CN113004515A - 一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物，属于生物医药技术领域，所述衍生物为PAsp[DET‑DBCO(‑ss‑siRNA)&CDM]；本发明还公开了上述衍生物的制备方法，其步骤包括：通过BLA‑NCA单体的开环聚合，合成PBLA，将DET与PBLA反应得到PAsp（DET），对PAsp（DET）进一步修饰，在其侧链上依次引入磺胺‑DBCO‑NHS和羧二甲基马来酸酐，得到PAsp[DET‑DBCO&CDM]，通过PAsp[DET‑DBCO&CDM]和5'‑氨基siRNA与N3‑PEG3‑NHS的连接物反应，得到目标大分子PAsp[DET‑DBCO(‑ss‑siRNA)&CDM]；本发明提供了一种降甲状旁腺激素的新途径，实现从源头上阻断合成甲状旁腺激素的基因表达，降甲状旁腺作用效果好；另外，本发明所合成的衍生物，从作用机制上讲，对电解质也不影响，不会导致高钙、高磷、低钙等，因此可以达到单药有效控制甲状旁腺激素的效果。

Description

一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物、其制备方法及其应用。
背景技术
继发性甲状旁腺功能亢进(secondary hyperparathyroidism，SHPT)是慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)的常见并发症，其突出表现就是高甲状旁腺血症，是CKD患者发生心血管事件与死亡的重要因素。目前SHPT的主要药物为活性维生素D，但容易导致高磷、高钙血症，增加血管钙化风险。钙敏感受体(calcium sensing receptor，CaSR)激动剂(如目前上市的西那卡塞)也被用于治疗SHPT，主要的不良反应是低钙血症，因此临床上两者经常联合使用。
发明内容
本发明的目的之一，就在于提供一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物，以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物，所述衍生物为PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]，其具有如下式所示的结构：
Figure BDA0002958632880000021
上述结构式中，15≤x≤17，93≤y≤95。
本发明的目的之二，在于提供上述的仿透明质酸聚氨基酸衍生物的制备方法，采用的技术方案为，包括以下步骤：
(1)在引发剂作用下，通过BLA-NCA单体的开环聚合，合成聚β-苄基-L-天冬氨酸，即PBLA；
(2)将步骤(1)所得的PBLA溶解于溶剂中得到PBLA溶剂，然后将二乙基甲苯(即DET)在惰性气体环境下添加到PBLA溶剂中，搅拌反应，然后进行后处理，得到聚{N-[N'-(2-氨基乙基)-2-氨基乙基]天冬酰胺}，即PAsp(DET)；
(3)将步骤(2)所得的PAsp(DET)进一步修饰，在其侧链上依次引入磺胺-dbco-nhs和羧二甲基马来酸酐，得到PAsp[DET-DBCO&CDM]；
(4)将5'-氨基siRNA在缓冲液中与N3-PEG3-NHS混合反应，然后加入步骤(3)所得的PAsp[DET-DBCO&CDM]，透析，即得PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]。
作为优选的技术方案：步骤(1)中，所述引发剂为正丁胺，所述溶剂为二甲基甲酰胺(即DMF)，所述惰性气体为氩气。
作为优选的技术方案：步骤(2)中，反应温度为4℃，反应时间为24h。
作为优选的技术方案：步骤(2)中，所述后处理方法为：将反应混合物倒入乙酸溶液中，并依次用HCl溶液和蒸馏水透析，然后冻干。
作为优选的技术方案：步骤(3)中，引入磺胺-DBCO-NHS的具体方法为：将PAsp(DET)溶于缓冲液中得到PAsp(DET)缓冲溶液；将二苯基环辛炔-磺基-琥珀酰亚胺酯(即Sulfo-DBCO-NHS)溶解于溶液中，然后加入到PAsp(DET)缓冲溶液中，搅拌反应，得到磺基DBCO共轭PAsp(DET)溶液。
作为优选的技术方案：步骤(3)中，引入羧二甲基马来酸酐的具体方法为：将羧二甲基马来酸酐溶解于溶液中，加入到磺基DBCO共轭PAsp(DET)溶液中，搅拌反应，然后进行后处理，即得。
本发明的目的之二，在于提供上述的仿透明质酸聚氨基酸衍生物的应用，具体而言，所述衍生物用于降甲状旁腺激素。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过合成仿透明质酸聚氨基酸衍生物PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]，该大分子物质具有明显的跨细胞膜转运功能，能将甲状旁腺激素mRNA的特异性聚合RNAi转运至细胞内。在溶酶体的作用下，该大分子物质释放出RNAi，沉默细胞内甲状旁腺激素mRNA，从而发挥抑制甲状旁腺激素生成的作用；本发明通过阻断甲状旁腺激素mRNA的转录，从而达到有效抑制甲状旁腺激素的合成，目前未见到利用该作用机制发挥疗效的药物；本发明提供了一种降甲状旁腺激素的新途径，其优点在于从源头上阻断合成甲状旁腺激素的基因表达，降甲状旁腺作用效果好；本发明还通过对该大分子进行修饰，有效解决了跨细胞膜转运的问题，从而高效、精准的发挥作用；另外，本发明所合成的大分子，从机制上讲，对电解质也不影响，不会导致高钙、高磷、低钙等，因此可以达到单药有效控制甲状旁腺激素的效果。
附图说明
图1为本发明实施例1合成的PAsp(DET)在D2O中的1H-NMR谱；
图2为本发明实施例1合成的PAsp[DET-DBCO&CDM]的1H-NMR谱；
图3为本发明实施例2的基因敲除效率对比图；
图4为本发明实施例3的细胞活性对比图；
图5为本发明实施例4的细胞摄取结果图；
图6为本发明实施例5的抑制甲状旁腺激素功能结果图；
图7为本发明实施例6的pH和氧化还原响应功能；
图8为本发明实施例6的基于LDH检测的一类样品对细胞膜的破坏能力的估计；
图9为本发明实施例6的PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]或透明质酸与晚期核内体和溶酶体的定量共定位。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1：
一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物，所述衍生物为PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]，其具有如下式所示的结构：
Figure BDA0002958632880000051
上述结构式中，x+y＝110；x约为16，y约94。
本实施例例举上述衍生物的其中一种制备方法，其步骤包括：
(1)以正丁胺为引发剂，通过BLA-NCA单体的开环聚合，合成聚β-苄基-L-天冬氨酸(即PBLA)：
具体方法为：在氩气环境下，将醋酸酐正丁胺(50.0μL，0.506mmol)溶于二氯甲烷(5.0mL)中，然后将溶液添加到二甲基甲酰胺(即DMF，20.0mL)和二氯甲烷(200mL)混合溶剂中的β-苄基-L-天冬氨酸N-羧酸酐(即BLA-NCA，20.0g，80.2mmol)中，并在35℃搅拌48h；将反应溶液倒入乙醚中以沉淀PBLA；回收的PBLA溶解在二氯甲烷(1.25L)中；二氯甲烷蒸发后，PBLA溶解于苯中，冻干收集得到PBLA(11.93g，产率59％)；然后通过PBLA与二亚乙基三胺(即DETA)的氨解反应将氨基引入PBLA侧链，其反应式如下所示：
Figure BDA0002958632880000061
(2)PAsp(DET)的典型合成过程如下：
二乙基甲苯(即DET，13.1mL，121mmol)在氩气环境下添加到二甲基甲酰胺(即DMF，10.0mL)中的PBLA(500mg，24.9μmol)中，并在4℃下搅拌24小时；将反应混合物缓慢地倒入20％v/v乙酸(104mL)中，并依次用0.01N HCl溶液和蒸馏水透析；将最终溶液冻干以获得作为氯化物的聚{N-[N'-(2-氨基乙基)-2-氨基乙基]天冬酰胺}，即PAsp(DET)(461mg，69.3％产率)；
所得PAsp(DET)PAsp(DET)在D2O中的1H-NMR谱如图1所示，其侧链上的1,2-二氨基乙烷(PAsp(DET)：H2N(CH2)2NH(CH2)2NH2，δ＝3.1-3.5ppm)中的α链端丁基质子与亚甲基质子的峰强比证实了PBLA通过氨解反应定量转化为PAsp(DET)；
(3)合成PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)cdm]：将合成的聚{N-[N'-(2-氨基乙基)-2-氨基乙基]天冬酰胺}[PAsp(DET)](分子量:26000g/mol,PAsp(DET)段聚合度:108)进一步修饰，在其侧链上依次引入磺胺-dbco-nhs和羧二甲基马来酸酐(即CDM)，得到PAsp[DET-dbco(-ss-sirna)和CDM]，具体的：
PAsp(DET)(100mg,3.82μmol)溶于1M NaCl,0.5M NaHCO3缓冲液(pH9.0,50mL)，4℃；将Sulfo-DBCO-NHS(32.5mg,45.8μmol)溶解于1ml DMF中，加入到PAsp(DET)聚合物溶液中，4℃搅拌反应1h，将羧二甲基马来酸酐(386mg,2.1mmol)溶解于2ml乙醇中，加入到磺基DBCO共轭PAsp(DET)溶液中，在4℃下搅拌3h反应；用离心超滤(Amicon Ultra,MWCO:10,000；Millipore,Billerica,MA)在4℃下处理，最终溶液冻干得到PAsp[DET-DBCO&CDM]为白色粉末(120mg，收率66.4％)，其氢谱如图2所示；
然后，通过PAsp[DET-DBCO&CDM]和5'-氨基siRNA与N3-PEG3-NHS的连接物反应，实现siRNA的偶联：
将5'-氨基siRNA(200nmol)在2mM NaHCO3缓冲液(pH 9.0)中与叠氮PEG活性酯(即N3-PEG3-NHS，市购，商品型号：PS2-HAZ，上海芃硕生物科技有限公司)(200nmol)混合反应2h，然后加入PAsp[DET-DBCO&CDM]溶液(2mM NaHCO3,pH 9.0)；反应溶液在水中透析(12kDa)3次，冷冻干燥收集；
其中，5'-氨基siRNA，是可以定制的，甲状旁腺激素的合成所需要的mRNA都是已知可以查询的，对应的siRNA(小干扰RNA)序列也是已知的，具体的，5'-氨基siRNA的核苷酸序列为：5’-azido-CGA AGA UCA CCA AGU GCU AAU UdTdT-3’(sense),5’-AUA GCA CUU GGUGAU CUU CGU GdTdT-3’(antisense)；本实施例的5'-氨基siRNA是委托上海吉玛制药技术有限公司即吉玛基因合成得到的；
本实施例合成的PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]的化学描述见表1
表1PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]的化学描述
Figure BDA0002958632880000071
Figure BDA0002958632880000081
需要说明的是：上述的制备方法，仅仅是众多实施参数中较为优选的一种，所采用的物质的浓度、所采用的溶剂、辅助化合物的种类和浓度、反应、处理的温度和时间，都可以在本领域技术人员普遍知晓的范围内调整，其调整仅仅会影响收率、制备效率等，凡是能实现本发明的制备方法的各种调整和变换，均在本发明的保护范围内。
实施例2：
基因敲除试验：
将甲状旁腺细胞接种于24孔培养板(20,000个/孔)，加入含有10％胎牛血清和1％抗生素(青霉素和链霉素)的400μl DMEM，在37℃、5％CO2的湿气氛中孵育；孵育24h后，用400μl的新鲜培养基替换培养液，加入siRNA配方溶液；孵育24h后，用新鲜培养基替换培养基，再孵育24h；冷冻PBS洗3次，加入200μl的新鲜培养基。再用150μl细胞培养裂解液37℃裂解15min；随后，20μl细胞溶解产物被转移到96孔的光度板,每孔加入100μl荧光素酶检测试剂(Promega,Madison,WI)，反应15min。使用Mithras LB 940(Berthold Technologies,BadWildbad,Germany)，根据光致发光强度测定10秒钟。使用Micro BCATMprotein Assay Kit(Pierce,Rockford,IL)定量细胞裂解液中总蛋白的数量。数据以每毫克蛋白质的相对轻单位(RLU)表示(n＝6)，
结果如图3所示，图3中，“衍生物”是指实施例合成得到的PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]，试液浓度单位均为“mg/ml”；从图3中可看出，PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]是基因敲除效率随着剂量增加，最高可达到90％左右，并且，PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]的基因敲除效率明显高于其他现有的商业试剂。
实施例3：
安全性实验：细胞活性测定
将甲状旁腺细胞接种于24孔培养板(20,000个/孔)，加入含有10％胎牛血清和1％抗生素(青霉素和链霉素)的400μl DMEM，在37℃、5％CO2的湿气氛中孵育；孵育24h后，用400μl的新鲜培养基替换培养液，加入siRNA配方溶液；孵育24h后，用新鲜培养基替换培养基，再孵育24h；冷冻PBS洗3次，加入200μl的新鲜培养基。使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(日本熊本市，Dojindo)，将活细胞脱氢酶活性还原为WST-8－formazan，以2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2h-四唑(WST-8)来评估细胞活力。简而言之，在每孔中加入20μl CCK-8试剂，使其显色为橙色的WST-8－formazan2 h。WST-8－formazan2 h在450nm处用酶标仪(Bio-Rad,UK,680型)测定紫外吸收度。细胞毒性表示为用10mM HEPES(pH 7.4)处理的对照组细胞的细胞存活率百分比(n＝4)；
结果如图4所示，图4中，“衍生物”是指实施例合成得到的PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]，并且，每组的浓度从左至右均依次为0.0001mg/ml、0.001mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、1.0mg/ml和2.0mg/ml；从图4中可以看出，本发明所合成得到的PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]的细胞活性随着剂量增加有所下降，但细胞活性基本稳定在85％以上；对于低剂量组，对细胞活性几乎没有影响，并且，较低浓度(0.0001mg/ml、0.001mg/ml)条件下的细胞活性与其他现有的商业试剂相当，在较高浓度(尤其是0.1mg/ml、1.0mg/ml和2.0mg/ml)条件下的细胞活性显著高于其他现有的商业试剂，证明PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]有较高的安全性。
实施例4：
有效性：较高的细胞摄取率
(a)通过流式细胞仪检测不同siRNA结构的细胞摄取效率；
(b)用不同浓度的透明质酸孵育SGC-7901细胞后，细胞对PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)和cdm]的吸收效率(*p&lt；0.05,**p&lt；0.01,**p&lt；0.005，t检验)，
结果见图5，从图5可以看出，本发明所获得的新化合物，具有良好细胞吸收率，提示本发明新化合物可能类似于透明质酸，通过CD44受体被细胞有效摄取。
实施例5：
体外细胞有效性检验
降甲状旁腺激素作用实验方法：
大鼠甲状旁腺细胞根据公开发表的方案制备(王慧.提高细胞上清液中甲状旁腺激素水平对甲状旁腺细胞培养及分泌功能有优化作用[J].中国组织工程研究，2019,23(25)：4025-4030)
将大鼠通过腹腔注射1％戊巴比妥钠进行大鼠术前麻醉。大鼠完全麻醉之后将之固定于操作手术台上，使之处于仰卧体位并小心剪去颈部胸部的毛发。使用碘伏于大鼠的颈部和胸部皮肤进行常规性的消毒后，沿着大鼠颈部正中线纵向将皮肤切开；小心分离颈部的组织和肌肉，牵拉开大鼠颈部前部的肌肉群使大鼠的气管和2个甲状腺分别暴露出来。在10倍解剖显微镜下认真观察可见，大鼠的甲状腺为蝴蝶状暗红色，且位于大鼠的气管环和甲状软骨两侧；进一步分离甲状腺周围肌肉及甲状腺组织，可以见到灰白色或者呈乳白色的甲状旁腺组织；用显微剪将甲状旁腺取下来。
将所收集的甲状旁腺组织用4℃的含有青霉素和链霉素双抗的1640培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司，RPMI-1640培养基)漂洗3次，去除结缔组织和血液并吸弃培养基。在细胞超净台上将甲状旁腺组织小心剪成糊状并将之转移含有10mL培养基的离心管中，向其中加入2mL的胶原酶Ⅱ后恒温水浴进行消化20min。随后加入2mL含有胎牛血清的1640培养液使消化反应终止后，用灭菌后的不锈钢网过滤消化液。之后离心洗涤3次，将离心的沉淀物加入完全的1640培养基中，调节细胞浓度到1×108/L。将培养皿放于细胞培养箱中进行培养。
细胞被采集到1型胶原包被的培养板上后立即进行RNAi实验。采集的细胞培养于DMEM/Ham's F12培养基中(南京生航生物技术有限公司)，添加谷氨酰胺-1培养基、10％胎牛血清、50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素。孵育24小时后，加入一些RNAi结构体孵育。再孵育24h后收集上清，转入ELISA检测。甲状旁腺激素水平以三次独立实验的平均值表示。另外，细胞裂解缓冲液处理细胞后收集mRNA，转移至RT-PCR检测；
结果如图6所示，从图6中可以看出，本发明所获得的新衍生物剂量可明显抑制甲状旁腺激素(PTH)分泌，降甲状旁腺激素效率为空白组4倍；新合成物通过抑制mRNA发挥作用，抑制mRNA的能力约为对照组5倍。
实施例6
内化的PAsp[DET-DBCO(-ss siRNA)和CDM]会被酸性内切体和消化溶酶体摄取。
因此，为了从酶降解中恢复siRNA构建体，siRNA构建体必须赋予内切体逃逸功能。关于这一关键步骤，本申请合成的聚阴离子PAsp[DET-DBCO(-ss siRNA)和CDM]能够通过pH刺激的CDM分离(如图7所示)轻松转化为高正电荷(即膜破坏性)PAsp[DET-DBCO(-sssiRNA)]，对酸性环境作出响应3b)。为了验证这种分子转化，在醋酸缓冲液(pH5.0)中孵育前和孵育后，采用荧光胺法对PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)]中的氨基进行定量。基于LDH测定，所得到的PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)]具有强大的膜失稳能力。原则上，LDH是一种胞内酶，因此，胞外LDH的定量可以代表细胞质膜完整性丧失的程度。在此，SGC-7901细胞在pH7.4的PBS和pH5.0的MES缓冲液中，在PAsp[DET-DBCO(-ss siRNA)和CDM]的存在下进行培养，并对细胞外LDH进行定量以评估膜破坏效力。
如图8所示，用pH7.4的PAsp[DET-DBCO(-ss siRNA)和CDM孵育的细胞的LDH最低。相反，在pH5.0条件下，用PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)和CDM]孵育的细胞，细胞外培养基中检测到明显的LDH水平，这证明了我们的分子转化是为了追求强大的膜失稳能力而进行的电荷逆转。通过定量测定PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]和晚期内体/溶酶体的共定位程度来研究内体逃逸能力(图9)。与LDH分析结果一致，PAsp[DET-DBCO(-ss siRNA)和CDM](图9)样品的siRNA和晚期内体/溶酶体的共定位显著低于透明质酸(图9)。晚期内切体/溶酶体的包封率降低验证了我们的分子设计能够实现避免溶酶体降解的重要功能。

Claims (8)

1.一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物，其特征在于：所述衍生物为PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]，其具有如下式所示的结构：
Figure FDA0002958632870000011
上述结构式中，15≤x≤17，93≤y≤95。
2.权利要求1所述的仿透明质酸聚氨基酸衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在引发剂作用下，通过BLA-NCA单体的开环聚合，合成聚β-苄基-L-天冬氨酸，即PBLA；
(2)将步骤(1)所得的PBLA溶解于溶剂中得到PBLA溶剂，然后将二乙基甲苯在惰性气体环境下添加到PBLA溶剂中，搅拌反应，然后进行后处理，得到聚{N-[N'-(2-氨基乙基)-2-氨基乙基]天冬酰胺}，即PAsp(DET)；
(3)将步骤(2)所得的PAsp(DET)进一步修饰，在其侧链上依次引入磺胺-DBCO-NHS和羧二甲基马来酸酐，得到PAsp[DET-DBCO&CDM]；
(4)将5'-氨基siRNA在缓冲液中与N3-PEG3-NHS混合反应，然后加入步骤(3)所得的PAsp[DET-DBCO&CDM]，透析，即得PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述引发剂为正丁胺，所述溶剂为二甲基甲酰胺，所述惰性气体为氩气。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，反应温度为4℃，反应时间为24h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述后处理方法为：将反应混合物倒入乙酸溶液中，并依次用HCl溶液和蒸馏水透析，然后冻干。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，引入磺胺-dbco-nhs的具体方法为：将PAsp(DET)溶于缓冲液中得到PAsp(DET)缓冲溶液；将二苯基环辛炔-磺基-琥珀酰亚胺酯溶解于溶液中，然后加入到PAsp(DET)缓冲溶液中，搅拌反应，得到磺基DBCO共轭PAsp(DET)溶液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，引入羧二甲基马来酸酐的具体方法为：将羧二甲基马来酸酐溶解于溶液中，加入到磺基DBCO共轭PAsp(DET)溶液中，搅拌反应，然后进行后处理，即得。
8.权利要求1所述的仿透明质酸聚氨基酸衍生物的应用，其特征在于：所述衍生物用于降甲状旁腺激素。
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