计算细菌氯耐受指数值并根据耐氯性评价规则实现对细菌耐氯性的评价。本发明将细菌划分为活细胞、受损细胞、死细胞三个群体进行计数，充分考虑了活的不可培养状态细胞可能带来的风险；同时引入氯耐受指数概念及计算方法，更加全面的量化评估了细菌的耐氯能力，大大缩短了耐氯性评价的时间。

Description

一种细菌耐氯性的快速评价方法
技术领域
本发明属于环境微生物学领域，涉及细菌耐氯性的快速评价方法，尤其是基于流式细胞术的供水系统中细菌耐氯性评价方法。
背景技术
氯作为一种消毒技术在供水系统中被广泛应用，氯消毒过程也是对细菌耐氯性选择的过程，供水系统中部分细菌对氯消毒剂产生了抗性后能够在含有较高余氯浓度的自来水厂、管网系统中存活，这部分细菌被称为“耐氯性细菌”或“耐氯菌”。
供水系统中耐氯菌的存在是研究者们一直关注的问题，水源、管网等均有耐氯菌检出的报道。供水系统中耐氯菌的存在可引起多方面的危害：(1)部分耐氯菌为致病菌或者条件致病菌；(2)细菌氯耐受性与抗生素耐药性之间存在相关性；(3)配水系统中的耐氯菌会导致管道腐蚀和生物膜过度生长；(4)耐氯菌的过度繁殖导致膜工艺处理系统效率降低、能耗增加和结构部件使用寿命缩短等问题。
目前，耐氯菌通常被定义为具有高抗氯消毒能力的细菌或能在余氯中存活甚至再生的细菌，是一个相对的概念。耐氯菌的科学定义和抗氯能力的量化方法至今为止未达成共识。WHO于2011年提出了一种评估病原微生物耐氯性的方法，该方法基于微生物在常规消毒剂量(0.5mg/L游离氯)下的存活时间。专利“一种细菌耐氯性的评估方法”(ZL201811024489.0)提出了以消毒剂浓度和反应时间的乘积(CT值，mg·min/L)为指标进行耐氯性评估的方法。也有研究提出以对数灭活率作为评价细菌耐氯性的指标，这些方法均采用培养法进行耐氯性细菌的培养，存在以下两方面的问题：(1)多采用低温、贫营养培养条件，耗时较长；(2)消毒过程中存在大量活的不可培养(VBNC)状态的细菌，传统培养法无法对其进行检测，往往忽略了该部分受损菌体可能带来的危害。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种细菌耐氯性的快速评价方法，为供水系统中耐氯性细菌的筛查及耐氯性的量化评估提供支撑。
本发明通过以下技术方案来实现：
本发明先对细菌进行驯养，利用流式细胞仪对驯养后的菌液进行计数，制备适宜菌细胞浓度的污染样品，然后进行氯消毒试验，流式细胞术进行消毒后菌细胞活性的检测，最终计算细菌氯耐受指数值并根据耐氯性评价规则实现对细菌耐氯性的评价。
(1)菌的驯养：将冻存管中保存的菌液加入5mL营养肉汤中，37℃震荡培养24h，对冻存的菌株进行复苏；以菌株原生长环境水体作为细菌驯养基质液，对待评价菌株进行驯养，得到驯养的菌液；若原生长环境水体难以获得，以无菌磷酸盐PBS缓冲液作为替代驯养基质液；
(2)氯消毒试验：步骤(1)驯养的菌液经离心收集菌细胞，使用稀释基质制备成菌悬液，流式细胞仪上机分析计数，根据计数结果稀释制备消毒用工作菌液，加入氯消毒剂进行消毒试验，试验结束加入足量反应终止剂至去除残留余氯；
(3)菌细胞浓度计算：步骤(2)终止反应后，使用流式细胞仪进行消毒后菌液细胞活性的检测，按照活性将菌细胞分为活体菌、死亡菌以及受损菌三个群体，按照公式(1)计算消毒后菌细胞浓度：
N＝CL+CI×50％ (公式1)
式中：N-消毒后菌细胞浓度；
CL-活体菌细胞浓度，cells/mL；
CI-受损菌菌细胞浓度，cells/mL；
(4)氯耐受指数的计算：按照公式(2)计算氯耐受指数：
Figure BDA0002969611740000031
式中：R-氯耐受指数；
N0-消毒起始菌细胞浓度，cells/mL；
N-消毒后菌细胞浓度，cells/mL；
(5)耐氯性评价：以氯耐受指数作为评价指标，待评价菌株氯耐受性指数(R)大于等于1，评价为高耐氯菌株；待评价菌株氯耐受性指数(R)大于等于0.8且小于1，评价为中耐氯菌株；待评价菌株氯耐受性指数(R)大于等于0.5且小于0.8，评价为为低耐氯菌株；待评价菌株氯耐受性指数(R)小于0.5，评价为不耐氯菌株；
若消毒结束后菌细胞浓度为0，跳过氯耐受性指数(R)计算，直接评价为不耐氯菌株。
优选的，步骤(1)中所述的驯养基质液为经0.2μm的聚碳酸酯膜过滤后的菌株原生长环境水体或pH为7.2-7.4的无菌磷酸盐PBS缓冲液。
优选的，步骤(1)中所述驯养的温度为22℃，时间为7d，振荡转速为100rpm/min。
优选的，步骤(2)中所述离心的转速为3500rpm，时间为10min。
优选的，步骤(2)中所述稀释介质为pH为7.2-7.4的PBS缓冲液。
优选的，步骤(2)中所述稀释制备消毒用工作菌液的浓度为106-107cells/mL。
优选的，步骤(2)中消毒试验所述的氯消毒剂为次氯酸钠溶液，消毒起始浓度为：以余氯计，2.5mg/L；接触时间为30min。
优选的，步骤(2)中所述流式细胞仪上机分析计数的步骤为：
①取驯养后菌液500μL，向其中加入噻唑橙和碘化丙啶以及绝对计数微球，荧光染料终浓度分别为0.4μmol/L、40μmol/L，绝对计数微球终浓度为103个/μL，室温、黑暗静置孵育5-10min进行染色；
②流式细胞仪上机分析：激光器为488nm，收集10000个Events采集荧光信号并按照绝对计数微球进行菌细胞浓度计算。
优选的，步骤(2)中消毒结束后所加入的反应终止剂为硫代硫酸钠溶液。
优选的，步骤(3)中所述使用流式细胞仪对消毒后菌液细胞活性进行检测的步骤为：
①取消毒后菌液500μL，向其中加入噻唑橙和碘化丙啶以及绝对计数微球，荧光染料终浓度分别为0.4μmol/L、40μmol/L，绝对计数微球终浓度为103个/μL，室温、黑暗静置孵育5-10min进行染色；
②流式细胞仪上机分析：激光器为488nm，收集10000个Events采集荧光信号并按照绝对计数微球进行菌细胞浓度计算。
本发明的有益效果：与现有技术方法相比，本发明以流式细胞仪为检测手段，实现了细菌活性的评估，将细菌划分为活细胞、受损细胞、死细胞三个群体进行计数，充分考虑了活的不可培养状态细胞可能带来的风险；同时，引入了氯耐受指数的概念及计算方法，更加全面的量化评估了细菌的耐氯能力。实验证明，使用本发明的评估方法，对耐氯性评价的时间仅需要8天即可完成，而以“一种细菌耐氯性的评估方法”(ZL 201811024489.0)为代表的基于传统培养法的评估技术完成一株细菌耐氯性评估的时间为16天，因此本发明的方法大大缩短了耐氯性评价的时间。
附图说明
图1a为枯草芽孢杆菌氯消毒前流式细胞仪检测图；
图1b为枯草芽孢杆菌氯消毒后流式细胞仪检测图；
图2a为烂泥假单胞菌氯消毒前流式细胞仪检测图；
图2b为烂泥假单胞菌氯消毒后流式细胞仪检测图；
图3a为大肠埃希氏菌氯消毒前流式细胞仪检测图；
图3b为大肠埃希氏菌氯消毒后流式细胞仪检测图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行进一步的阐述，但下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
以某管网系统中分离到的枯草芽孢杆菌为例，评价其耐氯能力：
将保存菌种加入5mL营养肉汤中，37℃震荡培养24h，完成菌株的复苏。取1mL复苏后的菌液加入500mL灭菌的管网水中，置于22℃培养箱中驯养7d；取500μL驯养后菌液向其中加入噻唑橙和碘化丙啶以及绝对计数微球，荧光染料终浓度分别为0.4μmol/L、40μmol/L，绝对计数微球终浓度为103个/μL，室温、黑暗静置孵育5-10min进行染色；使用488nm激光器进行流式细胞仪上机分析，采集荧光信号收集10000个Event。测试结果显示菌细胞99％以上为活体菌，根据绝对计数微球进行计算，浓度为8.0×109CFU/mL。使用PBS缓冲液对菌液进行稀释，制备成菌浓度为8.0×106CFU/mL的样品进行消毒实验。向制备好的100mL样品中加入次氯酸钠溶液(余氯终浓度2.5mg/L)，在消毒30min后取出菌液加入100μL 5g/L硫代硫酸钠至去除残留余氯，取500μL驯养后菌液向其中加入噻唑橙和碘化丙啶以及绝对计数微球，荧光染料终浓度分别为0.4μmol/L、40μmol/L，绝对计数微球终浓度为103个/μL，室温、黑暗静置孵育5-10min进行染色；使用488nm激光器进行流式细胞仪上机分析，采集荧光信号收集10000个Event结果见图。根据绝对计数微球进行计算，活体菌浓度为0.16×106CFU/mL，受损菌浓度为4.8×106CFU/mL，按照公式1计算消毒后菌细胞浓度为2.56×106CFU/mL，按照公式2计算枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的氯耐受性指数值为：2.02，评价为高耐氯菌株。
本实施例对枯草芽孢杆菌的耐氯性评估完成时间为8天，而以“一种细菌耐氯性的评估方法”(ZL 201811024489.0)为代表的基于传统培养法的评估技术完成一株细菌耐氯性评估的时间为16天，本方法大大缩短了耐氯性评价的时间。
图1a和1b所示为枯草芽孢杆菌氯消毒前后流式细胞仪检测图。
实施例2
以某水厂生物砂中分离到的烂泥假单胞菌(Pseudomonas peli)为例评价其耐氯能力：
将保存菌种加入5mL营养肉汤中，37℃震荡培养24h，完成菌株的复苏。取1mL复苏后的菌液加入500mL灭菌的管网水中，置于22℃培养箱中驯养7d；取500μL驯养后菌液向其中加入噻唑橙和碘化丙啶以及绝对计数微球，荧光染料终浓度分别为0.4μmol/L、40μmol/L，绝对计数微球终浓度为103个/μL，室温、黑暗静置孵育5-10min进行染色；使用488nm激光器进行流式细胞仪上机分析，采集荧光信号收集10000个Event。测试结果显示菌细胞99％以上为活体菌，根据绝对计数微球进行计算，浓度为4.0×108CFU/mL。使用PBS缓冲液对菌液进行稀释，制备成菌浓度为4.0×106CFU/mL的样品进行消毒实验。向制备好的100mL样品中加入次氯酸钠溶液(余氯终浓度2.5mg/L)，在消毒30min后取出菌液加入100μL 5g/L硫代硫酸钠至去除残留余氯，取500μL驯养后菌液向其中加入噻唑橙和碘化丙啶以及绝对计数微球，荧光染料终浓度分别为0.4μmol/L、40μmol/L，绝对计数微球终浓度为103个/μL，室温、黑暗静置孵育5-10min进行染色；使用488nm激光器进行流式细胞仪上机分析，采集荧光信号，收集10000个Event，结果见图。根据绝对计数微球进行计算，活体菌浓度为0.4×105CFU/mL，受损菌浓度为6.4×105CFU/mL，按照公式1计算消毒后菌细胞浓度为3.6×105CFU/mL，按照公式2计算烂泥假单胞菌(Pseudomonas peli)的氯耐受性指数值为：0.96，评价为中等耐氯菌株。
本实施例对烂泥假单胞菌的耐氯性评估完成时间为8天，而以“一种细菌耐氯性的评估方法”(ZL 201811024489.0)为代表的基于传统培养法的评估技术完成一株细菌耐氯性评估的时间为16天，本方法大大缩短了耐氯性评价的时间。
图2a和2b所示为烂泥假单胞菌氯消毒前后流式细胞仪检测图。
实施例3
以大肠埃希氏菌(Escherichia coli，ATCC8739)为为例，评价其耐氯能力：
将保存菌种加入5mL营养肉汤中，37℃震荡培养24h，完成菌株的复苏。取1mL复苏后的菌液加入500mL灭菌的管网水中，置于22℃培养箱中驯养7d；取500μL驯养后菌液向其中加入噻唑橙和碘化丙啶以及绝对计数微球，荧光染料终浓度分别为0.4μmol/L、40μmol/L，绝对计数微球终浓度为103个/μL，室温、黑暗静置孵育5-10min进行染色；使用488nm激光器进行流式细胞仪上机分析，采集荧光信号收集10000个Event。测试结果显示菌细胞98％以上为活体菌，根据绝对计数微球进行计算，浓度为3.6×109CFU/mL。使用PBS缓冲液对菌液进行稀释，制备成菌浓度为3.6×106CFU/mL的样品进行消毒实验。向制备好的100mL样品中加入次氯酸钠溶液(余氯终浓度2.5mg/L)，在消毒30min后取出菌液加入100μL 5g/L硫代硫酸钠至去除残留余氯，取500μL驯养后菌液向其中加入噻唑橙和碘化丙啶以及绝对计数微球，荧光染料终浓度分别为0.4μmol/L、40μmol/L，绝对计数微球终浓度为103个/μL，室温、黑暗静置孵育5-10min进行染色；使用488nm激光器进行流式细胞仪上机分析，采集荧光信号，收集10000个Event，结果见图。根据绝对计数微球进行计算，活体菌浓度为6.4×102CFU/mL，受损菌浓度为2.32×103CFU/mL，按照公式1计算消毒后菌细胞浓度为1.8×103CFU/mL，按照公式2计算大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的氯耐受性指数值为：0.30，评价为不耐氯菌株。
本实施例对大肠埃希氏菌的耐氯性评估完成时间为8天，而以“一种细菌耐氯性的评估方法”(ZL 201811024489.0)为代表的基于传统培养法的评估技术完成一株细菌耐氯性评估的时间为16天，本方法大大缩短了耐氯性评价的时间。
图3a和3b所示为大肠埃希氏菌氯消毒前后流式细胞仪检测图。

Claims (7)

1.一种细菌耐氯性的快速评价方法，其特征在于，对细菌进行驯养——进行氯消毒试验——进行细菌活性检测——计算氯耐受指数——实现细菌耐氯性评价，具体步骤如下：
(1)菌的驯养：以菌株原生长环境水体或无菌磷酸盐PBS缓冲液作为细菌驯养基质液，对待评价菌株进行驯养，得到驯养的菌液；
(2)氯消毒试验：步骤(1)驯养的菌液经离心收集菌细胞，用稀释介质制备成菌悬液，流式细胞仪上机进行细胞计数；根据计数结果稀释制备消毒用工作菌液，加入氯消毒剂进行消毒试验，试验完毕加入足量反应终止剂至去除残留余氯；
(3)菌细胞浓度计算：步骤(2)终止反应后，使用流式细胞仪对消毒后菌液细胞活性进行检测，按照活性将菌细胞分为活体菌、死亡菌以及受损菌三个群体，按照公式(1)计算消毒后菌细胞浓度：
N＝CL+CI×50％ 公式(1)
式中：N-消毒后菌细胞浓度；
CL-活体菌细胞浓度，cells/mL；
CI-受损菌细胞浓度，cells/mL；
(4)氯耐受指数计算：按照公式(2)计算氯耐受指数：
Figure FDA0003779679460000011
式中：R-氯耐受指数；
N0-消毒起始菌细胞浓度，cells/mL；
N-消毒后菌细胞浓度，cells/mL；
(5)耐氯性评价：以氯耐受指数作为评价指标，待评价菌株氯耐受指数R大于等于1，评价为高耐氯菌株；待评价菌株氯耐受指数R大于等于0.8且小于1，评价为中等耐氯菌株待；评价菌株氯耐受指数R大于等于0.5且小于0.8，评价为为低耐氯菌株；待评价菌株氯耐受指数R小于0.5，评价为不耐氯菌株；
若消毒结束后菌液浓度为0，跳过氯耐受指数计算，直接评价为不耐氯菌株；
步骤(2)中消毒试验所述的氯消毒剂为次氯酸钠溶液，消毒起始浓度为：以余氯计，2.5mg/L；接触时间为30min；
步骤(2)中所述流式细胞仪上机分析计数及步骤(3)中所述使用流式细胞仪对消毒后菌液细胞活性进行检测的步骤为：
①取驯养后菌液500μL，向其中加入噻唑橙和碘化丙啶以及绝对计数微球，荧光染料终浓度分别为0.4μmol/L、40μmol/L，绝对计数微球终浓度为103个/μL，室温、黑暗静置孵育5-10min进行染色；
②流式细胞仪上机分析：激光器为488nm，收集10000个Events采集荧光信号并按照绝对计数微球进行菌细胞浓度计算。
2.根据权利要求1所述的细菌耐氯性的快速评价方法，其特征在于，步骤(1)中所述的驯养基质液为经0.2μm的聚碳酸酯膜过滤后的菌株原生长环境水体或pH为7.2-7.4的无菌磷酸盐PBS缓冲液。
3.根据权利要求1所述的细菌耐氯性的快速评价方法，其特征在于，步骤(1)中所述驯养的温度为22℃，时间为7d，振荡转速为100rpm/min。
4.根据权利要求1所述的细菌耐氯性的快速评价方法，其特征在于，步骤(2)中所述离心的转速为3500rpm，时间为10min。
5.根据权利要求1所述的细菌耐氯性的快速评价方法，其特征在于，步骤(2)中所述稀释介质为pH为7.2-7.4的PBS缓冲液。
6.根据权利要求书1所述的细菌耐氯性的快速评价方法，其特征在于，步骤(2)中所述稀释制备消毒用工作菌液的浓度为106-107cells/mL。
7.根据权利要求1-6任一项所述的细菌耐氯性的快速评价方法，其特征在于，步骤(2)中所述的反应终止剂为硫代硫酸钠。
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