CN112996546A - 用于医学植入物的涂布组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于涂布医学植入物的方法。特别是，本发明涉及一种用于涂布医学植入物的涂布组合物，所述涂布组合物包括：PDLLA、VEGF、氯仿、与氯仿不同的有机溶剂、优选地诸如BSA之类的载体和水。这种涂布的医学植入物在移植后显示出改善的骨再生和骨向内生长。

Description

用于医学植入物的涂布组合物
技术领域
本发明涉及一种用于涂布医学植入物或医学植入物的一部分的方法。特别是，本发明涉及一种用于涂布医学植入物的包括PDLLA、VEGF、氯仿、与氯仿不同的有机溶剂、和水的涂布组合物。
背景技术
由于老龄人口的增加、骨折发生率的增加、以及对于确保修复和再生的可持续且不受限的方法的需求，骨再生在骨科研究领域引起了越来越多的关注。当前在较大的骨缺损中使用的通常是同种异体移植体，取自插入关节成形术后的备用骨或尸体。然而，同种异体移植体与疾病传播、免疫原性、和供体部位发病率的风险相关联。而且，现有的骨库不能满足临床需求。
为了获得以上所列挑战的替代方案，已尝试了不同的生物材料。这些设计背后的理论在于增强骨重塑过程中的关键因子，诸如成骨和血管生成刺激、释放方法、刺激的时间点、剂量、成本和用途的临床适用性。
血液供应是最佳骨形成的常见限制因素，而趋化因子血管内皮生长因子(VEGF)是血管的主要刺激物。这种趋化因子来源于间叶干细胞(MSC)和内皮细胞，并通过增加内皮增殖、迁移、血管通透性、管道形成、和存活来诱导血管生成。
G.Schmidmaier等人(用于持续释放生长因子的植入物的可生物降解的聚(D,L-丙交酯)涂层，J Biomed Mater Res.2001；58(4):449-55)公开了从涂布有可生物降解的聚(D,L-丙交酯)(PDLLA)薄层的植入物局部应用类似于胰岛素样生长因子-I(IGF-I)和转化生长因子-beta 1(TGF-β1)的生长因子可以刺激骨折愈合。
US 2001/0031274 A1也公开了从涂布有可生物降解的聚(D,L-丙交酯)(PDLLA)薄层的植入物应用类似于胰岛素样生长因子-I(IGF-I)和转化生长因子-beta 1(TGF-β1)的生长因子可以刺激骨折愈合。
因此，用于涂布合成的医学植入物的改进方法会是有利的，并且特别是，更加有效和/或可靠的涂布组合物会是有利的。
发明内容
在此，公开了一种用于医学植入物(或医学植入物的部分)的涂布组合物，在骨向内生长中、在骨小梁结构中临界尺寸缺损(CSD)中的骨形成中、和还有在理论上的抗菌效果中显示出有希望的结果。这可给正常的骨结构以及血管生成性和成骨性下降的患有缺血性坏死或骨质疏松性骨折的患者两者均带来影响。本发明的涂层中的所有组分已经由FDA批准并在人体中给药。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种用于涂布医学植入物的方法。特别是，本发明涉及一种用于涂布医学植入物的包括PDLLA、VEGF、氯仿、与氯仿不同的有机溶剂、优选诸如BSA之类的载体和水的涂布组合物。这种涂布的医学植入物在移植后显示出改善的骨再生和骨向内生长。
因此，本发明的发明目的涉及提供一种改善的用于医学植入物的涂布组合物。改进的示例可以是：
-改善的骨向内生长和骨再生；
-避免同种异体移植体或其他代替材料；
-快速涂布方法；
-VEGF的缓释；和
-抗菌效果。
特别是，本发明的一个发明目的在于提供一种具有改善的骨向内生长性质的医学植入物。根据本发明的涂布组合物优选地包括与血管内皮生长因子(VEGF)组合的聚-DL-乳酸(PDLLA)、氯仿、乙醇和水。在实施例2中，这种涂布的植入物在羊模型中进行测试，并就骨向内生长而言，执行得至少与同种异体移植体同样好。实施例3-6示出了所述涂布组合物的进一步分析，并将其与G.Schmidmaier等人公开的涂布组合物进行比较。
因此，本发明的一个方面涉及一种用于涂布医学植入物(或医学植入物的一部分)的方法，所述方法包括：
a)提供医学植入物；
b)提供液体(涂布)组合物，所述液体(涂布)组合物包括：
-0.01-0.2mg/μl PLA，优选聚(DL-乳酸)(PDLLA)；
-0.1-10ng/μl VEGF；
-30-70体积％氯仿；
-20-50体积％有机溶剂(优选与氯仿不同)，更优选醇，甚至更优选乙醇；和
-2-10体积％水；
c)利用步骤b)的组合物在体外涂布所述医学植入物(或待涂布的医学植入物的一部分)；
d)干燥所述经涂布的医学植入物；和
e)任选地，重复步骤c)至d)至少一次。
优选地，所述液体组合物进一步包括载体，更优选地所述载体是BSA。
优选地，所述医学植入物选自由螺丝、关节、紧固手段、骨折固定装置、和内假体装置构成的群组；和/或优选地，所述医学植入物包括以下材料或由以下材料构成：金属，优选钛、钢或钽、纯镁和与合金的组合；塑料；羟基磷灰石(HA)；弹性体；丙烯酸树脂；和包括TCP在内的陶瓷。
本发明的另一方面涉及一种液体(涂布)组合物，包括：
-0.01-0.2mg/μl PLA，优选聚(DL-乳酸)(PDLLA)；
-0.1-5ng/μl VEGF；
-30-70体积％氯仿；
-20-50体积％有机溶剂，优选醇，更优选乙醇；优选所述有机溶剂与氯仿不同；
-任选地且优选地，载体，优选地所述载体是BSA；和
-2-10体积％水。
本发明的又一方面涉及根据本发明所述的液体涂布组合物用于涂布医学植入物(或待涂布的医学植入物的一部分)的用途。
再一方面涉及通过根据本发明所述的方法获得的或可获得的医学植入物。
还一方面涉及在表面上涂布有聚(DL-乳酸)和VEGF的医学植入物(或医学植入物的一部分)。
另一方面涉及一种成套的试剂盒，包括：
-包括PLA、优选聚(DL-乳酸)(PDLLA)的第一容器；
-包括VEGF的第二容器；
-包括氯仿的第三容器；
-包括有机溶剂、优选醇、更优选乙醇的第四容器，优选所述有机溶剂与氯仿不同；
-任选地，包括水的第五容器；
-任选地且优选地，包括载体的第六容器；和
-任选地，用于准备根据本发明所述的液体涂布组合物和/或执行根据本发明所述的方法的使用说明。
最终，本发明涉及根据本发明的试剂盒用于涂布医学植入物(或医学植入物的一部分)的用途。优选地，所述医学植入物选自由螺丝、关节、紧固手段、骨填充物、骨折固定装置、和内假体装置构成的群组；和/或所述医学植入物包括以下材料或由以下材料构成：金属，优选钛、钢或钽、纯镁和与合金的组合；塑料；羟基磷灰石(HA)；弹性体；丙烯酸树脂；和包括TCP在内的陶瓷。
附图说明
图1示出了A)设计中使用的钛植入物的图示和B)尺寸和测量结果。钛植入物的内长度和外直径是10mm×10mm和导致0.5mL的围绕植入物2mm同心圆间隙——本分析中的关注区域。
图2示出了当与VEGF蛋白混合时Schmidmaier等人描述的方法中的混合物。VEGF溶液聚积在液体的顶部(箭头)且不能通过旋转或振动来稀释。
图3示出了A：将10mm×10mm钛植入物放置在股骨远端髁中的骨小梁结构中的图示。注意根据组织学图像在90°旋转之后植入物的放置。然后将该植入物嵌入并进行切片。B：在预计每日释放为100ng VEGF/天、观测12周之后植入物的图示。灰色区域是骨，白色区域是纤维组织和骨髓二者之一，黑色区域是植入物。C-E：用不同量VEGF涂布的植入物。C：预计每日释放为500ng VEGF/天。D：预计每日释放为1000ng VEGF/天。E：预计每日释放为2000ng VEGF/天。F：没有涂层或VEGF的空植入物。
图4示出了不同植入物的微CT图像。A：在扫描中显示的关注区域的图示，其与没有植入物的2mm同心圆间隙相关(图1)。B-E：用不同量VEGF涂布的植入物。B：预计每日释放为100ng VEGF/天。C：预计每日释放为500ng VEGF/天。D：预计每日释放为1000ng VEGF/天。E：预计每日释放为2000ng VEGF/天。F：同种异体移植体。G：预计每日释放为500ng VEGF/天——涂布在羟基磷灰石上。
图5：在从每组分析BV/TV时统计数据的图表。*p<0.05。与同种异体移植体的金标准相比，在VEGF涂布的植入物之间没有区别。具有涂布的羟基磷灰石的组在2cm的间隙内具有更大的骨状结构和更高的BV/TV(图1B)，这包括羟基磷灰石和新形成的骨两者。注意，涂布在羟基磷灰石上、预计每日释放为500ng VEGF/天的植入物的BV/TV包括未溶解的羟基磷灰石和新形成的骨两者。
现在将在下面更详细地描述本发明。
具体实施方式
定义
在进一步详细讨论本发明之前，将首先定义下述术语和惯例：
聚乳酸
在本语境中，术语“聚(乳酸)”或“聚乳酸”或“聚丙交酯”(PLA)是可生物降解的且生物活性的热塑性脂肪族聚酯。L-丙交酯和D-丙交酯的消旋混合物的聚合通常导致无定型的聚-DL-丙交酯(PDLLA)的合成。在本发明的优选实施方式中，“聚(乳酸)”是聚-DL-丙交酯(PDLLA)。在实施例部分中，已使用PDLLA。
血管内皮生长因子(VEGF)，
在本语境中，术语“血管内皮生长因子”、或“VEGF”或“血管渗透因子”(VPF)指由细胞产生的据信刺激血管形成的信号蛋白。VEGF家族在哺乳动物中包括五个成员：VEGF-A、胎盘生长因子(PGF)、VEGF-B、VEGF-C、和VEGF-D。VEGF-A通常就被称为VEGF。
在本研究中，将VEGF添加至牛血清白蛋白(以1：50(重量)的比例)。据信当处于冷冻条件下时，BSA会防止等分试样的生长因子/细胞因子与存储容器的低水平结合，并防止失活。白蛋白是循环中许多生长因子的天然载体蛋白。对于纯化的生长因子或细胞因子，它会防止纯蛋白在水溶液中析出，以及防止通过输水相互作用而粘附至载体器皿。
用于涂布医学植入物的方法
如上所述，本发明涉及一种新型涂布组合物，其适于涂布医学植入物，诸如用于改善围绕该医学植入物的骨向内生长。因此，本发明的一个方面涉及一种用于涂布医学植入物(或医学植入物的一部分)的方法，所述方法包括
a)提供医学植入物；
b)提供液体(涂布)组合物，所述液体(涂布)组合物包括：
-0.01-0.2mg/μl PLA，优选聚(DL-乳酸)(PDLLA)；
-0.1-10ng/μl VEGF；
-30-70体积％氯仿；
-20-50体积％有机溶剂，优选醇，更优选乙醇；优选地所述有机溶剂与氯仿不同；和
-2-10％水；
c)利用步骤b)的组合物在体外涂布所述医学植入物(或待涂布的医学植入物的一部分)；
d)干燥所述经涂布的医学植入物；和
e)任选地，重复步骤c)至d)至少一次。
所述医学植入物是其会有利于刺激例如围绕该植入物的骨向内生长的植入物。因此，在一个实施方式中，所述医学植入物选自由螺丝、关节、紧固手段、骨填充物、骨折固定装置、和内假体装置构成的群组。在相关的实施方式中，骨折固定装置选自由板、螺丝、钉、针、线、螺纹、关节成形术、和笼构成的群组。在又一实施方式中，所述植入物具有喷砂表面。
在另一实施方式中，所述医学植入物选自由以下构成的群组：
·诸如螺丝、克氏针、钉、植入物和板之类的固定装置；
·关节假体；
·脊椎笼；和
·生物材料、骨填充物、和骨移植体。
所述医学植入物可包括不同材料或由不同材料构成。因此，在另一实施方式中，所述医学植入物包括以下材料或由以下材料构成：金属，优选钛、钢或钽、纯镁和与合金的组合；塑料；羟基磷灰石(HA)；弹性体；丙烯酸树脂；包括TCP在内的陶瓷；以及其他天然和合成的聚合物。在实施例部分中，已测试了钛和羟基磷灰石(HA)。
根据本发明的涂布组合物可以使用不同类型的PLA。因此，在一个实施方式中，PLA选自由以下各者构成的群组：聚(D-乳酸)、聚(L-乳酸)、聚(DL-乳酸)、聚(乳酸)(PLA)、诸如聚(L-乳25酸)、诸如聚(DL-乳酸)、诸如聚己内酯、诸如聚(乙醇酸)(PGA)、诸如聚酸酐、例如聚(丁二酸烷二醇酯)、诸如聚(羟基丁酸酯)(PHB)、例如聚(二乙醇酸丁二醇酯)、诸如聚(ε-己内酯)、和它们的共聚物或共混物，优选聚(DL-乳酸)。在实施例部分中，已使用了聚(DL-乳酸)。
聚(DL-乳酸)(或另一种PLA)的量可以有所不同。因此，在一个实施方式中，所述液体组合物包括在0.01-0.2mg/μl的范围内的聚(DL-乳酸)(PDLLA)，优选在0.05-0.1的范围内，更优选在0.06-0.08mg/μl的范围内。
VEGF的量也可以有所不同。因此，在一个实施方式中，所述液体组合物包括在0.1-10ng/μl的范围内的VEGF(无BSA载体)，优选在0.02-4ng/μl的范围内，更优选在0.2-2.5ng/μl的范围内。
也可使用不同类型的VEGF。因此，在一个实施方式中，所述VEGF选自由VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、和PIGF1,2构成的群组，所述VEGF优选是VEGFA，更优选是重组人VEGF165(rVEGF165)(VEGFA的一员)。在实施例部分中，已使用了VEGFA，即重组人VEGF165(rVEGF165)。
氯仿在涂布组合物中的量也可以有所不同。因此，在一个实施方式中，所述液体组合物包括在40-70体积％的范围内的氯仿，诸如50-70％，或诸如55-65％，优选57-62％的氯仿。
有机溶剂在涂布组合物中的量也可以有所不同。因此，在一个实施方式中，所述液体组合物包括在30-50体积％的范围内的有机溶剂，诸如30-40％，优选在32-38％的范围内。在又一实施方式中，所述有机溶剂是醇，优选具有分子式CnH2n+1OH的醇，其中n是1-20，更优选n是1-5，诸如1-3，或诸如2，最优选所述醇是乙醇。在实施例部分中，已测试了乙醇。
水(蒸馏水)在组合物中的量也可以有所不同。因此，在一个实施方式中，所述液体组合物包括在2-8体积％的范围内的水，优选3-7％的水。
可通过添加一种或多种进一步的组分来进一步改善骨向内生长。因此，在又一实施方式中，所述液体(涂布)组合物进一步包括选自由以下各者构成的群组中的一种或多种组分：血小板源生长因子(PDGF)AA、PDGF BB；胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、IGF-II、酸性纤维母细胞生长因子(FGF)(FGF家族的全部22个成员，FGF1-FGF22)、碱性FGF、β-内皮细胞生长因子、FGF4、FGF 5、FGF 6、FGF 7、FGF 8、和FGF 9；Ang1、Ang2；基质金属蛋白酶(MMP)；信号素(SEMA)、SEMA3；Delta样配体4(Dll4)；转化生长因子TGF-P1、TGFβ1.2、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β5；骨形态发生蛋白(BMP)1、BMP 2、BMP 3、BMP 4、BMP 7、15血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子；表皮生长因子(EGF)、双调蛋白、细胞素、结合肝素的EGF、白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15-18、群落刺激因子(CSF)-G、CSF-GM、CSF-M、红细胞生成素；神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子、干细胞因子、肝细胞生长因子、用于分泌的修饰RNA(mRNA)细胞、降钙素基因相关肽(CGRP)、缺氧诱导因子1(HIF-1α)、和血小板源生长因子(PDGF)。
然而，由于所述涂布组合物仅包括一种生长因子，即VEGF，因而可能无需将进一步的生长因子或其他刺激因子添加至所述组合物。因此，在另一实施方式中，所述液体(涂布)组合物不含选自由以下各者构成的群组中的进一步的组分：血小板源生长因子(PDGF)AA、PDGF BB；胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、IGF-II、酸性纤维母细胞生长因子(FGF)(FGF家族的全部22个成员，FGF1-FGF22)、碱性FGF、β-内皮细胞生长因子、FGF 4、FGF 5、FGF 6、FGF7、FGF 8、和FGF 9；Ang1、Ang2；基质金属蛋白酶(MMP)；信号素(SEMA)、SEMA3；Delta样配体4(Dll4)；转化生长因子TGF-P1、TGFβ1.2、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β5；骨形态发生蛋白(BMP)1、BMP 2、BMP 3、BMP 4、BMP 7、15血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子；表皮生长因子(EGF)、双调蛋白、细胞素、结合肝素的EGF、白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15-18、群落刺激因子(CSF)-G、CSF-GM、CSF-M、红细胞生成素；神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子、干细胞因子、肝细胞生长因子、用于分泌的修饰RNA(mRNA)细胞、降钙素基因相关肽(CGRP)、缺氧诱导因子1(HIF-1α)、和血小板源生长因子(PDGF)。在实施例部分中，仅利用VEGF作为生长因子而获得了有效的骨向内生长。
因此，在本发明的优选实施方式中，所述涂布组合物包括：
-0.01-0.2mg/μl聚(DL-乳酸)(PDLLA)；
-0.1-10ng/μl VEGFA；
-50-70体积％氯仿；
-30-40体积％醇，最优选乙醇；和
-3-7体积％水。
如果添加有载体，则可以改善VEGF的效果。因此，在又一实施方式中，所述液体组合物进一步包括载体，优选BSA，优选以VEGFA相对于BSA的比例是在1：10至1：100(重量)的范围，诸如1：30至1：70，或诸如1：40至1：60，诸如1：50。不受理论所限，BSA的效果也可对存储机理具有影响，因为BSA是一种载体/填充物蛋白，当处于冷冻条件下时，BSA防止等分试样的生长因子/细胞因子与存储容器的低水平结合并防止失活。本领域技术人员可发现除BSA之外的其他相关载体/填充物的用途。因此，在一个实施方式中，所述蛋白质载体/填充物选自由牛血清白蛋白(BSA)、钥孔帽血蓝蛋白(KLH)、智利鲍鱼血蓝蛋白(CCH)、从血蓝蛋白、马来酰亚胺、和甲状腺球蛋白发育而来的载体蛋白、和它们的组合构成的群组。
用所述涂布组合物涂布所述医学植入物的步骤可以不同的方式发生。因此，在一个实施方式中，所述涂布步骤c)通过将所述医学植入物浸渍/浸没在所述液体组合物中一次或多次、或者通过将所述液体组合物喷涂至所述医学植入物上来执行。在又一实施方式中，所述浸渍/浸没是在0-20℃下发生3秒至1分钟，诸如在0-10℃下3秒至30秒或诸如3秒至10秒。在另一实施方式中，所述干燥步骤d)是空气干燥，诸如在20-30℃下10秒至5分钟，在20-30℃下诸如20秒至3分钟或诸如30秒至90秒。在实施例1中，进一步详细地描述了涂布方法。
在又另一实施方式中，所述重复步骤e)发生1-5次、优选1-3次、且更优选1次或2次。在实施例1中，重复步骤e)一次。
当涂布组合物将被用于医学植入物上时，当然所述组合物必须是无菌的。因此在一个实施方式中，提供的所述医学植入物是无菌的。此外，所述涂布组合物优选是无菌的。
如果经涂布的医学植入物可以在使用之前存储一段时间，这将是一个优势。因此，在一个实施方式中，所获得的经涂布的医学植入物可在用作医学植入物之前在-20℃下存储至少30天，诸如至少60天，诸如至少90天，或诸如1-100天，或诸如10-60天。
所述涂布组合物的pH可以有所不同。因此，在一个实施方式中，所述液体组合物具有在3.5-8的范围内的pH。
可应用于医学植入物的涂布组合物的体积当然取决于植入物的尺寸(或待涂布的医学植入物的一部分的尺寸)。因此，在一个实施方式中，所述涂布组合物在步骤c)中以在每mm2待涂布的医学植入物的表面积0.1至10μl的范围内、诸如在每mm2 0.2至2μl的范围内、或诸如在每mm2 0.3至1μl的范围内、优选在每mm2待涂布的医学植入物的表面积0.4至0.8μl的范围内的量进行施加。在实施例部分中，所述植入物的表面涂布有每mm2 0.6-0.7μl的总涂层。
也如上所述，并且如在实施例部分中所示，对于根据本发明所述的医学植入物已确认不同的优点。因此，在进一步的实施方式中，所获得的医学植入物用于在体内改善骨形成和/或植入物固定和/或骨向内生长(与未涂布的植入物、或涂布有另外涂层的植入物相比)。
涂布组合物
如上所述，本发明也涉及一种新型涂布组合物。因此，在又一方面中，本发明涉及一种液体涂布组合物，包括：
-0.01-0.2mg/μl PLA，优选聚(DL-乳酸)(PDLLA)；
-0.1-5ng/μl VEGF；
-30-70体积％氯仿；
-20-50体积％与氯仿不同的有机溶剂，优选醇，更优选乙醇；
-优选载体，更优选BSA；和
-2-10体积％水。
在一个实施方式中，液体涂布组合物是用于涂布医学植入物(或医学植入物的一部分)，诸如用于在体内改善骨形成和/或植入物固定。
液体涂布组合物的用途
本发明的进一步的方面涉及根据本发明所述的液体涂布组合物用于涂布医学植入物(或医学植入物的一部分)的用途。
涂布的医学植入物
在又进一步的方面中，本发明涉及一种在表面上涂布有聚(DL-乳酸)和VEGF的医学植入物。
在优选的实施方式中，所述医学植入物选自由螺丝、关节、紧固手段、骨填充物、骨折固定装置、和内假体装置构成的群组；
和/或
所述医学植入物包括以下材料或由以下材料构成：金属，优选钛、钢或钽、纯镁和与合金的组合；塑料；羟基磷灰石(HA)；弹性体；丙烯酸树脂；和包括TCP在内的陶瓷。
在又一优选实施方式中，所述医学植入物选自由螺丝、关节、紧固手段、骨填充物、骨折固定装置、和内假体装置构成的群组。
在又进一步的优选实施方式中，所述医学植入物包括以下材料或由以下材料构成：金属，优选钛、钢或钽、纯镁和与合金的组合；塑料；羟基磷灰石(HA)；弹性体；丙烯酸树脂；和包括TCP在内的陶瓷。
另一优选的实施方式，所述医学植入物包括金属或由金属构成，优选钛。
在一个实施方式中，所述医学植入物用在每mm2拟被涂布的植入物0.5ng至300ng的范围内、诸如在每mm2待涂布的植入物5-200ng的范围内、诸如在每mm2待涂布的植入物25-120ng的范围内的VEGF的量进行涂布。
在又一实施方式中，涂布的医学植入物的存储时间为在-20℃下24小时、诸如7天、诸如至少30天、诸如至少60天、或诸如至少90天。实验已经显示出，在-20℃下24小时后使用的植入物和在-20℃下存储90天的植入物之间没有区别(数据未示出)。
在相关的方面中，本发明涉及一种通过根据本发明所述的涂布方法获得或可获得的医学植入物。
成套的试剂盒
能够提供一种试剂盒，其可在使用前进行混合以形成根据本发明所述的涂布组合物，这可以是有利的。因此，本发明的一个方面涉及一种成套的试剂盒，包括：
-包括PLA、优选聚(DL-乳酸)(PDLLA)的第一容器；
-包括VEGF的第二容器；
-包括氯仿的第三容器；
-包括与氯仿不同的有机溶剂、优选醇、更优选乙醇的第四容器；
-任选地，包括水的第五容器；
-任选地，包括载体、优选BSA的第六容器；和
-任选地，用于准备根据本发明所述的液体涂布组合物和/或执行根据本发明所述的方法的使用说明。
在一个实施方式中，所述试剂盒进一步包括待涂布的一个或多个植入物。
在又进一步的方面中，本发明涉及根据本发明所述的试剂盒用于涂布医学植入物(或医学植入物的一部分)的用途。优选地，所述医学植入物选自由螺丝、关节、紧固手段、骨填充物、骨折固定装置、和内假体装置构成的群组；和/或所述医学植入物包括以下材料或由以下材料构成：金属，优选钛、钢或钽、纯镁和与合金的组合；塑料；羟基磷灰石(HA)；弹性体；丙烯酸树脂；和包括TCP在内的陶瓷。
植入物的医学用途
如果医学植入物本身是可生物降解的，则其可被视为一种药物。因此，在进一步的方面中，本发明涉及一种根据本发明所述的医学植入物，其用作药物，条件是所述医学植入物是可生物降解的。在又另一方面中，本发明涉及根据本发明所述的医学植入物，其用作骨植入物，条件是所述医学植入物是可生物降解的。
应当注意的是，在本发明的各方面之一的语境中描述的实施方式和特征也适用于本发明的其他方面。
本申请中引用的所有专利和非专利参考文献通过引用将其整体以此并入。
现在将在下述的非限制性实施例中进一步详细地描述本发明。
实施例
实施例1——涂布植入物的方法——材料和方法
涂布程序
植入物的涂层的目的是延迟血管内皮生长因子(VEGF)从植入物的释放。在无菌环境中完成该程序。所有设备进行灭菌消毒，并且因无菌程序而使用工作台、手套、和口罩。涂层由可生物降解的PLA即聚(D,L-丙交酯)(PDLLA)、结合了由60体积％的氯仿、5体积％的水和35体积％的乙醇组成的载体溶液而构成。植入物的表面涂布有每mm2 0.6-0.7μl的总涂层。
植入物是钛植入物(也可参见图1A)或羟基磷灰石。
理想的生物材料应当具有三项基本特性：骨诱导性、骨传导性、和成骨特性。自体移植体具有全部三项特性，并且已经是金标准移植体材料。然而，通常从髂嵴采集自体移植体可能与失血量增加、伤口并发症、局部感觉障碍、和持续的供体部位疼痛相关联。来自捐献者的同种异体移植体已常被用于翻修手术中，且被认为是仅次于自体移植体的代用金标准，并主要具有骨传导特性。然而，除了功效问题，潜在的疾病传播风险是与使用同种异体移植骨相关联的最大顾虑。
用于本研究中所用的涂层的载体材料是羟基磷灰石(HA)，且是与可提供的骨最相同的骨替代物之一。为了达到局部效果，这将与PDLLA VEGF涂层一起用于股骨间隙中。
所使用的植入物具有302mm2的喷砂表面。0.7μl×302mm2＝≈200-210μl的总量。PDLLA的量是0.06-0.07mg/μl。对于200μl，这意味着每植入物12-15mg PDLLA。
估计VEGF的释放大约是21天，因此溶液中总产物的量应当除以21以给出每日释放的剂量。100ng/天的释放将使溶液增加总计2100ng。将牛血清白蛋白(BSA)载体以1：50的比例(重量)用于VEGF-A-165中。这意味着对于100ng/天的释放，添加总计2100ng×50＝0.105mg。
对于100ng/天、500ng/天、1000ng/天、和2000ng/天的释放的总剂量，与BSA以1：50的比例结合的VEGF分别是2100ng、10,500ng、21,000ng、和42,000ng。
在这一程序期间，单独地制作用于每一植入物的混合物和涂层以确保合适的剂量。
首先，通过移液管准备液体。取决于按照表面积的植入物中的总体积，计算出60％的氯仿。200μl×60％的总量＝每植入物120μl。蒸馏水(水)200μl×5％＝10μl。70％乙醇200μl×35％＝70μl。
当制作了液体溶液时，以计算量加入PDLLA和VEGF。温和地旋转该流体以稀释混合物中的VEGF组分。
使用移液管或镊子或导丝以将植入物浸渍在该混合物中。当植入物表面已被覆盖时，将其放置在无菌台上。在30-90秒(取决于表面)后，涂层被干燥。重复相同的浸渍程序，并耗费30-90秒直至植入物被干燥。将植入物在-20℃下存储在无菌袋中。
本设计中使用的钛植入物示出在图1中。
动物
选用得克萨斯/哥特兰羊毛混血羊品种。它们的平均年龄为4-7岁，并且它们的平均体重为71.0±8.7kg。将这些羊安置在室外围场中，并在整个实验过程中喂食干草和复合饲料。将这些动物在手术前1周和手术后2-3天安置在中央动物设施的室内。遵守诸如用于护理和使用实验动物的ARRIVE之类的所有机构的和国家的以及国际的准则，并且丹麦动物实验监察局批准了本研究。
手术程序
作为术前给药，动物们接受了0.2mg/kg的隆朋。用3mg/kg的10mg/mL丙泊酚诱导麻醉，同时在全身麻醉(2.0％异氟烷)下执行手术程序。在无菌条件下并在对股外侧进行碘酒消毒后，通过皮肤切口暴露骨膜表面。为了防止骨和周围组织的任何热损伤，低速钻头创造了一个12mm深、周长为10mm的圆柱形孔。为了去除残留的骨颗粒，在插入形成2mm间隙的植入物之前，用生理盐水冲洗该间隙。将植入物正确放置并固定在临界尺寸缺损中。如需在该缺损中施加同种异体移植体，则用灭菌的同种异体移植体填充该间隙。最后，将伤口缝合成三层。对股骨踝部的内侧以及相对侧双侧地重复该程序。术后镇痛每日给药0.03ml/mg的Temgesic和250mg/mL的氨苄西林，持续3-4天。在观察12周后，用过量的戊巴比妥对羊进行安乐死，并在按照之前工作进一步处理之前采集并分割两股骨远端。
试样的制备
用Exakt金刚石带锯将骨植入物试样正交地锯成两部分。在去除顶部垫圈后，制备3.5mm的骨植入物样品，并在-20℃下存储，直到其使用6μ体素尺寸的微CT进行扫描。由于植入物的保存，因而一次只扫描一个样品。准备植入的试样的剩余部分，5.5mm，用于组织学和组织形态测量学调查。那些样品中的一些仍在乙醇系列(70-90％)中于室温脱水，并被嵌入甲基丙烯酸甲酯中。利用切片机采用垂直切片法，并用甲苯胺蓝O复染，来可视化矿化骨。
同种异体移植体
同种异体移植骨取自健康的羊。在无菌程序期间用手动骨磨机将来自股骨头的骨小梁结构进行分割。将同种异体移植体按照协议存储在-80℃的冷冻室中。
Schmidmaier等人使用的方法：
在Schmidmaier等人的方案中，按照他们的方案使用PDLLA和氯仿，并结合使用与本发明相同剂量的VEGF。
Schmidmaier等人使用直径为1mm、长度为3.5cm的克氏针。然后通过2×π×半径×长度计算出圆柱体的表面为具有109.95mm2的总表面。
对于10个克氏针，他们使用了总计100mg的PDLLA和1.5ml的氯仿。这意味着在他们的溶液中，每1ml氯仿他们使用了66.67mg的PDLLA。如果将这些数分到1个克氏针上，则针对109.95mm2给出总计10mg和0.15ml。
本实施例中使用的植入物具有376mm2的表面积。表面积的差异为376mm2/109.95＝3.41。当将他们针对克氏针的方法移用到按照表面积的植入物模型时，那么剂量-比例是1：3.41。
然后，在已知该比例是3.41时，计算需要用在植入物上的量。
10mg×3.41＝34.1mg PDLLA，且0.15ml×3.41＝0.51ml＝510μl氯仿。这针对每一个植入物给出了如在本实施例中所用的双倍量的体积/混合物。将这种根据Schmidmaier等人的方法的PDLLA和氯仿的混合物与如在本方法中使用的2100ng、10,500ng、和21,000ng的VEGF/BSA的三种总剂量结合使用。
实施例2——羊中的植入物
研究目的
本实施例旨在验证植入物在羊模型中的有效性。
材料和方法
参见实施例1。
结果
微CT和组织学：
通过评价植入物的顶部3.5mm(图1)，微CT扫描示出了与间隙内的同种异体移植体相比相似量的骨体积(BV)/组织体积(TV)，这是在临界尺寸缺损中从植入物和现有宿主骨之间的距离测量的(图5)。
当与估测释放速率为500ng VEGF/天涂布在羟基磷灰石(HA)上的组相比时，观察到了与同种异体移植体相比在间隙内增加的BV/TV(p<0.05)。这暗示着该涂布组合物具有与同种异体移植体的对照组相同或更好的成骨性和血管生成性。
组织学图像显示，当具有合适的剂量时，骨向内生长至植入物是最佳的，尤其是在1000ng VEGF/天(估算释放速率)的剂量左右，间隙有很多具有良好的向内生长的新形成的骨。这在微CT和组织学上都说明新形成的骨非常紧凑，并填充间隙且向内生长至植入物的多孔表面中(图4)，但与同种异体移植体没有显著差异。然而，该视觉资料给出了关于骨形成和骨向内生长至植入物中非常有希望的结果。当插入没有涂层(根据本发明所述的涂布组合物)的植入物来观察12周的时间时，在间隙中没有检测到任何骨(图3F)。
结论
该结果示出，就骨向内生长而言，根据本发明所述的涂布组合物执行得至少与同种异体移植体同样好。如前所述，需要同种异体移植体的替代方案。
当与没有涂层的对照组相比时，骨向内生长和骨再生存在显著的增加。
当与在微CT上羟基磷灰石上的PDLLA VEGF涂层相比，观察到了与同种异体移植体相比显著更高的BV/TV。
综上所述，在金属上以及在羟基磷灰石上的涂层均成功地刺激了骨再生。
实施例3——与Schmidmaier等人的比较
研究的目的
本实施例旨在将Schmidmaier等人公开的涂布组合物与根据本发明所述的涂布组合物进行比较。
材料和方法
参见实施例1。
结果
由于在植入物的间隙内不存在骨生长，所以无法对结果进行详细的分析。当实验室技术人员试图制作切片时，如果有缺损，则植入物会脱落，使得无法进行进一步的分析。
该涂布程序中的结果显示出生长因子被糟糕地稀释至仅有PDLLA和氯仿的组合物中。
结论
当在Schmidmaier等人提及的涂层中使用VEGF时，不能测量到植入物内的骨生长。这表明该方法在没有抑制和合适剂量的PDLLA和氯仿但具有乙醇和水用于骨生长的效果的情况下不能抑制相同的生长因子。
实施例4——液体组合物的优化-pH
研究的目的
本实施例旨在优化液体组合物的组分。
在使用由Schmidmaier等人描述的涂布组合物(涂布组合物3-4)和根据本发明所述的涂布组合物(涂布组合物1-2)时通过电子pH装置来测量pH值。该剂量对应于将用于200μl溶液中股骨间隙模型中的1个植入物的量。
本发明的组合物(体积：1ml)(用于具有376mm2表面积的5个植入物的量)：
涂布组合物1 涂布组合物2
PDLAA 0.06mg/μl 0.06mg/μl
氯仿 60％(v/v) 60％(v/v)
水 5％(v/v) 5％(v/v)
乙醇 35％(v/v) 35％(v/v)
VEGF 0.3μg
BSA 14.7μg
pH ≈4 ≈3.8
总体积 1 ml 1ml
从Schmidmaier等人改进的组合物(体积：2.55ml)，(用于具有376mm2表面积的5个植入物的量)：
涂布组合物3 涂布组合物4
PDLLA 0.0134mg/μl＝170.5mg 0.0134mg/μl＝170.5mg
氯仿 100％(v/v) 100％(v/v)
VEGF 0.3μg
BSA 14.7μg
pH ≈3 ≈4
总体积 2.55ml 2.55ml
结果
当将VEGF添加至涂布组合物1时，由此获得了涂布组合物2，pH值随着VEGF的添加而增加。另一方面，当将VEGF添加至涂布组合物3时，由此获得了涂布组合物4，pH值随着VEGF的添加而增加。而且，在涂布组合物3中不可能稀释VEGF(图2)。
结论
以上结果表明，无论使用Schmidmaier等人描述的方法还是根据本发明所述的组合物，对于这些组分的反应是不同的。这可能是由于灵敏度或VEGF的产物在没有任何乙醇或水的情况下是否具有被稀释在该溶液中的能力，如图2中所示的困难一样。
因此，水和醇(乙醇)的存在看上去对于获得合适的涂布组合物至关重要。因此，仅仅用VEGF来改变Schmidmaier等人公开的生长因子以实现功能性涂布组合物是不可能的(也参见实施例6)。Schmidmaier等人的方法的结果在应用于羊中的股骨间隙模型中时没有骨形成或骨向内生长。显然，Schmidmaier等人的方法在这种临界尺寸的缺损植入物模型中不可行。
实施例5——液体组合物的优化
研究的目的
本实施例旨在评价没有VEGF的涂布组合物。
结果
植入物用涂布组合物5(参见下文)(体积：每植入物200μl)进行涂布，如实施例1中描述的一样进行移植和评价。
涂布组合物5
PDLLA 0.06mg/μl＝12mg
氯仿 60％(v/v)
乙醇 35％(v/v)
水 5％(v/v)
总体积 200μl
结论
当评价涂布有组合物5的植入物时，植入物如此松散，以至于它们不能如在使用Schmidmaier等人的方法且结合使用VEGF(实施例3)时也观察到的一样来进行切片用于扫描或组织学。骨向内生长至植入物是不存在的。因此，在没有VEGF的情况下，不能观察到骨向内生长(数据未示出)。
实施例6——液体组合物的优化
研究的目的
本实施例旨在评价具有不同浓度的作为生长因子的VEGF的Schmidmaier等人公开的涂布组合物。
植入物用涂布组合物6-9(参见下文)进行涂布，如实施例1中描述的一样进行移植和评价(体积：每376mm2植入物表面0.51ml)。
涂布组合物 6 7 8 9
PDLLA 34.1mg 34.1mg 34.1mg 34.1mg
氯仿 100％(v/v) 100％(v/v) 100％(v/v) 100％(v/v)
VEGF 42ng 210ng 420ng 840ng
BSA 2058ng 10.290ng 20.580ng 41.160ng
等价物 100ng/day 500ng/day 1000ng/day 2000ng/day
pH ≈4 ≈4 ≈4 ≈4
总体积 0.51ml 0.51ml 0.51ml 0.51ml
结论
当评价涂布有涂布组合物6-9的植入物时，植入物如此松散，以至于它们不能进行切片用于扫描或组织学。骨向内生长至植入物是不存在的。因此，在没有乙醇和水的情况下，不能观察到骨向内生长(数据未示出)。
结果总结
微CT扫描的统计数据显示出，本发明的涂布组合物具有与同种异体移植体的当前临床金标准相同的形成骨的能力。组织学显示出，无论VEGF的剂量如何，骨均向内生长至每个植入物中。而且，当用VEGF以估算释放500ng/天的量涂布羟基磷灰石时，扫描表明了在2mm间隙内比同种异体移植体更多的HA的骨状结构和新形成的骨(BV/TV)。这表明在临界尺寸缺损中代替同种异体移植体可行的用途。
该涂层被设计为用于每一种骨科植入物、板、或关节成形术上，以增强向内生长，并也许因PDLLA的含量而抑制金黄色葡萄球菌的定植。
当与结合有VEGF的Schmidmaier等人的方法相比时，在间隙区域中没有骨向内生长，并且植入物无法进行切片来分析。在涂层中没有VEGF的情况下，没有骨再生。
基于当前的调查，本发明的涂布组合物显著优于Schmidmaier等人的涂布组合物，并且这一结论得到以下支持：
i本发明的涂布组合物被认为因VEGF、醇(乙醇)、水和例如还有载体(BSA)而执行得更好。
ii在骨再生和植入物固定方面的正面结果。

Claims (20)

1.一种用于涂布医学植入物的方法，所述方法包括：
a)提供医学植入物；
b)提供液体组合物，所述液体组合物包括：
-0.01-0.2mg/μl PLA，优选聚(DL-乳酸)(PDLLA)；
-0.1-10ng/μl VEGF；
-30-70体积％氯仿；
-20-50体积％与氯仿不同的有机溶剂，优选醇，更优选乙醇；和
-2-10体积％水；
c)利用步骤b)的组合物在体外涂布所述医学植入物；
d)干燥所述经涂布的医学植入物；和
e)任选地，重复步骤c)至d)至少一次；
其中所述液体组合物进一步包括载体，优选BSA；并且
其中所述医学植入物选自由螺丝、关节、紧固手段、骨折固定装置、和内假体装置构成的群组；和/或所述医学植入物包括以下材料或由以下材料构成：金属，优选钛、钢或钽、纯镁和与合金的组合；塑料；羟基磷灰石(HA)；弹性体；丙烯酸树脂；和包括TCP在内的陶瓷。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体选自由牛血清白蛋白(BSA)、钥孔帽血蓝蛋白(KLH)、智利鲍鱼血蓝蛋白(CCH)、从血蓝蛋白、马来酰亚胺、和甲状腺球蛋白发育而来的载体蛋白、和它们的组合构成的群组，优选是BSA。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述涂布步骤c)通过将所述医学植入物浸渍/浸没在所述液体组合物中一次或多次来执行。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述医学植入物在表面上用聚(DL-乳酸)和VEGF进行涂布。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述医学植入物选自由螺丝、关节、紧固手段、骨折固定装置、和内假体装置构成的群组。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述医学植入物包括以下材料或由以下材料构成：金属，优选钛、钢或钽、纯镁和与合金的组合；塑料；羟基磷灰石(HA)；弹性体；丙烯酸树脂；和包括TCP在内的陶瓷。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述医学植入物包括金属或由金属构成，优选钛。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中PLA是聚(DL-乳酸)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体组合物包括：
-0.01-0.2mg/μl聚(DL-乳酸)(PDLLA)；
-0.1-10ng/μl VEGFA；
-50-70体积％氯仿；
-30-40体积％乙醇；和
-3-7体积％水。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤c)中，所述涂布以在每mm2待涂布的医学植入物的表面积0.1至10μl的范围内、诸如在每mm2 0.2至2μl的范围内、或诸如在每mm2 0.3至1μl的范围内、优选在每mm2待涂布的医学植入物的表面积0.4至0.8μl的范围内的量进行施加。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所获得的医学植入物适于在体内改善骨形成和/或改善植入物固定和/或改善骨向内生长。
12.一种液体组合物，包括：
-0.01-0.2mg/μl PLA，优选聚(DL-乳酸)(PDLLA)；
-0.1-5ng/μl VEGF；
-30-70体积％氯仿；
-20-50体积％与氯仿不同的有机溶剂，优选醇，更优选乙醇；
-载体，优选BSA；和
-2-10体积％水。
13.根据权利要求12所述的液体涂布组合物，其中所述涂布组合物用于涂布医学植入物，诸如为了改善所述医学植入物在体内的骨形成和/或植入物固定和/或骨向内生长。
14.根据权利要求12或13所述的液体涂布组合物用于涂布医学植入物的用途，其中所述医学植入物选自由螺丝、关节、紧固手段、骨折固定装置、和内假体装置构成的群组；
和/或
所述医学植入物包括以下材料或由以下材料构成：金属，优选钛、钢或钽、纯镁和与合金的组合；塑料；羟基磷灰石(HA)；弹性体；丙烯酸树脂；和包括TCP在内的陶瓷。
15.一种在表面上涂布有聚(DL-乳酸)和VEGF的医学植入物，
其中所述医学植入物选自由螺丝、关节、紧固手段、骨折固定装置、和内假体装置构成的群组；
和/或
所述医学植入物包括以下材料或由以下材料构成：金属，优选钛、钢或钽、纯镁和与合金的组合；塑料；羟基磷灰石(HA)；弹性体；丙烯酸树脂；和包括TCP在内的陶瓷。
16.根据权利要求15所述的医学植入物，其中所述医学植入物选自由螺丝、关节、紧固手段、骨折固定装置、和内假体装置构成的群组。
17.根据权利要求15或16所述的医学植入物，其中所述医学植入物包括以下材料或由以下材料构成：金属，优选钛、钢或钽、纯镁和与合金的组合；塑料；羟基磷灰石(HA)；弹性体；丙烯酸树脂；和包括TCP在内的陶瓷。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的医学植入物，其中所述医学植入物包括金属或由金属构成，优选钛。
19.一种成套的试剂盒，包括：
-包括PLA、优选聚(DL-乳酸)(PDLLA)的第一容器；
-包括VEGF的第二容器；
-包括氯仿的第三容器；
-包括与氯仿不同的有机溶剂、优选醇、更优选乙醇的第四容器；
-任选地，包括水的第五容器；
-包括载体的第六容器；和
-任选地，用于准备根据权利要求12或13所述的液体涂布组合物和/或执行根据权利要求1至11中任一项所述的方法的使用说明。
20.根据权利要求19所述的试剂盒用于涂布医学植入物的用途，
其中所述医学植入物选自由螺丝、关节、紧固手段、骨折固定装置、和内假体装置构成的群组；和/或所述医学植入物包括以下材料或由以下材料构成：金属，优选钛、钢或钽、纯镁和与合金的组合；塑料；羟基磷灰石(HA)；弹性体；丙烯酸树脂；和包括TCP在内的陶瓷。
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