CN102030908A

CN102030908A - 聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102030908A
Application number: CN2009100706004A
Authority: CN
Inventors: 邢金峰; 董岸杰; 乔勇; 邓联东; 肖丽; 徐建青
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2009-09-25
Filing date: 2009-09-25
Publication date: 2011-04-27

Abstract

本发明涉及一种聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物及其制备方法和应用。它是以瓜尔胶多糖大分子为主链，以聚乙烯亚胺分子为侧链的接枝聚合物，主链瓜尔胶多糖大分子的相对分子质量为1000～1,000,000，聚乙烯亚胺侧链的相对分子质量为400～20000。制备方法是羧基化瓜尔胶与聚乙烯亚胺在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺存在下，通过羧基与氨基的缩合而制备的。本发明通过对瓜尔胶多糖大分子进行PEI接枝改性，制备出可用于基因、RNA、蛋白等载体的可生物降解的聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物，为基因转染、基因治疗和免疫预防以及生物大分子药物制剂的开发提供一种低毒性、可生物降解的阳离子型非病毒载体。

Description

聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物及其制备方法和应用

技术领域：

本发明涉及一种聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物及其制备方法和应用。该聚合物可以与金属、阴离子性化合物、基因、蛋白质等形成复合物，可用于药物缓控释材料、基因载体和药物制剂应用。

背景技术：

近年来基因治疗和基因免疫的研究和应用越来越广泛，已成为治疗由于人类先天性和获得性基因缺陷引起的疾病的具有广阔应用前景的方法。基因治疗和免疫成功应用的关键是适宜的DNA运输载体的研究和开发，因为裸DNA在体内易受到酶的作用在到达靶细胞之前很快降解。生物安全和高效的DNA运输载体的研究是当前基因治疗和基因免疫领域中研究的热点。病毒载体系统转运DNA与表达蛋白的效率高(＞90％)。目前临床上75％的基因治疗方案，都应用重组病毒作DNA转运的载体。然而由于病毒载体本身特点决定了其存在以下缺点：潜在的免疫原性、有限的DNA运载能力、成本高、不易大量生产及质量控制难，尤其是病毒载体系统的免疫原性极大限制了其常规的应用。而非病毒载体系统具有结构可设计性、易于制备、高的DNA荷载能力和低的免疫原性等优点，但目前的非病毒载体输运DNA的转染效率还远低于病毒载体。

瓜尔胶(guar gum，也称瓜尔豆胶)是一类分子结构类似于纤维素的中性天然聚多糖，具有来源丰富、可生物降解和生物相容性好等优点，而聚乙烯亚胺(PEI)是目前公认具有较好基因负载和转染效果的阳离子聚合物，但PEI不可降解，且高分子量的PEI虽然具有高的基因转染效率，毒性却较大，而分子量的PEI毒性小但转染效率低。

发明内容：

本发明的目的是提供一种聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物及其制备方法和应用。本发明通过对瓜尔胶多糖大分子进行PEI接枝改性，制备一种可用于基因、RNA、蛋白等载体的可生物降解的聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物，以便为基因转染、基因治疗和免疫预防以及生物大分子药物制剂的开发提供一种低毒性、可生物降解的阳离子型非病毒载体。

本发明提供的一种聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物，它是以瓜尔胶多糖大分子为主链，以聚乙烯亚胺分子为侧链的接枝聚合物。

所述的聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物，主链瓜尔胶多糖大分子的相对分子质量为1000～1,000,000，聚乙烯亚胺侧链的相对分子质量为400～20000。

所述的聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物，主链瓜尔胶多糖大分子的相对分子质量为3000～100,000，聚乙烯亚胺侧链的相对分子质量为400～10000。

所述的聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物是通过羧基化瓜尔胶多糖上的羧基与聚乙烯亚胺上的氨基进行缩合形成的接枝聚合物。

本发明中，羧基瓜尔胶多糖的羧基化度是指每个瓜尔胶葡萄糖残基上取代上的羧基的平均个数；聚乙烯亚胺的接枝度是指每个瓜尔胶葡萄糖残基上所接枝上的PEI侧链的平均个数。

本发明中，所述的聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物，是采用羧甲基化度为0.01～1的羧甲基瓜尔胶接枝上PEI制备的，聚乙烯亚胺的接枝度是0.01～0.7。

本发明提供的聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物的制备方法经过的步骤：按计量向pH值为3～6的羧基化瓜尔胶多糖水溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌预反应1～2h。然后加入聚乙烯亚胺，调节pH值大于8，室温下继续搅拌反应20～36h。反应产物置于透析袋中透析48h后，冷冻干燥，获得聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物。

所述的聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物可与阴离子性化合物通过静电作用用于基因、RNA、多肽、蛋白类药物的载体，用于药物制剂和基因转染。

本发明提供了聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物及其制备方法和应用。本发明通过对瓜尔胶多糖大分子进行PEI接枝改性，制备出可用于基因、RNA、蛋白等载体的可生物降解的聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物，为基因转染、基因治疗和免疫预防以及生物大分子药物制剂的开发提供一种低毒性、可生物降解的阳离子型非病毒载体。

附图说明：

图1是PEI₁₂₀₀(A)、羧甲基化瓜尔胶C_0.7-GG₂₂₀₀₀(B)、聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物PEI₁₂₀₀-g-GG₂₂₀₀₀-0.15(C)的核磁共振(H-NMR)谱图。

图2PEI₁₂₀₀-g-GG₂₂₀₀₀-0.15与pEGFP-N1质粒DNA(电荷比10∶1)的粒径(A)及透射电镜图(B)。

图3PEI₁₂₀₀-g-GG₂₂₀₀₀-0.15与pEGFP-N1质粒DNA在不同N/P下的转染率(Hela细胞)。

具体实施方式

下面以实施例进一步说明本发明。

本发明实施例所用的瓜尔胶是市售产品，通过粘度法表征其相对分子质量为196.6万，

粘度法计算公式为：[η]＝5.13×10^-4M_w ^0.72

[η]是用乌氏粘度计，30℃恒温水浴中测定的瓜尔胶水溶液的特性粘数。

取上述瓜尔胶，加入0.01～1％的多糖降解酶，置于30℃的水浴中降解不同时间2～48h，分离出降解产物，干燥，即得到不同分子量的瓜尔胶。本发明实施例所用的低分子量的瓜尔胶都是高分子量瓜尔胶酶降解的产物。

实施例1

羧甲基瓜尔胶的制备：配制0.1～1％瓜尔胶溶液，加入乙醇，使乙醇含量为50～90％，混合均匀后，加入NaOH，在室温下溶胀1～2h。然后在30～60min内缓慢滴加氯乙酸钠溶液，氯乙酸钠与多糖单元摩尔比在0.1～1.5之间，NaOH与氯乙酸钠的摩尔比

60～70℃反应2～10h。用6mol/L的盐酸调节pH值为7，然后过滤，分别用乙醇、80％的乙醇溶液洗涤，最后产物置于烘箱中干燥，制得不同羧甲基化度的羧甲基化瓜尔胶(C-GG)，记为C_m-GG_n，m是羧甲基化度，n为瓜尔胶的相对分子质量，原料配比见表1所示。C_0.7-GG₂₂₀₀₀的核磁共振谱图如附图1。图1是PEI₁₂₀₀(A)、羧甲基化瓜尔胶C_0.7-GG₂₂₀₀₀(B)、聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物PEI₁₂₀₀-g-GG₂₂₀₀₀-0.15(C)的核磁共振(H-NMR)谱图。3.2-4.2ppm是瓜尔胶中葡萄糖单元亚甲基的特征峰，2.2-2.5ppm处的峰则是PEI的特征峰，对比三个谱图，可以证明成功接上了PEI。

羧甲基化度(DS)采用酸减滴定法测定：准确称取羧甲基化瓜尔胶样品0.5g置于50ml烧杯中，加入2mol/L的HCl溶液40ml，充分搅拌，过滤，用乙醇洗涤样品，直至滤液用AgNO₃检验无Cl^-1检出为止，这时样品转化成酸式羧甲基化瓜尔胶，将其溶解在20ml 0.5mol/LNaOH溶液中，然后以酚酞为指示剂用0.5mol/L HCl溶液反滴定，记录所消耗HCl溶液的体积。

DS按下式(1)计算：

a＝(b·c-d·e)/f

DS＝0.162/(1-0.058a) (1)

式中：a-每克样品消耗的酸；b-加入的NaOH的体积，ml；c-NaOH标准溶液的浓度，mol/L；d-滴定多余的NaOH所需的HCl的体积，ml；e-HCl标准溶液的浓度，mol/L；f-消耗样品质量。

表1羧甲基化瓜尔胶结构组成及制备条件

n_G瓜尔胶多糖单元摩尔数

实施例2

实施例1制备的羧甲基化瓜尔胶C_0.7-GG₂₂₀₀₀，0.5g，加入到三口瓶中，加入一定体积的水直到完全溶解，调节pH值为4～5，加入0.66g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和0.4g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下磁力搅拌预反应1h。然后加入20.8g PEI(分子量1200)，调节pH值大于8，室温下继续磁力搅拌反应18～24h。反应产物置于透析袋中透析48h以除去未反应的PEI。最终产物冷冻干燥，得聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物，以重水(D₂O)为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标，25℃下测定聚合物试样的核磁光谱(如附图1)，测得聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶的接枝度为0.15，该样品记为PEI₁₂₀₀-g-GG₂₂₀₀₀-0.15，如表2。

聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶的接枝度是指瓜尔胶每摩尔葡萄糖单元上接枝上的PEI侧链的个数，可根据核磁共振数据计算得出。每个瓜尔胶葡萄糖重复单元上有20H，位移在3.2-4.2ppm之间。PEI上面的氢质子位移在2.2-3.0ppm，根据二者氢质子积分面积可以计算出每个重复单元上PEI的个数，再除以3(每个重复单元含有3个葡萄糖单元)，即得接枝度X_g。

实施例3～12

按照实施例2方法，采用表1中其它羧甲基化瓜尔胶和不同分子量的PEI，制备出表2所列的各种聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶。

表2聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶结构组成及制备条件

n_G瓜尔胶多糖单元摩尔数；n_PEI/n_COOHPEI与羧基的摩尔比

实施例13

按实施例2方法，采用其它的羧基化瓜尔胶，如羧丁基瓜尔胶BC_0.8-GG₂₂₀₀₀，制备出PEI₁₂₀₀-g-BC_0.8-GG₂₂₀₀₀-0.51。

实施例14

按实施例2方法，采用其它的羧基化瓜尔胶，如二羧甲基亚胺基瓜尔胶ECA_1.5-GG₂₂₀₀₀，制备出PEI₁₂₀₀-g-EC_1.5-GG₂₂₀₀₀-1.0。

实施例15

按实施例2方法，采用其它的羧基化瓜尔胶，如二羧甲基亚胺基瓜尔胶ECA_1.0-GG₂₂₀₀₀，制备出PEI₁₂₀₀-g-ECA_1.0-GG₂₂₀₀₀-0.7。

实施例16

将PEI₁₂₀₀-g-GG₂₂₀₀₀-0.15、pEGFP-N1质粒DNA分别用PBS(pH7.4)溶解稀释(约1μg/100μL)，按照N/P比(聚合物中的氮与DNA中的磷原子含量的摩尔比)为20/1、30/1、40/1、50/1、60/1的比例，将聚合物的稀释液逐滴加入到pEGFP-N1质粒DNA的稀释液中，边加边振荡，使之充分混匀，形成复合物，室温放置20min，光散射仪测定复合物的粒径，透射电镜表征复合物粒子形态，如图2。可见，所制备的聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物可有效复合阴离子聚合物形成纳米粒。

培养板中种植Hela细胞，加入含10％小牛血清的DMEM细胞培养液培养。生长到70～80％融合时，移去培养基，再加入无血清培养基，然后将上述制备的DNA复合物溶液加到培养板中，混匀，将细胞置于培养箱培养4h后，将培养基换成含血清的培养基，继续培养24h，用流式细胞仪检测EGFP阳性细胞比例。结果如图3。图3PEI₁₂₀₀-g-GG₂₂₀₀₀-0.15与pEGFP-N1质粒DNA在不同N/P下的转染率(Hela细胞)，与市售阳离子脂质体转染试剂相比，PEI₁₂₀₀-g-GG₂₂₀₀₀-0.49负载质粒呈现出相当的转染效率。

Claims

1.一种聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物，其特征在于它是以瓜尔胶多糖大分子为主链，以聚乙烯亚胺分子为侧链的接枝聚合物，主链瓜尔胶多糖大分子的相对分子质量为1000～1,000,000，聚乙烯亚胺侧链的相对分子质量为400～20000。

2.按权利要求1所述的聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物，其特征在于所述的聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物是通过羧基化瓜尔胶多糖上的羧基与聚乙烯亚胺上的氨基进行缩合形成的接枝聚合物。

3.按权利要求1所述的聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物，其特征在于主链瓜尔胶多糖的相对分子质量为3000～100,000，聚乙烯亚胺侧链的相对分子质量为400～10000。

4.按权利要求1-3任一所述的聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物，其特征在于所用的羧基化瓜尔胶多糖的羧基化度为0.01～1.5，聚乙烯亚胺的接枝度是0.01～1.0。

5.一种聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物的制备方法，其特征在于经过的步骤：按计量将pH值为3～6羧基化瓜尔胶多糖水溶液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌预反应1～2h，然后加入聚乙烯亚胺，调节pH值大于8，室温下继续搅拌反应20～36h。反应产物置于透析袋(相对分子质量为8000～20000)中透析48h后，冷冻干燥，获得聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物。

6.权利要求1～4任一所述的聚乙烯亚胺接枝瓜尔胶阳离子聚合物的用途，其特征在于可用于基因、RNA、多肽、蛋白类药物的载体和用于药物制剂。