CN113008844A - 用于单分子核酸检测的设备与系统 - Google Patents

Abstract

本发明揭示一种用于单分子核酸检测的设备。所述设备包含一检测模块，用以检测由一测序晶片产生的荧光。所述检测模块包含一传感器装置、具有第一放大倍率的物镜以及具有第二放大倍率的投射透镜。所述物镜与投射透镜用以将荧光由测序晶片传输至传感器装置。第二放大倍率小于1。

Description

用于单分子核酸检测的设备与系统

技术领域

本发明案主张2019年12月19日提申的美国临时申请案第62/950,551号，在此将其全文引入作为参照。

本公开内容是关于一种生物测定系统；特别是包含能够检测单分子核酸测序的检测模块的系统。

背景技术

连续单分子核酸测序方法是一种极具潜力的高速、长序列的测序方法，可用于测序DNA/RNA/mRNA/修饰DNA/修饰RNA。执行此方法时，需要利用一光学系统来连续监测复制模板DNA/RNA分子(欲测序的分子)的各个聚合酶，并鉴别出与引入事件相关的荧光信号，并因此能够读出模板分子的核酸碱基序列。《Science》杂志(02Jan 2009,Vol.323,Issue5910,pp.133-138)公开了一种测序方法，其使用染料测定法应用于DNA测序，以确定在DNA纳米结构阵列上特定反应位点的给定DNA片段的荧光标记核苷酸(A、T、G、C)序列。

测序位点是能够将聚合酶复制复合物(即，聚合酶与模板和引子结合的复合物)固定、保持或限制在定位的位置。通常会将大量的测序位点在基板上排列成阵列的形式，这称为测序晶片。

连续单分子测序系统包括激发光源、测序晶片、荧光光学装置以及光学传感器。激发光源可向每个测序位点供应激发光。荧光光光学装置用以将定由序晶片上的每个测序位点发射的荧光信号收集和引导至光学传感器。所述的光学传感器由光电探测器形成阵列(也称为图像传感器或区域传感器)形成。传感器上的每个光电探测器称为像素。由于需要区分四个核苷酸碱基，因此光学传感器需要能够区分经标记荧光团的多波长带。

测序系统的性能。为了使测序系统能够捕获引入事件发出的荧光而不受聚合酶周围漂浮的所有经标记dNTP的干扰，需要将复制复合物(又称测序复合物，由聚合酶/模板/引物所形成)固定在一个位置(测序位点)。并且系统需要提供一光源与一传感器，所述光源仅激发足够接近聚合酶的荧光团(受限的激发空间)，而所述传感器仅接收来自邻近于聚合酶的信号(受限的观察空间)。为了提高系统的效率，优选具有多个并行作用的测序位点的系统。系统性能可被定义为“测序位点数量/系统成本”。

基于透镜的测序系统。在实验室中，可将高解析度全内反射荧光(total internalreflection fluorescence，TIRF)显微镜转换为连续核酸DNA单分子测序仪。图1是倒装显微镜的示意图，这是一种典型的TIRF显微镜。激光光束从激光光发射器90穿过滤光片91射入高NA(通常为1.5NA)的60X或100X油浸物镜92，该物镜在盖玻片93的上表面形成TIRF条件，以供进行连续核酸DNA单分子测序。物镜92被无限远校正。由物镜92收集并通过滤光镜立方体91的荧光图像去除了激光光波长，并且仅保留了感兴趣的荧光。利用一些其他光学元件，例如镜子、棱镜和中继透镜(未示出)，图像光束被投影到传感器装置94上，以通过投影透镜95(也称为物镜或管透镜)形成放大的图像。然后分析由传感器装置94收集的荧光图像，并将其转换为测序数据。由于利用透镜来提供激发光和收集荧光，因此这类系统称为基于透镜的测序系统。基于透镜的系统的测序位点数量在数千到数万之间，具体取决于透镜和传感器的规格。

美国专利第8,318,094号和美国专利第7,170,050号公开了一种测序系统，提供了超过100,000个测序位点。这些系统晶片上的反应部位通常具有微透镜或微镜，以增加荧光收集效率。然而，这些微光学器件使得无法减小反应位点的间距，因此不能进一步提高密度。微光学器件增加了晶片制造程序与成本。而且，这样的系统通常采用各种不同的光学元件来引导、修饰和以其他方式操纵被引导到和/或从反应部位接收的光。此类系统体积庞大且对环境震动敏感，因为其激发光点阵列需要与测序位点阵列精确地对齐。这些采用透镜来收集来自测序晶片的荧光的系统，可以归类为基于透镜的测序系统的特例。现有最佳的基于透镜的商业测序系统能够监测的测序位点总数为150,000个。相比之下，基于透镜的系统中的测序晶片则简单且成本相对较低。

关于基于晶片的测序系统。在另一个实施例中，美国专利第7,767,441号公开了一种测序系统，其将测序位点阵列、激发光分布波导和传感器整合到一个晶片中。此种将测序晶片和光学传感器整合在一起的系统可以称为基于晶片的测序系统。测序位点的数目取决于晶片的尺寸，可以是数百万或数千万。然而，晶片的制造成本非常高，并且被设计为一次性使用，这使得操作成本高于大多数应用可能负担的范围。

发明内容

于一例示性实施方式中，揭示一种用于单分子核酸检测的设备。所述设备包含一检测模块，用以检测由一测序晶片产生的荧光。所述检测模块包含一传感器装置、具有第一放大倍率的物镜以及具有第二放大倍率的投射透镜。所述物镜与投射透镜用以将荧光由测序晶片传输至传感器装置。第二放大倍率小于1。

于另一例示性实施方式中，揭示一种用于连续单分子核酸检测的设备。所述设备包含一测序晶片，其具有多个测序位点以一间距排置；以及一检测模块，用于检测由测序位点产生的荧光。所述检测模块包含一传感器装置，其具有多个像素，每一该像素具有一像素尺寸；以及一透镜组，其具有一物镜及一投射透镜。所述物镜与投射透镜用以将荧光由测序位点传输至传感器装置，且所述透镜组具有一整体放大倍率。所述间距与整体放大倍率的乘积等于或大于1倍像素尺寸，且等于或小于2倍像素尺寸。

于又一例示性实施方式中，揭示一种用于连续单分子核酸测序的设备。所述设备包含一检测模块，用于检测由一测序晶片产生的一荧光。所述检测模块包含一传感器装置，其具有多个像素，每一该像素具有一像素尺寸；以及一透镜组，其具有一物镜及一投射透镜，所述物镜与投射透镜用以将荧光由测序晶片传输至传感器装置。所述荧光在传感器装置上的一投影光点尺寸小于或等于该像素尺寸的1.5倍。

于又另一例示性实施方式中，揭示一种用于连续单分子核酸测序的测序晶片。所述测序晶片包含一基板、一波导、一光耦合器、一测序位点及一光束调整机构。所述波导设于基板上。所述波导包含一核心层以及一上覆层，其设于核心层抗上。所述光耦合器自上覆层延伸进入核心层。所述测序位点位于该上覆层中。所述光束调整机构用以调整将来自光耦合器的一光束于朝向该测序位点传递时的一总投影面积。

附图说明

图1绘示现有TIRF显微镜的剖面示意图。

图2绘示根据本公开内容某些实施例，基于透镜的单分子测序系统的设计示意图。

图3绘示传统显微镜物镜的示意图。

图4绘示根据本公开内容某些实施例，物镜的数值孔径(numerical aperture，NA)示意图。

图5绘示一透镜系统的视野(field of view，FOV)。

图6绘示一光学系统的空间解析度。

图7绘示根据本公开内容某些实施例，纳米井的示意图。

图8A与图8B绘示epi激发与渐逝波激发的场强度分布。

图9A与图9B绘示根据本公开内容某些实施例的透镜型与棱镜型TIRF。

图10绘示根据本公开内容某些实施例，投影光点尺寸可影响一像素上的信号强度。

图11绘示根据本公开内容某些实施例，用于连续单分子核酸测序的设备的示意图。

图12绘示根据本公开内容某些实施例，测序晶片的剖面示意图。

图13绘示根据本公开内容某些实施例，大致上为圆形的纳米井的概要上视图。

图14绘示根据本公开内容某些实施例，槽形纳米井的概要上视图。

图15绘示根据本公开内容某些实施例，槽形纳米井的概要上视图。

图16绘示根据本公开内容某些实施例，大致上为圆形的纳米井的概要上视图。

图17绘示根据本公开内容某些实施例，槽形纳米井的概要上视图。

图18绘示根据本公开内容某些实施例，槽形纳米井的概要上视图。

图19A绘示根据本公开内容某些实施例，具有一光束调整机构的波导的概要上视图。

图19B绘示根据本公开内容某些实施例的间隔件的概要上视图。

图19C绘示根据本公开内容某些实施例的覆盖件的概要上视图。

图20绘示根据本公开内容某些实施例的纳米井的间距，且此一间距亦为传感器装置上的像素的尺寸。

图21绘示三个通道所检测到的经标记荧光团的光谱频带。

图22绘示根据本公开内容某些实施例的飞利浦型棱镜。

图23绘示根据本公开内容某些实施例的光谱检测的色散装置。

图24为根据本公开内容某些实施例，具有纳米井的测序晶片的SEM剖面影像。

图25A与图25B绘示测序原始资料的影像框的快照。

图26绘示来自一通道的纳米井的测序时间轨迹。

主要元件符号如下：

10：测序位点

11：投影透镜

12：光学传感器组

13：测序晶片

14：物镜

20：正在测序的分子

21：三磷酸核苷酸

22：大光点

23：小光点

24：像素

31：测序晶片

32：检测模块

32'：检测模块

33：激光光源

34：激光耦合器

35：波导

36：滤光器

41：光束调整机构

42：孔洞

43：间隔件

44：第一开孔

45：流体通道

46：覆盖件

47：第二开孔

50：飞利浦型棱镜

51：色散装置

90：激光光发射器

91：滤光片

92：油浸物镜

93：盖玻片

94：传感器装置

95：投影透镜

120：传感器

150：透镜FOV

151：有效FOV

310：基板

311：光耦合器

312：薄膜或通道波导

313：上覆层

314：下覆层

315：纳米井测序位点阵列

315A：上开孔

315B：圆柱壁

316：纳米井

317：核心层

318：纳米沟槽

321：传感器装置

322：物镜

323：投射透镜

S：间距

P：间距

具体实施方式

以下揭示内容提供了多种不同的实施例或例示，其能用以实现所提供的本公开内容的不同特征。下文所述的元件与配置的具体例子系用以简化本公开内容。当可想见，这些叙述仅为例示，其本意并非用于限制本公开内容。举例来说，在以下详述中，第一特征形成在第二特征上方或第二特征的上可包含第一及第二特征形成为直接接触的实施例，且亦可包含第一特征与第二特征之间可形成额外特征使得第一及第二特征并未直接接触的实施例。另外，本公开内容可能会在多个实施例中重复使用元件符号和/或标号。此种重复使用乃是基于简洁与清楚的目的，且其本身不代表所讨论的不同实施例和/或组态之间的关系。

此外，在本文中使用空间相对术语(例如“在…下面(beneath)”、“在…下方(below)”、“较低(lower)”、“在…上面(above)”、“上方(upper)”及与其相似者，以利于描述图中绘示的一元件或特征与另一或多个元件或特征的相对关系。这些空间相对术语旨在涵盖除图中所描绘的方位以外，该装置于使用中或操作中的其他方位。可将该设备置于其他方位(旋转90度或其他方位)，并可相对应地解释此处所用的空间相对描述。

于本公开内容中，运用诸如“第一”、“第二”和“第三”的类的术语来描述各种元件、组件、区域、层和/或部分，但所述元件、组件、区域、层和/或部分不受其限制。这些术语仅是用来将一元件、组件、区域、层或部分和另一者加以区分。除非上下文另有明显的指示，于本公开内容中使用例如“第一”、“第二”和“第三”等术语并不表示特定的序列或顺序。

图2绘示根据本公开内容某些实施例，基于透镜的单分子测序系统的设计示意图，此设计主要依循单分子检测的设计原理。使用一无限远校正的物镜来收集来自测序位点10的荧光，并使用一投影透镜11将测序位点10的信号投影至一光学传感器组12。一般来说，物镜是用来收集来自测序位点的荧光，投影透镜(亦称为像场透镜或镜筒透镜)是用来将测序位点的信号投影至光学传感器组。于某些实施例中，测序系统还包含一微流体结构，其耦接于纳米井，且样本可透过此微流体结构而载入至测序晶片13上。所述微流体结构可使样本在测序晶片13上均匀散布或可将样本导引至指定的纳米井。

图3绘示典型的显微镜物镜14的示意图。通常来说，物镜14的放大倍率会标记于其本体，譬如图中所示的“100X”。在普通的显微镜中，100X的物镜会和预设或预置的1X投影透镜搭配使用，如图1所示，而此透镜组的整体放大倍率为100X。由于显微镜是用来放大检体的细部结构，投影透镜的放大倍率永远等于或大于1。因此，常见投影透镜的放大倍率为1X，藉以实现物镜本体上标示的放大倍率，但也可见到2X或更大的放大倍率。

图4绘示物镜14的数值孔径(NA)的示意图。物镜14的NA是一种无因次的数，其描述了物镜14对于所发出的荧光能够收集的角度范围，而NA较高的物镜能够收集更多光。通常来说，物镜14的NA亦标示于其本体，譬如图中所示的“1.5”。相关公式可表示为：NA＝n×sinθ，其中n是浸润媒介的折射率，而θ是物镜的收集角度。为了实现较高的单分子灵敏度，物镜14的NA必须高于一定程度。一般来说，最小NA会受到传感器效能规格与光学透镜排列方式的影响。

在基于透镜的单分子测序系统中，物镜14的NA是小于1、0.9、0.8或0.7。

基于透镜的光学模块的视野(FOV)是可由图5所示系统成像的圆形区域的直径。由于使用一传感器120来接收由光学模块投影的影像，可藉由透镜FOV 150和传感器120的一对应区域间的重迭部分，来决定有效FOV 151。若传感器120的尺寸大于透镜FOV 150于其上的投影，则有效FOV 151取决于透镜。否则，有效FOV 151会受限于传感器120的尺寸。

有效晶片面积是指测序晶片13上对应于光学模块的有效FOV 151的面积。为了实现较高的效能，应尽可能将测序位点10排列于有效晶片面积内，以确保能够容纳测序位点10。间距可定义为每两个相邻测序位点10间的距离。有多种因素会使得测序位点10无法过于靠近。

举例来说，光学空间解析度是光学模块能够鉴别来自两个邻近测序位点10的信号的最小间距。由于光的本质，来自不同测序位点10的信号通常呈现高斯分布。如图6所示，来自单分子测序位点A与位点B的荧光信号被投影到传感器平面上。每一信号光束点之间没有明确的界线，而且始终互相重迭而无法完全分开。只要位点A与位点B的距离够远，且其信号光束点的重迭部分并未超过可解析的程度，就能够鉴别来自这两个位点的信号。因此，来自位点A与位点B的信号间的最小距离称为光学系统的空间解析度。

通常来说，物镜的数值孔径(NA)较大时，可提较高的空间解析度，这是基于相关方程式：解析度(r)＝0.61×(λ)/NA，故因此，能够以较小的间距将测序位点10排置地更为接近或紧密，以解析较小的特征，这意味着能够在相同的面积中排置更多的测序位点10。因此，光学系统的设计在于提供一种透镜模块与传感器的组合，其可用以识别更多测序位点，且因此能提供最佳效能。

下文提出一例子来说明传统基于透镜的单分子系统设计。在这个例子中，传感器具有2000x 1500的像素阵列，且每一像素尺寸为3.45平方微米。表1是具有不同放大倍率与NA值的透镜的空间解析度。

以60X油浸透镜搭配NA 1.5时，空间解析度为0.24μm，即，测序位点的最小间距为0.24μm。60X物镜搭配1X投影透镜可将0.24μm的间距在传感器平面上放大为14.4μm的间距。可成像的最大测序位点总数为(3.45x2000)/14.4x(3.45x 1500)/14.4＝479x 359＝171,961(测序位点)。

表1

透镜	100X油	60X油	40X油	20X空气
					放大倍率	100	60	40	20
NA	1.5	1.5	1.3	0.7
					FOV(D，μm)	220	366	550	1100
SR(μm)	0.24	0.24	0.28	0.5
					位点数目：1	61,705	171,961	284,592	356,730
位点数目：2	61,705	136,354	100,178	31,416
					每一位点的像素数目	48	17	11	8.4

于表1中，“位点数目：1”该列的结果仅纳入透镜模块的光学空间解析度作为考量因素。

连续单分子测序需要一定的受质浓度值以保持聚合酶以合理的速度引入。如图7所示，即使一些经标记的三磷酸核苷酸21不像正在测序的分子20一样被引入，但是一旦被激发，附着在那些三磷酸核苷酸上的荧光团或荧光染料可能会发射出具有相同波长的不需要的荧光。即，进入观察空间(即，测序纳米井)的所有荧光染料都可能产生荧光，因此成为不需要的“荧光背景”。后文将进一步描述纳米井的细节。可解析的且检测到的引入事件应具有较高比率的“(引入信号+荧光背景)/(荧光背景)”，其中，可以从受质浓度、激发场分布和相应像素的观察体积估算出荧光背景。

对于这种情况，有意义的体积观察是在于荧光可以穿过透镜到达对应像素的空间。如果使用图8A所示的epi激发，由于相当多的背景分子会被激发并压过单分子信号，因此上表1中列出的所有透镜都无法检测到1μm受质量的单分子事件。为了克服此种干扰问题，单分子测序系统可以部署如图8B所示的渐逝波，在不增加背景荧光信号的情况下将激发能量提供给测序位点10。渐逝波可能以指数方式衰减，并迅速衰减到100nm的范围以外。

如图9A所示的基于透镜的全内反射(TIRF)或如图9B所示的基于棱镜的TIRF可将有效激发能量限制在距离反射表面100nm的范围内。受限于激光光功率，基于透镜的TIRF或基于棱镜的TIRF只能激发较小的区域，例如直径约为100微米。表1中的“位点数目：1”列仅考虑有效FOV。表1中的“位点数目：2”列是假设激发区域的尺寸约为100μm的结果。表1显示，基于传统设计(即，通过使用60X油浸透镜)的基于透镜的系统的可用测序位点约为150,000个。有效FOV可以通过应用大面积传感器来提高，但系统的局限性是渐逝波激发场的面积。在本公开内容中，激光光功率是由250nm的波导纤芯引导，并在100nm的渐逝波范围内，而不是在100μm的光束尺寸范围内，因此在整个测序晶片上产生了很强的场强度，进而延伸了2mm的面积而不是100μm。因此，可以在激发区域中排置更多的测序位点10。在一些实施例中，可以在2mm×2mm的面积中排置并观察超过一百万个测序位点10。

关于传感器的灵敏度，由于显微镜的放大性质，测序位点发射可散布到数个像素24上，例如图10所示的“大光点”22。因此，信号强度会被这些像素瓜分，这使得信号太弱而不能被CMOS图像传感器的每个像素24检测到。虽然有些科研级的CCD、ICCD、EMCCD或经过特殊设计的科研级CMOS传感器可用于检测微弱的信号，但它们通常都是笨重且昂贵的组件，可能会显著地增加系统的尺寸、重量和整体成本。理想地，当测序位点发射仅被投影到一个或两个或至多四个像素24上，如图10中所示的“小光点”23，此时信号相对集中，并且可能大大增加检测到的信号强度。如此一来，价格合理的现代CMOS传感器就足以灵敏地检测信号。如今，高质量的CMOS传感器可实现60％的峰值量子效率，与90％的科研级相去不远。本公开内容可以采用现代工业或监视用等级的CMOS传感器，并且透过适当地布置测序晶片和光学元件来避免使用昂贵的科研级传感器。实际上，尽管投影的光点尺寸可以跟像素24一样小或小于像素24，但是投影可能会跟像素24的边界重迭，从而导致两个或最差时四个相邻像素24共享来自一个测序位点的相同信号。然而，在信号被分为四份的情况下，分散在四个像素中的每个像素上的信号强度仍然足够强以被检测到。

基于透镜的连续单分子测序设备的设计规则。基于所揭示的设计规则，基于透镜的连续单分子测序系统可具有超过150,000、300,000、500,000或1,000,000个测序位点。根据奈奎斯特采样定理(Nyquist sampling theorem)，一个测序井可被传感器的2x 2个像素解析。故此，5百万个像素传感器将可解析超过一百万个测序井。

如图11所示，于某些实施例中，其包含一测序晶片31及一检测模块32。于某些实施例中，所述检测模块32包含一传感器装置321、具有第一放大倍率的物镜322以及具有第二放大倍率的投射透镜323。于某些实施例中，所述物镜322与投射透镜323用于将来自测序晶片31的荧光传输至传感器装置321。于某些实施例中，第二放大倍率小于1。于某些实施例中，一激光光源33可透过一激光耦合器34耦接于测序晶片31，故可利用测序晶片31的波导35将激光光引导至测序位点10。激光光源33与测序晶片31应尽可能接近，以避免不想要的散射光进入封闭的空间中。两者间的距离小于1mm、小于0.5mm或小于0.3mm。于某些实施例中，测序信号经物镜322收集后通过一滤光器36，以在投影透镜322将测序信号投影至传感器装置321上之前，阻隔激光光。

于某些实施例中，物镜322的第一放大倍率用以收集荧光。于某些实施例中，投射透镜323的第二放大倍率用以将来自物镜的荧光投影至传感器装置上。于某些实施例中，投射透镜323的第二放大倍率小于1、小于0.5X或小于0.25X。

如图12所示，于某些实施例中，测序晶片31包含一基板310、设于基板310上的一薄膜或一通道波导312、形成于波导312处的一光耦合器311。于某些实施例中，所述波导312包含上覆层313、下覆层314以及纳米井测序位点阵列315。于某些实施例中，所述纳米井测序位点阵列315包含多个纳米井316。于某些实施例中，上覆层313与下覆层314间夹设有一核心层317，其具有一下表面以及与下表面相对的一上表面。于某些实施例中，光耦合器311用以将激发光耦合至波导312中，且波导312可限制并引导此激发光到达纳米井测序位点阵列315并形成来自每一纳米井316底部的渐逝波激发场，如上图8B所示。换句话说，光场强度在底部最强并以指数形式逐渐减弱，如图8B所示。在较佳的应用场景中，上覆层313上的场强度较弱且可忽略不计或趋近于零。这使得在上覆层313的上表面上悬浮或未引入的荧光团可能不会产生不想要的荧光背景信号。于某些实施例中，将纳米井测序位点阵列315制造为上覆层313中有一上开孔315A与一圆柱壁315B，而纳米井测序位点阵列315的底部位于或邻近核心层317的上表面。于某些实施例中，所述圆柱壁315B形成于波导312的上覆层313中。于某些实施例中，每一纳米井316的底部可和核心层317的上表面共平面或具有一覆盖核心层317上表面的薄底层(图中未绘示)。可使用与上覆层313相同或不同的材质来制备上述纳米井316的薄底层。

于某些实施例中，纳米井316的形状大致上为圆形，如图13所示。于某些实施例中，可将纳米井316制成其他形状，譬如由上视角度为方形、六角形等。于某些实施例中，纳米井316亦可侧向延伸而形成沟槽状而非一般的井状。举例来说，测序位点阵列可包含如图14与图15所示的数个平行排置的纳米沟槽318。

图16绘示根据本公开内容某些实施例，大致上为圆形的纳米井的概要上视图。如图所示，测序晶片的一光束调整机构41可设于点型光耦合器311以及纳米井测序位点阵列315的第一侧之间，以调整来自光耦合器311的每一光束在朝向测序位点10传递的一总投影面积。举例而言，光束调整机构41可将来自光耦合器311的较窄光束(如，所注入的激光光)转换为进入其中的测序位点的较宽光束，而条型光耦合器311则位于邻近阵列315中测序位点的之第二侧处。于某些实施例中，所述第二侧相对于第一侧，故测序位点阵列315实质上介于不同类型的光耦合器311间。

图17绘示根据本公开内容某些实施例，槽形纳米井的概要上视图。如图所示，一光束调整机构41可设于点型光耦合器311以及纳米沟槽318的侧壁之间，而条型光耦合器311则位于邻近另一纳米沟槽318的侧壁处。于某些实施例中，数个纳米沟槽318是平行排置且平行于与条型光耦合器311。

图18绘示根据本公开内容某些实施例，槽形纳米井的概要上视图。与图17所示的实施例相似，一光束调整机构41可设于点型光耦合器311与数个纳米沟槽318间，而纳米沟槽318平行排置并与一条型光耦合器311平行。所述点型光耦合器311与光束调整机构41设于纳米沟槽318的阵列的第一侧，而条型光耦合器311设于纳米沟槽318的阵列的第二侧，其中第二侧与第一侧相对。在此种实施例中，光束调整机构41邻近于每一纳米沟槽318的一端。

参照图19A，于某些实施例中，可运用超过一个一光束调整机构41。举例来说，光束调整机构41可设于每一光耦合器311与纳米井测序位点阵列315间，以调整来自光耦合器311的每一光束在朝向测序位点10传递的一总投影面积。举例而言，光束调整机构41可将来自光耦合器311的较窄光束(如，所注入的激光光)转换为进入测序位点10的较宽光束。于某些实施例中，所述光耦合器311包含一纳米等级的光栅结构。于某些实施例中，所述光耦合器311为条型。某些实施例中，所述光耦合器311为点型。于某些实施例中，所述波导312为薄膜型。于某些实施例中，所述波导312为通道型。于某些实施例中，所述测序位点10形成测序位点阵列315，且所述较宽光束的光束宽度实质上涵盖测序位点阵列315。于某些实施例中，所述光束调整机构41包含一纳米结构光束扩张器，设于光耦合器311与测序位点10间。于某些实施例中，所述纳米结构光束扩张器是波导312的至少一部份，故可为薄膜波导或通道波导。于某些实施例中，所述测序位点阵列315包含2000x 2000个像素，而所述光耦合器311的直径为约50μm。于某些实施例中，测序晶片包含一对孔洞42，以供运载样本的流体输入与输出。

在其他实施例中，光束调整机构可包含多个光束分光件，以加乘来自光耦合器311的光束的数量，从而允许数量加乘后的光束同步朝向测序位点10传递。相较于单一光束，数量加乘后的光束可于测序位点提供更大的覆盖范围。

如图19B所示，于某些实施例中，一间隔件43可设于测序晶片上方。间隔件43可包含多个第一开孔44，与上图19A所示的多个光耦合器311对齐，以供激光光通过。间隔件43可包含一流体通道45，位于其中心且位于上图19A所示的测序位点阵列315上方，以供储存包括样本的流体。于某些实施例中，开孔44的直径大于光耦合器311的直径。如图19C所示，于某些实施例中，一覆盖件46可设于间隔件43上方。覆盖件46可包含多个第二开孔47，第二开孔47与间隔件43的第一开孔44对齐。于某些实施例中，间隔件43夹设于覆盖件46与测序晶片间。

于某些实施例中，聚合酶复制复合物可透过连结物位点而固加至纳米井316的底部，如前图7所示。于某些实施例中，可利用类似生物素-链霉素的复合方式或共价键结合或利用电荷吸引或物理限制等方式，将聚合酶复制复合物固加于连结物。

当测序位点阵列包含数个平行排置的纳米沟槽318时，可排置不同纳米沟槽318中的连结物部位，使其间具有实质上相同的区间。于某些实施例中，可考量此排列方式是否能够防止由每一连结物位点产生的荧光是否会彼此干扰，因而可确保较佳的光学空间解析度。

于某些实施例中，相邻纳米井316间的区间介于小于1μm至约5μm。于某些实施例中，连结物位点间的区间约为3μm。虽然本公开内容中并未绘示，于某些实施例中，测序晶片31上未形成纳米井。于此种实施例中，多个连结物位点以适当的区间配置于测序晶片31的平坦表面上。

在某些实施例中，如上图7所示，每个纳米井316的宽度(沿Y轴)在约50nm至约650nm的范围内。每个纳米井的高度(沿Z轴)在约20nm至约600nm范围的内。在某些实施例中，两个相邻纳米井间的间距(沿Y轴)在小于1μm至约5μm的范围内。在纳米井316的宽度小于约50nm或纳米井316的高度大于约600nm的情况下，由于毛细管力的缘故，样本可能难以加载到纳米井316中并到达其底部。另一方面，在纳米井316的宽度大于约650nm的情况下，纳米井316对样品的空间限制可能不足。在一实施例中，两个相邻的纳米井316的间距小于约1μm。在某些情况下，两个相邻纳米井的间距大于约5μm，则纳米井316的密度太小，无法维持检测通量。在某些实施例中，纳米井316的宽度为约80nm且高度为约100nm，并且两个相邻的纳米井316之间的间距为约1.3μm。

于某些实施例中，为了提升测序复合物(如，聚合酶复制复合物)在测序晶片31的纳米井316中的安定性，纳米井316的下表面或侧壁经化学修饰以加强测序复合物在连结物位点的吸附能力。举例来说，可在纳米井316的下表面或侧壁进行亲水性处理。可任选地，可在界定纳米井316的覆盖层(如，上覆层313)的上表面进行疏水性处理，因而可避免未引入的荧光团标记，且因此可降低不想要的背景荧光信号。再者，上述疏水性处理亦可防止包含未引入的荧光团的流体流经非反应区域，因而减少不想要的荧光背景信号。

于某些实施例中，图12所示的基板310可以是不透明的硅晶圆、透明玻璃、石英、熔融石英、蓝宝石等。

在某些实施例中，可以通过图样化上覆层313来限定纳米井316的空间。换句话说，测序晶片31上的两个相邻的纳米井被图样化的上覆层313隔开。上覆层313用以降低背景信号，例如来自非讯息空间(即，相邻连结物位点之间的空间)的散射光。在某些实施例中，上覆层313可以是透明的，但是在物理上能防止荧光染料标记的受质到达除了测序位点10(即，连接物部位)以外的激发场。图样化的覆盖层可以是不透明的，进而部分或完全地阻挡来自非讯息空间的光。在某些实施例中，上覆层313是金属片。在某些实施例中，上覆层313是经化学修饰的表面，其能够降低荧光染料标记的受质更接近激发场的机会。在某些实施例中，上覆层313可以是塑胶膜。在某些实施例中，上覆层313可以是与核心层317相比具有低折射率的SiO₂或其他无机氧化物。

图20绘示传感器装置321上的纳米井316间距以及像素间距。于某些实施例中，测序位点的间距(S)可设计为：

2P>＝S×F>＝1P

也就是说，间距与整体放大倍率的乘积等于或大于一倍间距且等于或小于两倍间距，其中(F)为检测模块32'的整体放大倍率，(P)为传感器装置321的像素的间距，其等于像素尺寸。于某些实施例中，像素尺寸小于或等于约10μm、约5μm或约3μm。于某些实施例中，两个相邻测序位点的间距小于或等于约5μm、约3μm或约1μm。

于某些实施例中，来自一测序位点的荧光信号首先经物镜323收集后，被以小于1.5倍或1倍像素尺寸P的尺寸投影到传感器装置321上。可将荧光信号妥适地集中到一或至多四个像素上，同时重迭边界，进而产生如而前图10所示“小光点”23那样可供良好地检测的信号强度。

依循上述设计规则的设备的一实施例包含一传感器装置321，其具有2000x 1500个像素，且每一像素的像素尺寸与间距为3.45μm；一物镜322，其NA为0.7且放大倍率为20X；一投影透镜323，其放大倍率为0.25X；以及一测序晶片31，其纳米井测序位点间距为1.38μm，

其中X1×X2＝5

(2x 3.45μm)/5＝1.38μm。

也就是说，测序位点的间距为1.38μm，符合上述设计规则。于某些实施例中，有效测序位点的数目为750,000。

依循上述设计规则的设备的一实施例包含一传感器装置321，其具有2000x 1500个像素，且每一像素的像素尺寸与间距为3.45μm；一物镜322，其NA为0.7且放大倍率为20X；一投影透镜323，其放大倍率为0.25X；以及一测序晶片31，其纳米井测序位点间距为1.04μm，

其中X1 x X2＝5

(2x 3.45μm)/5＝1.38μm

(1x 3.45μm)/5＝0.69μm

也就是说，测序位点的间距为1.04μm，而1.04μm大于0.69μm且小于1.38μm，符合上述设计规则。于某些实施例中，有效测序位点的数目为1,333,333。

依循上述设计规则的设备的一实施例包含一传感器装置321，其具有2000x 1500个像素，且每一像素的像素尺寸与间距为3.45μm；一物镜322，其NA为0.7且放大倍率为20X；一投影透镜323，其放大倍率为0.25X；以及一测序晶片31，其纳米井测序位点间距为0.7μm

其中X1 x X2＝5

(1x 3.45μm)/5＝0.69μm

也就是说，测序位点的间距为0.7μm，而0.7μm大于0.69μm，符合上述设计规则。于某些实施例中，有效测序位点的数目为3,000,000。

此处提出的设备与系统能够用以高效地检测单分子核酸，即，可利用基于透镜的光学模块实现更多的测序位点数目。此外，通过使用更为简单且可替换的测序晶片，还降低了检测成本。来自一位点的测序信号被投影到传感器装置上小于1.5像素或甚至小于1像素的尺寸上，以将信号强度集中在其上，并大大提高了检测信号强度。如此一来，不需使用笨重的高灵敏度和昂贵的科研级CCD或CMOS传感器，因此可以降低检测模块的成本。

图21绘示经标记荧光团的光谱频带。于某些实施例中，用于测序ATCG四种d-NTP的每个核苷酸序列可标记上能够发射不同波长的不同荧光团(荧光染料)。如图所示，通过计算不同通道的权重，可以使用三个光谱范围的通道来解析这些不同的荧光团，并且可以对其进行分析并转换为测序资料。例如，当使用激光光作为激发能量并因此将其耦合到波导中并引导到测序位点时；位于阵列中特定测序位点的染料1将被渐逝地激发，而通道1和通道2可以收集由此发出的光。基于发射光谱的资讯，例如，只有通道1会显示高于阈值的像素信号值，因此权重(1,0,0)代表在该反应位点上被专一引入的核苷酸是经过染料1所标记。但是，如果将染料改为染料2，结果会显示权重(1,1,0)，这意味着通道1和2显示的像素值高于阈值，因此权重(1,1,0)代表被专一引入的核苷酸是经过染料2所标记。染料3也会被激光光渐逝地激发，而其结果会显示权重(0,1,1)。但是，如果将染料更改为染料4，其结果会显示权重(0,0,1)。请注意，这些权重(1,0,0)、(1,1,0)、(0,1,1)和(0,0,1)只是用于说明目的，而不是确切的测量数字。

在一个实施例中，三色棱镜被设计成使得通道1能够接收从530nm到610nm的波长、通道2能够接收从610nm到675nm的波长，并且通道3能够接收从675nm到800nm的波长，以上仅为例示。可以藉由改变染料的类型或修改三向色分束棱镜上每一通道的光谱范围来调整这三个光学传感器的每一像素能收集的光强度，并因此调整其信号值。

图22绘示根据本公开内容某些实施例的飞利浦型棱镜。于某些实施例中，一分波器被用以将具有不同波长光谱范围的该荧光指向该至少二传感器装置。于某些实施例中，利用飞利浦型棱镜50将测序信号分到三个通道中。将传感器装置321牢固地黏着(图中未绘示黏着剂)在棱镜上，且因此在操作环境中可保持极佳的机械稳定性。透过将数个元件黏着成一工作件，会使得此装置更能耐受震动，且因此亦可固定三个传感器中的像素相关性。飞利浦型棱镜50可商业购买，且很实用，但是其他类型的分色器也是可行的，例如十字分色棱镜或更常用的立方分色分束器。与常见色彩传感器中使用的拜耳滤光片相比，飞利浦型棱镜50可以分离颜色而不是滤光，因此它可以吸收不需要的颜色并提供更高的整体透射效率。实际上，使用棱镜三色分束器不会浪费光子。

图23绘示根据本公开内容某些例方式，用于光谱检测的色散装置。于某些实施例中，并未使用多通道传感器装置，而是运用一色散装置51，譬如楔形棱镜或光栅，将不同光谱范围的光分到阵列中的不同像素中。举例来说，可将不同光谱范围分入排列为阵列的4、5或6个像素。

图24为根据本公开内容某些实施例，带有纳米井316的测序晶片的剖面SEM影像。纳米井316系建置于上覆层313中，且纳米井底部邻近核心层317的上表面。

图25A与图25B绘示根据本公开内容某些实施例，测序原始资料的图像框快照。图25A是来自染料落地事件的影像框的快照的一部分。由图中可以看到传感器装置捕捉到的荧光团信号。在这种光学排置方式下，信号最多只会重迭四个相邻像素，且可确保坚实的信号强度。图25B绘示一典型的像素。由图中可以看到大多数的光线集中在一个像素，上只有一小部分散布在相邻像素上。整体来说，测序位点信号相当集中。

图26绘示一通道的纳米井的测序时间轨迹。可以观察到荧光信号的起落伴随着染料落地事件。透过依本公开内容的光学元件排置方式，所得到的信号/杂讯比(signal tonoise ratio，SNR)相当理想(如，信号/杂讯比＝54976/2441＝22.52)，且可藉由使用价格合理的工业级SMOS相机来实现商业化。

上文的叙述简要地提出了本发明某些实施例的特征，而使得本发明所属技术领域的技术人员能够更全面地理解本公开内容的多种实施方式。本发明所属技术领域的技术人员当可明了，其可轻易地利用揭示内容作为基础，来设计或更动其他制程与结构，以实现与此处所述的实施例相同的目的和/或达到相同的优点。本发明所属技术领域的技术人员应当明白，这些均等的实施例仍属于揭示内容的精神与范围，且其可进行各种变更、替代与更动，而不会悖离揭示内容的精神与范围。

Claims (31)

1.一种用于连续单分子核酸测序的设备，其包含：

一检测模块，用以检测由一测序晶片产生的一荧光，该检测模块包含：

一传感器装置；

一物镜，具有一第一放大倍率；以及

一投射透镜，具有一第二放大倍率，

其中该物镜与该投射透镜用以将该荧光由该测序晶片传输至该传感器装置；以及其中该第二放大倍率小于1。

2.一种用于连续单分子核酸测序的设备，其包含：

一测序晶片，具有多个测序位点以一间距排置；以及

一检测模块，用于检测由该测序位点产生的一荧光，该检测模块包含：

一传感器装置，具有多个像素，每一该像素具有一像素尺寸；以及

一透镜组，具有一物镜及一投射透镜，其中该物镜与该投射透镜用以将该荧光由该测序位点传输至该传感器装置，且该透镜组具有一整体放大倍率；

其中该间距与该整体放大倍率的一乘积等于或大于1倍像素尺寸，且等于或小于2倍像素尺寸。

3.一种用于连续单分子核酸测序的设备，其包含：

一检测模块，用以检测由一测序晶片产生的一荧光，该检测模块包含：

一传感器装置，具有多个像素，每一该像素具有一像素尺寸；以及

一透镜组，具有一物镜及一投射透镜，其中该物镜与该投射透镜用以将该荧光由该测序晶片传输至该传感器装置；

其中该荧光在该传感器装置上的一投影光点尺寸小于或等于该像素尺寸的1.5倍。

4.根据权利要求1至3任一项所述的设备，其中该测序晶片包含一光耦合器、一波导及多个测序位点。

5.根据权利要求4所述的设备，其中该测序晶片进一步包含一光束调整机构。

6.根据权利要求1至3任一项所述的设备，其中该检测模块包含至少二传感器装置，且该检测模块还包含一分波器，用以将具有不同波长光谱范围的该荧光指向该至少二传感器装置。

7.根据权利要求6所述的设备，其中该分波器为一十字分色棱镜。

8.根据权利要求6所述的设备，其中该分波器为一飞利浦型棱镜。

9.根据权利要求1至3任一项所述的设备，其中该检测模块进一步包含一楔形棱镜或一光栅，其可用以将该荧光的不同光谱范围分入排列为一阵列的4、5或6个像素。

10.根据权利要求6所述的设备，其中该检测模块包含三个传感器装置，且该分波器为一十字分色棱镜、一飞利浦型棱镜或一立方分色分束器，其中该传感器装置与该分波器黏合为一坚固件，且该分波器将该传感器装置接收到的该荧光分入三个通道中，其波长分别为小于610nm、介于610nm到675nm以及大于675nm。

11.根据权利要求6所述的设备，其中该至少二传感器装置固加于该分波器。

12.根据权利要求4所述的设备，其中该光耦合器包含一光栅耦合器，且该波导包含一薄膜波导或一通道波导，其中该光栅耦合器用以接收来自一激发光源的光线，且该薄膜波导或该通道波导用以引导该光线至该测序位点，以便在测序位点的底部形成一渐逝波激发场。

13.根据权利要求12所述的设备，其中该测序位点位于该波导的一上覆层所界定的一纳米井或一纳米沟槽中。

14.根据权利要求12所述的设备，其中各该测序位点的一底部包含一经修饰表面，用以选择性地固加测序复合物。

15.根据权利要求13所述的设备，其中该纳米井或该纳米沟槽的一底部具亲水性。

16.根据权利要求13所述的设备，其中该纳米井或该纳米沟槽包含一宽度，介于约50nm到约650nm，以及一高度，介于约20nm到约600nm。

17.根据权利要求13所述的设备，其中该上覆层的一上表面具疏水性。

18.根据权利要求12所述的设备，其中该测序位点位于一图样化覆盖层所界定的一纳米井或一纳米沟槽中。

19.根据权利要求18所述的设备，其中该图样化覆盖层的一上表面具疏水性。

20.根据权利要求1至3任一项所述的设备，进一步包含：

一激发光源，用以发出激发光；以及

一滤光器，用以阻挡该激发光进入该传感器装置。

21.根据权利要求4所述的设备，其中该测序位点的一数量超过约150,000、300,000、500,000或1,000,000。

22.根据权利要求1至3任一项所述的设备，其中该物镜的一数值孔径小于1。

23.根据权利要求1至3任一项所述的设备，进一步包含一微流体结构，耦接于该测序位点。

24.根据权利要求6所述的设备，其中该检测模块包含三个传感器装置。

25.根据权利要求2或3所述的设备，其中该像素尺寸小于或等于5μm。

26.根据权利要求2所述的设备，其中两个相邻测序位点间的该间距小于或等于3μm。

27.根据权利要求3所述的设备，其中该荧光在该传感器装置上的该投影光点尺寸小于或等于该像素尺寸的1倍。

28.一种用于连续单分子核酸测序的测序晶片，其包含：

一基板；

一波导，设于该基板上，其包含：

一核心层；以及

一上覆层，设于该核心层抗上；

一光耦合器，自该上覆层延伸进入该核心层；

一测序位点，位于该上覆层中；以及

一光束调整机构，用以调整将来自该光耦合器的一光束于朝向该测序位点传递时的一总投影面积。

29.根据权利要求28所述的测序晶片，其中该测序位点包含一测序位点阵列，且该光束的一光束宽度实质上涵盖该测序位点阵列。

30.根据权利要求28所述的测序晶片，其中该光束调整机构包含一纳米结构光束扩张器，设于该光耦合器与该测序位点间。

31.根据权利要求28所述的测序晶片，其中该测序晶片的该基板包含硅、透明玻璃、石英或熔融石英。

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