CN113005021A - 一种用于外泌体裂解和检测的微流控芯片及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微流控技术领域，涉及用于外泌体裂解和检测的微流控芯片及方法。一种用于外泌体裂解和检测的微流控芯片，包括上层控制层、中间流道层和功能化基底层，所述中间流道层设有第一加样口（4）、裂解腔（7）、检测腔（8）和第二加样口（5）；所述第一加样口（4）与裂解腔（7）通过第一微流道（6）连接；裂解腔（7）与检测腔（8）通过第二微流道（14）连接；所述第二加样口（5）与所述第二微流道（14）连接；功能化基底包括裂解区、检测反应区和检测区。本发明的有益效果是：提供了一种集外泌体裂解与检测为一体的微流控芯片及方法，该芯片结构简单，操作方便。本发明的方法采用特异性抗体捕获外泌体后，对外泌体进行裂解，精确度高，杂质少；外泌体裂解完后立刻进行miRNA的检测，免去了miRNA污染损坏的风险。
Description
技术领域
本发明属于微流控技术领域，涉及用于外泌体裂解和检测的微流控芯片及方法。
背景技术
外泌体是由细胞分泌的一种脂质双分子层小囊泡，尺寸在30-200 nm。外泌体主要是由蛋白质、mRNA、miRNA以及膜上的脂质双分子层构成，具有细胞间传递信息的功能。许多研究表明外泌体在恶性肿瘤中既发挥促癌作用，也可具有抗肿瘤的功能。肿瘤细胞在其发生、发展的过程中会不断释放肿瘤特异的外泌体到胞外，并通过其携带的肿瘤细胞的DNA、RNA及蛋白质等生物物质参与调节血管的生成、免疫反应等一系列生理活动。
miRNA是一种长度在19-23 bp的单链RNA分子，广泛存在于动植物和病毒中。近年来，许多研究表明，miRNA在生物体内的各种生物过程中均有参与，如细胞发育和分化、哺乳动物免疫细胞功能、增殖和凋亡等，并且由于个体的差异，每个个体内表达量是不同的，正因为这种不同，miRNA可以被用作生物标记物，进行癌症的早期检测。
目前，对于外泌体的研究主要集中于外泌体的提取，而对于外泌体内部基因主要集中于miRNA的总浓度、定量PCR等。在现有的提取外泌体miRNA的技术中，虽然获取方法很多，但现有提取方法提取的外泌体miRNA往往纯度不足，存在较多杂质。并且提取出后若不能及时进行检测，将导致miRNA损坏，从而影响后续的检测结果。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明采用微流控技术，设计出一种集外泌体裂解与检测为一体的芯片系统，在一张芯片上实现对外泌体裂解后随即对miRNA进行检测的目的，同时大大提高了检测的准确性。
本发明解决其技术问题采用的其中一种技术方案是：提供一种用于外泌体裂解和检测的微流控芯片，该芯片包括上层控制层、中间流道层和功能化基底，所述中间流道层设有第一加样口（4）、裂解腔（7）、检测腔（8）和第二加样口（5）；所述第一加样口（4）与裂解腔（7）通过第一微流道（6）连接；裂解腔（7）与检测腔（8）通过第二微流道（14）连接；所述第二加样口（5）与所述第二微流道（14）连接；功能化基底包括裂解区、检测反应区和检测区。
作为本发明的一种优选方式，所述的上层控制层包含若干阀门和进/出样口；以及连接所述阀门与进/出样口的流道。
进一步优选地，所述的阀门包括设置在第一加样口（4）与裂解腔（7）之间的第一阀门（10）、裂解腔（7）与检测腔（8）之间的第二阀门（11）和第三阀门（12）、第二加样口（5）前方的第四阀门（13）。
作为本发明的一种优选方式，所述的功能化基底上检测区对应检测腔（8）位置，修饰多聚赖氨酸，检测反应区对应第二微流道（14）位置，裂解区对应裂解腔（7）位置，检测反应区和裂解区修饰氧化石墨烯材料。
进一步优选地，所述的上层控制层、中间流道层为PDMS。
进一步优选地，所述的上层控制层厚度为4-8 mm。
进一步优选地，所述的中间流道层的厚度为10-20 μm。
进一步优选地，所述的功能化基底层为玻璃材质或其它具有高反射性的基底。
本发明解决其技术问题采用的另一种技术方案是：提供一种外泌体裂解和检测的方法，该方法包括：
（1）将含有核酸探针的溶液注入到第二加样口（5），采用氮气将核酸探针溶液吹入到微流道内，孵育一段时间，核酸探针被功能化基底上的氧化石墨烯吸附；
（2）将特异性捕获外泌体表面蛋白抗体注入到裂解腔（7）中，并孵育一段时间，抗体被功能化基底上的氧化石墨烯吸附；
（3）将包含外泌体的生物样本注入到第一加样口（4），采用氮气将生物样本经微流道吹入到裂解腔（7）中，孵育一段时间后，外泌体被底部的抗体捕获；
（4）将裂解液加入到裂解腔（7）中，孵育一段时间后，外泌体被裂解，内部的核酸被释放；
（5）采用氮气从第一加样口（4）将裂解腔（7）中包含核酸的溶液吹到第二微流道（14）中，并孵育一段时间，外泌体释放的核酸与基底上的核酸探针结合；
（6）采用氮气从第一加样口（4）将第二微流道（14）内的结合后的双链溶液吹入到检测腔（8）中，孵育一段时间后，双链被固定在多聚赖氨酸基底上，然后进行检测。
进一步优选地，所述的核酸探针带有荧光基团。
本发明的有益效果是：提供了一种集外泌体裂解与检测为一体的微流控芯片及方法，该芯片结构简单，操作方便。本发明的方法采用特异性抗体捕获外泌体后，对外泌体进行裂解，精确度高，杂质少；外泌体裂解完后立刻进行miRNA的检测，免去了miRNA污染损坏的风险。
附图说明
图1为本发明实施例中用于外泌体裂解和检测的微流控芯片的整体结构示意图；
图2为中间流道层结构示意图；
图3为上层控制层结构示意图；
图4为功能化玻璃基底结构示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
本发明提供的其中一个实施例是：一种用于外泌体裂解和检测的微流控芯片，其结构如图1所示，主要由上层控制层1、中间流道层2和下层的功能化玻璃基底3构成。其中上层控制层1和中间流道层2的厚度分别为5 mm和10 um的PDMS。如图2所示，中间流道层包括第一加样口4、第二加样口5、裂解腔7和检测腔8。其中第一加样口4通过第一微流道6与裂解腔7连接，裂解腔7通过第二微流道14与检测腔8连接。第二加样口5与第二微流道14连接，从而与裂解腔7和检测腔8连通。第一加样口4用于向裂解腔内加入裂解液、特异性捕获外泌体表面蛋白的抗体、及待测样本。第二加样口5用于将核酸探针加入到微流道内，并通过该口抽出微流道内多余的液体。
如图3所示，上层控制层1的作用是通过阀门控制下层流道层中液体的走向，包括第一阀门10、第二阀门11、第三阀门12和第四阀门13，以及向各个阀门中注水和抽水的进/出样口9和微流道。
其中，第一阀门10设置在第一加样口4和裂解腔7之间对应的位置，也即第一微流道6上方对应的位置，用于控制第一微流道6的通断。第二阀门11设置第二微流道上方对应的位置，裂解腔7的右侧，用于控制裂解腔7与检测腔8或第二加样口5之间微流道的通断。第三阀门12设置在第二微流道14上方对应的位置，检测腔8的左侧，用于控制检测腔8与裂解腔7或第二加样口5之间微流道的通断。第四阀门13设置在第二加样口5与第二微流道14之间对应的位置，控制第二加样口5与第二微流道14之间的通断。
在上层控制层1上，还开设有与第一加样口4、第二加样口5以及裂解腔7上下贯通的孔，便于从上层控制层上方进行相应操作。
如图4所示，下层的功能化玻璃基底3上，与检测腔8对应的位置为检测区，修饰有多聚赖氨酸（PLL），用于结合固定核酸探针与miRNA形成的双链。与裂解腔7对应的位置为裂解区，与第二微流道（14）对应的位置为检测反应区，裂解区和检测反应区均修饰有纳米氧化石墨烯材料，用于吸附固定核酸探针。
本实施例的微流控芯片的制作方法为：首先制作上层控制层1，然后制作中间流道层2，接下来将两层PDMS对接到一起，然后将对接在一起的PDMS粘贴于功能化玻璃基底3上，检测腔8与功能化玻璃基底3上的PLL部分相对接，其余的与功能化玻璃基底上的氧化石墨烯部分相对接，至此微流控芯片制作完成。
本发明提供的第二个实施例是：一种外泌体裂解和检测的方法，包括以下步骤：
本实施例所述开启阀门是指向阀门中注入去离子水，使阀门下压，阻断其下方的微流道；关闭阀门是指将阀门中的去离子水抽出，解除阀门的法向压力，使下方的微流道连通。
（1）铺设带有荧光基团的核酸探针。将去离子水通过进/出样口9注入第一阀门10和第二阀门11、第三阀门12，开启第一阀门10、第二阀门11和第三阀门12。将含有核酸探针的溶液注入到第二加样口5处，采用氮气将第二加样口5处的核酸探针溶液吹入到第二微流道14内，然后开启第四阀门13，关闭其他阀门，孵育一段时间，核酸探针被功能化玻璃基底3上的氧化石墨烯吸附固定；
（2）吸取多余的未结合的探针。关闭第四阀门13，从第二加样口5处将第二微流道14内多余的溶液吸出；
（3）加入特异性捕获外泌体表面蛋白的抗体。从上层控制层1的上方，通过贯通孔向裂解腔7中注入特异性捕获外泌体表面蛋白的抗体，并孵育一段时间，抗体被功能化玻璃基底3上的氧化石墨烯吸附；
（4）吸取多余的未被吸附的抗体。开启第一阀门10、第三阀门12，从第二加样口5将多余的未被吸附的抗体吸出；
（5）注入包含外泌体的生物样本。将包含外泌体的生物样本注入到第一加样口4，第一阀门10关闭；第二阀门11、第三阀门12和第四阀门13开启；采用氮气将第一加样口4中的生物样本经第一微流道6吹入到裂解腔7中，开启第一阀门10，孵育一段时间后，外泌体被裂解腔7底部的抗体捕获；
（6）吸取多余的生物样本。开启第一阀门10、第三阀门12，第二阀门11和第四阀门13关闭，从第二加样口5将多余的生物样本吸出；
（7）加入裂解液。将裂解液注入到第一加样口4，关闭第一阀门10，
，开启第二阀门11、第三阀门12和第四阀门13，采用氮气将裂解液经第一微流道6吹入到裂解腔7中，开启第一阀门10，孵育一段时间后，外泌体被裂解，内部的miRNA被释放；
（8）核酸探针和外泌体释放的miRNA结合成双链。外泌体释放的miRNA存放于裂解腔7中，关闭第一阀门10、第二阀门11，开启第三阀门12和第四阀门13，采用氮气从第一加样口4将裂解腔7中的包含外泌体释放出的miRNA的溶液吹到第二微流道14中，第二微流道14中已铺设带有荧光基团的探针，并孵育一段时间，外泌体释放的miRNA与基底上的带有荧光基团的探针结合，形成双链；
（9）吸取裂解腔7中多余的液体。开启第一阀门10和第三阀门12，关闭第二阀门11和第四阀门13，从第二加样口5将裂解腔7中多余的液体吸出；
（10）结合后的双链注入到检测腔8中。关闭第一阀门10、第二阀门11和第三阀门12，开启第四阀门13，采用氮气从第一加样口4将第二微流道14内的溶液吹入到检测腔8中，开启第三阀门12，孵育一段时间后，采用基因芯片扫描仪对检测腔8处的荧光进行检测。
Claims (10)
1.一种用于外泌体裂解和检测的微流控芯片，其特征在于：包括上层控制层、中间流道层和功能化基底，所述中间流道层设有第一加样口（4）、裂解腔（7）、检测腔（8）和第二加样口（5）；所述第一加样口（4）与裂解腔（7）通过第一微流道（6）连接；裂解腔（7）与检测腔（8）通过第二微流道（14）连接；所述第二加样口（5）与所述第二微流道（14）连接；功能化基底包括裂解区、检测反应区和检测区。
2.根据权利要求1所述的用于外泌体裂解和检测的微流控芯片，其特征在于：所述的上层控制层包含若干阀门和进/出样口；以及连接所述阀门与进/出样口的流道。
3.根据权利要求2所述的用于外泌体裂解和检测的微流控芯片，其特征在于：所述的阀门包括设置在第一加样口（4）与裂解腔（7）之间的第一阀门（10）、裂解腔（7）与检测腔（8）之间的第二阀门（11）和第三阀门（12）、第二加样口（5）前方的第四阀门（13）。
4.根据权利要求1所述的用于外泌体裂解和检测的微流控芯片，其特征在于：所述的功能化基底上检测区对应检测腔（8）位置，修饰多聚赖氨酸；检测反应区对应第二微流道（14）位置，裂解区对应裂解腔（7）位置，检测反应区和裂解区修饰氧化石墨烯材料。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用于外泌体裂解和检测的微流控芯片，其特征在于：所述的上层控制层、中间流道层为PDMS。
6.根据权利要求5所述的用于外泌体裂解和检测的微流控芯片，其特征在于：所述的上层控制层厚度为4-8mm。
7.根据权利要求5所述的用于外泌体裂解和检测的微流控芯片，其特征在于：所述的中间流道层的厚度为10-20 μm。
8.根据权利要求1-4任一项所述的用于外泌体裂解和检测的微流控芯片，其特征在于：所述的功能化基底层为玻璃材质或其它具有高反射性的基底。
9.一种外泌体裂解和检测的方法，其特征在于，包括：
（1）将含有核酸探针的溶液注入到第二加样口（5），采用氮气将核酸探针溶液吹入到微流道内，孵育一段时间，核酸探针被功能化基底上的氧化石墨烯吸附；（2）将特异性捕获外泌体表面蛋白的抗体注入到裂解腔（7）中，并孵育一段时间，抗体被功能化基底上的氧化石墨烯吸附；（3）将包含外泌体的生物样本注入到第一加样口（4），采用氮气将生物样本经微流道吹入到裂解腔（7）中，孵育一段时间后，外泌体被底部的抗体捕获；（4）将裂解液加入到裂解腔（7）中，孵育一段时间后，外泌体被裂解，内部的核酸被释放；（5）采用氮气从第一加样口（4）将裂解腔（7）中包含核酸的溶液吹到第二微流道（14）中，并孵育一段时间，外泌体释放的核酸与基底上的核酸探针结合；（6）采用氮气从第一加样口（4）将第二微流道（14）内的结合后的双链溶液吹入到检测腔（8）中，孵育一段时间后，双链被固定在多聚赖氨酸基底上，然后进行检测。
10.根据权利要求9所述的外泌体裂解和检测的方法，其特征在于，所述的核酸探针带有荧光基团。
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