CN111518668A - 外泌体提取和检测用微流控系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种外泌体提取和检测用微流控系统，其特征在于，所述微流控系统具有外泌体提取模块、外泌体核酸提取模块、外泌体核酸检测模块、外泌体蛋白提取模块、外泌体蛋白化学发光检测模块。本发明创新性的将外泌体的提取、外泌体核酸提取、外泌体蛋白提取、外泌体核酸检测、外泌体蛋白检测集成到一张芯片上，完成首个外泌体提取、外泌体核酸、蛋白提取及检测的自动化系统。

Description

外泌体提取和检测用微流控系统
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种外泌体提取和检测用微流控系统。
背景技术
液体活检是指通过检测、分析体液中的肿瘤细胞、核酸、蛋白质和代谢产物，对患者进行早期筛查、诊断并监测癌症发展演变的一类手段。
外泌体是在多囊体和质膜融合后释放到周围体液中的纳米大小(30～150nm)的生物囊泡。外泌体携带的蛋白质和核酸等内容物可以释放到远处靶细胞，调节细胞的生理状态。因此，外泌体作为一种新发现的细胞通讯模式，在包括细胞间的免疫应答，信号转导以及抗原呈递等方面均发挥着重要的作用。此外，由于外泌体的内容物会依据起源细胞的类型以及机体当前的状态而实时改变，因此外泌体及其内容物可以提供包括癌症、脂质代谢疾病、神经退行疾病、心血管疾病和肾病等疾病的诊断信息，以及某些慢性疾病的预后信息，从而在液体活检中发挥重要的作用。
当前，外泌体的提取手段主要有差速离心法、密度梯度离心法、超滤法、聚合物沉淀法、尺寸排阻色谱法(SEC)、免疫亲和捕获法以及基于微流控的捕获方法等。其中差速离心法是外泌体分离的金标准，但是由于这种方法需要昂贵的大型仪器且步骤繁多、非常耗时，因此还未开发出相关产品，且无法实现自动化；密度梯度离心法有着和差速离心法一样的问题，而且还需要额外的清洗步骤，因此也没开发出相应的产品(OptiprepTM是密度梯度离心过程中的常用试剂，但其本身不是外泌体提取试剂)；超滤法提取外泌体过程中，外泌体会堵住滤孔，导致过滤提取效率的下降，且过滤产生的剪切力会导致外泌体的破裂，进一步降低外泌体提取效率，此外，对于血浆、血清等生物样本，由于其含杂质较多，因此很可能导致滤孔堵塞，从而限制了大体积样本在超滤法方面的应用；聚合物沉淀法是当前实验室最常用的外泌体提取方法，但是这种方法提取的外泌体的纯度不高，沉淀中除了外泌体还会有很多包括脂蛋白在内的杂质，影响后续分析，且沉淀法涉及离心、重悬等操作，不利于自动化的进行，目前尚未有基于沉淀法的外泌体提取自动化产品；基于免疫亲和捕获外泌体的技术主要局限在其较高的成本，且还未有公司开发出配套的经济可靠的仪器进行外泌体的捕获；基于微流控的外泌体捕获技术的缺点主要体现在成本高、且由于微流控的定义就是基于微小流体的技术，因此其对于大体积样本的处理能力很弱，一般仅适用于小体积样本的提取检测。
由于外泌体的研究起步相对较晚比较晚，外泌体在疾病的诊断、治疗与预后方面有着巨大的潜力，与目前相对不成熟的外泌体提取技术产生了矛盾。目前市面上已有的关于细胞外囊泡(包括外泌体)提取的产品有基于超滤的PureExo、DiagExo(利用不同孔径的膜来分离细胞外囊泡)；基于聚合物沉淀的miRCURY、ExoQuick等(利用聚合物降低来析出沉淀外泌体)；基于尺寸排阻色谱的Izon qEV(是一种根据外泌体的尺寸进行分离的色谱技术)；基于免疫亲和捕获的MACSPlex Exosome Kit、Exo-Flow等(利用抗原抗体或者其他类似的反应特异性的分离出外泌体的技术)；而基于微流控的外泌体捕获技术还没有相关上市产品。
虽然当前全球范围内外泌体的研究非常热门，但在外泌体自动化提取领域研究相对较慢，目前国内还没有外泌体提取自动化的上市产品(全球有且仅有一款外泌体提取自动化设备qEv)。传统的手动法提取外泌体有着高耗时、通量低、人工操作步骤多、过程复杂、重复性低、无法满足临床检测需求等局限性。以外泌体提取的金标准——差异离心法为例，为了提取血浆中的外泌体，差速离心法需要先后经过第一次离心去除细胞、第二次离心去除细胞碎片、第三次离心去除线粒体等细胞器、有时还需要用0.22μm膜过滤去除较大的细胞外囊泡，然后再利用专业的、昂贵的超速离心机进行超高速离心70min以上离心得到外泌体沉淀，最后再经过吹打重悬才能得到外泌体。整个过程可能需要耗费一天的时间，且涉及常规离心机的多次离心、膜过滤、超速离心以及重悬等多个过程，整个过程中任何操作问题都可能影响外泌体提取的效率和纯度，且不同的滤膜，不同的离心机等外在条件的改变也都会影响外泌体提取的效率和纯度。外泌体作为液体活检领域的重要组成部分，如果采用传统的手动法进行提取的话每天只能处理几例样本，且无法保证提取外泌体提取的效率和纯度，因此亟需开发一款外泌体自动化提取设备。此外，在生物样本中外泌体所含有的蛋白和核酸量是极少的，这就会导致至少两个问题，第一个是提取的核酸或者蛋白是来自外泌体还是来自于非外泌体的其他组分，第二个是关于极微量的外泌体蛋白和核酸如何有效提取，以目前市面上提取外泌体最常用的沉淀法为例，沉淀法沉淀得到的不只是外泌体，还有一些与外泌体无关的杂蛋白以及某些蛋白核酸复合物，这些杂质都会影响外泌体蛋白和核酸提取的效率和纯度，因此亟需一款外泌体及其内容物提取、检测自动化系统来解决上述问题。然而，国内外目前还没有一款可以实现外泌体及其内容物提取、检测一体化自动化的产品。针对这一空白，非常有必要开发出第一款具有国内自主知识产权的，全球领先的外泌体及其内容物提取、检测自动化系统。
目前将微流控与磁珠法结合提取外泌体核酸的技术方案有以下几个：
1)苏州大学申请的专利《微流控系统及外泌体提取方法》(申请号：201910478837.X)采取微流控与磁珠法相结合的方法进行外泌体捕获。
2)东南大学申请的专利《一种外泌体内肿瘤标志miRNA的分离和检测系统及方法》(申请号：201910064022.7)通过微流控系统将外泌体的捕获以及外泌体的miRNA检测结合在一起。
但在上述方案中，仅实现了外泌体捕获或外泌体核酸捕获等单一步骤，未能从实际应用角度实现从大量体液中提取外泌体、提取外泌体核酸进行检测、并实现提取和检测过程可控的一体化和自动化。
发明内容
基于此，本发明提出了一种新的解决方案——将磁珠分选法和微流控技术相结合，利用微流控系统的功能化、模块化设计，将磁珠法提取外泌体及其内容物的过程以及内容物检测过程实现一体化、自动化。
本发明提供一种外泌体提取和检测用微流控系统，所述微流控系统具有外泌体提取模块、外泌体核酸提取模块、外泌体核酸检测模块、外泌体蛋白提取模块、外泌体蛋白化学发光检测模块。
所述外泌体蛋白提取模块通过微通道与微阀连接在外泌体提取模块和外泌体蛋白化学发光检测模块上；外泌体核酸提取模块通过微通道与微阀连接在外泌体提取模块和外泌体核酸检测模块上。
进一步的，所述微流控系统还包括：
气动混匀模块，所述气动混匀模块连接在外泌体提取模块、外泌体蛋白提取模块、外泌体蛋白化学发光检测模块、外泌体核酸提取模块以及外泌体核酸检测模块上，通过在压力往复泵的驱动以及混匀腔的配合下实现反应液的混匀、孵育过程。
具体的，所述气动混匀模块包括压力往复泵、混匀腔、微通道和微阀，其中混匀腔通过微通道与压力往复泵相连接，微阀安置于混匀腔与压力往复泵之间的微通道上；所述气动混匀模块置于所述微流控系统内部，用于为液体混匀提供驱动力、提高混匀效果、避免反应液回流。
具体地，所述压力往复泵为多层结构，所述微通道与所述压力往复泵的上层相连，吸入的反应液流入所述压力往复泵的下层，所述压力往复泵的下层与废液池相连，所述废液池置于所述微流控系统内。
其中，所述反应液包括但不限于用于本发明的微流控系统各模块中的洗涤液、洗脱液、PCR反应液、检测液、预激发液、激发液等各种用途的溶液及其混合的溶液。
进一步的，所述微流控系统还包括磁驱混匀模块，所述磁驱混匀模块包括磁驱部件、外泌体提取室(一级磁分离结构)、二级磁分离结构、核酸捕获磁珠储存室、化学发光捕获磁珠储存室以及相应的磁珠；所述磁驱部件由相对的电磁铁构成，电磁铁固定安装或者安装在轨道上，当电磁铁安装在轨道上时，可以在一定范围内往复移动、圆周运动；所述磁驱部件安装在外泌体提取室、二级磁分离结构、核酸捕获磁珠储存室以及化学发光捕获磁珠储存室的外侧的相对方，所述磁珠在外泌体提取室(一级磁分离结构)、二级磁分离结构、核酸捕获磁珠储存室以及化学发光捕获磁珠储存室的腔体内。
本发明中，所述外侧的相对方是指在将磁驱部件安置在需要驱动磁珠运动以进行磁驱混匀的单元结构(比如外泌体提取室、二级磁分离结构、核酸捕获磁珠储存室以及化学发光捕获磁珠储存室)的外侧相对位置，比如在上、下方，或者在两侧基本相对的位置；所述基本相对位置包括但不限于正相对侧、斜对侧等，只要能够有效驱动磁珠运动以实现磁驱混匀的目的即可。
进一步的，所述外泌体提取模块包括外泌体捕获磁珠、外泌体捕获磁珠加样口、微阀、压力往复泵、外泌体提取室(一级磁分离结构)、外泌体捕获磁珠储存室、混匀腔、外泌体洗涤液储存室、外泌体洗脱液储藏室、以及外泌体收集口；所述外泌体捕获磁珠储存室、外泌体洗涤液储存室和外泌体洗脱液储藏室连接在外泌体提取室(一级磁分离结构)上；所述加样口和外泌体收集口通过微阀与外泌体提取室(一级磁分离结构)相连；所述外泌体捕获磁珠储存室、外泌体洗涤液储存室和外泌体洗脱液储藏室分别通过混匀腔和微阀与压力往复泵相连。
进一步的，所述外泌体核酸提取模块包括：压力往复泵、外泌体提取室(一级磁分离结构)、二级磁分离结构、微阀、外泌体裂解液(用于核酸提取)储藏室、混匀腔、核酸捕获磁珠储存室、核酸洗涤液储存室、核酸洗脱液储存室、PCR缓冲室、外泌体核酸收集口。所述外泌体提取室(一级磁分离结构)与外泌体裂解液(用于核酸提取)储藏室和二级磁分离结构相连；所述核酸捕获磁珠储存室与二级磁分离结构、混匀腔、核酸洗涤液储存室、核酸洗脱液储存室和PCR缓冲室相连；所述PCR缓冲室通过微阀和外泌体核酸收集口相连；外泌体裂解液(用于核酸提取)储藏室、核酸洗涤液储存室、核酸洗脱液储存室分别与混匀腔相连；混匀腔分别通过微阀与压力往复泵相连。
进一步的，所述外泌体核酸检测模块包括外泌体核酸检测模块包括压力往复泵、PCR室、PCR缓冲室、微阀、PCR反应液储藏室、混匀腔、引物探针储藏室；所述PCR缓冲室与PCR反应液储藏室、引物探针储藏室和PCR室相连；PCR室、PCR反应液储藏室、引物探针储藏室和混匀腔相连；混匀腔通过微阀和压力往复泵相连。
进一步的，所述外泌体蛋白提取模块还包括压力往复泵、外泌体提取室(一级磁分离结构)、微阀、外泌体裂解液(用于蛋白提取)储藏室、混匀腔、二级磁分离结构以及外泌体蛋白收集口；所述外泌体裂解液(用于蛋白提取)储藏室和二级磁分离结构与外泌体提取室(一级磁分离结构)相连；所述外泌体裂解液(用于蛋白提取)储藏室与混匀腔、微阀以及压力往复泵相连；所述二级磁分离结构与微阀以及外泌体蛋白收集口相连。
进一步的，所述外泌体蛋白化学发光检测模块还包括压力往复泵、微阀、混匀腔、化学发光洗涤液储藏室、AE(吖啶酯)标记的抗体储藏室、预激发液储藏室、激发液储藏室、化学发光检测孔、磁驱部件；所述混匀腔、化学发光洗涤液储藏室、AE(吖啶酯)标记的抗体储藏室、预激发液储藏室与化学发光捕获磁珠储存室相连；所述激发液储藏室和混匀腔与化学发光检测孔相连；所述化学发光检测孔与化学发光捕获磁珠储存室相连；所述混匀腔一端与化学发光洗涤液储藏室、AE(吖啶酯)标记的抗体储藏室、化学发光洗涤液储藏室、预激发液储藏室、激发液储藏室相连，另一端与微阀相连，微阀与压力往复泵相连。
进一步的，所述混匀腔的容积为10～500μL。
进一步的，所述微阀由软腔室和压力控制指针组成，软腔室与微通道相连，压力控制指针在软腔室上方，当压力控制指针不对软腔室施加压力的情况下，微阀保持打开状态，当压力控制指针对软腔室施加压力的情况下，微阀保持关闭状态。
进一步的，将所述各模块集成在一张芯片上。本发明的芯片即集成化的微流控装置，比如可以将各模块集成在一个只有厘米见方的微流控装置上，因为微流控装置具有与芯片相同的微型化、集成化等特征，因此微流控装置也被称为微流控芯片。
本发明中外泌体及其内容物的提取和检测的方法如下：
步骤1，外泌体自动化的提取：样品由加样口加入，进入外泌体提取室，在气动混匀模块的协助下，利用外泌体捕获磁珠完成外泌体的捕获过程；在气动混匀模块以及磁驱混匀模块的共同协助下完成外泌体的洗涤纯化过程；将所得的外泌体由外泌体收集口取出或进一步进行外泌体核酸提取或蛋白提取操作。
步骤2，外泌体蛋白的自动化提取：将步骤1中得到的外泌体在气动混匀模块的协助下用外泌体裂解液(用于蛋白提取)进行裂解，并在磁驱混匀模块的作用下去除外泌体裂解液中多余的磁珠；将得到的外泌体裂解液(用于蛋白提取)在外泌体蛋白收集口进行收集或进一步进行外泌体蛋白的化学发光检测。
步骤3，外泌体蛋白的自动化化学发光检测：将步骤2中得到的外泌体裂解液(用于蛋白提取)与化学发光捕获磁珠混匀，在气动混匀模块以及磁驱混匀模块的共同协助下，完成化学发光捕获磁珠对外泌体蛋白的捕获过程、AE(吖啶酯)标记的抗体对检测抗原的识别过程以及化学发光激发及检测过程。
步骤4，外泌体核酸的自动化提取：将步骤1中得到的外泌体在气动混匀模块的协助下用外泌体裂解液(用于核酸提取)进行裂解，并在磁驱混匀模块的作用下去除外泌体裂解液中多余的磁珠；将得到的外泌体裂解液(用于核酸提取)通过压力往复泵驱动入外泌体核酸捕获磁珠储存室，并在气动混匀模块以及磁驱混匀模块的共同协助下完成外泌体核酸的捕获，洗涤和洗脱过程；将所得的外泌体核酸在外泌体核酸收集口收集或进一步进行外泌体核酸自动化检测过程。
步骤5，外泌体核酸的自动化检测过程：在气动混匀模块的协助下将PCR的反应液与外泌体的核酸进行混匀反应过程，并在外置的加热模块和检测探头的协助下完成外泌体核酸的PCR以及检测过程。
本发明的外泌体提取和检测用微流控系统将外泌体的提取、外泌体核酸提取、外泌体蛋白提取、外泌体核酸检测、外泌体蛋白检测集成到一张芯片上，实现了外泌体及其内容物的提取和检测的一体化、自动化，一体化全封闭的系统避免了来自环境的污染。
本发明的微流控系统集成了独特的气动混匀模块，同时实现了混匀以及溶液缓冲的功能，解决了载液量较少的蛇形混匀通道载液量较少，容易回吸到泵里的问题，创新性地辅助实现了微流控芯片上大体积样本的混匀过程。气动混匀模块中的压力往复泵，实现了注射、抽取以及气动混匀过程，相对于常规微流控系统所用的注射泵以及蠕动泵，减小了系统体积。压力往复泵独特的多层结构避免了反应液的回流，使压力往复泵与废液池合二为一，减小了系统的体积，简化了系统上通道和操作的复杂性。
本发明的微流控系统集成了磁驱混匀模块，解决了在微流控芯片小的腔室内，磁分离后，磁珠难以分散，容易黏壁，残留的问题，提高了磁珠的回收率、外泌体的提取效率以及洗涤效率。
气动混匀模块和磁驱混匀模块的结合，解决了微流控只能处理微量样本的局限性，增大了微流控芯片对于样本的处理能力，提高了外泌体捕获磁珠对于外泌体的捕获效率、提高了外泌体的洗涤效率，解决了外泌体捕获磁珠残留的问题；可以实现大体积样本的混匀、孵育、清洗以及磁珠的再分散过程，凭借压力往复泵这一单一动力源，便可提供从样本中提取并检测外泌体及其所包含的核酸、蛋白质全过程的全部动力。
附图说明
为了更清楚地说明本说明书实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的类似技术方案附图。
图1为外泌体提取和检测用微流控系统的整体结构示意图
图2为本发明的外泌体提取模块示意图；
图3为本发明的外泌体蛋白提取模块示意图；
图4为本发明的外泌体蛋白化学发光检测模块示意图；
图5为本发明的外泌体核酸提取模块示意图；
图6为本发明的外泌体核酸检测模块示意图；
图7A为本发明的气动混匀模块的示意图；
图7B为本发明的压力往复泵的驱动示意图；
图7C为本发明的压力往复泵的结构示意图；
图8A为本发明的磁驱混匀模块的安置区域；
图8B为本发明的磁驱混匀模块的磁驱部件示例(外泌体提取和检测用微流控系统78是集成在一张类似平面的芯片，磁驱部件安置在78外侧的相对方)；
图9A为本发明微阀的安置区域；
图9B为本发明微阀的开启与关闭示意图；
图10为气动混匀模块对于外泌体提取效率的影响(检测指标GAPDH基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因，一种常见的人源内参基因))；
图11为磁驱混匀模块对于磁珠回收率的影响；
图12为二级磁分离结构对不同流速的磁珠的分离效果；
图13为通过外泌体提取模块分离得到的外泌体；
图14为通过外泌体提取模块分离得到的外泌体与差速离心得到的外泌体的NTA验证；
图15为不同磁珠在血清、血浆中的捕获效率；
图16为本发明外泌体蛋白提取模块提取的外泌体蛋白质的Western Blot表征，并与当前外泌体提取的金标准——差速离心法做对比结果；
图17A为外泌体蛋白化学发光检测模块III对不同浓度的外泌体进行CD9的化学发光检测；
图17B为外泌体蛋白化学发光检测模块III对不同浓度的外泌体进行CD63的化学发光检测；
图17C为外泌体蛋白化学发光检测模块III对不同浓度的外泌体进行CD81的化学发光检测；
图18A为外泌体核酸提取模块IV提取到的外泌体核酸的A2100检测结果；
图18B为差速离心法提取到的外泌体核酸的A2100检测结果；
图18C为经RNA酶处理后外泌体核酸提取模块IV提取到的外泌体核酸的A2100检测结果；
图19A为用外泌体核酸检测模块V对自动化提取的外泌体及其核酸进行自动化检测(检测指标B2M基因(β2微球蛋白基因，一种常见的人源内参基因))；
图19B为用外泌体核酸检测模块V对自动化提取的外泌体及其核酸进行自动化检测(检测指标外源内参LALBA基因(α-乳白蛋白基因，掺入的外源外泌体质控品的外参基因))。
其中，I-外泌体提取模块、II-外泌体蛋白提取模块、III-外泌体蛋白化学发光检测模块、IV-外泌体核酸提取模块、V-外泌体核酸检测模块、VI-气动混匀模块。
1-加样口、2-微阀、3-压力往复泵、4-外泌体提取室(一级磁分离结构)、5-外泌体捕获磁珠储存室、6-混匀腔、7-微阀、8-外泌体洗涤液储存室、9-混匀腔、10-微阀、11-外泌体洗脱液储藏室、12-混匀腔、13-微阀、14-外泌体收集口、15-微阀、16-外泌体裂解液(用于蛋白提取)储藏室、17-混匀腔、18-二级磁分离结构、19-微阀、20-微阀、21-外泌体蛋白收集口、22-化学发光捕获磁珠储存室、23-微阀、24-混匀腔、25-微阀、26-化学发光洗涤液储藏室A、27-混匀腔、28-微阀、29-AE(吖啶酯)标记的抗体储藏室、30-混匀腔、31-微阀、32-化学发光洗涤液储藏室B、33-混匀腔、34-微阀、35-预激发液储藏室、36-混匀腔、37-微阀、38-微阀、39-化学发光检测孔、40-激发液储藏室、41-混匀腔、42-混匀腔、43-微阀、44-外泌体裂解液(用于核酸提取)储藏室、45-混匀腔、46-微阀、47-核酸捕获磁珠储存室、48-微阀、49-混匀腔、50-微阀、51-核酸洗涤液A储存室、52-混匀腔、53-微阀、54-核酸洗涤液B储存室、55-混匀腔、56-微阀、57-核酸洗脱液储存室、58-混匀腔、59-PCR缓冲室、60-微阀、61-外泌体核酸收集口、62-微阀、63-PCR反应液A储藏室、64-混匀腔、65-微阀、66-PCR反应液B储藏室、67-混匀腔、68-微阀、69-引物探针A储藏室、70-混匀腔、71-微阀、72-引物探针B储藏室、73-混匀腔、74-微阀、75-PCR室、76-混匀腔、77-磁驱混匀组件、78-外泌体提取和检测用微流控系统、79-微阀打开的微通道、80-微阀关闭的微通道、81-打开状态的微阀驱动器、82-关闭状态的微阀驱动器、83-微阀驱动器的整体示意简图、84-压力往复泵的整体结构、85-压力往复泵的驱动器、86-压力往复泵的底层、87-压力往复泵的中间层、88-压力往复泵与微通道连接的中间层、89-压力往复泵的顶层、90-压力往复泵在中间层2上的位置、91-压力往复泵在中间层1上的位置、92-与压力往复泵连接的微通道。
具体实施方式
本发明旨在①通过磁珠分选法实现外泌体的提取捕获，并创新性地设计了气动混匀模块和磁驱混匀模块解决微流控技术只能处理微量样本的问题；②通过微流控的结构以及功能化的模块设计实现对外泌体捕获磁珠的操控，从而实现外泌体提取的自动化；③设计外泌体蛋白提取模块，并搭配相应的裂解液实现外泌体蛋白的自动化提取；④设计外泌体核酸提取模块，并搭配相应的裂解液、洗涤液、核酸提取珠以及洗脱液，实现外泌体核酸的自动化提取；⑤设计外泌体蛋白检测模块，并搭配相应的化学发光磁珠、洗涤液、AE(吖啶酯)检测液、预激发液、激发液，实现外泌体蛋白的自动化检测；⑥设计外泌体核酸检测模块，并搭配一步法qPCR检测试剂、PCR模块实现外泌体核酸的自动化检测；⑦实现上述过程的全自动化。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种外泌体及其内容物的自动化提取、检测系统，系统包括外泌体提取模块、外泌体蛋白提取模块、外泌体核酸提取模块、外泌体蛋白化学发光检测模块、外泌体核酸检测模块、气动混匀模块、磁驱混匀模块以及微阀。所述外泌体蛋白提取模块通过微阀连接在外泌体提取模块和外泌体蛋白化学发光检测模块上；所述外泌体核酸提取模块通过微阀连接在外泌体提取模块和外泌体核酸检测模块上；所述气动混匀模块连接在外泌体提取模块、外泌体蛋白提取模块、外泌体核酸提取模块、外泌体蛋白化学发光检测模块、外泌体核酸检测模块以及微阀上；所述微阀连接在外泌体提取模块、外泌体蛋白提取模块、外泌体核酸提取模块、外泌体蛋白化学发光检测模块以及外泌体核酸检测模块相互连接的通道上；所述磁驱混匀模块置于外泌体提取模块、外泌体核酸提取模块、外泌体蛋白化学发光检测模块的外侧相对方(如上、下方)；所述外泌体核酸检测模块连接在外泌体核酸提取模块上，与PCR模块相配套；所述外泌体蛋白化学发光检测模块连接在外泌体蛋白提取模块上，并与化学发光检测装置相配套。
本发明的磁驱混匀模块由电磁铁，可选的电磁铁运行轨道组成。磁驱混匀模块置于含有磁珠的反应槽的外侧相对方(如上下方)，当反应需要进行磁分离时，单独打开磁驱混匀模块一侧(如下方)的电磁铁，完成磁分离；当磁珠需要再分散时，依次往复打开、关闭磁珠反应槽相对侧(如上下方)的电磁铁，并在电磁铁打开的时候，使电磁铁沿着反应槽进行往复运动，实现磁珠的再分散过程。
本发明的气动混匀模块由压力往复驱动泵、气动混匀腔、微通道以及微阀组成。压力往复泵具有多层结构，其中气动混匀腔通过微通道一端与压力往复驱动泵的上层相连，在气动混匀腔与压力往复驱动泵之间的微通道上设有微阀。气动混匀腔的另一端与反应液所在的腔室相连接。反应液在尺寸较大的气动混匀腔、反应液所在的腔室与尺寸较小的微通道之间往复流动可以实现混匀的过程。气动混匀腔同时是气动混匀过程中的溶液缓冲池，避免在气动混匀过程中反应液回流到压力往复泵之中。在微阀打开的情况下，通过在压力往复驱动泵上施加压力，即可完成注射过程；通过在压力往复驱动泵上释放压力，完成抽取过程；通过在压力往复驱动泵上施加、释放压力，使反应液通过微通道在相应的腔室和气动混匀腔之间往复运动，完成气动混匀过程。微通道与压力往复泵的上层相连，吸入的反应液流入压力往复泵的下层，避免了反应液在压力往复泵泵出时回流造成污染。
本发明的微阀由软腔室和压力控制指针组成。软腔室与微通道相连，压力控制指针在软腔室上方。当压力控制指针不对软腔室施加压力的情况下，微阀保持打开状态；当压力控制指针对软腔室施加压力的情况下，微阀保持关闭状态。
本发明的外泌体提取模块由加样口、外泌体捕获磁珠、外泌体捕获磁珠储存室、外泌体提取室(一级磁分离结构)、外泌体洗涤液储存室、外泌体洗脱液储藏室、气动混匀腔、磁驱混匀组件、外泌体收集口及相应的微阀等结构组成。外泌体提取过程如下：Ⅰ外泌体提取孵育过程：样品由加样口加入，并进入外泌体提取室(一级磁分离结构)，在压力往复泵的驱动下，外泌体捕获磁珠储存室中的外泌体捕获磁珠进入外泌体提取室进行外泌体的提取捕获；Ⅱ外泌体气动混匀过程：在压力往复泵的驱动下，外泌体捕获磁珠与样本在外泌体提取室和气动混匀腔之间往复流动，实现气动混匀的过程；Ⅲ外泌体捕获磁珠磁分离过程：外泌体捕获完成后将外泌体提取室(一级磁分离结构)一侧(如下方)的电磁铁打开，实现外泌体捕获磁珠的磁分离，并将多余的反应液在压力往复泵的驱动下经外泌体提取室(一级磁分离结构)、外泌体捕获磁珠储存室、气动混匀腔最后进入压力往复泵下面的废液池中；Ⅳ外泌体洗涤过程之分选磁珠的再分散过程：打开外泌体洗涤液储存室的微阀，在压力泵的驱动下将外泌体洗涤液泵入外泌体提取室(一级磁分离结构)，并依次打开、关闭外泌体提取室(一级磁分离结构)外侧相对方(如上、下方)的磁驱混匀组件，解决外泌体捕获磁珠捕获完外泌体并磁分离后团聚在外泌体提取室(一级磁分离结构)底部的问题；Ⅴ外泌体洗涤过程之气动混匀过程：将外泌体捕获磁珠在外泌体洗涤液中利用磁驱混匀组件再分散之后，进一步地在压力往复泵的驱动下使外泌体捕获磁珠与外泌体洗涤液在外泌体提取室和气动混匀腔之间往复流动，实现充分洗涤的过程；外泌体捕获完成后将外泌体提取室(一级磁分离结构)一侧(如下方)的电磁铁打开，实现外泌体捕获磁珠的磁分离，并将多余的反应液在压力往复泵的驱动下经外泌体提取室(一级磁分离结构)、外泌体捕获磁珠储存室、气动混匀腔最后进入压力往复泵下面的废液池中，完成外泌体捕获磁珠的洗涤过程；VI外泌体的收集过程：打开外泌体洗脱液储藏室的微阀，并在压力泵的驱动下将外泌体洗脱液泵入外泌体提取室(一级磁分离结构)，并重复步骤Ⅳ和步骤Ⅴ，打开外泌体收集口的微阀，在外泌体收集口收集捕获的外泌体。
本发明的外泌体蛋白提取模块由外泌体蛋白裂解液储藏室、外泌体提取室(一级磁分离结构)、二级磁分离结构、气动混匀腔、磁驱混匀组件、压力往复驱动泵、外泌体蛋白收集口、微阀等结构组成。外泌体蛋白自动化分离过程如下：Ⅰ外泌体的裂解过程：完成外泌体的提取、洗涤及磁分离后，打开外泌体蛋白裂解液储藏室的微阀，在压力泵的驱动下将外泌体蛋白裂解液泵入外泌体提取室(一级磁分离结构)，并依次打开、关闭外泌体提取室(一级磁分离结构)外侧相对方(如上、下方)的磁驱混匀组件，实现外泌体捕获磁珠在外泌体蛋白裂解液中的再分散；在压力往复泵的驱动下使外泌体捕获磁珠与外泌体蛋白裂解液在外泌体提取室和气动混匀腔之间往复流动，确保外泌体的充分裂解；Ⅱ外泌体蛋白的释放过程：外泌体充分裂解后，打开外泌体提取室(一级磁分离结构)、二级磁分离结构下面的电磁铁，对外泌体捕获磁珠进行磁分离，二级磁分离结构一方面可以确保磁分离更彻底，另一方面可以加快磁分离的速度，从而提高样本处理能力；打开二级磁分离结构和外泌体蛋白分离槽之间的微阀，通过压力往复驱动泵将去除外泌体捕获磁珠的外泌体蛋白裂解液通过泵入外泌体蛋白分离槽中，最后打开外泌体蛋白分离槽和外泌体蛋白收集口之间的微阀，在外泌体蛋白收集口收集分离的外泌体蛋白。
本发明的外泌体蛋白化学发光检测模块由化学发光捕获磁珠、化学发光捕获磁珠储存室、气动混匀腔、压力往复驱动泵、化学发光洗涤液储藏室A、化学发光洗涤液储藏室B、AE(吖啶酯)标记的抗体储藏室、预激发液储藏室、激发液储藏室、化学发光检测孔、微阀以及化学发光检测器等结构组成。外泌体蛋白化学发光检测的过程如下：Ⅰ化学发光捕获磁珠捕获外泌体蛋白：将外泌体蛋白裂解液在压力往复驱动泵的驱动下，泵入化学发光捕获磁珠储存室，关闭外泌体蛋白分离槽和外泌体蛋白收集口之间的微阀，打开化学发光捕获磁珠储存室和压力往复驱动泵之间的微阀，在压力往复驱动泵的驱动下，使化学发光捕获磁珠与外泌体蛋白裂解液在气动混匀腔之间往复流动，实现化学发光捕获磁珠与外泌体蛋白的充分捕获；Ⅱ化学发光捕获磁珠的第一次洗涤：外泌体蛋白捕获完成后将化学发光捕获磁珠储存室一侧(如下方)的电磁铁打开，实现化学发光捕获磁珠的磁分离，并将多余的反应液在压力往复泵的驱动下经化学发光捕获磁珠储存室、气动混匀腔最后进入压力往复泵下面的废液池中；打开化学发光洗涤液储藏室A的微阀，在压力泵的驱动下将化学发光洗涤液A泵入化学发光捕获磁珠储存室，并依次打开、关闭化学发光捕获磁珠储存室外侧相对方(如上、下方)的磁驱混匀组件，实现化学发光捕获磁珠的再分散过程；然后进一步地在压力往复泵的驱动下使化学发光捕获磁珠与化学发光洗涤液A在化学发光捕获磁珠储存室和气动混匀腔之间往复流动，实现充分洗涤的过程；化学发光捕获磁珠洗涤完成后将化学发光捕获磁珠储存室一侧(如下方)的电磁铁打开，实现化学发光捕获磁珠的磁分离，并将多余的反应液在压力往复泵的驱动下经化学发光捕获磁珠储存室、气动混匀腔最后进入压力往复泵下面的废液池中；ⅢAE(吖啶酯)标记的抗体对外泌体蛋白的孵育过程：打开AE(吖啶酯)标记的抗体储藏室与压力往复泵之间的微阀，将AE(吖啶酯)标记的抗体泵入化学发光捕获磁珠储存室中，并依次打开、关闭化学发光捕获磁珠储存室外侧相对方(如上、下方)的磁驱混匀组件，实现化学发光捕获磁珠在AE(吖啶酯)标记的抗体中的再分散过程；然后进一步地在压力往复泵的驱动下使化学发光捕获磁珠与AE(吖啶酯)标记的抗体在化学发光捕获磁珠储存室和气动混匀腔之间往复流动，实现AE(吖啶酯)标记的抗体的充分孵育过程；AE(吖啶酯)标记的抗体孵育完成后将化学发光捕获磁珠储存室一侧(如下方)的电磁铁打开，实现化学发光捕获磁珠的磁分离，并将多余的反应液在压力往复泵的驱动下经化学发光捕获磁珠储存室、气动混匀腔最后进入压力往复泵下面的废液池中；Ⅳ化学发光捕获磁珠的第二次洗涤：外泌体蛋白捕获完成后将化学发光捕获磁珠储存室一侧(如下方)的电磁铁打开，实现化学发光捕获磁珠的磁分离，并将多余的反应液在压力往复泵的驱动下经化学发光捕获磁珠储存室、气动混匀腔最后进入压力往复泵下面的废液池中；打开化学发光洗涤液储藏室B的微阀，在压力泵的驱动下将化学发光洗涤液B泵入化学发光捕获磁珠储存室，并依次打开、关闭化学发光捕获磁珠储存室外侧相对方(如上、下方)的磁驱混匀组件，实现化学发光捕获磁珠的再分散过程；然后进一步地在压力往复泵的驱动下使化学发光捕获磁珠与化学发光洗涤液B在化学发光捕获磁珠储存室和气动混匀腔之间往复流动，实现充分洗涤的过程；化学发光捕获磁珠洗涤完成后将化学发光捕获磁珠储存室一侧(如下方)的电磁铁打开，实现化学发光捕获磁珠的磁分离，并将多余的反应液在压力往复泵的驱动下经化学发光捕获磁珠储存室、气动混匀腔最后进入压力往复泵下面的废液池中；Ⅴ预激发液的反应过程：打开预激发液储藏室的微阀，在压力泵的驱动下将预激发液泵入化学发光捕获磁珠储存室，并依次打开、关闭化学发光捕获磁珠储存室外部相对侧(如上、下方)的磁驱混匀组件，实现化学发光捕获磁珠的再分散过程；然后进一步地在压力往复泵的驱动下使化学发光捕获磁珠与预激发液在化学发光捕获磁珠储存室和气动混匀腔之间往复流动，实现充分混匀、反应的过程；VI激发液的反应、检测过程：压力往复泵的驱动下使化学发光捕获磁珠与预激发液经化学发光捕获磁珠储存室泵入化学发光检测孔，打开激发液储藏室与压力往复泵之间的微阀，在压力往复泵的驱动下将激发液泵入化学发光捕获磁珠与预激发液的混合液中，并在化学发光检测孔和气动混匀腔之间往复流动，实现充分混匀、反应的过程，反应结束后利用化学发光检测孔下面的化学发光检测器对外泌体蛋白质进行检测。
本发明的外泌体核酸提取模块由外泌体核酸裂解液储藏室、外泌体提取室(一级磁分离结构)、二级磁分离结构、气动混匀腔、磁驱混匀组件、压力往复驱动泵、外泌体核酸收集口、PCR缓冲室、核酸捕获磁珠、核酸捕获磁珠储存室、核酸洗涤液A储存室、核酸洗涤液B储存室、核酸洗脱液储存室、微阀等结构组成。外泌体核酸自动化提取的过程如下：Ⅰ外泌体的裂解过程：完成外泌体的提取、洗涤及磁分离后，打开外泌体核酸裂解液储藏室的微阀，在压力泵的驱动下将外泌体核酸裂解液泵入外泌体提取室(一级磁分离结构)，并依次打开、关闭外泌体提取室(一级磁分离结构)外部相对侧(如上、下方)的磁驱混匀组件，实现外泌体捕获磁珠在外泌体核酸裂解液中的再分散；在压力往复泵的驱动下使外泌体捕获磁珠与外泌体核酸裂解液在外泌体提取室和气动混匀腔之间往复流动，确保外泌体的充分裂解；Ⅱ外泌体核酸的捕获过程：外泌体充分裂解后，打开二级磁分离结构和外泌体核酸捕获磁珠储存室之间的微阀，通过压力往复驱动泵将外泌体核酸裂解液泵入外泌体核酸捕获磁珠储存室中，外泌体核酸捕获磁珠储存室中有预先加入的核酸捕获磁珠；在压力往复泵的驱动下使外泌体捕获磁珠与外泌体核酸裂解液在核酸捕获磁珠储存室和气动混匀腔之间往复流动，确保外泌体核酸裂解液与核酸提取磁珠充分混合，实现核酸提取磁珠对于外泌体核酸的充分捕获；Ⅲ外泌体核酸的第一次洗涤过程：外泌体核酸捕获完成后将外泌体核酸捕获磁珠储存室一侧(如下方)的电磁铁打开，实现外泌体核酸捕获磁珠的磁分离，并将多余的反应液在压力往复泵的驱动下经外泌体核酸捕获磁珠、气动混匀腔最后进入压力往复泵下面的废液池中；打开核酸洗涤液A储存室的微阀，在压力泵的驱动下将核酸洗涤液A泵入外泌体核酸捕获磁珠储存室，并依次打开、关闭外泌体核酸捕获磁珠储存室外侧相对方(如上、下方)的磁驱混匀组件，实现外泌体核酸捕获磁珠的再分散过程；然后进一步地在压力往复泵的驱动下使外泌体核酸捕获磁珠与核酸洗涤液A在外泌体核酸捕获磁珠储存室和气动混匀腔之间往复流动，实现充分洗涤的过程；外泌体核酸捕获磁珠洗涤完成后将外泌体核酸捕获磁珠储存室一侧(如下方)的电磁铁打开，实现外泌体核酸捕获磁珠的磁分离，并将多余的反应液在压力往复泵的驱动下经外泌体核酸捕获磁珠储存室、气动混匀腔最后进入压力往复泵下面的废液池中；Ⅳ外泌体核酸的第二次洗涤过程：打开核酸洗涤液B储存室的微阀，在压力泵的驱动下将核酸洗涤液B泵入外泌体核酸捕获磁珠储存室，并依次打开、关闭外泌体核酸捕获磁珠储存室外侧相对方(如上、下方)的磁驱混匀组件，实现外泌体核酸捕获磁珠的再分散过程；然后进一步地在压力往复泵的驱动下使外泌体核酸捕获磁珠与核酸洗涤液B在外泌体核酸捕获磁珠储存室和气动混匀腔之间往复流动，实现充分洗涤的过程；外泌体核酸捕获磁珠洗涤完成后将外泌体核酸捕获磁珠储存室一侧(如下方)的电磁铁打开，实现外泌体核酸捕获磁珠的磁分离，并将多余的反应液在压力往复泵的驱动下经外泌体核酸捕获磁珠储存室、气动混匀腔最后进入压力往复泵下面的废液池中；Ⅴ外泌体核酸的洗脱过程：打开核酸洗脱液储存室和压力往复泵之间的微阀，在压力泵的驱动下将核酸洗脱液泵入外泌体核酸捕获磁珠储存室，并依次打开、关闭外泌体核酸捕获磁珠储存室外侧相对方(如上、下方)的磁驱混匀组件，实现外泌体核酸捕获磁珠的再分散过程；然后进一步地在压力往复泵的驱动下使外泌体核酸捕获磁珠与核酸洗脱液在外泌体核酸捕获磁珠储存室和气动混匀腔之间往复流动，实现充分洗脱的过程；外泌体核酸捕获磁珠洗脱完成后将外泌体核酸捕获磁珠储存室一侧(如下方)的电磁铁打开，实现外泌体核酸捕获磁珠的磁分离，并将外泌体核酸洗脱液在压力往复泵的驱动下经外泌体核酸捕获磁珠储存室进入PCR缓冲室中，按照需求可打开PCR缓冲室和外泌体核酸收集口之间的微阀或进入接下来的外泌体核酸检测过程。
本发明的外泌体核酸检测模块由气动混匀腔、磁驱混匀组件、压力往复驱动泵、PCR缓冲室、PCR室、PCR反应液A储藏室、PCR反应液B储藏室、引物探针A储藏室、引物探针B储藏室、以及PCR装置组成。外泌体核酸检测的过程如下：ⅠPCR反应体系的配置：依次打开PCR反应液A储藏室、PCR反应液B储藏室、引物探针A储藏室、引物探针B储藏室与压力往复泵之间的微阀，在压力往复泵的驱动下，将PCR反应液A、PCR反应液B、引物探针A和引物探针B依次注入PCR缓冲室，并在压力往复泵的驱动下使外泌体核酸洗脱液与上述试剂在PCR缓冲室、PCR室和气动混匀腔之间往复流动，实现PCR反应体系的充分混匀过程；ⅡPCR反应及外泌体核酸的检测过程：在压力往复泵的驱动下，将PCR反应体系泵入PCR室，在外置PCR装置的协助下由PCR热循环系统进行目标序列的扩增,由光路系统对PCR产物的荧光物质进行激发，最后由检测系统对激发的荧光进行检测统计，得到每个循环中靶基因的扩增量，从而外泌体的对靶基因进行定性或定量研究。本发明所述的外泌体提取模块、外泌体蛋白提取模块、外泌体核酸提取模块、外泌体蛋白化学发光检测模块、外泌体核酸检测模块、气动混匀模块、磁驱混匀模块以及微阀集成在一个载体如芯片上。
下面将结合本说明书实施例中的附图，对本说明书实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本说明书一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本说明书中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利公开和保护的范围。
实施例1
如图1、图7、图8和图9所示，一种外泌体提取和检测用微流控系统，系统主要包括外泌体提取模块I、外泌体蛋白提取模块II、外泌体蛋白化学发光检测模块III、外泌体核酸提取模块IV、外泌体核酸检测模块V、气动混匀模块VI、磁驱混匀模块77以及微阀。所述外泌体蛋白提取模块II通过微通道与微阀连接在外泌体提取模块I和外泌体蛋白化学发光检测模块III上；外泌体核酸提取模块IV通过微通道与微阀连接在外泌体提取模块I和外泌体核酸检测模块V上；所述的气动混匀模块VI连接在外泌体提取模块I、外泌体蛋白提取模块II、外泌体蛋白化学发光检测模块III、外泌体核酸提取模块IV以及外泌体核酸检测模块V上，通过在压力往复泵的驱动以及混匀腔的配合下实现反应液的高效混匀、孵育过程；所述的磁驱混匀模块77置于外泌体提取模块I的外泌体提取室(一级磁分离结构)4和二级磁分离结构18、外泌体蛋白化学发光检测模块III的化学发光捕获磁珠储存室22以及外泌体核酸提取模块IV的核酸捕获磁珠储存室47的外侧的相对方，实现了磁珠的高效再分散并减少了磁珠的残留。本发明所述的外泌体提取模块I、外泌体蛋白提取模块II、外泌体蛋白化学发光检测模块III、外泌体核酸提取模块IV、外泌体核酸检测模块V、气动混匀模块VI、以及微阀集成在一个外泌体提取和检测用微流控系统78上。
本发明中，所述的集成是指将外泌体提取模块I、外泌体蛋白提取模块II、外泌体蛋白化学发光检测模块III、外泌体核酸提取模块IV、外泌体核酸检测模块V、气动混匀模块VI、以及微阀集的设计图整合到一个设计图(图1)中，并将总的设计图(图1)利用微流控芯片制备的常规工艺在厘米见方的基底上制备出集合了上述所有模块的功能的微流控芯片，各个模块的连接细节以及实现方法在本发明中有详细阐述。其中外泌体提取模块的设计图按照图2进行设计，外泌体蛋白提取模块的设计图按照图3进行设计，外泌体蛋白化学发光检测模块的设计图按照图4进行设计，外泌体核酸提取模块的设计图按照图5进行设计，外泌体核酸检测模块的设计图按照图6进行设计，气动混匀模块的设计图按照图7A进行设计，微阀的安置区域按照图9A进行设置，将图2、图3、图4、图5、图6、图7A以及图9A的设计图集成到同一个设计图1中(即图1包括图2、图3、图4、图5、图6、图7A以及图9A等各个功能模块的集合)。
实施例2
如图7A至7C所示，所述气动混匀模块VI包括压力往复泵3和混匀腔6、9、12、17、45、49、52、55、58、64、67、70、73、76、24、27、30、33、36、41、42；所述压力往复泵3包括压力往复泵的驱动器85以及压力往复泵的整体结构84；所述的压力往复泵的整体结构84包括压力往复泵的底层86、压力往复泵的中间层87、压力往复泵与微通道连接的中间层88、压力往复泵的顶层89等结构。其中驱动器85为本发明微流控系统之外的部件，工作时，根据需要对本发明的微流控系统的压力往复泵3进行按压，从而完成反应液的注射、抽取、孵育、混匀、清洗以及废液收集等操作。
其工作流程和原理为：当执行注射过程时，操控压力往复泵的驱动器85在压力往复泵3上施加压力，即可完成注射过程；当执行抽取过程时，操控压力往复泵的驱动器85释放压力往复泵3上的压力，即可完成抽取过程，抽取的废液经压力往复泵在中间层88上的位置90流入压力往复泵在中间层87上的位置91中，避免了废液的回流；当执行混匀过程时，操控压力往复泵的驱动器85在压力往复泵3上反复施加、释放压力，即可完成抽吸混匀过程；混匀腔通过微通道一端压力往复泵在中间层88上的位置90相连，在混匀腔和压力往复泵在中间层88上的位置90之间的微通道上设有微阀。混匀腔的另一端与反应液所在的腔室相连接。反应液在尺寸较大的混匀腔、反应液所在的腔室与尺寸较小的微通道之间往复流动可以实现混匀的过程；混匀腔同时是混匀过程中的溶液缓冲池，避免在混匀过程中反应液回流到压力往复泵之中。气动混匀模块需与微阀相配合，微阀的安置区域与操控原理如图9A和9B所示。在图9A中标志“x”的地方安置微阀；图中79和80分别微阀打开的微通道和微阀关闭的微通道；81和82分别表示打开和关闭状态的微阀驱动器；当微阀驱动器关闭时，微阀驱动器挤压微通道，使微通道闭合，从而关闭微阀；当微阀驱动器打开时，微阀驱动器停止对微通道的挤压，使微通道打开，从而打开微阀。图中的83表示多个微阀驱动器的排列，可以按照需求同时打开或关闭微阀驱动器。在同样的反应条件下，通过气动混匀模块可以实现大体积样本外泌体及其内容物的检测，并提高提取效率。以外泌体核酸内参基因GAPDH为例，样本体积为1mL的血浆，检测结果如图10所示，在气动混匀模块的参与下，本发明实现了对大体积血浆样本外泌体及其核酸的提取，且提取效率达到了外泌体提取金标准的180％；在气动混匀模块的参与下，本发明对外泌体及其核酸的提取效率提高了60％左右。(具体流程参考外泌体提取模块、外泌体核酸提取模块、外泌体核酸检测模块的操作。)不同磁珠在血清、血浆中的捕获效率见图15。
实施例3
如图8A和8B所示，所述磁驱混匀模块包括磁驱部件77、外泌体提取室(一级磁分离结构)4、二级磁分离结构18、核酸捕获磁珠储存室47、化学发光捕获磁珠储存室22以及相应的磁珠。所述磁驱部件77由上下两块电磁铁构成，电磁铁固定安装或者安装在轨道上，可以在一定范围内往复移动、圆周运动；所述磁驱部件77安装在外泌体提取室(一级磁分离结构)4、二级磁分离结构18、核酸捕获磁珠储存室47以及化学发光捕获磁珠储存室22的上下方，所述磁珠在外泌体提取室(一级磁分离结构)4、二级磁分离结构18、核酸捕获磁珠储存室47以及化学发光捕获磁珠储存室22的腔体内。
其工作流程和原理为：当磁珠与反应液在相应的反应腔内进行孵育反应后，启动磁驱部件77下方的电磁铁，磁分离1min，完成磁分离过程；由于体液中的外泌体尺寸相较于蛋白大很多(外泌体尺寸：30～150nm)，因此很可能发生同一个外泌体与多个磁珠反应的状况，在这种状况下磁珠就容易发生团聚、粘连，磁分离后磁珠再分散比较困难。这时候关闭磁驱部件77下方的电磁铁，打开磁驱部件77上方的电磁铁，并围绕相应的腔体做往复移动、圆周运动，5s后，贴在腔体底部的磁珠重悬完成；再打开磁驱部件77下方的电磁铁，做同样的运动，重复3次后，磁珠再分散完成。我们在外泌体提取室(一级磁分离结构)4、核酸捕获磁珠储存室47以及化学发光捕获磁珠储存室22内分别注入外泌体捕获磁珠、核酸捕获磁珠以及化学发光捕获磁珠，并依照上述过程启动/不启动磁驱混匀模块，对回收的磁珠进行回收率的测定。测定结果如图11所示，在磁驱混匀模块的协助下，外泌体捕获磁珠、核酸捕获磁珠以及化学发光捕获磁珠的回收率分别由68％、82％和77％提升到了95％、98％和96％；此外我们还在外泌体提取室(一级磁分离结构)4的基础上添加了二级磁分离结构18，并在二级磁分离结构18的下方同样放置了磁驱部件77，二级磁分离结构的存在提高了磁珠的分离速度，在磁珠160μL/min的速度驱动的情况下，对磁珠的回收率仍然可以保持在95％左右，在保证磁珠回收率的前提下(>95％)，处理1mL血浆样本仅需6分钟左右，这是本发明可以进行大体积样本外泌体捕获的另一个基础，其对样本的处理速度远大于对比文件《微流控系统及外泌体提取方法》(申请号：201910478837.X)的最高样本处理速度6μL/min，样本处理效率提升了约26倍。
实施例4
如图2所示，外泌体提取模块I包括加样口1、微阀2、压力往复泵3、外泌体提取室(一级磁分离结构)4、外泌体捕获磁珠储存室5、混匀腔6、微阀7、外泌体洗涤液储存室8、混匀腔9、微阀10、微阀37、外泌体洗脱液储藏室11、混匀腔12、微阀13以及外泌体收集口14；所述外泌体捕获磁珠储存室5、外泌体洗涤液储存室8和外泌体洗脱液储藏室11连接在外泌体提取室(一级磁分离结构)4上；所述加样口1和外泌体收集口14通过微阀2、13与外泌体提取室(一级磁分离结构)4相连；所述外泌体捕获磁珠储存室5、外泌体洗涤液储存室8和外泌体洗脱液储藏室11分别通过混匀腔6、9、12和微阀37、7、10与压力往复泵3相连。
其工作流程和原理为：以1mL血浆样本为例，打开微阀2，在加样口1加入1mL血浆样本，关闭微阀2，打开微阀6，挤压压力往复泵3将外泌体捕获磁珠储存室5中的磁珠对压力往复泵3反复施加或释放压力，使外泌体捕获磁珠与血浆样本在外泌体提取室(一级磁分离结构)4、外泌体捕获磁珠储存室5以及混匀腔6之间往复运动，进行外泌体的孵育过程(为了简化撰写内容，以下磁珠的磁驱再分散和磁珠的混匀将分别简写为“磁珠磁驱再分散过程”“磁珠混匀过程”)；孵育15～30min后，打开外泌体提取室(一级磁分离结构)4下方的磁驱混匀模块，进行磁分离，磁分离时间为1min，将磁分离后的上清通过外泌体捕获磁珠储存室5、混匀腔6和微阀37吸入压力往复泵3充当废液槽的压力往复泵的底层86中，完成磁分离过程；关闭微阀37，打开微阀7，将外泌体洗涤液储存室8中的洗涤液以160μL/min的速度注射入外泌体提取室(一级磁分离结构)4，依次打开磁驱混匀模块以及气动混匀模块进行磁珠磁驱再分散过程以及磁珠混匀过程；洗涤1min，将洗涤完成后的磁珠再进行磁分离，并打开微阀10，将外泌体洗脱液储藏室11中的外泌体洗脱液注射入外泌体提取室(一级磁分离结构)4，依次打开磁驱混匀模块以及气动混匀模块进行磁珠磁驱再分散过程以及磁珠混匀过程；打开微阀13，将洗脱的外泌体通过压力往复泵3泵入外泌体收集口14收集外泌体或进行下一步自动化操作。
将外泌体收集口14收集到的外泌体进行外泌体鉴定的三大金标准之一的透射电镜表征，表征结果如图13所示，结果显示本发明的确提取到了外泌体，且具有外泌体的典型双层膜结构(箭头所指为外泌体)；将收集外泌体收集口14收集到的外泌体用外泌体鉴定的另一个三大金标准纳米颗粒跟踪分析(NTA)进行表征，并与外泌体提取的金标准进行对比实验，结果如图14所示，通过本发明外泌体提取模块提取的外泌体的尺寸在100nm和136nm，这个尺寸在外泌体的典型尺寸(30～150nm)之间，属于外泌体的典型尺寸；通过本发明外泌体提取模块提取的外泌体每毫升的粒子数为2.59x 109particles/mL，远高于外泌体提取金标准差速离心法，提取到的外泌体数量为差速离心法的2.5倍左右；外泌体鉴定的最后一个金标准“Western Blot鉴定”将在外泌体蛋白提取模块进行论证。
利用本发明的外泌体提取模块，并依照上述方法用不同磁珠对血清、血浆样本的外泌体进行提取，并对提取的外泌体进行ddPCR定量检测，检测结果如图15所示，图中“血清的阴性磁珠”指的是常用于外泌体血清检测时用的阴性质控磁珠，IgG磁珠。该磁珠在血清中不能有效地提取外泌体，但在血浆中却能捕获到外泌体，阴性质控“不再阴性”，这个证据表明磁珠法提取外泌体在血清和血浆中有明显的差异，在血清和血浆领域对外泌体的提取方法有所差异。
实施例5
如图3所示，外泌体蛋白提取模块II包括压力往复泵3、外泌体提取室(一级磁分离结构)4、微阀15、外泌体裂解液(用于蛋白提取)储藏室16、混匀腔17、二级磁分离结构18、微阀19、微阀20以及外泌体蛋白收集口21；所述外泌体裂解液(用于蛋白提取)储藏室16和二级磁分离结构18与外泌体提取室(一级磁分离结构)4相连；所述外泌体裂解液(用于蛋白提取)储藏室16与混匀腔17、微阀15以及压力往复泵3相连；所述二级磁分离结构18与微阀19、微阀20以及外泌体蛋白收集口21相连。
其工作流程和原理为：外泌体提取完成后，打开微阀15，在压力往复泵3的驱动下，将外泌体裂解液(用于蛋白提取)储藏室16中的外泌体裂解液(用于蛋白提取)泵入外泌体提取室(一级磁分离结构)4；依次打开磁驱混匀模块以及气动混匀模块进行磁珠磁驱再分散过程以及磁珠混匀过程；打开外泌体提取室(一级磁分离结构)4和二级磁分离结构18下方磁驱混匀模块的电磁铁，进行磁分离，磁分离时间为1min；打开微阀19、微阀20，将外泌体裂解液(用于蛋白提取)泵入外泌体蛋白收集口21收集外泌体裂解液(用于蛋白提取)或泵入化学发光捕获磁珠储存室22进行下一步外泌体蛋白化学发光检测。
将从外泌体蛋白收集口21收集的蛋白裂解液进行外泌体鉴定的三大金标准的Western Blot进行鉴定并与外泌体提取的金标准差速离心法进行对比，如图16显示，本发明外泌体蛋白提取模块提取的外泌体蛋白质包含外泌体鉴定最常用的蛋白质CD9、CD63、CD81，进一步证明了本发明的外泌体提取模块成功地提取出外泌体蛋白；且检测到的外泌体标志蛋白含量比外泌体分离的金标准差速离心法更高。
实施例6
如图4所示，外泌体蛋白化学发光检测模块III包括压力往复泵3、微阀23、混匀腔24、微阀25、化学发光洗涤液储藏室A 26、混匀腔27、微阀28、AE(吖啶酯)标记的抗体储藏室29、混匀腔30、微阀31、化学发光洗涤液储藏室B 32、混匀腔33、微阀34、预激发液储藏室35、混匀腔36、微阀38、化学发光检测孔39、激发液储藏室40、混匀腔41、混匀腔42、磁驱部件77；所述混匀腔24、化学发光洗涤液储藏室A 26、AE(吖啶酯)标记的抗体储藏室29、化学发光洗涤液储藏室B 32以及预激发液储藏室35与化学发光捕获磁珠储存室22相连；所述激发液储藏室40和混匀腔42与化学发光检测孔39相连；所述化学发光检测孔39与化学发光捕获磁珠储存室22相连；所述混匀腔27、30、33、36、41一端与化学发光洗涤液储藏室A 26、AE(吖啶酯)标记的抗体储藏室29、化学发光洗涤液储藏室B 32、预激发液储藏室35、激发液储藏室40相连，另一端与微阀25、28、31、34、38相连，微阀与压力往复泵3相连。
其工作原理和流程为：将通过外泌体蛋白提取模块II提取的外泌体裂解液(用于蛋白提取)泵入化学发光捕获磁珠储存室22，与化学发光捕获磁珠储存室22储存的化学发光捕获磁珠进行外泌体蛋白的进行特异性捕获；打开微阀23，在压力往复泵3的驱动、混匀腔24的配合下，进行的外泌体裂解液(用于蛋白提取)和化学发光捕获磁珠的混匀过程，提高孵育效率。孵育15min后，打开启动磁驱部件77下方的电磁铁，磁分离1min；将反应液通过混匀腔24、微阀23吸入压力往复泵3充当废液槽的压力往复泵的底层86中，完成磁分离过程；关闭微阀23，打开微阀25，在压力往复泵3的驱动下，将化学发光洗涤液储藏室A 26中的化学发光洗涤液泵入化学发光捕获磁珠储存室22中，与捕获完特异性抗体的化学发光捕获磁珠进行洗涤，在磁驱部件77和气动混匀模块VI的协助下完成化学发光捕获磁珠的第一次洗涤过程；关闭微阀25，打开微阀28，将AE(吖啶酯)标记的抗体储藏室29中的化学发光洗涤液泵入化学发光捕获磁珠储存室22中，进行标记抗体的孵育过程；孵育5min后，打开启动磁驱部件77下方的电磁铁，磁分离1min；将反应液通过混匀腔30、微阀28吸入压力往复泵3充当废液槽的压力往复泵的底层86中，完成磁分离过程；关闭微阀28，打开微阀31，在压力往复泵3的驱动下，将化学发光洗涤液储藏室B32中的化学发光洗涤液泵入化学发光捕获磁珠储存室22中，与标记完特异性抗体的化学发光捕获磁珠进行洗涤，在磁驱部件77和气动混匀模块VI的协助下完成化学发光捕获磁珠的第二次洗涤过程；关闭微阀31，打开微阀34，在压力往复泵3的驱动下，将预激发液储藏室35中的预激发液泵入化学发光捕获磁珠储存室22中，在压力往复泵3的驱动、混匀腔36的配合下，进行的预激发液和化学发光捕获磁珠的混匀过程，提高孵育效率；孵育2min后，将预激发液和化学发光捕获磁珠在压力往复泵3的驱动下泵入化学发光检测孔39；关闭微阀34，打开微阀38，在压力往复泵3的驱动下将激发液储藏室40中的激发液泵入化学发光检测孔39，关闭微阀38，打开微阀25，在压力往复泵3的协助下，反应液化学发光检测孔39和混匀腔42之间在完成混匀过程，并对化学发光检测孔39中的反应液进行化学发光检测。
在化学发光捕获磁珠储存室22中加入不同浓度的外泌体蛋白依照上述过程进行化学发光检测，检测结果如图17A～17C所示。对于外泌体常见的检测蛋白，其化学发光值与外泌体常用检测蛋白(CD9，CD63，CD81)的浓度成正相关，且拟合度很好(R2均>0.998)，这表明外泌体蛋白化学发光检测模块III能很好地完成外泌体蛋白的化学发光检测。
实施例7
如图5所示，外泌体核酸提取模块IV包括压力往复泵3、外泌体提取室(一级磁分离结构)4、二级磁分离结构18、微阀43、外泌体裂解液(用于核酸提取)储藏室44、混匀腔45、微阀46、核酸捕获磁珠储存室47、微阀48、混匀腔49、微阀50、核酸洗涤液A储存室51、混匀腔52、微阀53、核酸洗涤液B储存室54、混匀腔55、微阀56、核酸洗脱液储存室57、混匀腔58、PCR缓冲室59、微阀60、外泌体核酸收集口61。所述外泌体提取室(一级磁分离结构)4与外泌体裂解液(用于核酸提取)储藏室44和二级磁分离结构18相连；所述核酸捕获磁珠储存室47与二级磁分离结构18、混匀腔49、核酸洗涤液A储存室51、核酸洗涤液B储存室54、核酸洗脱液储存室57和PCR缓冲室59相连；所述PCR缓冲室59通过微阀60和外泌体核酸收集口61相连；外泌体裂解液(用于核酸提取)储藏室44、核酸洗涤液A储存室51、核酸洗涤液B储存室54、核酸洗脱液储存室57分别与混匀腔45、52、55、58相连；混匀腔45、49、52、55、58分别通过微阀43、48、50、53和56与压力往复泵3相连。二级磁分离结构对不同流速的磁珠的分离效果如图12所示。
其工作原理和流程为：外泌体提取完成后，打开微阀43，在压力往复泵3的驱动下，将外泌体裂解液(用于核酸提取)储藏室44中的外泌体裂解液(用于核酸提取)泵入外泌体提取室(一级磁分离结构)4；依次打开磁驱混匀模块以及气动混匀模块进行磁珠磁驱再分散过程以及磁珠混匀过程，过程持续10min；打开外泌体提取室(一级磁分离结构)4和二级磁分离结构18下方磁驱混匀模块的电磁铁，进行磁分离，磁分离时间为1min；打开微阀46，将外泌体裂解液(用于核酸提取)泵入核酸捕获磁珠储存室47；打开微阀48，在压力往复泵3的驱动下，外泌体裂解液(用于核酸提取)与核酸捕获磁珠在核酸捕获磁珠储存室47和混匀腔49混匀，混匀5min，完成外泌体核酸的捕获过程；打开核酸捕获磁珠储存室47下方的电磁铁，进行磁分离，磁分离时间为1min，将反应液通过混匀腔49、微阀48吸入压力往复泵3充当废液槽的压力往复泵的底层86中，完成磁分离过程；关闭微阀48，打开微阀50，将核酸洗涤液A储存室51中的核酸洗涤液A通过压力往复泵3泵入核酸捕获磁珠储存室47中，在磁驱部件77和气动混匀模块VI的协助下完成核酸捕获磁珠的第一次洗涤过程；关闭微阀50，打开微阀53，重复个过程完成核酸捕获磁珠的第二次洗涤过程；关闭微阀53，打开微阀56，将核酸洗脱液储存室57中的核酸洗脱液泵入核酸捕获磁珠储存室47中，在磁驱部件77的协助下，完成核酸捕获磁珠的再分散过程，在气动混匀模块VI的协助下完成核酸捕获磁珠的混匀过程；打开核酸捕获磁珠储存室47下方磁驱部件77的电磁铁，磁分离1min，将洗脱液泵入PCR缓冲室59，即可完成外泌体核酸的提取过程。根据需求打开微阀60，从外泌体核酸收集口61收集外泌体核酸或直接继续进行外泌体核酸检测。
将提取的外泌体核酸进行Agilent 2100检测，检测结果如图18A和18B所示，提取的外泌体核酸(RNA)的大小在1～1000nt之间，提取的是外泌体的全部RNA(包括miRNA，mRNA等)，比东南大学申请的《一种外泌体内肿瘤标志miRNA的分离和检测系统及方法》(申请号：201910064022.7)中miRNA(19～24nt)具有更大的范围；本发明提取的外泌体尺寸范围与外泌体提取的金标准差速离心法相一致，且提取的核酸浓度为1513pg/μL，比差速离心法的869pg/μL提高了74％。
为了更严谨地证明外泌体核酸提取模块提取的核酸来自于外泌体而不是来自于游离的核酸，我们在外泌体洗涤液储存室8中的外泌体洗涤液中加入RNA酶，其他反应条件不变，反应结果如图18A和18C所示。由于外泌体保存在囊泡结构里面，RNA酶无法对囊泡内的RNA进行反应，但会对样本中游离的RNA进行反应。经过RNA酶处理后，提取的核酸片段的大小，浓度均没有明显改变，这表明通过外泌体核酸提取模块提取的核酸来自于有囊泡结构保护的外泌体，有效排除了非外泌体核酸的干扰。
实施例8
如图6所示，外泌体核酸检测模块V包括压力往复泵3、PCR缓冲室59、微阀62、PCR反应液A储藏室63、混匀腔64、微阀65、PCR反应液B储藏室66、混匀腔67、微阀68、引物探针A储藏室69、混匀腔70、微阀71、引物探针B储藏室72、混匀腔73、微阀74、PCR室75和混匀腔76。所述PCR缓冲室59与PCR反应液A储藏室63、PCR反应液B储藏室66、引物探针A储藏室69、引物探针B储藏室72和PCR室75相连；PCR室75、PCR反应液A储藏室63、PCR反应液B储藏室66、引物探针A储藏室69、引物探针B储藏室72和混匀腔76、64、67、70、73相连；混匀腔76、64、67、70、73通过微阀74、62、65、68、71和压力往复泵3相连。
其工作原理和流程为：打开微阀62，在压力往复泵3的驱动下，将PCR反应液A储藏室63中的PCR反应液A泵入PCR缓冲室59；关闭微阀62，打开微阀65，在压力往复泵3的驱动下，将PCR反应液B储藏室66中的PCR反应液B泵入PCR缓冲室59；关闭微阀65，打开微阀68，在压力往复泵3的驱动下，将引物探针A储藏室69中的引物探针A泵入PCR缓冲室59；关闭微阀68，打开微阀71，在压力往复泵3的驱动下，将引物探针B储藏室72中的引物探针B泵入PCR缓冲室59；关闭微阀71，打开微阀74，在压力往复泵3的驱动下，使PCR反应的混合液在PCR室75和PCR缓冲室59之间混匀；混匀1min后，将PCR反应的混合液泵入PCR室75中，并通过PCR室75下方的PCR装置进行qPCR的反应与检测。
将合成的B2M_Primer_Probe引物探针作为引物探针A，合成的LALBA_Primer_Probe引物探针作为引物探针B按照上述流程进行外泌体核酸的qPCR检测过程，每个过程进行8次重复，检测结果如图19A和19B所示，外泌体核酸检测模块可以进行外泌体核酸的检测，且外泌体提取、外泌体核酸提取以及外泌体核酸检测全过程的CV<2％。
实施例9
如图1～图9所示，外泌体提取和检测用微流控系统包括外泌体提取模块I、外泌体蛋白提取模块II、外泌体蛋白化学发光检测模块III、外泌体核酸提取模块IV、外泌体核酸检测模块V、气动混匀模块VI、加样口1、微阀2、压力往复泵3、外泌体提取室(一级磁分离结构)4、外泌体捕获磁珠储存室5、混匀腔6、微阀7、外泌体洗涤液储存室8、混匀腔9、微阀10、外泌体洗脱液储藏室11、混匀腔12、微阀13、外泌体收集口14、微阀15、外泌体裂解液(用于蛋白提取)储藏室16、混匀腔17、二级磁分离结构18、微阀19、微阀20、外泌体蛋白收集口21、化学发光捕获磁珠储存室22、微阀23、混匀腔24、微阀25、化学发光洗涤液储藏室A26、混匀腔27、微阀28、AE(吖啶酯)标记的抗体储藏室29、混匀腔30、微阀31、化学发光洗涤液储藏室B32、混匀腔33、微阀34、预激发液储藏室35、混匀腔36、微阀37、微阀38、化学发光检测孔39、激发液储藏室40、混匀腔41、混匀腔42、微阀43、外泌体裂解液(用于核酸提取)储藏室44、混匀腔45、微阀46、核酸捕获磁珠储存室47、微阀48、混匀腔49、微阀50、核酸洗涤液A储存室51、混匀腔52、微阀53、核酸洗涤液B储存室54、混匀腔55、微阀56、核酸洗脱液储存室57、混匀腔58、PCR缓冲室59、微阀60、外泌体核酸收集口61、微阀62、PCR反应液A储藏室63、混匀腔64、微阀65、PCR反应液B储藏室66、混匀腔67、微阀68、引物探针A储藏室69、混匀腔70、微阀71、引物探针B储藏室72、混匀腔73、微阀74、PCR室75、混匀腔76、磁驱混匀组件77、外泌体提取和检测用微流控系统78、微阀打开的微通道79、微阀关闭的微通道80、打开状态的微阀驱动器81、关闭状态的微阀驱动器82、微阀驱动器的整体示意简图83、压力往复泵的整体结构84、压力往复泵的驱动器85、压力往复泵的底层86、压力往复泵的中间层87、压力往复泵与微通道连接的中间层88、压力往复泵的顶层89、压力往复泵在中间层88上的位置90、压力往复泵在中间层87上的位置91、与压力往复泵连接的微通道92。
其外泌体及其蛋白质的提取检测一体化、自动化过程的工作原理和流程为：以1mL血浆样本为例，打开微阀2，在加样口1加入1mL血浆样本，关闭微阀2，打开微阀6，挤压压力往复泵3将外泌体捕获磁珠储存室5中的磁珠对压力往复泵3反复施加或释放压力，使外泌体捕获磁珠与血浆样本在外泌体提取室(一级磁分离结构)4、外泌体捕获磁珠储存室5以及混匀腔6之间往复运动，进行外泌体的孵育过程；孵育15～30min后，打开外泌体提取室(一级磁分离结构)4下方的磁驱混匀模块，进行磁分离，磁分离时间为1min，将磁分离后的上清通过外泌体捕获磁珠储存室5、混匀腔6和微阀37吸入压力往复泵3充当废液槽的压力往复泵的底层86中，完成磁分离过程；关闭，打开微阀7，将外泌体洗涤液储存室8中的洗涤液以160μL/min的速度注射入外泌体提取室(一级磁分离结构)4，依次打开磁驱混匀模块以及气动混匀模块进行磁珠磁驱再分散过程以及磁珠混匀过程；洗涤1min，将洗涤完成后的磁珠再进行磁分离，并打开微阀10，将外泌体洗脱液储藏室11中的外泌体洗脱液注射入外泌体提取室(一级磁分离结构)4，依次打开磁驱混匀模块以及气动混匀模块进行磁珠磁驱再分散过程以及磁珠混匀过程；打开微阀13，将洗脱的外泌体通过压力往复泵3泵入外泌体收集口14收集外泌体或打开微阀15，在压力往复泵3的驱动下，将外泌体裂解液(用于蛋白提取)储藏室16中的外泌体裂解液(用于蛋白提取)泵入外泌体提取室(一级磁分离结构)4；依次打开磁驱混匀模块以及气动混匀模块进行磁珠磁驱再分散过程以及磁珠混匀过程；打开外泌体提取室(一级磁分离结构)4和二级磁分离结构18下方磁驱混匀模块的电磁铁，进行磁分离，磁分离时间为1min；打开微阀19、微阀20，将外泌体裂解液(用于蛋白提取)泵入外泌体蛋白收集口21收集外泌体裂解液(用于蛋白提取)或将通过外泌体蛋白提取模块II提取的外泌体裂解液(用于蛋白提取)泵入化学发光捕获磁珠储存室22，与化学发光捕获磁珠储存室22储存的化学发光捕获磁珠进行外泌体蛋白的进行特异性捕获；打开微阀23，在压力往复泵3的驱动、混匀腔24的配合下，进行的外泌体裂解液(用于蛋白提取)和化学发光捕获磁珠的混匀过程，提高孵育效率。孵育15min后，打开启动磁驱部件77下方的电磁铁，磁分离1min；将反应液通过混匀腔24、微阀23吸入压力往复泵3充当废液槽的压力往复泵的底层86中，完成磁分离过程；关闭微阀23，打开微阀25，在压力往复泵3的驱动下，将化学发光洗涤液储藏室A 26中的化学发光洗涤液泵入化学发光捕获磁珠储存室22中，与捕获完特异性抗体的化学发光捕获磁珠进行洗涤，在磁驱部件77和气动混匀模块VI的协助下完成化学发光捕获磁珠的第一次洗涤过程；关闭微阀25，打开微阀28，将AE(吖啶酯)标记的抗体储藏室29中的化学发光洗涤液泵入化学发光捕获磁珠储存室22中，进行标记抗体的孵育过程；孵育5min后，打开启动磁驱部件77下方的电磁铁，磁分离1min；将反应液通过混匀腔30、微阀28吸入压力往复泵3充当废液槽的压力往复泵的底层86中，完成磁分离过程；关闭微阀28，打开微阀31，在压力往复泵3的驱动下，将化学发光洗涤液储藏室B 32中的化学发光洗涤液泵入化学发光捕获磁珠储存室22中，与标记完特异性抗体的化学发光捕获磁珠进行洗涤，在磁驱部件77和气动混匀模块VI的协助下完成化学发光捕获磁珠的第二次洗涤过程；关闭微阀31，打开微阀34，在压力往复泵3的驱动下，将预激发液储藏室35中的预激发液泵入化学发光捕获磁珠储存室22中，在压力往复泵3的驱动、混匀腔36的配合下，进行的预激发液和化学发光捕获磁珠的混匀过程，提高孵育效率；孵育2min后，将预激发液和化学发光捕获磁珠在压力往复泵3的驱动下泵入化学发光检测孔39；关闭微阀34，打开微阀38，在压力往复泵3的驱动下将激发液储藏室40中的激发液泵入化学发光检测孔39，关闭微阀38，打开微阀25，在压力往复泵3的协助下，反应液化学发光检测孔39和混匀腔42之间在完成混匀过程，并对化学发光检测孔39中的反应液进行化学发光检测。通过以上过程实现外泌体及其蛋白质的提取检测一体化过程。
其外泌体及其核酸的提取检测一体化、自动化过程的工作原理和流程为：以1mL血浆样本为例，打开微阀2，在加样口1加入1mL血浆样本，关闭微阀2，打开微阀6，挤压压力往复泵3将外泌体捕获磁珠储存室5中的磁珠对压力往复泵3反复施加或释放压力，使外泌体捕获磁珠与血浆样本在外泌体提取室(一级磁分离结构)4、外泌体捕获磁珠储存室5以及混匀腔6之间往复运动，进行外泌体的孵育过程；孵育15～30min后，打开外泌体提取室(一级磁分离结构)4下方的磁驱混匀模块，进行磁分离，磁分离时间为1min，将磁分离后的上清通过外泌体捕获磁珠储存室5、混匀腔6和微阀37吸入压力往复泵3充当废液槽的压力往复泵的底层86中，完成磁分离过程；关闭，打开微阀7，将外泌体洗涤液储存室8中的洗涤液以160μL/min的速度注射入外泌体提取室(一级磁分离结构)4，依次打开磁驱混匀模块以及气动混匀模块进行磁珠磁驱再分散过程以及磁珠混匀过程；洗涤1min，将洗涤完成后的磁珠再进行磁分离，并打开微阀10，将外泌体洗脱液储藏室11中的外泌体洗脱液注射入外泌体提取室(一级磁分离结构)4，依次打开磁驱混匀模块以及气动混匀模块进行磁珠磁驱再分散过程以及磁珠混匀过程；打开微阀13，将洗脱的外泌体通过压力往复泵3泵入外泌体收集口14收集外泌体或打开微阀43，在压力往复泵3的驱动下，将外泌体裂解液(用于核酸提取)储藏室44中的外泌体裂解液(用于核酸提取)泵入外泌体提取室(一级磁分离结构)4；依次打开磁驱混匀模块以及气动混匀模块进行磁珠磁驱再分散过程以及磁珠混匀过程，过程持续10min；打开外泌体提取室(一级磁分离结构)4和二级磁分离结构18下方磁驱混匀模块的电磁铁，进行磁分离，磁分离时间为1min；打开微阀46，将外泌体裂解液(用于核酸提取)泵入核酸捕获磁珠储存室47；打开微阀48，在压力往复泵3的驱动下，外泌体裂解液(用于核酸提取)与核酸捕获磁珠在核酸捕获磁珠储存室47和混匀腔49混匀，混匀5min，完成外泌体核酸的捕获过程；打开核酸捕获磁珠储存室47下方的电磁铁，进行磁分离，磁分离时间为1min，将反应液通过混匀腔49、微阀48吸入压力往复泵3充当废液槽的压力往复泵的底层86中，完成磁分离过程；关闭微阀48，打开微阀50，将核酸洗涤液A储存室51中的核酸洗涤液A通过压力往复泵3泵入核酸捕获磁珠储存室47中，在磁驱部件77和气动混匀模块VI的协助下完成核酸捕获磁珠的第一次洗涤过程；关闭微阀50，打开微阀53，重复个过程完成核酸捕获磁珠的第二次洗涤过程；关闭微阀53，打开微阀56，将核酸洗脱液储存室57中的核酸洗脱液泵入核酸捕获磁珠储存室47中，在磁驱部件77的协助下，完成核酸捕获磁珠的再分散过程，在气动混匀模块VI的协助下完成核酸捕获磁珠的混匀过程；打开核酸捕获磁珠储存室47下方磁驱部件77的电磁铁，磁分离1min，将洗脱液泵入PCR缓冲室59，即可完成外泌体核酸的提取过程。根据需求打开微阀60，从外泌体核酸收集口61收集外泌体核酸或打开微阀62，在压力往复泵3的驱动下，将PCR反应液A储藏室63中的PCR反应液A泵入PCR缓冲室59；关闭微阀62，打开微阀65，在压力往复泵3的驱动下，将PCR反应液B储藏室66中的PCR反应液B泵入PCR缓冲室59；关闭微阀65，打开微阀68，在压力往复泵3的驱动下，将引物探针A储藏室69中的引物探针A泵入PCR缓冲室59；关闭微阀68，打开微阀71，在压力往复泵3的驱动下，将引物探针B储藏室72中的引物探针B泵入PCR缓冲室59；关闭微阀71，打开微阀74，在压力往复泵3的驱动下，使PCR反应的混合液在PCR室75和PCR缓冲室59之间混匀；混匀1min后，将PCR反应的混合液泵入PCR室75中，进行PCR反应，并通过PCR室75下方的检测器进行qPCR检测。通过以上过程实现外泌体核酸的提取检测一体化过程。
综上，通过本发明的外泌体提取和检测用微流控系统可以实现外泌体及其核酸、蛋白的提取检测一体化、自动化。
专业人员还可以进一步意识到，结合本文中所公开的实施例描述的各示例的单元及算法步骤，能够以电子硬件、计算机软件或者二者的结合来实现，为了清楚地说明硬件和软件的可互换性，在上述说明中已经按照功能一般性地描述了各示例的组成及步骤。这些功能究竟以硬件还是软件方式来执行，取决于技术方案的特定应用和设计约束条件。专业技术人员可以对每个特定的应用来使用不同方法来实现所描述的功能，但是这种实现不应认为超出本申请的范围。
结合本文中所公开的实施例描述的方法或算法的步骤可以直接用硬件、处理器执行的软件模块，或者二者的结合来实施。软件模块可以置于随机存储器(RAM)、内存、只读存储器(ROM)、电可编程ROM、电可擦除可编程ROM、寄存器、硬盘、可移动磁盘、CD-ROM、或技术领域内所公知的任意其它形式的存储介质中。
以上对本申请所提供的一种外泌体提取和检测用微流控系统、消息处理装置进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以对本申请进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本申请权利要求的保护范围内。

Claims (14)

1.一种外泌体提取和检测用微流控系统，其特征在于，所述微流控系统具有外泌体提取模块、外泌体核酸提取模块、外泌体核酸检测模块、外泌体蛋白提取模块、外泌体蛋白化学发光检测模块和气动混匀模块。
2.如权利要求1所述外泌体提取和检测用微流控系统，其特征在于所述外泌体蛋白提取模块通过微通道与微阀连接在外泌体提取模块和外泌体蛋白化学发光检测模块上；外泌体核酸提取模块通过微通道与微阀连接在外泌体提取模块和外泌体核酸检测模块上；所述气动混匀模块连接在外泌体提取模块、外泌体蛋白提取模块、外泌体蛋白化学发光检测模块、外泌体核酸提取模块以及外泌体核酸检测模块上，通过在压力往复泵的驱动以及混匀腔的配合下实现反应液的混匀、孵育过程。
3.根据权利要求2所述的外泌体提取和检测用微流控系统，其特征在于，所述微流控系统还包括磁驱混匀模块，所述磁驱混匀模块包括磁驱部件、外泌体提取室(一级磁分离结构)、二级磁分离结构、核酸捕获磁珠储存室、化学发光捕获磁珠储存室以及相应的磁珠；所述磁驱部件由相对的电磁铁构成，电磁铁固定安装或者安装在轨道上，可以在一定范围内往复移动、圆周运动；所述磁驱部件安装在外泌体提取室、二级磁分离结构、核酸捕获磁珠储存室以及化学发光捕获磁珠储存室的外侧的相对方，所述磁珠在外泌体提取室(一级磁分离结构)、二级磁分离结构、核酸捕获磁珠储存室以及化学发光捕获磁珠储存室的腔体内。
4.根据权利要求1-3所述的外泌体提取和检测用微流控系统，其特征在于，所述气动混匀模块包括压力往复泵、混匀腔、微通道和微阀，其中混匀腔通过微通道与压力往复泵相连接，微阀安置于混匀腔与压力往复泵之间的微通道上；所述气动混匀模块置于所述微流控系统内部。
5.根据权利要求4所述的外泌体提取和检测用微流控系统，其特征在于，所述压力往复泵为多层结构，所述微通道与所述压力往复泵的上层相连，吸入的反应液流入所述压力往复泵的下层，所述压力往复泵的下层与废液池相连，所述废液池置于所述微流控系统内。
6.根据权利要求1-3所述的外泌体提取和检测用微流控系统，其特征在于，所述外泌体提取模块包括外泌体捕获磁珠、外泌体捕获磁珠加样口、微阀、压力往复泵、外泌体提取室(一级磁分离结构)、外泌体捕获磁珠储存室、混匀腔、外泌体洗涤液储存室、外泌体洗脱液储藏室、以及外泌体收集口；所述外泌体捕获磁珠储存室、外泌体洗涤液储存室和外泌体洗脱液储藏室连接在外泌体提取室(一级磁分离结构)上；所述加样口和外泌体收集口通过微阀与外泌体提取室(一级磁分离结构)相连；所述外泌体捕获磁珠储存室、外泌体洗涤液储存室和外泌体洗脱液储藏室分别通过混匀腔和微阀与压力往复泵相连。
7.根据权利要求1-3所述的外泌体提取和检测用微流控系统，其特征在于，所述外泌体核酸提取模块包括：压力往复泵、外泌体提取室(一级磁分离结构)、二级磁分离结构、微阀、外泌体裂解液(用于核酸提取)储藏室、混匀腔、核酸捕获磁珠储存室、核酸洗涤液储存室、核酸洗脱液储存室、PCR缓冲室、外泌体核酸收集口。所述外泌体提取室(一级磁分离结构)与外泌体裂解液(用于核酸提取)储藏室和二级磁分离结构相连；所述核酸捕获磁珠储存室与二级磁分离结构、混匀腔、核酸洗涤液储存室、核酸洗脱液储存室和PCR缓冲室相连；所述PCR缓冲室通过微阀和外泌体核酸收集口相连；外泌体裂解液(用于核酸提取)储藏室、核酸洗涤液储存室、核酸洗脱液储存室分别与混匀腔相连；混匀腔分别通过微阀与压力往复泵相连。
8.根据权利要求1-3所述的外泌体提取和检测用微流控系统，其特征在于，所述外泌体核酸检测模块包括外泌体核酸检测模块包括压力往复泵、PCR室、PCR缓冲室、微阀、PCR反应液储藏室、混匀腔、引物探针储藏室；所述PCR缓冲室与PCR反应液储藏室、引物探针储藏室和PCR室相连；PCR室、PCR反应液储藏室、引物探针储藏室和混匀腔相连；混匀腔通过微阀和压力往复泵相连。
9.根据权利要求1-3所述的外泌体提取和检测用微流控系统，其特征在于，所述外泌体蛋白提取模块还包括压力往复泵、外泌体提取室(一级磁分离结构)、微阀、外泌体裂解液(用于蛋白提取)储藏室、混匀腔、二级磁分离结构以及外泌体蛋白收集口；所述外泌体裂解液(用于蛋白提取)储藏室和二级磁分离结构与外泌体提取室(一级磁分离结构)相连；所述外泌体裂解液(用于蛋白提取)储藏室与混匀腔、微阀以及压力往复泵相连；所述二级磁分离结构与微阀以及外泌体蛋白收集口相连。
10.根据权利要求1-3所述的外泌体提取和检测用微流控系统，其特征在于，所述外泌体蛋白化学发光检测模块还包括压力往复泵、微阀、混匀腔、化学发光洗涤液储藏室、AE(吖啶酯)标记的抗体储藏室、预激发液储藏室、激发液储藏室、化学发光检测孔、磁驱部件；所述混匀腔、化学发光洗涤液储藏室、AE(吖啶酯)标记的抗体储藏室、预激发液储藏室与化学发光捕获磁珠储存室相连；所述激发液储藏室和混匀腔与化学发光检测孔相连；所述化学发光检测孔与化学发光捕获磁珠储存室相连；所述混匀腔一端与化学发光洗涤液储藏室、AE(吖啶酯)标记的抗体储藏室、化学发光洗涤液储藏室、预激发液储藏室、激发液储藏室相连，另一端与微阀相连，微阀与压力往复泵相连。
11.根据权利要求4-10所述的外泌体提取和检测用微流控系统，其特征在于，所述混匀腔的容积为10～500μL。
12.根据权利要求4-10所述的外泌体提取和检测用微流控系统，其特征在于，所述微阀由软腔室和压力控制指针组成，软腔室与微通道相连，压力控制指针在软腔室上方，当压力控制指针不对软腔室施加压力的情况下，微阀保持打开状态，当压力控制指针对软腔室施加压力的情况下，微阀保持关闭状态。
13.根据权利要求1-3所述的外泌体提取和检测用微流控系统，其特征在于将所述各模块集成在一张芯片上。
14.一种利用权利要求1-10所述的外泌体提取和检测用微流控系统进行外泌体及其内容物的提取和检测的方法如下：
步骤1，外泌体自动化的提取：样品由加样口加入，进入外泌体提取室，在气动混匀模块的协助下，利用外泌体捕获磁珠完成外泌体的捕获过程；在气动混匀模块以及磁驱混匀模块的共同协助下完成外泌体的洗涤纯化过程；将所得的外泌体由外泌体收集口取出或进一步进行外泌体核酸提取、蛋白提取操作。
步骤2，外泌体蛋白的自动化提取：将步骤1中得到的外泌体在气动混匀模块的协助下用外泌体裂解液(用于蛋白提取)进行裂解，并在磁驱混匀模块的作用下去除外泌体裂解液中多余的磁珠；将得到的外泌体裂解液(用于蛋白提取)在外泌体蛋白收集口进行收集或进一步进行外泌体蛋白的化学发光检测。
步骤3，外泌体蛋白的自动化化学发光检测：将步骤2中得到的外泌体裂解液(用于蛋白提取)与化学发光捕获磁珠混匀，在气动混匀模块以及磁驱混匀模块的共同协助下，完成化学发光捕获磁珠对外泌体蛋白的捕获过程、AE(吖啶酯)标记的抗体对检测抗原的识别过程以及化学发光激发及检测过程。
步骤4，外泌体核酸的自动化提取：将步骤1中得到的外泌体在气动混匀模块的协助下用外泌体裂解液(用于核酸提取)进行裂解，并在磁驱混匀模块的作用下去除外泌体裂解液中多余的磁珠；将得到的外泌体裂解液(用于核酸提取)通过压力往复泵驱动入外泌体核酸捕获磁珠储存室，并在气动混匀模块以及磁驱混匀模块的共同协助下完成外泌体核酸的捕获，洗涤和洗脱过程；将所得的外泌体核酸在外泌体核酸收集口收集或进一步进行外泌体核酸自动化检测过程。
步骤5，外泌体核酸的自动化检测过程：在气动混匀模块的协助下将PCR的反应液与外泌体的核酸进行混匀反应过程，并在外置的加热模块和检测探头的协助下完成外泌体核酸的PCR以及检测过程。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113005033A (zh) * 2021-02-24 2021-06-22 清华大学 生物样品中外泌体和细胞的捕获分离装置及捕获分离方法
CN113025480A (zh) * 2021-03-05 2021-06-25 北京凯祥弘康生物科技有限公司 一种有效富集血液中神经源性外泌体的自动化设备
CN113049552A (zh) * 2021-03-07 2021-06-29 天津大学 基于外泌体检测和单分子荧光漂白技术的muc1蛋白定量检测方法
CN113042121A (zh) * 2021-03-26 2021-06-29 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 用于外泌体核酸检测的一体化芯片及检测方法和应用
WO2022242549A1 (zh) * 2021-05-16 2022-11-24 深圳市品学优技术有限公司 一种反应及其驱动装置
CN115895879A (zh) * 2023-01-04 2023-04-04 北京金诺美科技股份有限公司 一种基于膜吸附法的核酸提取卡盒

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090148847A1 (en) * 2006-03-15 2009-06-11 Micronics, Inc. Rapid magnetic flow assays
CN103861668A (zh) * 2012-12-17 2014-06-18 中国科学院沈阳自动化研究所 一种基于气动微泵和微混合器的微流控芯片
WO2017087940A1 (en) * 2015-11-20 2017-05-26 University Of Kansas Non-invasive monitoring cancer using integrated microfluidic profiling of circulating microvesicles
CN109459571A (zh) * 2018-11-08 2019-03-12 浙江大学 基于微流控和化学发光免疫分析的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统及其应用
CN109628277A (zh) * 2019-01-23 2019-04-16 东南大学 一种外泌体内肿瘤标志miRNA的分离和检测系统及方法
CN109655608A (zh) * 2018-12-13 2019-04-19 杭州多泰科技有限公司 一种用于骨肉瘤诊断的外泌体蛋白及其即时检测方法
CN110560186A (zh) * 2019-08-28 2019-12-13 国家纳米科学中心 使用微流控芯片合成生物膜纳米颗粒的方法及微流控芯片

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090148847A1 (en) * 2006-03-15 2009-06-11 Micronics, Inc. Rapid magnetic flow assays
CN103861668A (zh) * 2012-12-17 2014-06-18 中国科学院沈阳自动化研究所 一种基于气动微泵和微混合器的微流控芯片
WO2017087940A1 (en) * 2015-11-20 2017-05-26 University Of Kansas Non-invasive monitoring cancer using integrated microfluidic profiling of circulating microvesicles
CN109459571A (zh) * 2018-11-08 2019-03-12 浙江大学 基于微流控和化学发光免疫分析的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统及其应用
CN109655608A (zh) * 2018-12-13 2019-04-19 杭州多泰科技有限公司 一种用于骨肉瘤诊断的外泌体蛋白及其即时检测方法
CN109628277A (zh) * 2019-01-23 2019-04-16 东南大学 一种外泌体内肿瘤标志miRNA的分离和检测系统及方法
CN110560186A (zh) * 2019-08-28 2019-12-13 国家纳米科学中心 使用微流控芯片合成生物膜纳米颗粒的方法及微流控芯片

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113005033A (zh) * 2021-02-24 2021-06-22 清华大学 生物样品中外泌体和细胞的捕获分离装置及捕获分离方法
CN113025480A (zh) * 2021-03-05 2021-06-25 北京凯祥弘康生物科技有限公司 一种有效富集血液中神经源性外泌体的自动化设备
CN113025480B (zh) * 2021-03-05 2022-02-11 北京凯祥弘康生物科技有限公司 一种有效富集血液中神经源性外泌体的自动化设备
WO2022184135A1 (zh) * 2021-03-05 2022-09-09 北京尔瑞鑫悦科技有限公司 一种有效富集血液中神经源性外泌体的自动化设备
CN113049552A (zh) * 2021-03-07 2021-06-29 天津大学 基于外泌体检测和单分子荧光漂白技术的muc1蛋白定量检测方法
CN113049552B (zh) * 2021-03-07 2022-08-05 天津大学 基于外泌体检测和单分子荧光漂白技术的muc1蛋白定量检测方法
CN113042121A (zh) * 2021-03-26 2021-06-29 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 用于外泌体核酸检测的一体化芯片及检测方法和应用
WO2022242549A1 (zh) * 2021-05-16 2022-11-24 深圳市品学优技术有限公司 一种反应及其驱动装置
CN115895879A (zh) * 2023-01-04 2023-04-04 北京金诺美科技股份有限公司 一种基于膜吸附法的核酸提取卡盒

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