CN112996493A - 作为rad51抑制剂的亲电试剂和亲电前药 - Google Patents

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Abstract

一种方法，包括向患有癌症、疑似患有癌症或者有发展成癌症风险的个体共同施用以下成分：治疗有效量的至少一种化合物(a)，所述化合物(a)选自(a)(i)硝基烯脂肪酸、(a)(ii)具有吸电子基团、离去基团和在所述吸电子基团与所述离去基团之间的碳‑碳双键的不饱和脂肪酸、(a)(iii)硫醇化硝基脂肪酸、或(a)(iv)含有吸电子基团的二羧酸化合物；和治疗有效量的至少一种抗肿瘤剂(b)，其中所述癌症是具有DNA修复基因缺陷的遗传病因的癌症、自发基因组不稳定率高的癌症、对DNA损伤剂反应良好的癌症或者对DNA损伤剂与免疫疗法联合反应良好的癌症。

Description

作为RAD51抑制剂的亲电试剂和亲电前药
相关领域的交叉申请
本申请要求2018年11月14日提交的第62/767,424号美国临时专利申请的权益，其通过参考并入本文。
感谢政府的支持
本发明是在国家卫生研究院授予的HL058115、DK072506、HL103455和HL064937号政府资助下完成的。政府对这项发明有一定的权利。
背景技术
三阴性乳腺癌(TNBC)在所有乳腺癌中占大约20％，是最具侵略性的乳腺癌亚型。由于缺乏雌激素和孕激素受体以及限定大多数乳腺癌的受体酪氨酸激酶ERB2(HER2)，没有针对TNBC患者的靶向治疗。其他乳腺癌表型相比，癌转移率高和5年存活率更低，这说明对新治疗策略的需要没有得到满足。
脂肪酸硝基烯是一氧化氮和不饱和脂肪酸的亚硝酸盐依赖性代谢和炎性反应的内源性可检测产物。凭借其亲电子性质，脂肪酸硝基烯介导蛋白质中的反应性亲核半胱氨酸巯基(包括NF-κB、Keapl，PPARγ、STING、5-脂氧合酶中的p65)的翻译后修饰(PTM)，从而调节蛋白质结构和功能并介导多效性细胞保护和抗炎性信号传导响应。
大量的外源和内源刺激的DNA损伤事件要求DNA损伤被警惕地检测和有效地修复。若干DNA修复机制已被证实可以改善有害的基因组干扰，如直接逆转、错配修复、核苷酸切除修复、碱基切除修复和双链断裂(DSB)修复。DNA DSB尤其具有致病性，因为基因组物质的丢失和突变可促进基因组的变异和不平衡。
DNA DSB修复包括四条途径：典型非同源末端连接(c-NHEJ)、选择性连接(ALT-EJ)、单链退火(SSA)和同源重组定向修复(HDR)。虽然NHEJ不需要同源性(同源序列)来在连接前桥接DSB，但ALT-EJ在连接前通过短距离同源性介导来桥接DSB。SSA利用侧翼同源性来桥接DNA病灶，导致重复序列之间出现缺失。HDR是DSB修复的主要事件，它涉及通过至少一条来自DSB的链侵入同源模板，该链模板新生的DNA合成以形成延长链，该延长链可以形成到DSB另一端的桥。同源链侵入步骤由重组酶Rad51催化。末端切除是染色体DSB产生3'单链DNA的过程。这些途径中的每一种都涉及一组特定的DNA修复蛋白(图14A)。
修复DSB的两条主要途径为：非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)。虽然NHEJ的使用速度更快、频率更高，但HR修复机制保持了基因组的最高保真度。HR修复通过维持基因组格局的同源模板搜索纠正遗传物质损失，从而保护细胞免受DSB造成的有害基因组不稳定影响。RAD51是HR的重要组成部分，其有助于同源搜索和链交换来修复DSB。RAD51和结构相似的蛋白质XRCC2、XRCC3、RAD51B、RAD51C、RAD51D、DMC1和SWSAP1都协同促进HR。因此，RAD51和横向同源活性的降低与癌变有关。虽然RAD51对DSB的高保真修复至关重要，以维持基因组内稳态，但RAD51在癌症中的过度表达也可产生有害的后果。RAD51过度表达的程度与乳腺癌的肿瘤分级相关，并且已在三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系和转移患者样品中得到鉴定。RAD51的过度表达通过使癌细胞对DNA损伤剂更具抵抗力而抑制癌症患者的化疗疗效。新辅助化疗的疗效与治疗前的BRCA1病灶、γH2AX病灶和RAD51病灶数以及治疗后的RAD51病灶数呈负相关。
发明内容
本文公开一种方法，包括向患有癌症、疑似患有癌症、有发展成癌症风险或者处于癌症缓解中的个体共同施用以下成分：
治疗有效量的至少一种化合物(a)，所述化合物(a)选自(a)(i)硝基烯脂肪酸、(a)(ii)具有吸电子基团、离去基团和在所述吸电子基团与所述离去基团之间的碳-碳双键的不饱和脂肪酸、(a)(iii)硫醇化硝基脂肪酸或(a)(iv)含有吸电子基团的二羧酸化合物；和
治疗有效量的至少一种抗肿瘤剂(b)，
其中所述癌症是具有DNA修复基因缺陷的遗传病因的癌症、自发基因组不稳定率高的癌症、用一种或多种DNA损伤剂治疗的癌症、或用一种或多种DNA损伤剂与免疫疗法的组合来治疗的癌症。
示例性癌症包括乳腺癌(特别是三阴性乳腺癌)、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌(恶性胶质瘤)、胰腺癌、皮肤癌(如黑素瘤)。获取传播(转移)的能力并且是在基因组学上高度不稳定的癌细胞特别适用于本文所述的联合治疗。
本文还公开多种方法，其包括向患有三阴性癌症、疑似患有三阴性乳腺癌症、或有发展成三阴性乳腺癌风险的个体施用以下成分：治疗有效量的至少一种化合物(a)，所述化合物(a)选自(a)(i)硝基烯脂肪酸、(a)(ii)具有吸电子基团、离去基团和在所述吸电子基团与所述离去基团之间的碳-碳双键的不饱和脂肪酸、(a)(iii)硫醇化硝基脂肪酸、或(a)(iv)含有吸电子基团的二羧酸化合物。
本文进一步公开一种药物组合物，包括治疗有效量的至少一种化合物(a)，所述化合物(a)选自(a)(i)硝基烯脂肪酸、(a)(ii)具有吸电子基团、离去基团和在所述吸电子基团与所述离去基团之间的碳-碳双键的不饱和脂肪酸、(a)(iii)硫醇化硝基脂肪酸、或(a)(iv)含有吸电子基团的二羧酸化合物；和
治疗有效量的至少一种抗肿瘤剂(b)。
根据参照附图进行的详细描述，前述将变得更加显而易见。
附图说明
图1A至图1K：NO2-OA(10-硝基-十八碳-9-烯酸)抑制TNBC细胞生长、RAD51病灶形成和对电离辐射的敏感性。图1A：将细胞(0.5x106)注入6周龄小鼠体内，在肿瘤体积达到100mm3时，用15mg/kg油酸(OA)(黑色)或NO2-OA(红色)灌胃4周。图1B：通过免疫印迹法，NO2-OA治疗组小鼠的肿瘤γH2AX表达比OA对照组小鼠有所增加(每组n＝6-7只)。图1C：用增加浓度的NO2-OA处理MM231(红色)、BT549(蓝色)或HS578T(绿色)细胞，并通过量化发光ATP水平(细胞滴度Glo)来测量相对生长。EC50值表示平均值+SEM，n＝3。图1D-1F：MM231(红色)、BT549(蓝色)或HS578T(绿色)细胞用增加浓度的阿霉素、顺铂或奥拉帕林±NO2-OA处理，并如上所述进行测量。图1G：MM231(红色)细胞用浓度增加的奥拉帕尼每日+载体、OA或NO2-OA处理，并如上所述进行测量。图1H-1I：用5gy辐照后，NO2-OA减少了MM231细胞中的RAD51病灶形成(绿色)并增加了γH2AX(红色)。合并样品包括DAPI染色的细胞核(蓝色)。16孔盖玻片上的细胞给药5Gy，然后在IF处理前用5μM NO2-OA或载体处理6h。从0或5gy样品+SEM显示共聚焦z-堆积图像中具有5个或更多个病灶的细胞的平均百分比。图1J：NO2-OA减少TNBC细胞系MDA-MB-231中的Rad51病灶，由于NO2-OA在非致瘤性乳腺导管上皮细胞中的代谢和PK与TNBC细胞明显不同，因此对辐照的良性乳腺上皮细胞(MCF-10A)没有影响。对Rad51病灶计数，通过由免疫荧光法(IF)分析的5Gy辐照的细胞(直方图)中的ImageJ评估γH2AX强度。图IK，上部。与NO2-OA相比，NO2-OA显示出更低的IC50，与他拉唑帕尼合用时显示出更好的组合指数。用三磷酸腺苷(CellTite-Glo)荧光检测法测定每日用他拉唑帕尼(0.01-75μM)加二氧化氮OA(0.2-12μM])处理的MDA-MB-231细胞的生长抑制(相对于细胞数)。图IK，下半部分。组合指数(Cl)用Chou-Talalay法计算。CI<1具有协同作用。数据代表三个独立实验的平均值。
图2A-2D：抑制同源重组，但不抑制NO2-OA的非同源末端连接。图2A-2B：用I-SceI质粒转染含有HR报告基因构建体DR-GFP的U2OS细胞，并用载体(灰色)、5μM-OA(绿色)或5μM-NO2-OA(红色)处理。阴性对照细胞不存在I-SceI。平均值+SEM，n>3。图2A：在48小时用流式细胞术时检测GFP阳性细胞的数量。图2B：使用活细胞荧光显微镜对68小时后出现的GFP阳性细胞进行定量。GFP阳性细胞计数标准化为细胞融合率并进行比较。图2C-2D：用I-SceI质粒转染含有NHEJ报告基因构建体EJ5-GFP的U2OS细胞，并用载体(灰色)、5μM-OA(绿色)或5μM-NO2-OA(红色)处理。阴性对照细胞不存在I-SceI。平均值+扫SEM，n＝3。图2C：在48小时时用流式细胞术检测GFP阳性细胞的数量。图2D：使用活细胞荧光显微镜对68小时后出现的GFP阳性细胞进行定量。GFP阳性细胞计数标准化为细胞融合率并进行比较。
图3A-3I：NO2-OA在Cys319处与RAD51共价结合，并阻断ABL异源二聚体(heterodimerization)。图3A：用对照或RAD51过表达质粒稳定转染包含HR报告构建体DR-GFP的U2OS细胞，并与5μM NO2-OA在对照(红色)或RAD51过表达细胞(红色条带)中进行了研究。图3B：NO2-OA体外结合RAD51。纯化的RAD51蛋白质用对照组、生物素化OA、NO2-OA或硝化硬脂酸NO2-SA孵育1h，并用链球菌亲和素包埋琼脂糖沉淀，然后通过免疫印迹法检测。图3C：NO2-OA与表达RAD51的细胞中的RAD51 Cys319共价反应。表达WT或半胱氨酸突变株RAD51的293T细胞用生物素化NO2-OA孵育1h，沉淀并检测。三个独立实验采用单因素ANOVA*p<0.05定量分析。图3D：与Alexa Fluor 488结合的DNA用纯化的RAD51、ATP和5μM OA(黑色)、5μM NO2-OA(灰色)或10μM NO2-OA(白色)孵育，定量荧光偏振并标准化为缺乏ATP的对照。图3E：RAD51(蓝色)和NO2-OA(紫色)的分子建模。预测NO2-OA与RAD51的Cys319残基(金)的共价结合以通过与Pro318的疏水相互作用以及与RAD51的Glu322的可能的氢键合而进一步稳定。图3F：NO2-OA在体外破坏了与RAD51结合的ABL。纯化的RAD51和ABL核蛋白在0、100或500nM处用OA-NO2孵育1h，沉淀ABL。通过免疫印迹法检测结合的RAD51的量。图3G：NO2-OA破坏通过免疫沉淀分析(IP)评估的RAD51和ABL相互作用，并降低RAD51 Y315磷酸化。293T细胞用FLAG-RAD51和ABL核蛋白转染，并用NO2-OA处理1h。通过IP和免疫印迹来探测RAD51与ABL和磷酸化RAD51 Y315的相互作用。图3H：NO2-OA结合MM231或MM468细胞中的RAD51。细胞用生物素化NO2-OA孵育，然后用链球菌亲和素包被琼脂糖沉淀裂解物，并用免疫印迹进行检测。图3I：NO2-OA通过抑制RAD51丝的形成来损害HR，从而导致TNBC细胞中的基因组不稳定和死亡。
图4A-4F：NO2-OA抑制TNBC细胞的体外和体内生长。(图4A)硝基油酸(NO2-OA；10-硝基-十八碳-9-烯酸)和非亲电10-硬脂酸(NO2-SA；10-硝基-十八酸)和油酸(OA；十八碳-9-烯酸)的化学结构。*表示亲电碳。(图4B-4D)与MCF-10A细胞相比，NO2-OA对MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF7生长的影响。数据显示为未经处理的对照细胞百分比(平均值为SD)。*p<0.05表明两种细胞类型在每个治疗中均有显著性差异。分别进行了三个独立实验(n＝5每个实验)。(图4E)每个乳腺癌细胞系中NO2-OA的IC50值。(图4F)NO2-OA(7.5mg/kg/kg)对MDA-MB-231异种移植瘤生长的影响(平均值±SEM)。*，p<0.05对治疗时间内的载体组。对变体进行的双因素分析，然后进行Tukey后hoc检验，进而确定显著性。
图5A-5F：NO2-OA促进TNBC细胞中的细胞周期阻滞和凋亡。示出了(图5A)MDA-MB-231、(图5B)MDA-MB-468和(图5C)经NO2-OA(5μM)处理24小时的MCF-10A细胞在细胞周期的每个阶段(G0/G1、S和G2/M)中的细胞群百分比。收集细胞，用荧光活化细胞分选法进行分析。对变体进行单因素方差分析，然后进行Tukey后hoc检验，进而确定显著性。数据为平均值±SD。n＝3，*，p<0.05与对照。(图5D)用OA(7.5μM)、NO2-SA(7.5μM)或NO2-OA(5μM))处理24小时的MCF-10A、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中的细胞周期蛋白D1和P21的免疫印迹分析。(图5E)用OA(7.5μm)、NO2-SA(7.5μm)或NO2-OA(5μm)处理24小时的MCF-10A、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中的PARP-1切割的免疫印迹分析。(图5F)用或不用NO2-OA(5μM)处理24小时的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中的半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9切割的免疫印迹分析。β-肌动蛋白作为负荷对照。图5D-5F中的数据代表3个独立实验。
图6A-6H：多药耐药蛋白-1(MRP1)影响TNBC细胞中的NO2-OA的转运和信号传导。(图6A)通过LC-MS/MS分析测量MCF-10A、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞对NO2-OA-SG的输出。NO2-OA-SG输出的相对范围报告为NO2-OA-SG与外部添加的15NO2-d4-OA-SG标准的比率。与MCF-10A相比，*p<0.05，MCF-10A，n＝(Mann-Whitney U检验)。(图6B)MCF-10A、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中内源性MRP1蛋白表达的代表性免疫印迹。(图6C)MCF-10A细胞内NO2-OA-SG加合物浓度对MRP1活性的抑制和(图6D)MRP1表达的增加。相对量表示NO2-OA-SG相对于15NO2-d4-OA-SG标准的相对丰度，标准化为每个NO2-OA处理样品的蛋白质浓度除以对照或扰乱样品的丰度。通过Mann-Whitney U检验测定*p<0.05与对照(n＝6)或扰乱(n＝9)。用q-RT-PCR检测MRP1的siRNA敲除效率，n＝4。(图6E)丙磺舒对MCF-10A细胞的NO2-OA生长抑制的影响。细胞用或不同丙磺舒(0.25mm)预处理1小时，然后与0-25μM NO2-OA联合处理48小时。进行FluoReporter dsDNA染色法来测定细胞数。数据显示为未处理对照细胞的百分比(n＝3)，*，p<0.05，n＝3(未配对Student的t检验)。(图6G)在存在或不存在丙磺舒(1mM用于24小时孵育)的情况下，用NO2-OA(5μM)处理的MCF-10A细胞中的细胞周期蛋白D1和p21的免疫印迹分析。(图6H)在存在或不存在丙磺舒(1mM)的情况下，用NO2-OA(5μM)处理MCF-10A细胞24小时，对其中的半光氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和PARP-1切割进行免疫印迹分析。示出了PARP-1的全长(FL)-切割(C)形式和前半光氨酸天冬氨酸蛋白酶-3蛋白水平。所有数据均为平均值±标准差。所有的免疫印迹都代表三个独立实验。
图7A-7B：NO2-OA消耗TNBC细胞中的GSH水平并促进GSSG的形成。示出了细胞(图7A)GSH和(图7B)GSSG对MCF-10A(黑条)、MDA-MB-231(灰条)和MDA-MB-468(白条)细胞中NO2-OA的反应。细胞用NO2-OA(5μM)处理指定时间(hr)。从细胞中提取GSH和GSSG(3x106个细胞/ml)并通过LC-MS/MS进行定量。*p<0.05与0小时，非配对双尾Student的t-检验。数据表示为平均值±SD，n＝5。
图8A-8D：NO2-OA抑制TNFα诱导的TNBC细胞迁移和侵袭。(图8A)结晶紫色染色迁移的MDA-MB-231或MDA-MB-468细胞的实验方案和代表性图像。将细胞(1x105)放置在含有指定治疗病症的无血清培养基的上腔中。以100x，用光学显微镜拍摄迁移细胞。(图8B和8C)通过溶解结晶紫和在A573 nm处进行分光光度分析，对图4A中迁移的细胞进行定量。将每个治疗组的移行细胞百分比与无TNFα刺激(血清Ctrl)时的移行细胞数量进行比较。与血清对照组相比p<0.05；与单用TNFα组相比p<0.05。(图8D)为了测试NO2-OA对TNBC细胞侵袭的影响，将MDA-MB-468细胞在含有ng/mL TNFα细胞的无血清培养基中培养24小时，通过Matrigel基质向5％FBS化学引诱剂迁移。各处理的细胞侵入率与血清Ctrl有关。与单用TNFα比较p<0.05，无显著性差异。通过单因素方差分析和Tukey事后检验确定显著性。所有数据均为平均值±SD。
图9A-9I：NO2-OA抑制TNFα诱导的TNBC细胞NF-κB转录活性。在转染NF-κB荧光素酶报告基因的(图9A)MDA-MB-231或(图9B)MDA-MB-468细胞中测量NO2-OA对NF-κB依赖性报告基因转录的TNFα诱导激活的影响。与单用TNFα比较，*，p<0.05。(n＝3)显著性由Kruskal-Wallis检验确定，然后用Bonferroni校正进行Dunn后验进行多重比较。(图9C)使用人NF-κB靶PCR阵列测定MDA-MB-468细胞中被NO2-OA下调的NF-κB靶基因。直方图表示mRNA在经NO2-OA处理与未处理细胞中表达的部分。GAPDH用于内部控制(黑条)。NO2-OA对TNFα诱导的MDA-MB-231细胞(图9D)ICAM-1、(图9E)uPA或(图9F)RelA基因表达的影响。同样的，在TNFα诱导的MDA-MB-468细胞中，NO2-OA对(图9G)ICAM-1、(图9H)uPA或(图9I)RelA基因表达的影响。与未经治疗的对照组相比增加了数倍。与未经治疗的对照组相比，*，p<0.05，与单独使用TNFα相比，**，p<0.05，无显著性差异。通过单因素方差分析和Tukey后检验确定显著性。所有数据均为表示为平均值士SD，n＝5。
图10A-10F：NO2-OA抑制TNFα诱导的IKKβ磷酸化和IκBα降解，并与IKKβ共价加成。所有研究均采用MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞。(图10A)IKKβ(Ser 180)磷酸化、总IKKβ水平和相对磷酸化IKKβ水平的代表性免疫印迹。然后，对所有标准化为总IKKβ的磷酸化IKKβ水平标准化量化。(图10B)显示了IκBα蛋白水平的代表性免疫印迹，并且针对NO2-SA、NO2-OA和NFkB抑制剂BAY 11-7082对相对总IκBα水平(标准化为总β-肌动蛋白)进行量化。(图10C)IκBα(Ser 32)磷酸化和总IκBα的代表性免疫印迹显示对NO2-SA、NO2-OA和NFκB抑制剂BAY11-7082的反应。(图10D-10F)NO2-OA烷基化TNBC IKKβ蛋白。生物素化的NO2-OA、NO2-SA和OA及其结合蛋白用链霉亲和素琼脂糖珠从细胞裂解液中亲和纯化。然后用免疫印迹法检测下调后的IKKβ蛋白。来自用于亲和纯化的相同输入裂解物的IKKβ和对照γ-肌动蛋白免疫印迹显示在面板下方。仅与TNFα相比，*p<0.05，不显著。通过单因素方差分析和Tukey后检验确定显著性。
图11A-11C：NO2-OA烷基化并使TNBC细胞中NF-κB RelA蛋白不稳定。(图11A)用5μMBt-NO2-OA、Bt-NO2-SA或Bt-OA处理MDA-MB-231或MDA-MB-468细胞2小时。细胞裂解后，用链霉亲和素-琼脂糖珠亲和纯化生物素化的NO2-FAs及其加合物。用免疫印迹法检测下调后的RelA蛋白。用于亲和纯化的相同输入裂解物的RelA和对照β-肌动蛋白免疫印迹显示在面板下方。(图11B)以β-肌动蛋白作为负载对照，通过用抗RelA抗体探测的免疫印迹法检测内源性RelA蛋白水平。与未治疗对照组相比，量化相对总RelA水平(通过总β-肌动蛋白标准化)。与未处理对照组相比，*，p<0.05。显著性由单因素方差分析和Tukey后检验确定。(图11C)用载体(甲醇)、NO2-OA(5μM)或NO2-SA(5μM)处理MDA-MB-231或MDA-MB-468细胞6小时，然后收集细胞裂解物并用抗RelA抗体免疫沉淀，然后进行免疫印迹。免疫沉淀RelA蛋白的下拉水平显示在面板下方。
图12A-12B：组合指数的测定。每天用他拉唑帕尼(0.01-75μM)加OA-NO2(图12A)和7-NDA(图12B)(0.2-12μM))处理MDA-MB-231细胞共3天，通过ATP(细胞滴度Glo)的发光检测来测定其生长抑制(相对细胞数)。组合指数(Cl)采用Chou-Talalay方法计算(17)。CI<1具有协同作用。3个独立实验的平均值。与OA-NO2相比，7-NDA具有更好的Cl值。两者都能提高标准化疗(PARPi、放疗、阿霉素、铂)的附加或协同杀伤TNBC肿瘤细胞。
图13A是不同DNA DSB修复途径的示意图。DNA双链断裂修复包括四条途径：典型非同源末端连接(c-NHEJ)、选择性连接(ALT-EJ)、单链退火(SSA)和同源重组定向修复(HDR)。虽然在连接前NHEJ不需要同源性(同源序列)来桥接DSB，但ALT-EJ需要在连接前通过短距离同源性来介导桥接DSB。SSA利用侧翼同源性桥接DNA损伤，导致重复序列之间出现缺失。HDR是DSB修复的主要事件，它涉及至少一条来自DSB的链侵入同源模板，该链模板新生的DNA合成以形成延伸链，该延伸链可以形成到DSB另一端的桥。同源链侵入步骤由重组酶Rad51催化。末端切除是处理染色体DSB以产生单链DNA。这些途径中的每一种都涉及一组特定的DNA修复蛋白(图13A)。
图13B是检测OA-NO2对图14A中描述的不同DNA DSB修复途径的作用的GFP报告基因分析。用I-SceI质粒转染含有GFP报告基因构建体DR-GFP的U2OS细胞，并用载体(灰色)、5μM OA(绿色)或5μM OA-NO2(红色)处理。在48小时时用流式细胞术检测GFP阳性细胞的数量。GFP报告子测量NHEJ:n＝3，SSA:n＝3；HDR:n＝3；Alt EJ:n＝l。
图14：NO2-OA与他拉唑帕尼联合治疗的肿瘤体积。将MDA-MB-231细胞原位注射于裸鼠乳腺脂肪垫内。用卡尺测量用OA(15mg/kg)+载体(n＝8)、NO2-OA(15mg/kg)+载体(n＝7)、OA+他拉唑帕尼(0.3mg/kg)(n＝10)或NO2-OA(15mg/kg)+他拉唑帕尼(0.3mg/kg)治疗的小鼠中随时间的肿瘤体积。
图15描绘了合成杀伤力概念的方案，其中将硝基烯(例如CP-1)和PARP抑制剂组合。具有高活性的DNA修复机制和CP-1的肿瘤细胞抑制双链DNA断裂修复(同源重组)。与单链DNA断裂修复的PARP抑制剂CP-1+PARPi联合使用可诱导合成杀伤力。这是通过抑制DSB和SSB修复来实现的。
图16A是显示硝基烯(例如，甲基-乙基-4-硝基-辛-4-烯二酸(指定为“CP-1”)诱导比OA-NO2更低的EC50来抑制MDA-MB-231TNBC细胞生长的曲线图。图16B是显示抑制U2OS GFP报告基因构建体中同源重组的示意图。
图17A和17B是显示CP-1使人高等级浆液性卵巢癌细胞对PARP抑制剂敏感并且降低50％肿瘤细胞杀伤所需的PARP抑制剂奥拉帕尼(图17A)和他拉唑帕尼(图17B)的浓度的示意图。细胞生长/活力通过发光检测细胞ATP浓度来确定。
图18：MDA-MB-231TNBC细胞对7-NDA和8-NDA的敏感性高于OA-NO2。用ATP细胞滴度Glo增殖法测定生长抑制率，并用不同浓度的化合物测定其EC50。CP-1的EC50最低，其次是7-NDA和8-NDA。OA-NO2具有更高的EC50，OA不诱导任何生长抑制(n＝3)。
对MDA-MB-231TNBC细胞中的7-NDA和8-NDA的不同代谢途径进行了研究。MDA-MB231TNBC细胞通过β氧化结合并代谢7-NDA和8-NDA(图19)。活性7-NDA和8-NDA硝基烯的失活通过还原成硝基烷烃来实现(图20)。进一步的代谢包括与谷胱甘肽的反应和半胱氨酸加合物的形成(图21)和ε羟基化和羧化(图22)。
图19：用7-NDA处理MDA-MB 231TNBC细胞不会产生含有硝基烯的活性代谢物，这是通过观察dinor和tetranor 7-NDA的形成来评估的。Dinor 7-NDA对应一个β氧化循环，而tetranor对应两个β氧化循环。相反，用8-NDA处理会产生活性(具有活性硝基烯部分的结构)β-氧化产物。示出了Dinor和Tetranor 8-NDA的形成。色谱图对应于通过在三重四极质谱仪上使用MRMs在负离子模式下对不同化合物进行的HPLC-MSMS检测。
图20：MDA-MB231TNBC细胞同时使7-NDA和8-NDA失活，分别形成还原的7-NDA和还原的8-NDA。得到了形成还原的tetranor 8-NDA的证据，而观察到没有形成还原的tetranor7-NDA。色谱图对应于通过在三重四极质谱仪上使用MRMs在负离子模式下对不同化合物进行的HPLC-MSMS检测。
图21：MDA-MB 231TNBC细胞皆代谢7-NDA和8-NDA，形成半胱氨酸加合物，该半胱氨酸加合物在细胞培养基和细胞匀浆中检测得到。色谱图对应于通过在三重四极质谱仪上使用特定的MRM转换对不同化合物进行的HPLC-MSMS检测。
图22：MDA-MB231TNBC细胞都通过ω羟基化和羧化来代谢7-NDA和8-NDA。用10μm7-NDA和8-NDA处理细胞，在细胞培养基和细胞匀浆中检测到7-NDA和8-NDA的二羧酸。色谱图对应于通过在三重四极质谱仪上使用特定的MRM跃迁对不同化合物进行的HPLC-MSMS检测。
具体实施方式
术语
提供以下术语和方法的解释以更好地描述本发明化合物、组合物和方法，并指导本领域普通技术人员实施本发明。还应理解，在本发明中使用的术语仅用于描述特定实施方案和示例，而不是旨在限制。
本文所用的“给药(施用)”包括另一人对个体的给药或个体的自我给药。
“烯基”指仅含碳和氢的环状、支链或直链基团，包含一个或多个可共轭或不可共轭的双键。烯基可以是未取代的或被取代的。“低级烯”基含有1-6个碳原子。
术语“烷基”是指支链或非支链的饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、癸基、十四基、十六基、二十烷基、二十四烷基等。烷基基团可以是“取代的烷基”，其中一个或多个氢原子被卤素、环烷基、烷氧基、氨基、羟基、芳基、烯基或羧基等取代基取代。例如，低级烷基或(C1-C6)烷基可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、戊基、3-戊基或己基；(C3-C6)环烷基可以是环丙基、环丁基、环戊基或环己基；(C3-C6)环烷基(C1-C6)烷基可以是环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基，2-环丙基乙基、2-环丁基乙基、2-环戊基乙基或2-环己基乙基；(C1-C6)烷氧基可以是甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、戊氧基、3-戊氧基或己氧基；(C2-C6)烯基可以是乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基或5-己烯基；(C2-C6)炔基可以是炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基或5-己炔基；(C1-C6)烷酰基可以是乙酰基、丙酰基或丁酰基；卤代(C1-C6)烷基可以是碘甲基、溴甲基、氯甲基、氟甲基、三氟甲基、2-氯乙基、2-氟乙基、2,2,2-三氟乙基或五氟乙基；羟基(C1-C6)烷基可以是羟甲基、1-羟基乙基、2-羟基乙基、1-羟基丙基、2-羟基丙基、3-羟基丙基、1-羟基丁基、4-羟基丁基、1-羟基戊基、5-羟基戊基、1-羟基己基或6-羟基己基；(C1-C6)烷氧基羰基可以是甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基、丁氧基羰基、戊氧基羰基或己基氧基羰基；(C1-C6)烷硫基可以是甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、丁硫基、异丁基硫基、戊基硫基或己基硫基；(C2-C6)烷酰氧基可以是乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、异丁酰氧基、戊酰氧基或己酰氧基。
“炔基”是指一种仅含碳和氢以及一个或多个叁键的环状、支链或直链基团。炔基可以是未取代的或被取代的。
术语“胺或氨基”指-NRPRq基团，其中Rp和Rq各自独立地指氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)卤代烷基和(C1-C6)羟烷基基团。
动物是指活的多细胞脊椎动物有机体，包括例如哺乳动物和鸟类。术语哺乳动物包括人和非人哺乳动物。类似地，术语“个体”既包括人又包括非人个体，包括鸟类和非人哺乳动物，例如非人灵长类动物、伴生动物(如狗和猫)、牲畜(如猪、羊、牛)以及非驯养动物，如大猫。术语“个体”适用于生物体生命周期的任何阶段。因此，术语“个体”适用于子宫内或卵子内的生物体，这具体取决于该生物体(即该生物体是哺乳动物还是鸟类，如家养或野禽)。
如本文所用，“芳基”是指单环或多环芳香基团，优选单环或双环芳香基团，例如苯基或萘基。除非另有指示，否则芳基基团可以是未取代的或被一个或多个、尤其是独立地选自例如卤代、烷基、烯基、OCF3、NO2、CN、OH、烷氧基、氨基、CO2H、CO2烷基、芳基和杂芳基的1-4个基团取代。示例性芳基基团包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、氯苯基、甲基苯基、甲氧基苯基、三氟甲基苯基、硝基苯基和2,4-甲氧基氯苯基。
术语“生物样品”是指组织、细胞、细胞提取物或均质组织提取物。
术语“共同给药”或“共同施用”是指在相同的时间段内用至少一种其他治疗剂或疗法施用本文所述的化合物，并且不需要在相同的确切时刻施用(尽管共同施用包括在相同的确切时刻施用)。因此，共同给药可在同一天或不同的日子，或在同一周或不同的周。在一些实施方案中，可共同使用两种或更多种药剂。在其它实施方案中，在第二药剂/治疗之前施用第一药剂/治疗。本领域技术人员应理解，所使用的各种药剂或疗法的制剂和/或给药途径可能不同。所属领域的技术人员可以容易地确定用于共同施用的适当剂量。在一些实施方案中，当共同施用药剂或疗法时，以比单独施用它们的更低剂量施用相应药剂或疗法。因此，在药剂或疗法的共同施用降低潜在有害(例如，有毒)药剂的所需剂量和/或降低施用潜在有害(例如，有毒)药剂的频率的实施方案中，共同施用尤其可取。“共同给药”或“共同施用”包括向个体施用两种或两种以上活性剂，以使活性剂和/或其代谢物同时存在于个体中。共同给药包括在单独组合物中同时给药、在不同时间在单独组合物中给药或在其中存在两种或两种以上活性剂的组合物中给药。共同给药还包括经由第一给药途径递送第一药剂和经由第二给药途径递送第二药剂，其中第一给药途径和第二给药途径相同(例如，均为口服)或不同(例如，第一给药途径是口服的，第二给药途径是局部的)。
术语“衍生物”是指衍生自类似化合物的化合物，或者如果一个或多个原子被另一个原子或原子组取代，则可以想象衍生自另一化合物的化合物。
术语“卤代烷基”是指其中C1-C8烷基中的一个或多个氢原子被卤素原子取代的C1-C8烷基基团，所述卤素原子可以是相同或不同的。卤代烷基的示例包括但不限于三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基、五氯乙基和1,1，1-三氟-2-溴-2-氯乙基。
术语“卤素”和“卤代”指-F、-Cl、-Br或-I。
术语“杂原子”意指包括氧(O)、氮(N)和硫(S)。
术语“杂芳基”在这里用于指含有一个或两个芳香环并且在芳香环中含有至少一个氮、氧或硫原子的单环或双环体系。除非另有指示，杂芳基可以是未被取代的或被一个或多个、优选选自例如卤代、烷基、烯基、OCF3、NO2、CN、NC、OH、烷氧基、氨基、CO2H、CO2烷基、芳基和杂芳基的1-4个取代基取代。杂芳基的示例包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡啶基、噁唑基、喹啉基、硫代苯基、异喹啉基、吲哚基、三嗪基、三唑基、异噻唑基、异噁唑基、咪唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基和噻二唑基。
术语“杂环”是指单环、双环、三环或多环系，其是不饱和的或是芳香族的且含有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子，其中氮和硫杂原子任选地被氧化并且氮杂原子任选地季铵化，包括双环和三环系统。杂环可以通过任何杂原子或碳原子连接。杂环包括上文定义的杂芳基。杂环的代表性示例包括但不限于苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、异吲哚基、吲唑基、苯并二唑基、苯并三唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、嘌呤基、吲哚基、异喹啉基、喹啉基和喹唑啉基。杂环基团可以是未取代的或任选地被一个或多个取代基取代。
“杂环烷基”是指含有一个或两个饱和环或不饱和环且环中至少含有一个氮、氧或硫原子的单环或双环体系。术语“环烷基”是指含有一个或两个饱和或不饱和环的单环或双环体系。
术语“羟基烷基”是指具有所指示数量的碳原子的烷基，其中一个或多个烷基氢原子被-OH基团取代。羟基烷基的示例包括但不限于-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2CH2CH2OH、-CH2CH2CH2CH2OH、-CH2CH2CH2CH2CH2OH、-CH2CH2CH2CH2CH2CH2OH及其支链形式。
术语“氧代”是指附着于饱和或不饱和(C3-C8)环状或(C1-C8)非环部分的＝O原子。＝O原子可以连接到是环状或非环部分的一部分的碳、硫和氮原子。
术语“个体”包括人和非人个体，包括鸟类和非人哺乳动物，如非人灵长类动物、伴生动物(如狗和猫)、牲畜(如猪、羊、牛)以及非驯养动物，如大猫。术语“个体”适用于生物体生命周期的任何阶段。因此，术语“个体”适用于子宫内或卵子内的生物体，具体取决于该生物体(即该生物体是哺乳动物还是鸟类，如家养或野禽)。
“治疗有效量”是指在用特定药剂治疗的个体中足以达到预期效果的特定药剂的量。理想情况下，治疗有效量的药剂是足以抑制或治疗疾病或状况而不对个体造成实质性细胞毒性作用的量。药剂的治疗有效量将取决于所治疗的个体、痛苦的严重程度和治疗组合物的施用方式。
“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后，对其症状或体征进行改善的治疗性干预，或向未表现出疾病迹象或仅表现出早期迹象的个体施用化合物或组合物，以降低发生病理学或病况的风险，或降低病理学或病况的严重性。如本文所使用的，相对于疾病或病理状况，术语“改善”是指治疗的任何可观察到的有益效果。例如，可通过易感个体中疾病的临床症状的延迟出现、疾病的部分或全部临床症状的严重程度的降低、疾病的缓慢进展、个体的整体健康或福祉的改善来证明有益效果，或者通过特定于特定疾病的本领域公知的其他参数。短语“治疗疾病”是指抑制疾病在例如有患病风险的个体中的全面发展。“预防”疾病或状况是指为降低发生病理或状况的风险，或降低病理或状况的严重性，对未表现出疾病迹象或仅表现出早期迹象的个体预防性地施用组合物。在某些实施方案中，治疗疾病是指抑制疾病的转移。
“药物组合物”是包含一定量(例如，单位剂量)的一种或多种所述化合物以及一种或多种无毒的药学上可接受的添加剂(包括载体、稀释剂和/或佐剂)和任选的其他生物活性成分的组合物。此类药物组合物可藉由标准药物调配技术来制备，例如在雷明顿医药科学(Remington’s pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA)(第19版)中所揭示者。
本发明化合物可以以各种异构形式存在，包括构型异构体、几何异构体和构象异构体，以及以各种互变异构形式存在，特别是那些在氢原子附着点上不同的异构体。术语“异构体”旨在涵盖本发明化合物的所有异构形式，包括该化合物的互变异构形式。
这里描述的某些化合物可具有不对称中心，因此以不同的对映体和非对映体形式存在。本发明的化合物可以是光学异构体或非对映异构体的形式。因此，本发明包含以其光学异构体、非对映异构体及其混合物(包括外消旋混合物)形式存在的化合物。本发明化合物的光学异构体可通过已知技术获得，如不对称合成、手性色谱、模拟移动床技术或通过使用光学活性拆分剂对立体异构体进行化学分离。除非另有说明，“立体异构体”意指化合物的一种立体异构体，它基本上不含该化合物的其他立体异构体。因此，具有一个手性中心的立体纯化合物将基本上不含该化合物的对映体。具有两个手性中心的立体纯化合物将基本上不含该化合物的其他非对映体。典型的立体纯化合物包含大于约80重量％的该化合物的一个立体异构体和小于约20重量％的该化合物的其他立体异构体，例如，大于约90％(按重量计)的化合物的一个立体异构体和小于约10％(按重量计)的化合物的其他立体异构体，或大于约95％(按重量计)的化合物的一个立体异构体和小于约5％(按重量计)的化合物的其他立体异构体，或大于该化合物的一种立体异构体的约97重量％且小于该化合物的其它立体异构体的约3重量％。
术语“前药”表示化合物的衍生物，其可在体外或体内的生物条件下水解、氧化或以其他方式反应以提供活性化合物，尤其是本发明化合物。前药的示例包括但不限于本发明化合物的衍生物和代谢物，其包括可生物水解基团，如可生物水解酰胺、可生物水解酯、可生物水解氨基甲酸酯、可生物水解碳酸酯、可生物水解酯脲和可生物水解的磷酸酯类似物(例如，一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯)。例如，具有羧基官能团的化合物的前药是羧酸的低级烷基酯。羧酸酯可通过酯化分子上的任何羧酸部分方便地形成。前药通常可以使用众所周知的方法制备，例如BURGERS Medical CHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY第6版(Wiley，2001)和DESIGN AND APPLICATION OF Prodrugs(Harwood Academic PublishersGmbh，1985)中描述的那些方法。
本文所述的一个实施方案涉及共同施用治疗有效量的化合物(a)以及治疗有效量的用于治疗癌症的至少一种抗肿瘤剂(b)，所述化合物(a)选自(a)(i)硝基烯脂肪酸、(a)(ii)具有吸电子基团、离去基团和在在吸电子基团和离去基团之间的碳-碳双键的不饱和脂肪酸、(a)(iii)硫代硝基脂肪酸、(a)(iv)含有吸电子基团的二羧酸化合物、或其混合物。与化合物(a)的共同施用可增强所述抗肿瘤剂的抗增殖和诱导凋亡作用。共同施用对治疗癌症特别有用。
在某些实施方案中，所公开的组合疗法可用于治疗任何类型的赘生物(例如，癌症)。肿瘤或赘生物包括组织的新生长，其中细胞的增殖是不受控制的并且是进行性的。这样的生长有些是良性的，而另一些则是“恶性”的，导致有机体死亡。恶性赘生物或“癌症”与良性生长的区别在于它们除了表现出侵袭性的细胞增殖外，还侵入周围组织并转移。此外，恶性赘生物的特征在于它们表现出更大的分化丧失(更大的“去分化”)，以及它们的组织相对于彼此和周围组织的丧失。这种特性也被称为“间变性”。
说明性赘生物包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤(Wilms’s tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。
在某些实施方案中，本发明公开的方法涉及用于抑制癌症生长的方法，包括生物系统中的细胞增殖、侵袭和转移过程。优选地，所述方法用于抑制或减少哺乳动物等活体动物中的癌细胞增殖、侵袭性、转移或肿瘤发生率。
本文还提供一种在癌细胞中诱导细胞毒性(细胞杀伤)或降低癌细胞活力的方法。
具体的说明性的癌症包括具有DNA修复基因缺陷的遗传病因的癌症、具有自发基因组不稳定率高的癌症、对DNA损伤剂反应良好的癌症或对DNA损伤剂与免疫治疗的组合反应良好的癌症。说明性癌症包括乳腺癌(尤其是三阴性乳腺癌)、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌(胶质母细胞瘤)、胰腺癌、皮肤癌(如黑色素瘤)。获得扩散(转移)能力且高度基因组不稳定的癌细胞特别适于本文所述的联合治疗。
在某些实施方案中，化合物(a)是RAD51抑制剂，从而抑制HDR，以及SSA的有效抑制剂，如下文更详细地描述。
在某些实施方案中，化合物(a)与聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂(PARPi)共同施用，如下更详细地描述。
化合物(a)(i)-硝基烯脂肪酸
在某些实施方案中，(a)(i)硝基烯脂肪酸是包含至少一个碳-碳双键和至少一个硝基的化合物。例如，在美国专利号7,776,916中描述了某些硝基烯脂肪酸。
硝基烯脂肪酸的一个说明性实施方案为式I者：
Figure BDA0003062146500000111
其中R1为氢、C1-C24烷基、C1-C24烯基或C1-C24炔基；
R2、R3、R7和R8各自独立地是氢、氧、C1-C24烷基、NO2、OH或OOH；
R4是末端COOR6基团，其中R6为氢、C1-C24烷基或药学上可接受的反离子；
R5是氢、C1-C24烷基，或R4和R5共同形成＝C(R9)(R10)，其中R9包括C1-C24烷基、C1-C24烯基或C1-C24炔基，或者其中R9为末端COOR6基团，且R10是氢、NO2、OH或OOH；
n是1-24；并且
其中所述硝基烯脂肪酸包括至少一个NO2基团。
在某些实施方案中，R3和R8各自独立地是氢、氧、C1-C24烷基、NO2、CN、CHO、OH或OOH；并且R2和R7各自独立地是氢、氧或C1-C24烷基。
在某些实施方案中，R1是C1-C24烷基，更具体地是C3-C20烷基。
在某些实施方案中，R2是氢。
在某些实施方案中，R3或R8中的一者是NO2，而R3或R8中的另一者是氢。
在某些实施方案中，n是3-20。
在某些实施方案中，R4为-COOH。
在某些实施方案中，R5是氢。
在某些实施方案中，R7是氢。
在某些实施方案中，R4是-COOH；R5是甲基；R7是甲基。
在某些实施方案中，所述硝基烯脂肪酸为式II者：
Figure BDA0003062146500000112
其中R1、R2、R3、R7、R8、R9和R10与式I中的相同。在某些实施方案中，R1、R2和R9与式I中的相同，并且R3、R7、R8和R10各自独立地是氢、氧、C1-C24烷基、NO2、CN、CHO、OH或OOH。
在某些实施方案中，所述硝基烯脂肪酸为式III者：
Figure BDA0003062146500000121
其中R1是C1-C24烷基、C1-C24烯基或C1-C24炔基；
R2和R12各自独立地是氢、NO2、ONOO2、ONO、OH或OOH；以及
R13为末端COOR6基团，其中R6是氢、C1-C24烷基或药学上可接受的反离子，
并且所述硝基烯脂肪酸包括至少一个NO2基团。
在某些实施方案中，R2和R12各自独立地是氢、NO2、OH或OOH。
在某些实施方案中，所述硝基烯脂肪酸是10-硝基-十八碳-9-烯酸(NO2-OA)。
在某些实施方案中，所述硝基烯脂肪酸是7-NO2-十九碳-7-烯酸(7-NDA)或8-NO2-十九碳-7-烯酸(8-NDA)。
在某些实施方案中，所述硝基烯脂肪酸(本文称为“7-NDA”)为：
Figure BDA0003062146500000122
在某些实施方案中，所述硝基烯脂肪酸(在本文中称为“8-NDA”)为：
Figure BDA0003062146500000123
在某些实施方案中，所述硝基烯脂肪酸为5-NO2-二十碳-5-烯酸或6-NO2-二十碳-5-烯酸。
在某些实施方案中，所述硝基烯脂肪酸基本上是纯的。在这方面，关于碳-碳双键的立体化学基本上是顺式(或Z)或基本上是反式(或E)。
化合物(a)(ii)-具有吸电子基团、离去基团和在吸电子基团和离去基团之间的碳-碳双键的不饱和脂肪酸
在某些实施方案中，在例如第WO 2018/067709号PCT公开中描述了具有吸电子基团、离去基团和在所述吸电子基团和所述离去基团之间的碳-碳双键的(a)(ii)不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，这些不饱和脂肪酸可以是吸电子基团为硝基(-NO2)的活性脂肪酸的氮氧化物，并且在具体实施方案中，该不饱和脂肪酸可以是硝基烯的氮氧化物，其中所述吸电子基团是硝基(-NO2)，而所述离去基团可以是氮氧化物，例如硝酸盐(-ONO2)或亚硝酸盐(-ONO)。在某些实施方案中，化合物(a)(ii)为前药，其中亚硝酸盐或硝酸盐取代基被裂解，并且烯烃移位以产生活化的硝基烯产物。如本文所用，“活化的脂肪酸”是指具有至少一个与脂肪酸的饱和或不饱和脂肪族链共价结合的吸电子基团的脂肪酸。所述活化的脂肪酸可包括在任何数目的位置被任何数目的吸电子基团取代的脂肪族链，并且此等吸电子基团可与或不与碳-碳双键结合。类似地，硝基烯的氮氧化物衍生物可包括具有任意数量的双键的脂肪族链，其可与吸电子基团有关，也可与吸电子基团无关。在某些实施方案中，离去基团可定位于不饱和脂肪族链的β碳、γ碳或δ碳，其中吸电子基团附着于α碳。
例如，一些实施方案的所述化合物可以为通式IV者：
Figure BDA0003062146500000131
其中R1为任何吸电子基团，包括但不限于-COH、-COR、-COOH、-COOR、-Cl、-F、-Br、-I、-CF3、-CN、-SO3-、-SO2R、-SO3H、-NH3 +、-NH2R+、-NHR2 +、-NR3 +和-NO2；R2为离去基团，包括但不限于-OC(O)(C1-4)、-ONO2、-OPO(OH)2、-OSO3和其他无机酯；X1和X2是-H、-COH、-COR、-COOH、-COOR、-COCF3和-CF2R；m和n独立地是1到10的整数，以及包含它们的组合物。
在其它实施方案中的化合物可为通式V者：
Figure BDA0003062146500000132
其中R1是-H或任何吸电子基团，包括但不限于-COH、-COR、-COOH、-COOR、-Cl、-F、-Br、-I、-CF3、-CN、-SO3-、-SO2R、-SO3H、-NH3 +、-NH2R+、-NHR2 +、-NR3 +和-NO2；R2是离去基团，包括但不限于-OC(O)(C1-4)、-ONO2、-OPO(OH)2、-OSO3和其他无机酯；X1和X2是-H、-COH、-COR，-COOH、-COOR、-COCF3和-CF2R；m和n是1到10的整数，以及包含它们的组合物。
在某些实施方案中，硝基烯的氮氧化物可为通式VI者：
Figure BDA0003062146500000133
其中m和n独立地是1到10的整数，以及包含它们的组合物。
在一些实施方案中，硝基烯的氮氧化物可为式VII者：
Figure BDA0003062146500000134
在某些实施方案中，式VI的硝基烯的氮氧化物为(E)-9-硝基-12-(硝基氧基)十八碳-10-烯酸、共轭亚油酸的氮氧化物或NO2-NO3-CLA。
在这些实施方案中，吸电子基团可定位在原始双键中的E或Z构型中，或位于sp3手性/立体发生中心处的R或S绝对立体化学中。例如，在一个实施方案中，硝基烯的氮氧化物衍生物可具有一个吸电子基团，并且在另一实施方案中，硝基烯的氮氧化物衍生物可在沿着烃链的多个位置处被多个吸电子基团取代。尽管硝基烯的可逆氮氧化物衍生物可具有位于羧基末端碳与末端甲基(ω位)之间的脂肪族烃链上的任何碳上的吸电子基团，但在一些实施方案中，所述吸电子基团可位于羧基末端碳或甲基末端碳的大约3个碳内，并且在其它实施方案中，所述吸电子基团可位于羧基末端碳或甲基末端碳中任一者的5个碳内。在其他实施方案中，所述吸电子基团可位于羧基末端碳和/或甲基末端碳中任一者的7个碳内，并且在另一实施方案中，所述吸电子基团可位于羧基末端碳和/或甲基末端碳中任一者的9个碳内。
在某些实施方案中，吸电子基团可定位在源自形成“吸电子乙烯基”的活性脂肪酸双键的碳上。此类乙烯基的吸电子基团可位于双键的任一侧。脂肪酸可以在脂肪烃链上的任何碳上具有一个或多个吸电子乙烯基，并且不饱和脂肪酸可以有几种方式具有一个吸电子基。在一个实施方案中，源自在第9(C-9)和第10(C-10)碳之间具有一个双键(表示为“18：1”)的18碳ω-9脂肪酸的油酸可逆氮氧化物(十八碳-9-烯酸，OA)可在C-9或C-10处具有吸电子基团，并且在交替位置处具有离去基团。在另一示例性实施方案中，亚油酸的氮氧化物(十八碳-9,12-二烯酸)起源于在ω-6(C-13)和-7(C-12)碳与ω-9(C-10)和10(C-9)碳之间具有两个双键(表示为“18:2”)的18碳ω-6脂肪酸，可具有在C-9或C-10处或C-12或C-13处的吸电子基团，位于相应的交替相邻位置的离去基团以及位于吸电子基团和离去基团之间的至少一个碳-碳双键。在另一实施方案中，亚油酸的可逆氮氧化物可具有在C-9或C-10或C-12或C-13处的吸电子基团，在相应的交替相邻位置处的离去基团以及在离去基团附近的至少一个碳-碳双键。类似地，起源于具有3、4、5、6或更多个双键的其他多不饱和脂肪酸可具有在任何原始双键碳的任一位置处的一个吸电子基团以及在相应的替代位置处的离去基团，碳-碳单键在吸电子基团和离去基团之间，离去基团包括所有可能的位置排列和吸电子基团。
术语“吸电子基团”在本领域中是公认的，并且表示取代基从相邻原子吸引有价电子的趋势，即、取代基相对于相邻原子是电负性的。术语“亲核”或“给电子基团”在本领域中是公认的，并且表示取代基从相邻原子提供过量价态电子的趋势，即、取代基相对于相邻原子是电正的。吸电子能力水平的量化由Hammett-sigma(σ)常数给出(参见J.March，Advanced Organic Chemistry，McGraw-Hill Book Company，New York，(1977年版)第251-259页)。给电子基团的Hammett常数一般为负值，而吸电子基团的Hammett常数一般为正值。例如，对位取代NH2(σ[P])的Hammett常数约为-0.7，硝基的σ[P]约为+0.8。
实施方案包括任何已知的吸电子基团。例如，吸电子基团可包括但不限于醛(-COH)、酰基(-COR)、羧酸(-COOH)、酯(-COOR)、卤化物(-C1、F、-Br等)、氟甲基(-CF3)、氟烷基(-CFnH2-nR)、氰基(-CN)、亚砜(-SOR)、磺酰基(-SO2R)、磺酸酯(SO3R)、1°、2°和3°铵(-NR3 +)、以及硝基(-NO2)，其中每个R可独立地为氢、甲基或C2至C6烷基、烯基或炔基。在一些实施方案中，吸电子基团可以是σ至少约为0.2的强吸电子基团，并且在某些实施方案中，吸电子基团可以形成偶极子。例如，在特定实施方案中，吸电子基团可为硝基、铵基或磺酰基。
术语“离去基团”在本领域中是公认的，并且表示在异构化键断裂期间取代基离开具有一对电子的母体分子的趋势。所包含的离去基团例如包括-OC(O)(C1-4)、-ONO2、-OPO(OH)2、-OSO3、其它无机酯等。
实施方案的脂肪酸可以是本领域已知的任何不饱和以及多不饱和脂肪酸。术语“脂肪酸”描述脂肪族单羧酸。各种实施方案包括具有与所鉴定的天然存在的脂肪酸相同或相似的脂肪族烃链的活化脂肪酸。例如，已知天然存在的脂肪酸的脂肪族烃链通常是非支化的，并且包含偶数个约4到约24个碳，并且其他的则包括在脂肪族烃链中具有12到18个碳的脂肪酸。在其他实施方案中，脂肪酸在脂肪族烃链中可具有大于24个碳。实施方案包含此类天然存在的脂肪酸以及非天然存在的脂肪酸，其可包含奇数个碳和/或包括杂原子的非天然存在的连接物。因此，一些实施方案包括具有奇数个碳的脂肪酸，例如，5到23个碳，并且在其他实施方案中，11到17个碳。在另外其它实施方案中，实施方案的脂肪酸可具有大于23个碳。天然和非天然存在的脂肪酸也可在沿着烃链的一个或多个位置支化，并且在各种实施方案中，每个支链可包括1到24个碳、2到20个碳或4到18个碳的脂肪族烃链，其中每个支链可具有偶数或奇数个碳。
各种实施方案的脂肪酸的脂肪族烃链可是不饱和或多不饱和。术语“不饱和”指具有包含至少一个双键和/或取代基的脂肪族烃链的脂肪酸。相反，“饱和”烃链不包括任何双键或取代基。因此，烃链上的每个碳都是饱和的，并具有最多数量的氢。一般来说，“多不饱和”是指具有一个以上双键的烃链的脂肪酸。各种实施方案的不饱和或多不饱和脂肪酸的双键可位于沿着脂肪族烃链的任何位置并且可为顺式或反式构型。术语“顺式”是指双键，其中与双键相邻的碳位于同一侧；术语“反式”是指双键，其中与双键相邻的碳位于相反一侧。通常，“顺式”与Z相同，“反式”与E相同，但有时IUPAC命名化合物的规则会给出与非碳取代基相反的结果，这是硝基烯的典型情况。例如，硝基烯可以有两个碳基“顺式”，但在命名化合物时优先使用的两个碳基(烯烃的一个碳上的硝基和烯烃的另一个碳上的碳基)在相反的侧面，因此是E。因此，“顺式”双键的硝基烯类似物称为E硝基烯。类似地，“反式”双键的硝基烯类似物被称为Z硝基烯。在不希望受到理论约束的情况下，沿着碳链的顺式构型的双键(顺式碳链，但E-硝基烯)可能会导致碳氢链弯曲。沿着碳链的“反式”构型的双键(反式碳链但Z-硝基烯)可能不会导致烃链弯曲。实施方案可包括具有E或Z构型的双键的硝基烯的可逆氮氧化物衍生物，并包括可包含含有顺式和反式的硝基烯的氮氧化物衍生物与硝基烯的氮氧化物衍生物的区域异构体的组合的组合物。
许多不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸已被确定，并已知是天然存在的。这种不饱和或多不饱和的天然脂肪酸，通常在其脂肪烃链中含有偶数个碳。例如，天然存在的不饱和或多不饱和脂肪酸可以具有4、6、8、10、12、14、16、18、20、22个等碳，并且可以包括ω-3、ω-5、ω-6、ω-7、ω-9碳-碳双键。任何这样的脂肪酸在化合物中都是有用的。符号ω用于表示脂肪烃链的末端甲基碳。ω-X脂肪酸的双键的位置是碳-碳键X距离ω碳的碳数。例如，ω-6脂肪酸在第6和第7个碳之间有一个双键，从ω碳向后计数，而ω-3脂肪酸在第3和第4个碳之间有一个双键，从ω碳向后计数。各种实施方案包括硝化ω-3脂肪酸包括但不限于亚麻酸、α-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸和硬脂酸；硝化ω-5脂肪酸包括但不限于肉豆蔻油酸；硝化ω-6脂肪酸包括但不限于亚油酸、γ-亚油酸、二高γ-亚油酸和花生四烯酸；硝化ω-7脂肪酸包括但不限于共轭亚油酸和棕榈油酸；硝化ω-9脂肪酸包括但不限于油酸和芥酸。当然，脂肪酸也可以使用IUPAC命名法，其中双键的位置通过计算羧酸的碳和‘C-X’来确定，使用IUPAC命名法表示脂肪烃中的碳，其中X是从羧酸(包括羰基碳本身)计数的碳数。实施方案还包括天然存在的脂肪酸及其衍生物的合成等价物。
其他实施方案包括不饱和或多不饱和的非天然存在的脂肪酸，其可具有奇数个碳，例如5、7、9、11、13、15、17、19、21等。与天然脂肪酸一样，与非天然脂肪酸相关联的一个或多个双键可位于脂肪烃链上的任何位置，并且双键可为顺式或反式构型。在又一其它实施方案中，非天然存在的脂肪酸可包括一个或多个中断脂肪族烃链的连接基。例如，在一些实施方案中，活化的脂肪酸可在脂肪族烃链内的任何位置具有一个或多个非碳-碳键，例如酯、醚、乙烯基醚、硫醚、氨基、亚胺等。
在其他实施方案中，活化的脂肪酸的氮氧化物的羧基末端可进行修饰。例如，在一些实施方案中，活化的脂肪酸的氮氧化物可包括与脂肪酸的羧基末端相结合的甘油以产生甘油脂质，并且此类甘油脂质可为甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯，其中甘油二或三酯的至少一种脂肪酸可以是活化的硝酸脂肪酸，而任何剩余的脂肪酸可以是饱和或不饱和脂肪酸。类似地，在其他实施方案中，糖可与氮氧化物活化的脂肪酸的羧基末端结合以形成糖脂。在这些实施方案中，本领域已知的任何糖可以是糖脂的糖部分，包括但不限于半乳糖和葡萄糖。在又一其它实施方案中，糖可与甘油酯(其与活化的硝酸脂肪酸的羧基末端相结合)的甘油酯相结合以形成甘油糖脂，其可具有与甘油糖脂的甘油部分相结合的一个或两个活化的脂肪酸，并且，在仅一种活化脂肪酸与甘油-糖脂相结合的实施方案中，甘油上的剩余位置可包括饱和或不饱和脂肪酸或氢、烷基或诸如醇、胺、磷酸酯、膦酸、硫醇、磺酸等的官能团。在某些实施方案中，活化的脂肪酸的羧基末端可与磷酸酯结合以形成磷脂。在这些实施方案中，磷酸酯可通过羧基末端直接与脂肪酸结合，或磷酸酯可与甘油二酯结合，其中一个或两个活化的脂肪酸连接甘油部分，并且在只有一个活化的硝酸的实施方案中，脂肪酸连接甘油，甘油上的剩余位置可包括饱和或不饱和脂肪酸或氢、烷基或诸如醇、胺、磷酸酯、膦酸、硫醇、磺酸等的官能团。在进一步实施方案中，活化的脂肪酸的羧基末端可与胆固醇或其他甾醇部分相结合。在又一其它实施方案中，所述羧基末端可通过二级活性剂的共价连接来修饰。在特定实施方案中，羧基末端修饰包括甘油但不包括硝基。在不受理论约束的情况下，活化的硝酸脂肪酸的羧基末端的修饰可增强给药后活性脂肪酸的分配，也可通过抑制给药后线粒体中的β-氧化来提高活性脂肪酸的弹性。
化合物(a)(iii)-硫醇加合硝基脂肪酸(“硫醇化脂肪酸”)
硝基油酸作为候选药物使用的一个潜在障碍是它的快速代谢，这是β-氧化反应和前列腺素还原酶1还原硝基烯的结果，在肝脏中第一次通过，与谷胱甘肽可逆的加合和排泄。为了提高疗效，药物必须经受第一次代谢。活性药物会在肠道微生物群和肝脏内代谢，因此必须加以保护，以便适当地将有效量的活性药物输送到循环中。
通过硝基烯的可逆硫醇化修饰硝基烯脂肪酸可防止其代谢失活，从而保持硝基烯脂肪酸的潜在亲电特性。当巯基或多巯基取代基解离时，“活化的”硝基烯产物能够靶向RAD51或其他DNA修复蛋白中具有重要功能的亲核残基。
例如，在PCT公开WO 2018/067705中描述了硫醇化脂肪酸的示例。
实施方案通常涉及硫醇化亲电不饱和的活化的脂肪酸，尤其是硫醇化不饱和硝化脂肪酸。如本文所用，“活化的脂肪酸”是指具有至少一个与脂肪酸的饱和或不饱和脂肪族链的不饱和碳共价结合的吸电子基团的脂肪酸。此等活化的脂肪酸可包括在烃链上任何数量的位置处被任何数量的吸电子基团取代的脂肪族链，并且吸电子基团可与或不与碳-碳双键相结合。类似地，本文所述的硫醇化的活化的脂肪酸可包括具有任意数目的双键的脂肪族链(其可与或不与吸电子基团相结合)和含硫基团(即硫醇基团)。在某些实施方案中，含硫基团可定位于不饱和脂肪族链的β碳、γ碳或δ碳处，其中吸电子基团附着于α碳。
硝基烯的亲电双键被H(S)xR可逆地保护，形成硫醇化的活化的脂肪酸。这种硫醇化的活化的脂肪酸现在是一种前药并且避免了首次通过时的代谢过程。亲电双键在保护基团丢失后再生，如下所述:
Figure BDA0003062146500000161
例如，一些实施方案的硫代活化脂肪酸可为通式VIII者：
Figure BDA0003062146500000162
其中，R是氢(-H)、甲基或C2-C6烷基、烯基或炔基，或(S)xR可以是含硫官能团，例如，亚磺基(-SOOH)、磺基(-SOOOH)或硫氰酸酯(-SCN)，x是1-5的整数，q和m各自独立地是1-10的整数。式VIII的化合物包含在β碳上的含硫基团。
其他硫醇化的活化的脂肪酸包括通式IX的化合物：
Figure BDA0003062146500000171
其中R是氢(-H)、甲基或C2-C6烷基、烯基或炔基，或(S)xR可以是含硫官能团，例如亚硫基(-SOOH)、磺基(-SOOOH)或硫氰酸酯(-SCN)，x是1-5的整数，q和m各自独立地是1-10的整数。式IX化合物包括δ碳处的含硫基团。
在一些实施方案中，式VIII或IX中的R可为双官能烷基、烯基或炔基，其附着于形成桥连或环状结构的活化的脂肪酸的羧基。在此类实施方案中，含硫部分可定位于β、χ或δ碳。例如，通式Xa和Xb的化合物，其包括β碳处的环化双功能含硫部分：
Figure BDA0003062146500000172
其中每个Y独立地是氧(O)或氮(N)，每个x独立地是1-5的整数，并且q、m、p和t独立地是1-10的整数。
在一些实施方案中，含硫基团可加入两种活化的脂肪酸。例如，各种实施方案针对通式XI的化合物：
Figure BDA0003062146500000173
其中R1和R2独立地选自-H和任何吸电子基团，包括但不限于-COH、-COR、-COOH、-COOR、-Cl、-F、-Br、-I、-CF3、-CN、-SO3-、-SO2R、-SO3H、-NH3 +、-NH2R+、-NHR2 +、-NR3 +和-NO2，其中R1和R2中的至少一者是吸电子基团；其中Y1和Y2独立地选自-H、-COH、-COR、-COOH和-COOR，其中R1和R2中的至少一者是吸电子基团；并且其中x是1-5的整数，并且q、m、p和t独立地是1-5的整数，以及包含该化合物的组合物。
各种实施方案针对通式XII、Xllb和XIIc的化合物：
Figure BDA0003062146500000174
Figure BDA0003062146500000181
其中x是1-5的整数，q、m、p和t独立地是1-10的整数，并且包含它们的组合物。
其它实施方案包括式XIII化合物：
Figure BDA0003062146500000182
其中x是1-5的整数，以及包含它们的组合物。
在一些实施方案中，所述化合物是硫醇化的硝基油酸(NO2-OA-Sx)物种，如式XIV所示：
Figure BDA0003062146500000183
吸电子基团可定位在原始双键中的顺式或反构型，或在sp3手性/立体中心处的R或S绝对立体化学中。例如，在一个实施方案中，硫醇化的活化脂肪酸可以具有一个吸电子基团，在另一个实施方案中，硫醇化的活化的脂肪酸可以在沿碳氢链的多个位置处被多个吸电子基团取代。虽然硫醇化的活化的脂肪酸可以可具有位于羧基末端碳与末端甲基(ω位)之间的脂肪族烃链上的任何碳上的吸电子基团，在一些实施方案中，所述吸电子基团可定位在羧基末端碳和/或甲基末端碳的约3个碳内，并且在其他实施方案中，所述吸电子基团可以定位在羧基末端碳和/或甲基末端碳的5个碳中。在其他实施方案中，所述吸电子基团可位于羧基末端碳和/或甲基末端碳中任一者的7个碳内，并且在进一步实施方案中，所述吸电子基团可位于羧基末端碳和/或甲基末端碳中任一者的9个碳内。
在某些实施方案中，吸电子基团可定位在源自形成“吸电子乙烯基”的活化的脂肪酸双键的碳上。此类乙烯基的吸电子基团可位于双键的任一侧。脂肪酸可以在脂肪烃链上的任何碳上具有一个或多个吸电子乙烯基，并且不饱和脂肪酸可以有几种方式具有一个吸电子基团。在一个实施方案中，源自在9(C-9)和10(C-10)碳之间具有一个双键(表示为“18:1”)的18碳，ω-9脂肪酸的硫醇化的活化油酸(十八碳-9-烯酸)可在C-9或C-10处具有吸电子基团，并且在交替位置处具有硫醇(-SR)。在另一示例性实施方案中，源自18碳，ω-6脂肪酸且在ω-6(C-13)和-7(C-12)碳与ω-9(C-10)和10(C-9)碳之间具有两个双键(表示为“18:2”)的硫醇化的活化亚油酸(十八碳-9,12-二烯酸)可在C-9或C-10或C-l2或C-13处具有吸电子基团，以及相应的交替相邻位置处的硫醇(-SR)。类似地，最初具有3、4、5、6或更多个双键的其他多不饱和脂肪酸可以在任何原始双键碳的任一位置具有一个吸电子，并且在相应的交替相邻位置具有硫醇(-SR)，包括所有可能的位置和吸电子基团的排列。
在其他实施方案中，单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸可具有两个吸电子基团，并且不饱和脂肪酸可以有几种方式具有两个吸电子基团。例如，在一个实施方案中，硫醇化的活性亚油酸(十八碳-9,12-二烯酸)，其来源于18碳，ω-6脂肪酸，在ω-6(C-13)和-7(C-12)碳与ω-9(C-10)和10(C-9)碳之间具有两个双键(表示为“18:2”)，可在位置C-9、C-10、C-12或C-13中的任意两个具有以下可能排列的吸电子基团：C-9和C-12、C-9和C-13、C-10和C-12或C-10和C-13，以及在相应的交替相邻位置处的一个或多个硫醇(-SR)。
与前面描述的具有一个吸电子基团或两个吸电子基团的化合物类似，也可能有三个、四个、五个或更多个吸电子基团。按照上述相同逻辑，在前面描述的具有一个吸电子基团或两个吸电子基团的化合物中，具有3、4、5、6或更多个共轭或非共轭双键的多不饱和脂肪酸可以在任何双键碳上的任何位置处具有多个吸电子基团(三、四、五或更多，如取代允许的位置)，包括所有可能的位置、亲核取代基和吸电子基团的排列。此外，在上述任何实施方案中，任意数量的非吸电子基团可以共价地结合到所述活化的脂肪酸的脂肪族链的碳。例如，在一些实施方案中，所述硫醇化的活化的脂肪酸可以包括一个或多个与所述硫醇化的活化的脂肪酸的脂肪族链的一个或多个碳共价连接的甲基、C2-C6烷基、烯基或炔基或氨基。
术语“吸电子基团”在本领域中是公认的，并且表示取代基从相邻原子吸引价电子的趋势，即，取代基相对于相邻原子是电负性的。术语“亲核”或“给电子基团”在本领域中是公认的，并且表示取代基从相邻原子提供多余价电子的趋势，即，取代基相对于相邻原子是电正性的。吸电子能力水平的量化由Hammett-sigma(σ)常数给出(参见J.March，AdvancedOrganic Chemistry，McGraw-Hill Book Company，New York，(1977年版)第251-259页)。给电子基团的Hammett常数一般为负值，吸电子基团的Hammett常数一般为正值。例如，对位取代的NH2(σ[P])的Hammett常数约为-0.7，硝基的σ[P]约为+0.8.
实施方案包括任何已知的吸电子基团。例如，吸电子基团可包括但不限于醛(-COH)、酰基(-COR)、羧酸(-COOH)、酯(-COOR)、卤化物(-C1、F、-Br等)、氟甲基(-CF3)、氟烷基(-CFnH2-nR)、氰基(-CN)、亚砜(-SOR)、磺酰基(-SO2R)、磺酸酯(SO3R)、1°、2°和3°铵(-NR3 +)，以及硝基(-NO2)，其中每个R可独立地为氢、甲基或C2-C6烷基、烯基或炔基。在一些实施方案中，吸电子基团可以是σ至少约为0.2的强吸电子基团，并且在某些实施方案中，吸电子基团可以形成偶极子。例如，在特定实施方案中，吸电子基团可为硝基、铵基或磺酰基。在其他实施方案中，硫醇化的活化的脂肪酸可另外由非吸电子基团或给电子基团取代，所述非吸电子基团或给电子基团包括例如硫醇(-SR)、醇(-OH)、反酯(-OOCR)、烷基、烯基、炔基、1°和2°胺(-NR2)、含氮杂环(-N＝，-NR-)、硝酸基(-ONO2)、亚硝酸基(-ONO)等。
实施方案的脂肪酸可以是本领域已知的任何不饱和以及多不饱和脂肪酸。术语“脂肪酸”描述脂肪族单羧酸。各种实施方案包括具有与所鉴定的天然存在的脂肪酸相同或相似的脂肪族烃链的活化的脂肪酸。例如，已知天然存在的脂肪酸的脂肪族烃链通常是非支化的，并且包含偶数个约4到约24个碳，并且其他的则包括在脂肪族烃链中具有12到18个碳的脂肪酸。在其他实施方案中，脂肪酸在脂肪族烃链中可具有大于24个碳。实施方案包含此类天然存在的脂肪酸以及非天然存在的脂肪酸，其可包含奇数个碳和/或包括杂原子的非天然存在的连接物。因此，一些实施方案包括具有奇数个碳的脂肪酸，例如5到23个碳，并且在其他实施方案中，11到17个碳。在另外其它实施方案中，实施方案的脂肪酸可具有大于23个碳。天然和非天然存在的脂肪酸也可在沿着烃链的一个或多个位置支化，并且在各种实施方案中，每个支链可包括1到24个碳、2到20个碳或4到18个碳的脂肪族烃链，其中每个支链可具有偶数或奇数个碳。
各种实施方案的脂肪酸的脂肪族烃链可是不饱和的或是多不饱和的。术语“不饱和”指具有包括至少一个双键和/或取代基的脂肪族烃链的脂肪酸。相反，“饱和”烃链不包括任何双键或取代基。因此，烃链上的每个碳都是饱和的，氢的数量最多。一般来说，多不饱和脂肪酸是指具有多于一个双键的烃链的脂肪酸。各种实施方案的不饱和或多不饱和脂肪酸的双键可位于沿着脂肪族烃链的任何位置并且可为顺式或反式构型。术语“顺式”是指双键，其中与双键相邻的碳位于同一侧；术语“反式”是指双键，其中与双键相邻的碳位于相反一侧。通常，“顺式”与Z相同，“反式”与E相同，但有时IUPAC命名化合物的规则会给出与非碳取代基相反的结果，这是硝基烯的典型情况。例如，一个硝基烯可以有两个碳基“顺式”，但在命名化合物时优先使用的两个碳基(在烯烃的一个碳上的硝基，和在烯烃的另一个碳上的碳基)是相对的，因此是E。因此，“顺式”双键的硝基烯类似物被称为E硝基烯。类似地，“反式”双键的硝基烯类似物被称为Z硝基烯。在不希望受到理论约束的情况下，沿着碳链的顺式构型的双键(顺式碳链，但E-硝基烯)可能会导致碳氢链弯曲。沿着碳链的“反式”构型中的双键(反式碳链但Z-硝基烯)可能不会导致烃链弯曲。实施方案可包括具有顺式或反式构型的双键的硫醇化的活化的脂肪酸，并包括可包含含顺式和反式的硫醇化的活化的脂肪酸和所述硫醇化的活化的脂肪酸的区域异构体的组合的组合物。
已鉴定许多不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，并已知是天然存在的。这些不饱和或多不饱和的天然脂肪酸，通常在其脂肪烃链中含有偶数个碳。例如，天然存在的不饱和或多不饱和脂肪酸可以具有4、6、8、10、12、14、16、18、20、22等个数的碳，并且可以包括ω-3、ω-5、ω-6、ω-7、ω-9碳-碳双键。任何这样的脂肪酸都可能有用。符号ω用于表示脂肪烃链的末端甲基碳。ω-X脂肪酸双键的位置是碳-碳键X距离ω碳的碳数。例如，ω-6脂肪酸在第6和第7个碳之间有一个双键，从ω碳向后计数，而ω-3脂肪酸在第3和第4个碳之间有一个双键，从ω碳向后计数。各种实施方案包括硝化ω-3脂肪酸包括但不限于亚麻酸、α-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸和硬脂酸；硝化ω-5脂肪酸包括但不限于肉豆蔻油酸；硝化ω-6脂肪酸包括但不限于亚油酸、γ-亚油酸、二高-γ-亚油酸和花生四烯酸；硝化ω-7脂肪酸包括但不限于共轭亚油酸和棕榈油酸；以及硝化ω-9脂肪酸包括但不限于油酸和芥酸。当然，脂肪酸也可以使用IUPAC命名法，其中双键的位置通过计算羧酸的碳和‘C-X’来确定，使用IUPAC命名法表示脂肪烃中的碳，其中X是从羧酸(包括羰基碳本身)计数的碳数。实施方案还包括天然存在的脂肪酸及其衍生物的合成等价物。
其他实施方案包括不饱和或多不饱和非天然存在的脂肪酸，其可具有奇数个碳，例如5、7、9、11、13、15、17、19、20、21等。与天然脂肪酸一样，与非天然脂肪酸相关联的一个或多个双键可位于脂肪烃链上的任何位置，并且双键可为顺式或反式构型。在又一其它实施方案中，非天然存在的脂肪酸可包括一个或多个中断脂肪族烃链的连接基。例如，在一些实施方案中，活化的脂肪酸可在脂肪族烃链内的任何位置具有一个或多个非碳-碳键，例如酯、醚、乙烯基醚、硫醚、氨基、亚胺等。
各种实施方案包括不饱和或多不饱和脂肪酸，其可在脂肪酸的脂肪族链的任何两个碳之间具有碳-碳双键，并且任何数量的碳-碳双键可存在于此类多不饱和脂肪酸中。例如，在一些实施方案中，多不饱和脂肪酸可具有2、3、4、5、6或更多个碳-碳双键。在这样的实施方案中，多于一个的碳-碳双键中的每一个可单独呈顺式或顺式构型。在一些实施方案中，硫醇化的活化的脂肪酸衍生自与具有结合的吸电子基团的多不饱和脂肪酸的至少一个碳-碳双键的反应，并且在其他实施方案中，这种多不饱和脂肪酸的碳-碳双键中有不止一个可能具有结合的吸电子基团。此外，在此类实施方案中，吸电子基团可与原始碳-碳双键的碳或直接与碳-碳双键的碳相邻的碳相结合，所述硫醇可与所述原始碳-碳双键的另一碳或与所述碳-碳双键的任一碳直接相邻的碳结合。例如，在一些实施方案中，吸电子基团可以附着到所述前一个碳-碳双键的α碳，并且在其他实施方案中，吸电子基团可以与所述前一个碳-碳双键的β碳相结合。在这些实施方案中，硫醇将分别连接到所述前一个碳-碳双键的β碳，并且在其他实施方案中，吸电子基团可与所述前一个碳-碳双键的α碳相结合。
在特定实施方案中，具有至少一个吸电子基团的不饱和脂肪酸可以是共轭脂肪酸。在这些实施方案中，脂肪族链中的两个碳-碳双键彼此相邻，使得它们之间不存在亚甲基。这种共轭化合物通常被称为1，3-二烯，或共轭脂肪酸。这种1,3-二烯可以在6个位置中的任意一个位置、1,3-二烯的1、2、3和/或4位以及与二烯相邻的两个碳(相对于1,3-二烯中的1、2、3、4碳的识别方法，在0和5位)包括一个或多个吸电子基团。例如，一个结合的吸电子基团可附接到上述6个位置中的任何一个，即附接到二烯上的1、2、3或4位，或附接到与1,3-二烯相邻的任一碳上(如上文所述，在0或5位)。在附加实施方案中，两个结合的吸电子基团可以连接到六个可能位置中的任意两个，三个结合的吸电子基团可以连接到六个可能位置中的任意两个，四个结合的吸电子基团可以连接到六个可能位置中的任意两个，五个结合的吸电子基团可以连接到六个可能的位置中的任意两个，以及六个结合的吸电子基团可以连接到六个可能的位置中的任意两个。总之，连接到1,3-二烯中上述六个位置中的任一位置的吸电子基团的任何构型都包括在化合物的实施方案中。
在某些实施方案中，硫醇化的活化的脂肪酸可在制备后进行异构化，使得双键的顺式/反式构型、双键在碳链中的位置或两者都可发生改变。例如，在一些实施方案中，硫醇化的活化的脂肪酸可由碳-碳双键制备，该碳-碳双键具有连接到碳-碳双键的伽马碳上的吸电子基团。在制备之后，碳-碳双键可以进行异构化，使得在异构化之后吸电子基团现在与碳-碳双键共轭。这种异构化可在制备后的任何时间自发发生，并且可产生可能最初制备为包括单一种类的硫醇化的活化的脂肪酸的组合物，其随后包括最初制备的第一种活化的脂肪酸的异构体的组合。
在其他实施方案中，所述硫醇化的活化的脂肪酸的羧基末端可进行修饰。例如，在一些实施方案中，事实硫醇化的活化的脂肪酸可包括与脂肪酸的羧基末端相结合的甘油以产生甘油酯，并且此类甘油酯可为甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯，其中甘油二酯或甘油三酯的至少一种脂肪酸可为硫醇化的活化的脂肪酸，而任何一种剩余的脂肪酸可以是饱和或不饱和脂肪酸。类似地，在其他实施方案中，糖可与事实硫醇化的活化的脂肪酸的羧基末端结合以形成糖脂。在这些实施方案中，本领域已知的任何糖可以是糖脂的糖部分，包括但不限于半乳糖和葡萄糖。在其它实施方案中，糖可与甘油酯结合，甘油酯与硫醇化的活化的脂肪酸的羧基末端结合以形成甘油糖脂，该甘油糖脂可具有与甘油糖脂的甘油部分结合的一个或两个活化脂肪酸，并且，在仅一个活化的脂肪酸与甘油糖脂结合的实施方案中，甘油上的剩余位置可包括饱和或不饱和脂肪酸或氢、烷基或官能团，例如醇、胺、磷酸酯、膦酸、硫醇、磺酸等。在某些实施方案中，所述活化的脂肪酸的羧基末端可与磷酸酯结合以形成磷脂。在此类实施方案中，磷酸酯可通过羧基末端直接与脂肪酸结合，或磷酸酯可与甘油二酯结合，其中一个或两个活化脂肪酸连接甘油部分，并且在仅一个硫醇化的活化的脂肪酸连接甘油的实施方案中，甘油上的剩余位置可包括饱和或不饱和脂肪酸或氢、烷基或官能团，例如醇、胺、磷酸酯、膦酸、硫醇、磺酸等。在进一步实施方案中，所述活化的脂肪酸的羧基末端可与胆固醇或其他甾醇部分结合。在又一其它实施方案中，羧基末端可通过第二活性剂的共价连接来修饰。在特定实施方案中，包括甘油的羧基末端修饰可不包括硝基。在不受理论约束的情况下，修饰硫醇化的活化的脂肪酸的羧基末端可增强给药后活性脂肪酸的分配，也可通过抑制给药后线粒体中的β-氧化来提高活化的脂肪酸的回弹力(resilience)。
这些化合物提高了硫醇化的分子中以二聚体形式存在的活化的脂肪酸的生物利用度。亲电烯烃的硫醇化通过肠道和肝脏的首过代谢来保护分子。这种保护作用是通过阻止前列腺素还原酶1还原烯烃和延缓与谷胱甘肽的加成反应来实现的。此外，聚硫链越长，分子的稳定性就越高，从而使所述活化的脂肪酸在循环中的释放时间延长。当含硫醇化的硝基脂肪酸释放出硝基脂肪酸和硫化氢时，提供额外的保护措施。化合物(a)(iv)-含有吸电子基团的二羧酸化合物
化合物(a)(iv)是含有吸电子基团的二羧酸化合物，并且在一些实施方案中，此类化合物可进一步包含与吸电子基团结合的烯烃。各种实施方案涉及含有吸电子基团的二羧酸化合物的烷基酯，并且在一些实施方案中，此类化合物可进一步含有与吸电子基团相结合的烯烃。本发明的各种实施方案涉及式XV至XXIV的化合物。例如，此类化合物在PCT公开WO 2017/151938中有描述。这些亲电二羧酸酯能够烷基化具有重要功能的硫醇，并使RAD51或其他DNA修复蛋白失活。
所述化合物可以是通式XV或XVI者：
Figure BDA0003062146500000221
其中X是吸电子基团，每个
Figure BDA0003062146500000222
可以单独地是单键或双键，以及每个m和b分别独立地是1-10的整数。在具体实施方案中，式XV和XVI中描绘的至少一个
Figure BDA0003062146500000223
是双键。在一些实施方案中，公式XV和XVI中描述的
Figure BDA0003062146500000224
都可以是单键，并且在其他实施方案中，公式XV和XVIII中描述的
Figure BDA0003062146500000225
都是双键。在其他实施方案中，所述化合物可以是通式XVII和XVIII者：
Figure BDA0003062146500000226
其中X是吸电子基团，m和n各自独立地为1-10的整数。
进一步的实施方案针对含有吸电子基团的二羧酸化合物的烷基酯，例如，通式XIX和XX的化合物：
Figure BDA0003062146500000231
其中X是吸电子基团，Y和Z各自分别是氢或C1-C10烷基，并且每个
Figure BDA0003062146500000232
分别单独地为单键或双键，以及m和n各自独立地不存在或是1-10的整数。在具体的实施方案中，式XIX和XX中描述的至少一个
Figure BDA0003062146500000233
是双键。在一些实施方案中，式XIX和XX中描述的
Figure BDA0003062146500000238
都可以是单键，并且在其他实施方案中，式XIX和XX中描述的
Figure BDA0003062146500000234
都可以是双键。在一些实施方案中，含有吸电子基团的二羧酸化合物的烷基酯可以是式XXI和XXII的化合物：
Figure BDA0003062146500000235
其中X是吸电子基团，Y和Z各自分别是氢或C1-C10烷基，以及m和n各自独立地为1-10的整数。在某些实施方案中，上述式XIX、XX、XXI和XXII的化合物中的每个Y和Z可为甲基(C1烷基)或乙基(C2烷基)。
由在每个上述式XV-XXII的化合物中的m和n产生的烯基，除了式XVII、XVIII、XXI和XXII所描述的双键或者任选地如式XV、XVI、XIX和XX的
Figure BDA0003062146500000236
所示存在的双键以外，还可包括碳-碳双键。例如，一些实施方案的化合物可为式XXIII和XXIV者：
Figure BDA0003062146500000237
其中X是吸电子基团，Y和Z各自分别是氢或C1-C10烷基，并且每个p和t独立地是1-10的整数，每个s不存在或是1-10的整数，并且每个r是1-5的整数。在某些实施方案中，上述式XXIII和XXIV的化合物中的每个Y和Z可为甲基(C1烷基)或乙基(C2烷基)。
附加实施方案针对含有吸电子基团的二羧酸化合物，其进一步含有与式XV、XVII、XIX、XXI及XXIII的吸电子基团结合的至少一种烯烃，其中通过迈克尔加成反应引入亲核试剂“A”使至少一个与吸电子基团结合的烯烃还原，得到式XVA、XVIIA、XIXA、XIXB、XXIA和XXIIIA的化合物。
Figure BDA0003062146500000241
其中X是吸电子基团，A是亲核基团，Y和Z各自分别是氢或C1到C10烷基，并且m、n、p和t各自独立地是1-10的整数，每个s不存在或是1-10的整数，并且每个r是1-5的整数。在某些实施方案中，每个Y和Z可以是甲基(C1烷基)或乙基(C2烷基)
设想式XVA、XVIIA、XIXA、XIXB、XXIA和XXIIA的化合物可以用作式XV、XVII、XIX、XXI和XXIII的化合物的前药或用作活性治疗剂本身。如果用作前药，则设想式XVA、XVIIA、XIXA、XIXB、XXIA和XXIIIA的化合物在给有需要的患者施用后会在体内代谢，以提供治疗有效量的式XV、XVII、XIX、XXI和XXIII的活性剂。
术语“亲核试剂”在本领域中是公认的，并且表示将电子对给予亲电体以形成与反应有关的化学键的化学物种。所有具有一对自由电子或至少一个π键的分子或离子都可以作为亲电体。亲核试剂，即A，可包括但不限于烯醇、氢氧化物阴离子、醇、醇盐阴离子、过氧化氢、羧酸盐阴离子、硫化氢、硫醇、硫醇盐阴离子、硫代羧酸阴离子、二硫代碳酸盐阴离子、氨、叠氮化物、胺和腈。
术语“吸电子基团”在本领域中是公认的，并且表示取代基从相邻原子吸引价电子的趋势，即，取代基相对于相邻原子是电负性的。吸电子能力水平的量化由Hammett-sigma(σ)常数给出(参见J.March，Advanced Organic Chemistry，McGraw-Hill Book Company，New York，(1977年版)第251-259页)。给电子基团的Hammett常数一般为负值，吸电子基团的Hammett常数一般为正值。例如，对位取代NH2(σ[P])的Hammett常数约为-0.7，而硝基的σ[P]约为0.8。吸电子基团可包括但不限于醛(-COH)、酰基(-COR)、羰基(-CO)、羧酸(-COOH)、酯(-COOR)、卤化物(-C1、-F、-Br等)、氟甲基(-CFn)、氰基(-CN)、磺酰基(-SO2R)、砜(-SO2H)、磺酸(-SO3H)、1°、2°和3°铵(-NR3 +)以及硝基(-NO2)。在一些实施方案中，所述吸电子基团可以是σ至少约为0.2的强吸电子基团，并且在某些实施方案中，所述吸电子基团可以形成偶极子。例如，在特定实施方案中，所述吸电子基团可为硝基、铵基或磺酰基。
在某些实施方案中，所述二羧酸化合物具有以下结构：
Figure BDA0003062146500000242
其中m为1至10；
n为1至10；
双键是顺式到反式的；以及
X为选自以下的吸电子基团：-NO2、-CN、卤化物、CxF2x+1，其中x是1-5、SOR，其中R为H或C1-C6烷基、SO2R，其中R为H或C1-C6烷基、或SO3R，其中R为H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，X是-NO2。
在某些实施方案中，该化合物是具有以下结构的二羧酸的烷基酯：
Figure BDA0003062146500000251
其中m为1-10；
n为1～10；
双键是顺式或反式的；
Y和Z各自独立地为C1-C10烷基、烯基或炔基；以及
X选自以下的吸电子基团：-NO2、-CN、卤化物、CxF2x+1，其中x是1-5、SOR，其中R是H或C1-C6烷基、SO2R，其中R系H或C1-C6烷基、或SO3R，其中R是H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，m是2并且n是2。
在某些实施方案中，Y和Z各自独立地为C1-C6烷基，更具体地为甲基或乙基。
在某些实施方案中，X是-NO2。
在某些实施方案中，该化合物是具有以下结构的二羧酸的烷基酯：
Figure BDA0003062146500000252
其中m为1-10；
n为1～10；
双键是顺式至反式的；
Y和Z各自独立地为C1-C10烷基、烯基或炔基；以及
X选自-NO2、-CN、卤化物、CxF2x+1的吸电子基团，其中x是1-5、SOR，其中R是H或C1-C6烷基、SO2R，其中R系H或C1-C6烷基、或SO3R，其中R是H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，m是2并且n是2。
在某些实施方案中，Y和Z各自独立地为C1-C6烷基，更具体地为甲基或乙基。
在某些实施方案中，X是-NO2。
在某些实施方案中，该化合物为：
Figure BDA0003062146500000261
化合物(b)-抗肿瘤剂
在某些实施方案中，抗肿瘤剂是DNA损伤剂或DNA损伤治疗剂。说明性的抗肿瘤剂包括阿霉素、顺铂、奥拉帕尼(olaparib)、鲁卡帕尼(rucaparib)、尼拉帕尼(niraparib)、他拉唑帕尼(talazoparib)、微利帕尼(veliparib)、喜树碱和辐射治疗(IR)。
在某些实施方案中，化合物(a)与抗肿瘤剂阿霉素、顺铂、IR或奥拉帕尼的共同施用增强了这些DNA损伤治疗策略在TNBC细胞中的细胞杀伤、抗增殖、抗组织侵袭和/或抗转移效果。经鉴定，NO2-OA可抑制IR诱导的RAD51病灶形成，抑制RAD51与单链DNA结合，降低HR，诱导Seri39 H2AX(γH2AX)的磷酸化，破坏RAD51-ABL异源二聚合，并降低RAD51 Tyr315的磷酸化。这些观察结果加强了反应性物种部分通过破坏HR来诱导基因组扰动的概念，并揭示了一种新的治疗策略-氧化还原衍生的软亲电体使癌细胞对DNA导向的治疗策略(如IR、顺铂和阿霉素)敏感。
脂肪酸硝基烯是不饱和脂肪酸的氮氧化物和亚硝酸盐依赖性硝化的内源性产物。通过动力学上快速且可逆的Michael加成，脂肪酸硝基烯介导蛋白质中易感Cys残基的PTM，在某些情况下通过多效性机制改变蛋白质功能和诱导信号反应。本文揭示的结果表明，NO2-OA可降低TNBC细胞的增殖，特别是当与临床相关的DNA导向治疗策略共同施用时(图1A-1K)。NO2-OA还通过限制IR诱导的核RAD51病灶形成和DNA重组，特别是通过抑制HR而非NHEJ，通过IR或I-SceI DNA切割放大DSB的诱导(图2A-2D)。RAD51的功能显著的Cys319被NO2-OA靶向，但不是非亲电的天然的和硝基烷烃取代的对照脂肪酸(图3A-3I)。由NO2-OA进行的Cys319烷基化破坏了RAD51与ABL的二聚反应，并降低了RAD51 Tyr315的ABL诱导的磷酸化(图3A-3I)。RAD51以外的NO2-OA靶蛋白可能额外地在抑制HR中起作用。NO2-OA减少RAD51病灶和诱导γH2AX染色(DNA DSB断裂标记物)是癌细胞选择性的，因为它不会发生在受辐照的良性(非致瘤性)乳腺上皮细胞MCF-10A中(图1J)。
在TNBC细胞系中与NO2-OA组合施用时，奥拉帕尼的有效抗增殖作用表明了NO2-OA对BRCAness表型的药理学诱导(图1A-1K)。NO2-OA对HR介导的DNA-DSB修复的抑制作用对癌细胞具有特异性，反映了BRCA基因的功能缺失突变，该突变通过HR损伤引起DNA修复能力的缺陷。携带BRCA1功能缺失突变的乳腺癌患者也可能受益于RAD51的抑制，因为RAD51的表达增加绕过了BRCA1功能，是BRCA1缺陷乳腺肿瘤的一个共同特征。
虽然功能性HR对维持基因组稳定性很重要，但同源性导向DNA修复活性的增强阻碍了癌症的化疗和电离辐射治疗。RAD51的表达升高与乳腺癌的肿瘤分级呈正相关，并且已经在一些TNBC细胞系和转移患者样品中被证实。一些研究试图利用RAD51的抑制作用来提高癌细胞的杀伤力。用小分子抑制剂抑制RAD51可使癌细胞对化疗药物或IR敏感[例如DIDS、B02、RI-1和IBR2]。例如，RI-1在高通量筛选中被鉴定为可增强RAD51丝的形成和HR活性，偶然地加合了Cys319。不幸的是，RI-1在一个复杂的双酚吗啉结构中有多个亲电中心，从而导致不可逆的Michael加成反应，并且由于毒性导致的体内应用的不相容性。
RAD51 Cys319是RAD51蛋白中一个重要的功能位点。同源多聚体RAD51丝界面围绕着Cys319残基，位于Src同源3(SH3)结构域内以及ATP酶结构域(PDB:1N0W)附近。翻译后硫醇修饰或Cys319的药理学靶向可能通过多种机制破坏RAD51的功能。
我们现在在这里鉴定了亲电硝基烯的一个特定靶点，RAD51的Cys319，它在烷基化后抑制RAD51与单链DNA的结合(图3A-3I)。因此，内生脂肪酸硝基烯的合成同系物的施用提供了一个可行的选择以使RAD51失活。静脉注射和口服NO2-OA制剂(IV IND，122583；口服IND，124524)的临床给药是安全的，已通过多个I期和药物相互作用研究，口服制剂目前正在多中心II期试验中，用于治疗慢性炎症相关疾病。
硝基烯脂肪酸具有抗癌多功能，除HDR外，还影响其他DNA DSB修复途径。对4条修复DNA-DSB的途径进行比较表明，除HDR外，NO2-OA还抑制单链退火(SSA)一条保守DNA-DSB修复途径，该途径特定于同源重复并导致重复序列的缺失(图14A和14B)。这支持其他蛋白质Cys作为SSA内或上游硝化脂肪酸(NFA)的目标。在TNBC异种移植模型(MDA-MB-231细胞)中，NO2-OA与PARPi他拉唑帕尼联合体内治疗显示，与单独使用他拉唑帕尼或NO2-OA相比，肿瘤减少显著(图15)。
本文公开的结果表明，外源性给药的硝基烯脂肪酸在调节DNA修复和其他信号反应中起作用，这些信号反应可以改善耐药癌症的治疗。
在某些实施方案中，本文公开的化合物抑制细胞迁移和侵袭。侵袭是肿瘤细胞扩散和转移的前提。
在某些实施方案中，亲电硝基烯脂肪酸抑制Rad51介导的DNA修复使TNBC细胞对PARP抑制、杀伤和潜在的侵袭和转移更敏感。大约15％的乳腺癌(BC)是三重阴性，缺乏三种受体，这三种受体对大部分BC进行分类和定义治疗策略：雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)和ERB2(也称HER2)。因此，TNBC是一种积极的BC类型，没有针对性的治疗，而且对年轻妇女和非洲裔妇女的影响不相称。多达20％的TNBC患者也携带一个细菌系BRCA1或BRCA2突变(gBRCAm)，导致同源定向DNA修复(HDR)的缺陷。由于成功的3期临床试验表明PARPi单药治疗的优势，与细菌系BRCA突变的TNBC患者相比，奥拉帕尼和他拉唑帕尼被FDA批准用于转移性gBRCAm阳性TNBC患者。这些发现强化了HDR中的遗传缺陷通过抑制单链DNA修复为PARPi癌细胞杀伤铺平道路的概念，并强调了本文中公开的共同施用方法的重要性，通过抑制Rad51和增强PARPi的效力，该方法化学诱导HDR缺乏。因此，80％的TNBC患者对gBRCAm呈阴性，且对PARPi的反应不一致，尽管BRCA样表型(BRCAness)，但这些患者可以从PARPi治疗中获益。特别地：
i)通过化学诱导Rad51抑制和限制TNBC细胞HDR，符合PARPi治疗条件的患者队列现在也可以包括BRCA野生型或在其他HDR相关基因中具有突变的患者；
ii)一些癌症，包括TNBC，已增加了Rad51的表达。临床前模型表明siRNA和shRNA对Rad51的缺失对以下敏感：a)PARPi、b)胰腺癌和多发性骨髓瘤的放射治疗、c)非小细胞肺癌(NSCLC)和胶质瘤的化疗、d)TNBC小鼠模型中原发肿瘤生长和脑转移的减少。对Rad51的药物靶向是一种令人垂涎的抗癌治疗方法，但迄今为止，还没有小分子Rad51抑制剂能够安全地进入1/2期开发。
iii)PARPi抵抗是患者面临的一个问题，这是由于癌细胞恢复BRCA1或BRCA2开放阅读框，增加使用非同源末端连接(NHEJ)进行修复和Rad51过度表达。PARPi的低毒性和令人鼓舞的成功，以及与PARPi和一种硝基烯脂肪酸联合治疗显著提高PARPi疗效的数据，为限制耐药性和增强TNBC细胞杀伤提供了新的机会。
在某些实施方案中，用本文公开的至少一种硝基烯脂肪酸治疗通过调节NF-κB信号传导抑制癌细胞生长、和/或迁移和/或侵袭。一个实施方案设想向患有、怀疑患有、处于发展风险中、治疗三阴性乳腺癌或缓解三阴性乳腺癌的个体施用治疗有效量的硝基烯脂肪酸。例如，用硝基烯脂肪酸，特别是亲电性(10-硝基-十八碳-9-烯酸，在本文中称为“NO2-OA”)治疗，通过调节NF-κB信号传导，抑制三阴性乳腺癌细胞生长、迁移和侵袭，而非肿瘤性乳腺上皮细胞对NO2-OA的作用有抵抗性的，因为其维持氧化还原稳态的机制更为完整。
与其他乳腺癌表型相比，TNBC是一种侵袭性亚型，预后较差。患者在确诊后5年内出现肺部、肝脏和脑部内脏转移的可能性是正常人的4倍。由于TNBC对内分泌治疗或其他更具靶向性的化疗药物没有反应，DNA损伤诱导策略如电离辐射、顺铂和阿霉素仍然是主要的治疗方法。DNA导向化疗药物的不良全身反应，包括心脏和肾脏毒性，由于对非癌细胞的细胞毒性作用，限制了化疗的选择。
NO2-OA抑制培养的TNBC细胞活力、能动性和肿瘤细胞增殖相关的信号反应，其程度可至口服NO2-OA抑制MDA-MB-231异种移植小鼠体内肿瘤生长。这一观察结果也促使在临床前动物模型中对NO2-OA对多种乳腺癌表型的肿瘤生长和转移的影响进行更详细的剂量-时间和剂量-反应研究。
在较低浓度下，与非致瘤性MCF-10A乳腺导管上皮细胞相比，NO2-OA对TNBC细胞具有选择性的细胞毒性。对这种选择性作用的一个重要解释来自于对对照细胞和TNBC细胞中的基础GSH水平和NO2-OA-SG加合物的形成和命运的分析。由于GSH-巯基的丰富性和反应活性，GSH是内源性产生的以及外源性施用的氧化剂和亲电物种的主要细胞内反应靶点。MRP1介导的细胞内GSH加合亲电体的流出率有助于确定细胞内净浓度、半衰期、靶蛋白反应以及细胞和组织对脂质亲电体的反应。与TNBC细胞相比，MRP1在MCF-10A细胞中高表达，这促使LC-MS/MS测定经NO2-OA处理的MCF-10A与MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞培养基中的细胞外NO2-OA-SG水平。与MRP1表达的相对范围一致，与TNBC细胞比较，MCF-10A细胞形成并输出4-5倍量的NO2-OA-SG加合物进入细胞外室中(图6A)。与MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞相比，MCF-10A更广泛地输出NO2-OA-SG也是值得注意的，因为在MCF-10A细胞中，基础GSH浓度和GSH:GSSG比率在用NO2-OA处理后更稳定。相反，在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中，GSH浓度和GSH:GSSG比率在NO2-OA处理后迅速减少。这些结果表明，与TNBC细胞相比，NO2-OA-SG的MRP1输出和MCF10A细胞系更充分的抗氧化能力，在确定TNBC细胞对NO2-OA信号作用的脆弱性方面发挥了作用。另一种亲电试剂2-氰基-3,12-二氧基-1,9-二烯-28-油酸(CDDO)通过诱导多种癌症细胞凋亡而显示出抗肿瘤活性。在胰腺癌细胞中，CDDO可迅速降低线粒体GSH，并诱导ROS生成增加。相反地，短期和长期(6小时)处理TNBC细胞后，NO2-OA对H2O2产生的细胞率没有显著影响，表明NO2-OA对TNBC细胞生长和活力的抑制不是由于ROS的诱导。
当用有机酸丙磺舒抑制MCF-10A细胞的MRP1转运活性时，在对NO2-OA敏感的背景下产生了更像TNBC的表型。例如，NO2-OA对细胞生长阻滞和杀伤(图6CD)、细胞周期阻滞(细胞周期蛋白Dl、p21)和凋亡调节介质(PARP-1、胱天蛋白酶-3)的影响都支持这样一个概念，即由于细胞内室更有利的药代动力学，NO2-OA信号作用在MRP 1缺失的细胞中被增强。这证实了GSH的细胞浓度、GSH与NO2-OA的反应以及随后NO2-OA-SG的MRP1输出影响下游对NO2-OA的反应。有可能其他尚未描述的机制也负责这种分化的乳腺上皮细胞反应。
在慢性血管和肺部疾病模型中观察到了NO2-OA对巨噬细胞、血管平滑肌细胞和成纤维细胞的抗增殖作用，但尚未考虑脂肪酸硝基烯对癌细胞增殖的影响。这激发了实验的考虑，因为有有限的报告表明，上调Nrf2信号传导可能导致内在的或获得性的化疗耐药。相反，我们观察到NO2-OA在体外和体内抑制TNBC生长(图4B-E)。TNBC细胞的这种生长抑制是TNBC细胞特异性信号反应改变的结果，而不是未转化的MCF-10A细胞。随着TNBC细胞G1亚群的增加(图5A-C)，观察到p21表达增加和细胞周期蛋白D1表达减少(图5D)。TNBC细胞中的NO2-OA参与了两条不同的凋亡信号通路，由线粒体(胱天蛋白酶-9激活)和死亡受体(胱天蛋白酶-8激活；图5F)调控机制启动。总的来说，这些数据表明NO2-OA通过抑制TNBC中的细胞增殖和诱导凋亡而显示出多效抗癌特性。在这一点上，NO2-OA诱导凋亡细胞死亡的更详细机制仍有待确定；然而，亲电硫氰酸萝卜硫素也降低Bcl-2表达，激活线粒体释放细胞色素c，并增加TNBC细胞中FasL的表达。这些作用提示亲电脂肪酸硝基烯衍生物可能在细胞凋亡的调控中起到类似的作用。NO2-OA对NF-κB信号的抑制也限制了TNBC细胞的迁移和侵袭。促炎性细胞因子如TNFα增强了TNBC的转移潜能，TNBC患者TNFα表达和活性的上调与肿瘤转移表型密切相关。通过激活TNBC细胞中的AP-1和NF-KB信号通路，TNFα刺激上皮间充质转化(EMT)和趋化因子基因的表达。在此，NO2-OA显著抑制TNFα诱导的TNBC细胞迁移和侵袭(图6)。NO2-OA也可通过降低NF-κB转录活性而降低促转移基因uPA和ICAM-1的表达(图9DE)。与此一致，亲电15脱氧-Δ12、l4-前列腺素J2、二巯基乙烷硫酮(dithiolethione)和富马酸二甲酯也能抑制乳腺癌细胞的迁移。在没有TNFα诱导的情况下，NO2-OA也减少MDA-MB-231细胞的迁移(图8B)。有可能的是，NO2-OA除了抑制NF-κB外，还抑制与分子靶点反应时的细胞迁移，因为亲电环戊烯酮15-脱氧-Δ12:14-前列腺素J2也通过抑制F-肌动蛋白重组和粘着斑解体来干扰乳腺癌细胞迁移。
NF-κB亚单位的蛋白水解降解有助于NF-κB活化的终止。RelA蛋白受泛素和蛋白酶体依赖的降解信号调节，这些信号终止NF-KB的激活。硫羟烷基化和S-亚硝化剂也通过翻译后修饰Cys62促进HT29和HCT116肿瘤细胞系中NF-KB亚单位p50的降解。因此，NF-κB RelA的NO2-OA烷基化诱导类似于其他烷基化剂的功能反应。值得注意的是，RelA被NO2-OA烷基化诱导TNBC细胞中RelA泛素化的增加，非亲电性NO2-SA未观察到这种效应(图10D)。过氧化物酶体增殖物激活的受体-γ(PPARγ)作为一种E3泛素连接酶起作用，通过与RelA蛋白的物理相互作用，诱导RelA蛋白泛素化和降解。PPARγ配体曲格列酮和吡格列酮促进PPARγE3配体与RelA蛋白的相互作用并进而降低RelA半衰期，由此提高PPARγE3配体的活性。由于NO2-OA是PPARγ的部分激动剂，因此可以推测NO2-OA也激活PPARγE3连接酶活性，从而进一步破坏TNBC中RelA蛋白的稳定性。
抑制NF-κB信号传导是一种可行的抗癌策略，尤其是因为NF-κB的异常激活与多种人类癌症的发生密切相关。免疫调节亲电剂富马酸二甲酯，其是FDA批准的用于治疗多发性硬化症的口服药物,，也抑制乳腺癌细胞的NF-κB活性，并且抑制TNBC细胞增殖。目前NO2-OA抑制TNBC细胞增殖、存活、迁移和侵袭等多种功能的结果提示亲电脂硝基烯类化合物也可能作为化疗药物。
脂质亲电体NO2-OA在多个水平上影响TNBC的NF-κB信号传导，包括抑制IKKβ磷酸化，抑制IκBα降解以及RelA的增强的泛素化和蛋白酶体降解。这些作用反过来又有助于抑制TNBC细胞在体外的迁移和侵袭。TNBC细胞在部分上对NO2-OA更敏感，这是由于GSH浓度较低，并且抑制NO2-OA作为NO2-OA-SG加合物的输出，这是MRP1表达较低的结果。TNBC细胞的这种GSH不足的氧化还原脆弱性促进了更广泛的蛋白质硫羟烷基化和氧化反应，并在较低的亲电体浓度下激发化疗信号反应。健康人血浆和尿液中内源性游离非蛋白加合NO2-FA的浓度通常为1-5nM。口服给药NO2-OA可增加小鼠肿瘤NO2-OA水平，其程度足以诱导药理学反应，这可通过抑制MDA-MB-231异种移植肿瘤生长得以证明。
在一些实施方案中，本文所公开的方法涉及向需要治疗的个体施用药物组合物，例如包含药学上可接受的载体和治疗有效量的本文所公开的一种或多种化合物的组合物。所述化合物可经口、非消化道(包括皮下注射(SC或depo-SC)、静脉(IV)注射、肌肉(IM或depo-IM)注射、胸骨内注射或输注技术)、舌下、鼻内(吸入)、鞘内、局部、眼内或直肠施用。所述药物组合物可以剂量单位剂型施用，所述剂量单位剂型包含常规药学上可接受的无毒的载体、佐剂和/或溶媒。所述化合物优选地被配制成合适的药物制剂，例如用于口服的片剂、胶囊或酏剂，或者配制成用于非消化道或局部施用或吸入的无菌溶液、乳剂或混悬剂。通常，使用本领域公知的技术和方法将上述化合物配制成药物组合物。
在一些实施方案中，将所公开的一种或多种化合物(包括与可检测标签或货物部分有关的化合物)与合适的药学上可接受的载体混合或组合以制备药物组合物。适用于施用本文所提供化合物的药物载体或溶媒包括已知适用于特定施用模式的任何此类载体。雷明顿：《药学科学与实践》(The Science and Practice of Pharmacy，The University ofThe Sciences in Philadelphia)，编辑，Lippincott，Williams，&Wilkins，Philadelphia，PA，第21版(2005年)描述了适用于本文所公开化合物的药物递送的示例性组合物和制剂。此外，所述化合物可配制为所述组合物中的唯一药物活性成分或可与其它活性成分组合。
将一种或多种所述化合物混合或添加至药学上可接受的载体后，所得的混合物可为溶液、悬浮液、乳液等。脂质体悬浮液也可用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法制备。所得混合物的形式取决于许多因素，包括预期的施用方式和化合物在所选载体或溶媒中的溶解度。当化合物表现出不充分的溶解性时，可使用增溶方法。此类方法是已知的，并且包括但不限于使用诸如二甲基亚砜(DMSO)的共溶剂、使用诸如
Figure BDA0003062146500000301
的表面活性剂以及在碳酸氢钠水溶液中的溶解。化合物的衍生物，例如盐或前药，也可用于配制有效的药物组合物。所公开的化合物也可以用保护它们不被身体快速清除的载体来制备，如时间释放(time-release)制剂或包衣。此类载体包括控释制剂，例如但不限于微胶囊递送系统。制剂也可通过溶解中长链天然油获得。
公开的化合物和/或组合物可以封装在多个或单剂量容器中。所述化合物和/或组合物也可以在套件中提供，例如，包括可组装用于使用的组件部件。例如，可以以冻干形式提供所公开的化合物中的一个或多个，并且可以提供适当的稀释剂作为分离的组分，以便在使用前进行组合。在一些示例中，所述套件可以包括公开的化合物和用于共同施用的第二治疗剂(例如抗逆转录病毒剂)。所述化合物和第二治疗剂可作为单独的成分部件提供。一个套件可包括多个容器，每个容器中包含一个或多个单位剂量的化合物。容器优选适合所需的给药方式，包括但不限于片剂、凝胶胶囊、缓释胶囊等，用于口服给药；储存产品、预填充注射器、安瓿、小瓶等，用于非胃肠道给药；以及贴片、医疗垫、乳膏等，用于局部给药。
药物组合物可以是剂量单位形式，例如可注射液体、口服输送液(例如溶液或混悬液)、鼻腔输送液(例如，作为气溶胶或蒸汽输送)、半固态形式(例如外用乳膏)或固体形式，例如粉末、丸、片剂或胶囊形式。
活性化合物包含在药学上可接受的载体中，其量足以在不产生对被治疗对象产生不良副作用的情况下发挥治疗有用的作用。通过在已知的用于所治疗的疾病的体外和体内模型系统中检测所述化合物，可以经验地确定治疗有效浓度。在一些示例中，该化合物的治疗有效量是减少或改善该化合物所给药的疾病的至少一种症状的量。通常，组合物是为单剂量给药而配制的。药物组合物中活性化合物的浓度将取决于该活性化合物的吸收、灭活和排泄率、剂量计划、给药量以及本领域技术人员已知的其他因素。
在一些示例中，约0.1mg至1000mg的所公开化合物、该等化合物的混合物或其生理上可接受的盐或酯以单位剂型与生理上可接受的溶媒、载体、赋形剂、黏合剂、防腐剂、稳定剂、香料等复配。这些组合物或制剂中活性物质的量使得在所示范围内获得合适的剂量。术语“单位剂型”是指适合作为人个体和其他哺乳动物的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位包含经计算以产生期望治疗效果的预定量的活性材料，与合适的药用赋形剂相关。在一些实施方案中，组合物以单位剂型配制，每个剂量含有约1mg至约1000mg(例如，约2mg至约500mg、约5mg至50mg、约10mg至100mg或约25mg至75mg)的一种或多种化合物。在其它示例中，单位剂型包括约0.1mg、约1mg、约5mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约100mg、900mg、约1000mg或更多量的所公开化合物。
所公开的化合物或组合物可作为单剂量施用，或可分为若干小剂量以时间间隔施用。治疗性组合物可在重复给药方案(例如，通过多天、每天、每周或每月重复给药方案)中以单剂量给药、通过延长时间段的连续给药来给药。据了解，治疗的精确剂量、时间和持续时间根据所治疗疾病而变化，并且可以使用已知的试验方案或通过从体内或体外试验数据外推来根据经验确定。值得注意的是，浓度和剂量值也可能随病情的严重程度而变化。此外，应理解，对于特定个体，可根据个人需要和施用或监督施用组合物之人的专业判断随时间调整剂量方案，且本文所述浓度范围仅为示范性。
当作为混悬液口服施用时，这些组合物根据药物制剂领域公知的技术制备，并且可包含用于填充的微晶纤维素、作为悬浮剂的海藻酸或海藻酸钠、作为增粘剂的甲基纤维素以及甜味剂/调味剂。作为速释片，这些组合物可含有微晶纤维素、磷酸氢钙、淀粉、硬脂酸镁和乳糖和/或其他赋形剂、粘合剂、填充剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂。如果需要口服给药，则该化合物通常以保护其免受胃酸性环境影响的组合物提供。例如，所述组合物可以配制在肠溶包衣中，所述肠溶包衣保持其在胃中的完整性并在肠中释放活性化合物。该组合物也可与抗酸剂或其它此类成分组合配制。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体，并且可压缩成片剂或封装在明胶胶囊中。为了口服治疗给药的目的，一种或多种活性化合物可与赋形剂结合并以片剂、胶囊或锭剂的形式使用。药学上相容的粘合剂和辅助材料可作为组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有以下任何一种成分或类似性质的化合物：粘合剂，例如但不限于黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如微晶纤维素、淀粉或乳糖；崩解剂，例如但不限于海藻酸和玉米淀粉；润滑剂，例如但不限于硬脂酸镁；助滑剂，例如但不限于胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；以及调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或水果调味品。
当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料之外，它还可以包含液体载体，例如脂肪油。此外，剂量单位形式可以包含各种该改变剂量单位的物理形式的其他材料，例如糖和其他肠溶剂的包衣。这些化合物也可作为酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂、咀嚼胶等的组分施用。糖浆除了含有活性化合物外还可以含有蔗糖作为甜味剂和某些防腐剂、染料和着色剂以及香料。
当口服给药时，这些化合物可以以口服给药的常规剂型施用。这些剂型包括片剂和胶囊的常用固体单位剂型以及溶液、混悬浮剂和酏剂等液体剂型。当使用固体剂型时，优选其为缓释型，使得所述化合物每天仅需施用一次或两次。在一些示例中，向个体施用口服剂型每日1次、2次、3次、4次或更多次。在另外的示例中，该等化合物可单剂量或分剂量以1至1000mg/kg体重的剂量范围口服施用于人。一个说明性的剂量范围为单剂量或分剂量口服0.1至200mg/kg体重(例如口服0.5至100mg/kg体重)。对于口服给药，所述组合物可以片剂形式提供，所述片剂含有约1毫克到1000毫克的活性成分，特别是1、5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400，500、600、750、800、900或1000毫克的活性成分。然而，应当理解，任何具体患者的具体剂量水平和剂量频率可以是变化的，并且将取决于各种因素，包括所用具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、给药方式和时间、排泄率、药物组合、具体病症的严重程度以及正在接受治疗的宿主。
可注射溶液或混悬剂也可使用合适的无毒、非胃肠道可接受的稀释剂或溶剂配制，例如甘露醇、1,3-丁二醇、水、林格溶液或等渗氯化钠溶液，或合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂，例如无菌、温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯，以及脂肪酸，包括油酸。用于非胃肠道、皮内、皮下或局部施用的溶液或混悬剂可包括以下任一组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液、固定油、天然植物油，例如芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油等，或合成脂肪溶媒，例如油酸乙酯等，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸和亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠和葡萄糖。非胃肠道制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃、塑料或其他合适材料制成的多剂量瓶中。可以根据需要加入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等。
如经静脉施用，合适的载体包括生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和含有增稠剂和增溶剂(例如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物)的溶液。包括组织靶向脂质体的脂质体悬浮液也可用作药学上可接受的载体。
所述化合物可经非胃肠道给药，例如通过IV、IM、depo-IM、SC或depo-SC给药。当经非胃肠道给药时，可递送约0.1mg/天至约500mg/天(例如约1mg/天至约100mg/天，或约5mg/天至约50mg/天)的治疗有效量。当贮库制剂用于每月一次或每两周一次注射时，剂量可为约0.1mg/天至约100mg/天，或每月剂量为约3mg至约3000mg。
这些化合物也可以进行舌下给药。当以舌下给药时，所述化合物应每天给药一至四次，剂量为上述IM给药量。
这些化合物也可以进行鼻内给药。通过这种途径给药时，合适的剂型是鼻喷雾剂或干粉。用于鼻内给药的化合物的剂量为上述IM给药的量。当通过鼻腔气雾剂或吸入施用时，这些组合物可根据药物制剂领域众所周知的技术来制备，并且可制成为盐水溶液，使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、氟碳化合物、和/或其他增溶剂或分散剂。
这些化合物可以进行鞘内给药。当通过该途径给药时，合适的剂型可以是非胃肠道剂型。鞘内给药的化合物剂量为上述IM给药的剂量。
这些化合物可以进行局部给药。通过这种途径给药时，适当的剂型是乳膏、软膏或贴片。当局部施用时，示例性的剂量为约0.5mg/天至约200mg/天。因为通过贴片可以提供的量是有限的，所以可以使用两个或更多的贴片。
这些化合物可通过栓剂经直肠给药。当通过栓剂施用时，示例性的治疗有效量可在约0.5mg至约500mg范围内。当以栓剂的形式经直肠给药时，这些组合物可通过将药物与适当的非刺激性赋形剂(例如可可脂、聚乙二醇的合成甘油酯)混合来制备，其在常温下为固体，但在直肠腔中液化和/或溶解以释放药物。
本领域技术人员应当清楚，给药的确切剂量和频率将取决于给药的具体化合物、所治疗的具体病症、所治疗病症的严重程度、具体个体的年龄、体重、一般身体状况，以及管理医生或其他精通逆转录病毒感染、疾病和相关疾病治疗的临床医生所熟知的个人可能正在服用的其他药物。
实施例
实验程序-硝基烯脂肪酸损害RAD51功能并增强DNA损伤剂对三阴性乳腺细胞生长的影响
细胞培养和试剂
HEK 293T、MDA-MB-231、MDA-MB-468、Hs578T和BT-549细胞(American TypeCulture Collection)在37℃下用5％CO2在含有5％FBS(HyClone)、100单位/ml青霉素、100mg/ml链霉素(Gibco)、非必需氨基酸(Gibco)和2mM 1-谷氨酰胺(Gibco)的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。将阿霉素(Selleckchem)、顺铂(Sigma)或奥拉帕尼(Selleckchem)溶于DMSO或DMF(顺铂)。如前所述合成了硝基油酸(10-十八碳-9-烯酸)(NO2-OA)和生物素化的NO2-OA。将纯NO2-OA在二甲基亚砜中稀释，在分析介质中溶剂化后加入细胞。用细胞滴度Glo(Promega)法测定ATP产生的发光信号，由此比较细胞的相对数量。细胞以每孔5000个(MDA-MB-231)或6600个(BT549或Hs578T)细胞接种于96孔板中。细胞用阿霉素、顺铂或奥拉帕尼在有或无2μM NO2-OA的情况下以指定浓度处理72小时，每24小时补充一次。
体内NO2-OA
用于本研究的动物由匹兹堡大学IACUC批准并按照其指导方针进行。将MDA-MB-231细胞(0.5x106)注入6周龄雌性裸鼠乳腺脂肪垫(左4腺)，体积为20μL无菌生理盐水。当肿瘤平均体积达到100mm3时，用OA+载体(n＝8)、OA-NO2+载体(n＝7)、OA+他拉唑帕尼(0.3mg/kg)(n＝10)或OA-NO2(15mg/kg)他拉唑帕尼(n＝ll)治疗小鼠。用卡尺测量肿瘤体积随时间的变化，P值：*<0.01，***<0.001，****<0.0001。手术过程已经在前面描述过了。
质粒
直接重复绿色荧光蛋白(DR-GFP)报告基因和I-SceI-pCAGGS质粒是Maria Jasin教授的善意馈赠。用含有Spel(5’)和BamHI(3’)限制位点的PCR引物对RAD51进行PCR扩增，克隆出pLVX Neo-RAD51。然后将PCR产物连接到pLVX-Neo(Clonetech)的相应限制位点并转化为DH5a最大效率细胞(Invitrogen)。以pLVX Neo-RAD51为模板，使用QuikChange II定点突变试剂盒(Agilent)产生pLVX Neo-RAD51半胱氨酸到丝氨酸突变质粒(137、312或319)。
DSB修复分析
如前所述，进行NHEJ、HR、Alt-EJ和SSA测定。用BD-LSRII(BD-Biosciences)在MWRI流式细胞仪核心处通过流式细胞术计数GFP阳性细胞来测量HR活性。用遗传霉素(Invitrogen)稳定转染pLVX-RAD51-IRES-Neo并选择，由此产生RAD51过表达细胞。
动力学DSB修复分析
如上所述制备U2OS细胞，但复合处理后5小时，将细胞转移到37℃含5％CO2的Incucyte Zoom(Essen)活细胞成像自动荧光显微镜中。利用Incucyte-Zoom软件测定细胞融合度和每平方毫米绿色物体数。将每个区域的绿色物体计数标准化为细胞融合度，以校正NO2-OA诱导的细胞增殖效应。
免疫染色和成像。
为了分析RAD51病灶的形成，将10,000个细胞接种于涂有聚赖氨酸(Sigma)的16孔盖玻片(MIDSCI)中培养，并在5％FBS培养基中培养过夜。然后用NO2-OA处理细胞，并用5Gy辐照(Gammacell 40Exactor y-Radiator，Best Medical)，然后培养6h。细胞用10％福尔马林在4℃下固定20分钟，并用RAD51(Santa Cruz)或γH2AX(EMD Biosciences)抗体进行免疫染色。用Nikon-AIR共聚焦显微镜和60x油物镜采集Z-叠加图像，用NIS-elements软件采集。使用ImageJ软件完成z叠加和病灶的量化。
细胞周期分析
用碘化丙啶对用DMSO或5μm NO2-OA处理的MDA-MB-231细胞进行细胞周期分析。使用BD LSRII(BD)在MWRI的流式细胞仪核心处分析样品。
免疫印迹和免疫沉淀
制备细胞裂解物和免疫沉淀。对于免疫沉淀分析，用Fugene6(Promega)和2μgpQCXIP(EV)或FLAG-RAD51-pQCXIP质粒瞬时转染100万个HEK 293T细胞，然后用抗FLAG-M2亲和凝胶(Sigma)沉淀。
生物素化OA-NO2亲和捕获RAD51
用Fugene6(Promega)和5μg RAD51表达载体(野生型、C312S或C319S)瞬时转染HEK293T。24小时后用5μM生物素-NO2-OA或生物素-SA-NO2在5％FBS培养基中处理细胞1小时。按上述方法制备细胞。生物素化NO2-OA的沉淀是用8μl链霉亲和素琼脂糖珠和1mg总细胞裂解物在4℃下培养16h完成的。RAD51的检测是用RAD51抗体(1:2000)和肌动蛋白抗体(1:3000)作为负载对照进行的免疫印迹来完成的。
体外RAD51-ABL结合试验的蛋白质纯化
重组His标记的RAD51在pET21a载体上转化进入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS细胞(EMD Milipore)并纯化。
DNA结合分析
反应在黑色96孔板(Greiner)中进行，反应体积为50μL，其中含20mM HEPES pH7.5，10mM MgC12，0.25BSA，2％甘油，30mM NaCl和4％DMSO。纯化的RAD51蛋白(Abeam)和OA(阴性对照)或NO2-OA在25℃下预培养5分钟。将2mM ATP和100nM 5’-Alexa Fluor488ssDNA poly-dT(集成DNA技术)添加到反应中并在37℃下培养90分钟。使用Tecan Spark20M(ex/em 480nm/535nm)上的荧光偏振(FP)测量DNA结合。在没有RAD51蛋白的情况下，检测到复合荧光猝灭。
分子模拟
用PyMOL 1.7.1对RAD51(PDB:1N0W(30))和NO2-OA的结构进行比对。NO2-OA 2的结构是使用ChemDraw 15(PerkinElmer)生成的，并使用OpenBabel版本2.3.1转换为3D结构。
统计分析
数据代表3个独立实验的平均值，除非另有说明。p值<0.05被认为具有统计学意义。在GraphPad Prism 7.0(GraphPad软件，La Jolla，CA，USA)中生成非线性曲线用于统计分析。EC50值和标准误差是利用非线性剂量反应变量斜率模型从三个独立的实验中计算出来的。多组采用单因素方差分析进行Tukey后测，或者组数小于3组时采用t检验进行显著性检验。RAD51病灶数用ImageJ进行分析。在三个独立的实验中，每个治疗组50多个细胞的核边界被单独确定。
结果-硝基烯脂肪酸损害RAD51功能，增强DNA损伤剂对三阴性乳腺细胞生长的影响。
NO2-OA抑制TNBC细胞生长、RAD51病灶形成和对电离辐射的敏感性。
数据表明，通过烷基化NF-κB亚单位激酶b(IKK b)抑制剂(a)中具有重要功能的硫醇，从而限制下游IκKa磷酸化，以及烷基化NF-κB RelA蛋白(b)中具有重要功能的硫醇，从而阻止DNA结合，并促进RelA多泛素化和蛋白酶体降解，NO2-OA由此抑制TNBC上皮细胞的多个方面，但不抑制非肿瘤性乳腺上皮细胞NF-κB信号传导。还评估NO2-OA是否也能增强TNBC在体内的DNA损伤。将MDA-MD-231细胞植入小鼠乳腺中，并且当肿瘤体积达到100mm3时，灌胃给药15mg/kg的非亲电脂肪酸油酸(OA)或NO2-OA治疗4周。与OA治疗对照组相比，NO2-OA治疗组小鼠的肿瘤生长率显著降低(图1A)。通过免疫印迹法检测DNA损伤生物标志物γH2AX的肿瘤水平显示OA-NO2处理的小鼠表现出更高水平的γH2AX(图1b)。光密度定量经OA和NO2-OA治疗小鼠的肿瘤γH2AX/β-肌动蛋白水平增加了NO2-OA治疗小鼠的γH2AX。在Grubbs异常检测和消除OA处理的小鼠#2后，这种反应变得具有统计学意义。OA小鼠#2的原位肿瘤是研究中最大的肿瘤，坏死可能导致γH2AX水平升高。
结合DNA损伤剂评价NO2-OA对TNBC生长的抑制作用。每天用NO2-OA处理细胞株MDA-MB-231、BT-549和Hs578T共3天，并通过测定Ultra-Glo荧光素酶与底物荧光素酶产生的ATP依赖性发光信号来定量细胞的相对数量。TNBC细胞生长抑制的EC50值范围为1.98±0.52μM(Hs578T)到3.78±0.48μM(BT-549)，MDA-MB-231细胞的EC50值为3.66±0.14μM(图1C)。接下来，我们测试了DNA损伤剂阿霉素和顺铂与每日2μM NO2-OA治疗的结合。NO2-OA增强了阿霉素对MDA-MB-231和Hs578T细胞的生长抑制作用，分别为7倍和5倍(图ID)。BT-549细胞的生长不受影响。NO2-OA与顺铂联合治疗对MDA-MB-231和Hs578T细胞显示出相似的趋势，分别显示出6倍和3倍的生长抑制，而对BT-549细胞的生长抑制被抑制了1.4倍(图IE)。TNBC细胞的一个子集对PARP抑制敏感，并且在存在野生型BRCA1的情况下显示BRCAness表型，因此评估PARP-1抑制剂奥拉帕尼以确定与NO2-OA联合治疗是否增强效力。当奥拉帕尼与NO2-OA合用时，MDA-MB-231、Hs578T和BT-549细胞均显示增强的生长抑制率，分别为5、17和3倍(图IF)。为了具体显示奥拉帕尼与NO2-OA联合治疗(而不是OA)对细胞增殖的影响，并评估奥拉帕尼每日交换培养基的效果，在剂量反应分析中对MDAMB-231细胞增殖进行了定量。每日与OA组合施用奥拉帕尼对奥拉帕尼在MDA-MB-231细胞中的EC50无明显改变。相反，奥拉帕尼联合NO2-OA显著抑制生长(图1G)。接下来，使用Chou-Talalay方法测试另一种PARPi他拉唑帕尼与NO2-OA的联合生长抑制和组合指数测定。将MDA-MB-231细胞置于96孔板上，用他拉唑帕尼(0.01-75μm)加OA-NO2或NDA-NO2(0.2-12μm)处理3天。通过发光检测ATP(CellTiter-Glo)来测定MDA-MB-231细胞的生长抑制(相对细胞数)(图IK)。在用12或6.0μm NO-OA和0.01-75μm他拉唑帕尼处理的孔中，生长抑制率接近100％(图IK，上半部分)。这转化为一个强有力的组合指数，表明NO2-OA与他拉唑帕尼的药物协同作用(CI<1)(图IK，下半部分)。因此，标准TNBC化疗药物以及靶向PARP-1抑制在TNBC细胞中与NO2-OA联合施用时表现出增强的协同抗增殖作用，而不是加和作用。
体内肿瘤γH2AX水平的升高和TNBC细胞对DNA损伤剂的敏感性，特别是在奥拉帕尼诱导的反应中，导致了NO2-OA对DNA损伤修复调控的进一步探索。由于奥拉帕尼敏感性是HR缺陷细胞的一个标志，因此评估NO2-OA是否影响HR的DNA修复。为特异性检测DNA双链断裂修复，用5Gy IR激发MDA-MB-231细胞，然后定量检测RAD51病灶。用NO2-OA处理乳腺癌细胞抑制RAD51病灶的形成，如a)病灶超过5个的细胞数量和b)溶媒处理细胞在IR后的反应所反映的(图II)。MDA-MB-231细胞的细胞周期分析证实，细胞周期没有发生明显变化，这可能间接改变RAD51病灶的形成。核γH2AX染色检测MDA-MB-231细胞DNA损伤的评估在有或无5Gy IR的情况下发现，与溶媒对照组相比，NO2-OA显著增加辐照MDAMB-231细胞的核γH2AX的局域化，表明DSB和整体DNA损伤增加(图II)。在2Gy IR照射后的克隆形成试验中，NO2-OA浓度的增加也增加了乳腺癌细胞的死亡。5Gy IR后，OA和NO2-OA对未转化MCF10A和MDA-MB-231细胞的DNA损伤作用的评价发现，只增加了经NO2-OA2处理的TNBC细胞但不是MCF10A细胞的γH2AX核染色。NO2-OA降低HR，但不降低NHEJ效率
利用DRGFP报告基因分析进一步研究了NO2-OA对HR DNA修复的依赖性作用。该分析通过测量成功重组后产生的荧光GFP蛋白来对在将I-SceI切割引入系统后两个串联非荧光GFP构建体的整合cDNA盒的细胞内重组进行定量。每日NO2-OA处理含有DR-GFP构建体的U2OS细胞显示，I-SceI转染后，与天然OA或溶媒对照相比，48小时后GFP阳性细胞的数量显著减少2倍(图2A)。一种新的策略被用来测量活细胞HR变化的动力学，其是通过使用自动荧光显微镜跟踪GFP阳性细胞在单层中随时间的出现，而不是使用流式细胞仪静态测量分离细胞。为了解释细胞密度随时间的变化，每4小时用溶媒、5μM OA或NO2-OA处理DR-GFP U2OS细胞3天后测量细胞融合度。定量分析I-SceI诱导的切割后出现的GFP阳性细胞，并将其标准化为细胞融合，以比较NO2-OA与OA和未处理细胞。与对照组相比，每天施用5μM NO2-OA可使GFP阳性细胞的数量在68小时内减少2倍(图2B)。NO2-OA通过HR和NHEJ两种途径抑制DSB修复的影响通过EJ5-GFP-NHEJ报告基因分析来检测，该分析将GFP cDNA从一个转录启动子中分离出来，其中puro基因两侧有两个I-SceI切割位点。与DR-GFP介导的心率测定结果相反，EJ5-GFP-U2OS细胞显示OA-NO2对NHEJ无影响。流式细胞仪分析显示，48小时后或活细胞荧光显微镜观察超过68小时后，I-SceI切割后，GFP阳性细胞的数量没有变化(图2C，2D)。
NO2-OA靶向RAD51 Cys319并降低RAD51磷酸化
NO2-OA对IR诱导的RAD51病灶形成和DR-GFP-HR报告基因功能的抑制作用通过检测HR报告细胞中的关键HR蛋白RAD51的过度表达是否可以挽救NO2-OA的作用来进一步研究。与对照报告细胞相比，经5μM NO2-OA处理的稳定过度表达RAD51的U2OS DR-GFP报告细胞的HR活性(通过相对于OA对照处理的GFP阳性细胞百分比来测量)显著增加(图3A)。蛋白质结构数据(PDB:1N0W)显示Cys319是RAD51c末端内的一种溶剂暴露的亲核试剂，易与RI-1反应，RI-1也是一种具有Michael受体性质的试剂。此外，在体外，Cys319的荧光团加合破坏了RAD51纤维的形成。推测NO2-OA与RAD51 Cys319反应。实际上，生物素-NO2-OA，而非亲电生物素-油酸(OA)和生物素-10-硝基十八酸(SA-NO2)支持用链霉亲和素标记的珠粒从细胞裂解物中亲和沉淀RAD51(图3B)。比较RAD51 Cys312Ser或Cys319Ser突变反应与生物素-OA-NO2，揭示了NO2-OA与Cys319的优先反应(图3C)。RAD51Cys 312Ser和RAD51 WT对照组很容易被生物素-NO2-OA亲和沉淀，而RAD51Cys319Ser在突变细胞中表达时则相反。值得注意的是，RAD51 Cys312Ser突变体显示NO2-OA沉淀增强，这可能反映了RAD51 Cys312和Cys319之间的二硫键或另一种掩盖Cys319的细胞内蛋白的中断。通过体外测定Alexa-Fluor488偶联单链寡核苷酸的荧光偏振变化，探讨了NO2-OA特异性破坏RAD51与DNA结合的能力。NO2-OA(而不是OA)降低了在ATP和DNA存在下RAD51的相对极化(图3D)。对照实验发现OA和NO2-OA通过荧光团猝灭降低荧光偏振，没有引起非特异性效应。计算分析表明，通过与RAD51的Pro318的疏水作用以及与Glu322的氢键作用，RAD51Cys319的NO2-OA烷基化进一步稳定(图3E)。
Cys319位于两个ABL-SH3结合域(氨基酸283-286和318-321)之一的RAD51 C末端。除了RAD51纤维断裂外，NO2-OA还抑制RAD51和ABL的异二聚。IP分析显示纯化的RAD51和催化ABL核心(仅SH2、SH3和激酶结构域)复合物的形成被NO2-OA消除(图3F)。ABL通过依次磷酸化RAD51 Tyr54和Tyr315来调节RAD51活性。将FLAGRAD51和ABL核转染入293T细胞中，观察NO2-OA对RAD51-ABL复合物形成和RAD51-Tyr315磷酸化的影响。在用0到5μM NO2-OA处理细胞1小时后，FLAG IP分析显示NO2-OA降低与RAD51结合的ABL的量(图3G)。在抑制RAD51-ABL复合物形成的同时，NO2-OA也抑制FLAG-RAD51和ABL表达细胞中的RAD51-Tyr315磷酸化。为了确定NO2-OA是否烷基化TNBC细胞中的内源性RAD51，在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中加入生物素-NO2-OA。在两种细胞系的裂解液中观察到链霉亲和素沉淀后生物素-NO2-OA-RAD51复合物的形成(图3H)。总的来说，这些数据揭示了NO2-OA通过与RAD51和可能额外的HR相关靶蛋白形成加合物来抑制HR，以增强对DNA导向癌症治疗的敏感性(图3I)。
实验程序-硝基烯脂肪酸抑制三阴性乳腺癌细胞活力、迁移、侵袭和肿瘤生长
细胞培养和试剂
细胞系购自ATCC。MDA-MB-231和MCF7细胞在Dulbecco改良的Eaglet培养基中培养，MDA-MD-468细胞在改良的最低必需培养基(Gibco，Gaithersburg，MD)中培养，每种培养基均添加5％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)。MCF-10A细胞在含有在5％马血清(Hyclone)中的DMEM:F12(1:1)，并补充0.5μg/mL氢化可的松、0.1μg/mL霍乱毒素、20ng/mL表皮生长因子和10μg/mL胰岛素(Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯市)的生长培养基中培养。细胞在37℃的5％二氧化碳气氛中培养。针对人RelA(L-003533-00-0005)、人MRP1/ABCC1 siRNA(L-007308-00-0005)和非靶向对照siRNA(D-001810-10-05)的siRNA购自Dharmacon RNAiTechnologies。Lipofectamine 2000或3000(Life Technologies)用于细胞转染。MRP1抑制剂丙磺舒(4-[(二丙基氨基)磺酰基]苯甲酸)购自恩佐生命科学公司，并溶于1M氢氧化钠中。NF-κB抑制剂JSH-23(4-甲基-N1-(3-苯基丙基)-苯-1,2-二胺)和蛋白酶体抑制剂MG-132(Z-LLeu-D-Leu-L-Leu-al)购自Sigma-Aldrich。IKKβ抑制剂Bay 11-7082(3-[(4-甲基苯基)磺酰基]-(2)-丙烯腈)购自Calbiochem，以及TNFα购自BD Biosciences。
IKKβ磷酸化、IκBα磷酸化和IκBα降解的细胞处理
所有研究均采用两种TNBC细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468。为了确定N02-OA对TNFα在TNBC细胞中诱导的IKKβ磷酸化的影响，在TNFα(20ng/mL)刺激5分钟之前，用N02-OA(5|iM)、N02-SA(5μM)或BAY11-7082(10μM)在无血清培养基(含有0.1％不含脂肪酸BSA的DMEM)中预处理细胞2小时。对于IκBα降解，如上所述处理细胞，并用20ng/mL TNFα刺激细胞10分钟。对于IκBα磷酸化，在无血清培养基中用MG-132(10μM)与NO2-OA(5μM)、NO2-SA(5μM)或BAY11-7082(10μM)组合预处理细胞2小时，然后用TNFa(20ng/mL)刺激细胞10分钟。
NO2-FA的合成及应用
油酸(OA；十八碳-9-烯酸)购自Nu Chek Prep(Elysian，MN)。硝基硬脂酸(NO2-SA；10-硝基十八酸)是由10-硝基油酸还原得到的。具体地，将NO2-OA溶解在THF/甲醇中并冷却，然后添加硼氢化钠。搅拌烧瓶并通过UV分析监测等分样品，直到硝基烯完全损失，然后用乙酸使反应猝灭。通过首先加合任何剩余的NO2-OA以及添加半胱氨酸来纯化NO2-SA，然后NO2-SA在硅胶上使用乙酸乙酯/己烷梯度进行色谱分离。将OA、NO2-OA和NO2-SA溶解在无水甲醇中，并在所有实验中的使用前立即在培养基中稀释，最大甲醇浓度为0.1％(体积/体积)。从相应的游离脂肪酸和生物素-(聚乙二醇)-胺合成生物素化NO2-FA(Bt-NO2-OA、Bt-NO2-SA和Bt-OA)。
细胞生长试验
细胞在96孔板中以每孔5000个细胞的细胞密度进行培养。贴壁过夜后，更换培养基并用0至15μm NO2-OA、NO2-SA或0.1％甲醇(溶媒)处理细胞48小时。在MRP抑制研究中，MCF-10A细胞用0.25mM丙磺舒预处理1小时，然后用0到25μMNO2-OA预处理48小时。根据制造商的说明，使用FluoReporter dsDNA定量试剂盒(分子探针)对细胞进行计数。使用SpectraMax M2平板阅读器(分子装置)测量荧光。采用Biosoft公司的CalcuSyn软件测定NO2-OA的半数最大抑制浓度(IC50)。进行了三个单独的实验(n＝5/个)，通过双因素方差分析和Tukey后检验确定两个细胞系在不同剂量下的统计比较。
荧光活化细胞分选(FACS)
在6孔板中以2.5x105的细胞密度将MCF-10A、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞培养24小时，然后用0.1％甲醇(溶媒)、5μM NO2-OA、NO2-SA或OA处理24小时。收集贴壁细胞和非贴壁细胞，在2000x rpm下离心10分钟，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤，在4℃下用70％冷乙醇固定30分钟，然后用50μg/mL碘化丙啶(Sigma-Aldrich)染色。FACS分析在匹兹堡大学免疫学系统一流动核心设施进行。采用单因素方差分析和Tukey后验法对各期(G0/G1、S和G2/M)进行统计学比较。
细胞迁移分析
MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞在Boyden室中进行细胞迁移分析。每次实验前，在12孔膜过滤器(BD Biosciences)底部涂上10μg/mL纤维粘连蛋白12小时。细胞用5μM NO2-OA或NO2-SA预处理1小时，然后在不存在或存在TNFα(20ng/mL)的情况下在含有1％FBS的培养基中额外处理2小时。细胞用胰蛋白酶消化，并用移行培养基(含0.1％无脂肪酸BSA的DMEM)洗涤，以去除血清。然后将密度为105/孔的细胞置于具有相同预处理条件的迁移培养基的上腔中。使细胞向5％FBS化学引诱剂迁移5小时。用棉签去除顶面未迁移的细胞。迁移的细胞用4％多聚甲醛固定(Electron Microscopy Sciences)。然后用0.5％结晶紫(Sigma-Aldrich)染色15min。用显微镜观察滤膜上迁移的细胞密度。迁移细胞上的结晶紫用10％醋酸脱色，在A573nm处测定单个滤膜的吸光度。图像是三个单独实验的代表，通过单因素方差分析和Tukey后检验确定治疗间的统计比较。
细胞侵袭试验
MDA-MB-468细胞用NO2-OA(5μM)、NO2-SA(5μM)或NF-KB抑制剂JSH-23(10μM)预处理1小时，然后在不存在或存在TNFα(20ng/mL)的情况下在含1％FBS的培养基中再进行2小时的预处理。然后将细胞悬浮在迁移介质中，置于侵入室(EMD微孔)的顶部孔中。将化学引诱剂(5％FBS)置于下腔中，37℃下放置24h，吸引侵袭细胞。然后采集细胞，并根据制造商的协议测定侵袭率。分别进行了三个单独实验，采用单因素方差分析法和Tukey后检验法对各处理间的统计比较进行分析。
荧光素酶对NF-κB活性的分析
采用荧光素酶化学发光法分析了NF-κB转录活性。用Lipofectamine 3000和NF-KB荧光素酶报告质粒(Stratagene，LaJolla，CA)瞬时转染12孔板中MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞(约70％融合)。转染(24小时)后，细胞用NO2-OA(5μM)、NO2-SA(5μM)、OA(5μM)或JSH-23(20μM)预处理2小时，然后用20ng/mL TNFα再处理4小时。每一次转染均一式三份。用双荧光素酶检测试剂盒(Promega)测定荧光素酶活性。根据制造商的说明(Victor II，PerkinmerLifeScience)，使用96孔板光度计测量相对光单位(RLU)。蛋白质浓度采用BCA Assay(Thermo Fisher Science)进行测量。数据表示处理后的样品与对照组在平均RLU/蛋白质含量+/-SD的方面的比率。分别进行三个单独实验，并用Kruskal-Wallis检验、然后Dunn后检验和Bonferroni修正后进行多次比较，确定其统计意义。
NO2-FA蛋白质烷基化反应
为了确定NO2-FAs是否与TNBC细胞中的RelA(p65)或IKKβ结合，MDA-MB-231或MDA-MB-468细胞在含有5％FBS的DMEM中用5μM生物素化(Bt)脂质Bt-NO2-OA、Bt-NO2-SA或Bt-OA处理。2小时后，在裂解缓冲液中收获细胞，所述裂解缓冲液含有1％Triton X、10％甘油、150mM NaCl、10mM HEPES、1mM EDTA、1mM EGTA的，并补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物(罗氏应用科学公司)。将总细胞裂解物(0.5-1mg)与链霉亲和素琼脂糖珠(Sigma-Aldrich)混合并在4℃下培养过夜。用裂解缓冲液将珠子洗涤三次。SDS-PAGE后，用抗RelA鼠单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)或抗IKKβ兔多克隆抗体(Cell Signaling)进行免疫印迹。用重组RelA蛋白和LC-MS/MS分析，进行NO2-OA对RelA的烷基化反应的蛋白质组学分析。
免疫沉淀和NO2-OA诱导的RelA蛋白泛素化
用0.1％甲醇(溶媒)、NO2-OA(5μm)或NO2-SA(5μm)处理MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞6小时，然后在添加有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中收集细胞裂解物，以确定NO2-FA诱导RelA蛋白多泛素化的水平。裂解物通过14000x g离心10分钟来澄清。蛋白裂解物(1mg)与抗RelA抗体和蛋白G/A缀合琼脂糖珠(EMD Millipore，Bedford，MA)在4℃下培养过夜。免疫沉淀组分在14000x g下离心1分钟，然后用裂解缓冲液洗涤3次。免疫沉淀的RelA用8％SDSPAGE凝胶重新溶解，然后转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上，用抗泛素抗体(Santa-Cruz Biotechnology)探测进行免疫印迹。然后剥离印迹并用抗RelA抗体探测，以评估RelA蛋白下拉量。
免疫印迹法
进行免疫印迹法。将每泳道20-60μg的总裂解物装载在7％、10％或12％的SDS-PAGE上，然后转移到硝化纤维素或聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad)上。所述膜用抗以下物质的一级抗体进行探测：胱天蛋白酶-3、多药耐药蛋白-1(MRP1)、多聚[ADP核糖]聚合酶-1(PARP-1)、泛素、RelA；细胞周期蛋白Dl、p21、胱天蛋白酶-9、MRP4、IKKβ、pIKKβ、IκBα或pIκBα(CellSignaling)；胱天蛋白酶-8(R&D Systems)。样品标准化为β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich)或GAPDH(Trevigen)。利用Image Lab软件(Bio-Rad)对蛋白质条带进行可视化和数字化图像量化。免疫印迹至少代表了三个单独的实验。定量结果是3个以上单独实验的平均值，通过单因素方差分析和Tukey后检验来确定统计显著性。
RNA提取、qPCR和RT2 profiler PCR Array
为测定NO2-OA对TNFα诱导的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中的NF-κB靶基因表达的影响，细胞用NO2-OA(5μM)预处理2小时，然后用TNFα(20ng/mL)刺激6小时。根据制造商说明书(Invitrogen)，使用TRIZOL试剂提取组织或细胞的总RNA样品。根据制造商的说明，使用iScript cDNA试剂盒(Bio-Rad)反向转录总RNA(1μg)。cDNA(25ng)用于随后的定量实时PCR(qRT-PCR)反应。所有qRT PCR均在StepOne PLUS PCR系统(Thermo FisherScientific)上使用TaqMan基因表达分析进行。以18S核糖体RNA或人β-肌动蛋白RNA为内对照，采用ΔΔCt法计算差异倍数变化。进行3个单独的实验，并采用单因素方差分析和Tukey后检验法进行统计学分析。对于RT2 profiler PCR Array，MDA-MB-468细胞用NO2-OA(5μM)处理24小时或不处理。按照制造商手册(Qiagen)中的说明，采用96孔板格式分析84个人NF-κB靶基因的表达。采用StepOne-PLUS PCR系统进行PCR扩增，并根据生产厂家说明书计算基因表达的差异倍数变化。
细胞培养基中NO2-OA-GSH缀合物(NO2-OA-SG)和NO2-OA的分析
MCF-10A、MDA-MB-231或MDA-MB-468细胞在6孔板(每孔1×106个细胞)中培养24小时。处理前，细胞培养基用含5％FBS的DMEM代替。将NO2-OA(5μM)添加到所述培养基中并且在收集细胞培养基之前将细胞在37℃下培养60分钟。对于MRP1抑制研究，MCF-10A细胞用1mM丙磺舒预处理1小时，然后与5NO2-OA共处理额外1小时。对于MRP1 siRNA敲除研究，在用5μM NO2-OA处理1小时之前，用非靶向siRNA(加扰)或MRP1 siRNA瞬时转染MCF-10A细胞48小时。用PBS清洗细胞，然后轻轻地将所述细胞由平板上刮除到1mL PBS中。细胞悬浮液的100μL经超声溶解，并通过BCA蛋白测定用于蛋白质浓度测定。剩余的0.9ml细胞悬液用于测定细胞内NO2-OA-SG的量。采用改进的Bligh-Dyer法提取NO2-OA-SG和游离NO2-OA，其中NO2-OA-SG分配在极性相中，而NO2-OA分配在有机相中。提取前，在细胞培养基中加入15NO2-d4-OA(5nm)作为游离NO2-OA的内标。样品在2800rpm和RT下离心5分钟。将底部(有机)层转移到干净的小瓶中，干燥并在甲醇中重建，然后进行MS分析。使用3mL C18 SPE柱(ThermoFisher Scientific)对含有NO2-OA-SG的上(水)层进行脱盐和浓缩。在加入样品之前，先用1柱体积的100％甲醇预处理柱，然后用2柱体积的5％甲醇预处理柱。提取前，样品在4℃下旋转并平衡5分钟。样品用两个柱体积的5％甲醇清洗，然后所述柱在真空下干燥30分钟，然后用3mL100％甲醇洗脱。然后在N2下蒸发溶剂，样品在甲醇中重建以供进一步分析。
GSH和GSSG的提取与分析
将MCF-10A、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞以3x105细胞/孔的密度接种于24孔板中。在用5μM NO2-OA处理指定时间之前，细胞培养过夜。在每个时间点，吸取细胞培养基并用无菌PBS洗涤2次。然后将细胞与含有25mM N-乙基马来酰亚胺(NEM)的PBS在37℃下培养15分钟。衍生溶液(50μL的15％MeOH，40mM HEPES，50mM NaCl、1mM EDTA、2μM[13C215N]-GSH、2μM[13C415N2]-GSSG、和25mM NEM)添加至每个孔中，并在室温下培养15分钟。接下来，立即向每个孔中添加50μl的10％(w/v)磺基水杨酸溶液以稳定GSH和GSSG。通过在4℃下以15000RPM离心10min收集上清液。将样品在5％磺基水杨酸中稀释1:5，并注入20μL进行HPLC-MS/MS分析。用Hoechst 33258DNA染色法测定0小时时的细胞数，并用于标准化以nmol/细胞(x 106)表示的GSH或GSSG水平。
液相色谱-质谱(LC-MS/MS)
NO2-OA、NO2-OA-SG、GSH和GSSG通过高效液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-MS/MS)进行分析，使用岛津/CTC PAL HPLC耦合Sciex 5000三重四极质谱仪(Sciex，加利福尼亚州圣何塞)。NO2-OA、NO2-OA-SG梯度溶剂体系由水+0.1％乙酸(溶剂A)和乙腈+0.1％乙酸(溶剂B)组成。使用Luna C18反相柱(2mm X 100mm，Phenomenex，Torrence，CA)以0.65mL/min的流速分离NO2-OA及其代谢物。将样品以30％B的浓度施加到柱上，并以溶剂B的线性增加(9.7分钟内30-100％)洗脱。该柱在100％B下洗涤3分钟，然后返回初始条件进行平衡(2分钟)。使用Luna C18反相柱(2mm x 150mm，Phenomenex)以0.25mL/min流速分离NO2-OA-SG缀合物。将样品以20％B置于柱上保持5分钟，并用线性增加的溶剂B(20-98％的溶剂B保持20分钟)洗脱，然后在98％B下洗涤4.5分钟，然后返回初始条件4分钟。在负离子模式下，采用电喷雾电离，碰撞气体设置为5个单位，帷幕气体设置为40个单位，离子源气体设置为#1 55个单位和#2 60个单位，离子喷雾电压为-4500V，温度为600℃，对NO2-FAs进行质谱分析。去簇电压为-80eV，入口电位-5，碰撞能量-35，以及碰撞出口电位-3。多重反应监测(MRM)用于分析显示碰撞诱导离解时硝基(m/z 46)丢失的脂质。(对于NO2-OA和15NO2-d4-OA，MRM分别为326.2/46和331/47)在负离子模式下。在正离子模式下，NO2-OA-SG缀合物的质谱仪参数如下：气体#1 50和气体#2 55，离子喷雾电压5000V，源温度设定为550℃，去簇电压为70eV，入口电位为5，碰撞能量为17，碰撞出口电位为5。以下MRM转换分别用于NO2-OA-SG和15NO2-d4-OA-SG：635.2/506.2和640.2/511.2。同时测定GSH和GSSG的方法涉及在Phenomenex C18(2.1x150mm，3.5μ孔径)柱上分离样品(20μL)。溶剂体系采用0.1％甲酸水溶液(A)和0.1％甲酸乙腈溶液(B)，净流量为0.6mL/min，线性梯度为2％B至75％B，从0.1-6.2分钟，然后用100％B洗涤2分钟，再用2％B再平衡6分钟进行分离。未标记和13C415N2 GSSG在2.7分钟下洗脱，而未标记和13C415N GS-NEM在
Figure BDA0003062146500000411
2.7分钟下洗脱。Sciex 5000质谱仪设置如下：CAD 4单位，帷幕气体40单位，GS1 45单位，GS2 50单位，离子喷雾电压5500V，源温度550℃，EP 5V，以及CXP 10V在正离子模式下进行多反应监测。各物种的跃迁如下：GSH(Q1308.3→Q3179.1；去簇电压(DP)60V，碰撞能(CE)18.5V)。13C415N GSH(Q1 311.3→Q3182.1；DP 60V，CE18.5V)。GS-NEM(Q1 433.0→Q3 304.2；DP 65V，CE 38V)；13C415N GS-NEM(Q1 436.0→Q3307.2；DP 65V，CE 38V)；GSSG(Q1 613.2→Q3 355.2；DP 60V，CE 24V)；13C415N GSSG(Q1619.2→Q3 361.2；DP 60V，CE 24V)。使用已知的GSH和GSSG标准品和同位素内标品生成校准曲线，显示线性超过5个数量级，GS-NEM和GSSG的定量限均为InM。样品[GSH]和[GSSG]的测定方法如下：分析物：I.S.面积比，而细胞内GSH和GSSG被标准化为细胞数(106)，结果表示为nmol GSH或GSSG/106个细胞。
统计分析
使用Prism 6软件(GraphPad Software)进行数据分析。结果以平均值±SD表示，肿瘤体积除外，图4E以平均值±SD表示。使用Student’s t检验进行统计分析，单因素或双因素方差分析(视情况而定)。p<0.05则有统计学显著性。
结果-硝基烯脂肪酸抑制三阴性乳腺癌细胞的存活、迁移、侵袭和肿瘤生长NO2-OA抑制TNBC细胞生长和活性
评估内源性脂质亲电体NO2-OA及其非亲电对照脂肪酸(NO2-SA和OA)对正常和癌症乳腺导管上皮细胞生长和信号反应的影响(图4A)。为了检测NO2-OA是否优先抑制TNBC细胞的生长，使用Hoechst 33258对非致瘤性乳腺上皮细胞(MCF-10A)、ER+乳腺癌细胞系(MCF7)和两个TNBC细胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-468)进行计数。每个细胞系用一定浓度范围的NO2-OA(0-15μm)处理48小时。NO2-OA显著抑制两种TNBC细胞系的生长，但不抑制ER+或MCF-10A细胞的生长(图4B、4C、4D)。与TNBC MDA-MB-231(2.7±0.11μM)和MDAMB-468(1.6±0.11μM)细胞相比，NO2-OA对非癌MCF-10A细胞(7.7±1.93μM)和MCF7细胞(11.61±3.59μM)的IC50显著更高(图4E)。除了优先抑制TNBC细胞生长外，MTT检测完整的细胞电子转移机制显示NO2-OA也显著降低MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的活力，但不降低MCF7或MCF-10A细胞的活力。在持续时间为1-8小时的后续细胞信号和功能研究中通常使用的5μM NO2-OA浓度下，在任何细胞系中24小时内均未检测到细胞毒性。结构上与NO2-OA相关的非亲电性NO2-SA(图4A)不影响TNBC细胞生长，证实了NO2-OA介导的TNBC细胞生长抑制归因于亲电性硝基烯部分。
NO2-OA降低MDA-MB-231异种移植瘤生长
考虑到NO2-OA抑制TNBC细胞的生长和活性，在TNBC小鼠异种移植模型中研究了NO2-OA对肿瘤生长的影响。将MDA-MB-231细胞注射于6周龄雌性裸鼠腹股沟第4乳脂肪垫。开始口服灌饲NO2-OA(7.5mg/kg/天)、NO2-SA(7.5mg/kg/天)或芝麻油(溶媒对照)，并在平均肿瘤尺寸达到50-100mm3后持续4周。治疗后27天时，与溶媒对照组和NO2-SA治疗组相比，NO2-OA治疗组小鼠的肿瘤生长显著减少(图4F)。在治疗过程中，NO2-OA治疗组和对照组小鼠的体重没有减轻。
这些结果支持NO2-OA介导MDA-MB-231细胞的体内生长抑制而没有明显的毒性作用。
NO2-OA诱导TNBC细胞中的细胞周期阻滞和细胞凋亡
为了确定细胞数量的减少是否是由于NO2-OA诱导的细胞周期改变所致，我们进行了荧光活化细胞分选分析(FACS)。在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中处理24小时时，NO2-OA显著增加G2/M期细胞的百分比，并降低G0/G1期细胞的百分比(图5A，5B)。值得注意的是，MCF-10A细胞的所有细胞周期期群体(G0/G1、S和G2/M)不受NO2-OA的影响(图5C)。在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中，NO2-OA对细胞周期的抑制伴随着p21的增加和细胞周期蛋白D1表达的降低，但在MCF-10A细胞中没有(图5D)。与对细胞生长和活力缺乏影响一致，NO2-SA不影响MCF-10A、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中的细胞周期群体或细胞周期调节蛋白的表达(图5D)。定量RT-PCR检测细胞周期蛋白D1和p21的基因表达。处理24小时后，NO2-OA可下调MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞而非MCF-10A细胞的细胞周期蛋白D1并上调p21的基因表达。这些结果表明，NO2-OA选择性地诱导TNBC细胞中的细胞周期阻滞。NO2-OA处理24小时后，在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中，亚Gl细胞群体都明显增加。用免疫印迹法检测PARP-1的裂解，以确定NO2-OA对TNBC细胞中亚Gl细胞的作用是否是凋亡介导的。NO2-OA处理24小时可促进胱天蛋白酶-3介导的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞而非MCF-10A细胞中PARP-1的裂解(图5E)，这表明NO2-OA通过胱天蛋白酶-3激活优先诱导TNBC凋亡。此外，p21的增加可能阻断细胞周期进入S期，导致亚Gl细胞的增加。为了进一步研究TNBC细胞中对NO2-OA的凋亡信号反应，使用检测这些起始子胱天蛋白酶的前胱天蛋白酶形式和激活(切割)形式的抗体来分析起始子胱天蛋白酶(外源途径的胱天蛋白酶-8和内源途径的胱天蛋白酶-9)的激活。NO2-OA处理增加了MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-9的裂解，表明NO2-OA通过TNBC细胞中的内源性(线粒体依赖性)和外源性(死亡受体依赖性)凋亡信号机制诱导凋亡(图5F)。总之，这些结果证实，与MCF-10A细胞相比，NO2-OA选择性地调节TNBC细胞中的细胞周期阻滞和凋亡。
细胞外NO2-OA-谷胱甘肽加合物外向通量与MRP1表达相关
在细胞内隔室内，GSH及其活性Cys部分比蛋白质硫醇更为丰富，因此GSH和其他低分子量硫醇是自由基、氧化剂和亲电试剂氧化和烷基化的主要靶点。在NO2-OA易于扩散并进入细胞内室和亚细胞器蛋白质靶点的情况下，形成GSH缀合物(NO2-OA-SG)，其可通过GSH缀合物外向通量泵MRP1从细胞主动转运。用5μmNO2-OA处理MCF-10A、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞1小时后，通过测定这些细胞的培养基中细胞外NO2-OA-SG的浓度进一步研究了这一现象。输出到MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的培养基中的NO2-OA-SG水平显著低于由MCF-10A细胞释放的NO2-OA-SG水平(图6A)。MCF-10A和TNBC细胞产生的细胞外NO2-OA-SG水平的4-5倍差异促使比较MRP1蛋白的相对表达程度以及TNBC和非癌细胞系的GSH和GSSG含量。免疫印迹分析在MCF-10A细胞中检测到MRP1蛋白表达，但在两种TNBC细胞系中均未检测到MRP1(图6B)。MRP4 mRNA在3种细胞中均呈低水平表达，但通过免疫印迹均未检测到明显的蛋白表达。
MRP1对MCF-10A细胞中NO2-OA活性的影响
两种策略，使用有机阴离子转运抑制剂丙磺舒(通常用作MRP抑制剂)，以及MRP1的siRNA敲除，有助于研究MRP1在对NO2-OA的细胞反应中的作用。丙磺舒和MRP1 siRNA敲除(约70％的敲除效率)均增强了MCF-10A细胞中NO2-OASG加合物的细胞内水平(图6CD)。值得注意的是，丙磺舒还显著增强了NO2-OA对MCF-10A细胞生长的抑制作用(图6E)。丙磺舒预处理的MCF-10A细胞中NO2-OA的IC50(7.23±0.15μm)比仅用NO2-OA处理(14.23±1.05μm；图6F)降低了2倍。此外，丙磺舒增加了NO2-OA诱导的MCF-10A细胞周期阻滞的程度，如p21水平增加和伴随的细胞周期蛋白D1表达减少所反映的(图6G)。丙磺舒还增强了NO2-OA诱导的MCF-10A细胞中的凋亡，其中具有增强的胱天蛋白酶-3活化和PARP-1裂解(图6H)。这些观察结果与NO2-OA的细胞内浓度和细胞生长/细胞存活信号作用均受NO2-OA与GSH的反应程度以及随后NO2-OA-SG的MRP1输出影响是一致的。
GSH和GSSG对MCF-10A细胞和TNBC细胞中的NO2-OA的反应
5μM NO2-OA处理后0至12小时内GSH和GSSG的LC-MS定量显示，MCF-10A细胞中的基础GSH水平(19.3±1.9nmol/106细胞)是MDA-MB-231(8.3±0.8nmol/106细胞)的>2倍，并且是MDA-MB-468细胞(12.9±0.5nmol/106细胞)的
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1.5倍(图7A)。在MCF-10A细胞中，GSSG水平(图7B)在时间零点更高，导致初始的GSH:GSSG比率为82±16，相比之下对于MDA-MB-231细胞为653±68，而对于MDA-MB-468细胞为2003±163。MCF-10A细胞在NO2-OA治疗后的前6小时内维持了该GSH:GSSG比率，但在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中由于GSH浓度降低，GSH:GSSG比率迅速下降。总之，图6和7中的数据支持NO2-OA和TNBC细胞中的细胞蛋白靶点之间预期会有更广泛的反应，因为较低的GSH浓度提供了更有利的药代动力学(更高的细胞内浓度和更长的t0.5)，并且MRP 1缺陷的TNBC细胞表型抑制了NO2-OA-SG的输出。在MCF-10A细胞中，NO2-OA更容易被谷胱甘肽化和输出，从而限制与信号通路蛋白的反应。
NO2-OA抑制TNFα诱导的TNBC细胞迁移和侵袭
炎症刺激如TNFα可诱导在肿瘤微环境中的反应，该反应可促进TNBC肿瘤的转移和侵袭。由于亲电NO2-FAs介导抗炎信号作用，因此评估了NO2-OA对TNFα诱导的TNBC细胞迁移的影响。Boyden腔迁移分析表明，与基础条件(图8A，图像2和图7)相比，TNFα增强了MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的迁移(图8A，图像3和8)。NO2-OA显著抑制TNFα诱导的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞迁移(图8A，图像4和9；图5，B和C)。NO2-OA适度抑制MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的基础、非刺激迁移(图8、B和C)。接下来，将细胞置于涂有基质胶的透孔渗透性支架中进行侵袭试验，以评估NO2-OA对TNBC细胞侵袭表型的潜在影响。NO2-OA处理MDA-MB-468细胞显著抑制TNFα诱导的侵袭，而非亲电对照脂肪酸(NO2-SA)对肿瘤细胞侵袭显示出微不足道的效应(图8D)。比较了NO2-OA对MDA-MB-468侵袭的抑制作用以及对NF-κB抑制剂JSH-23的细胞反应，后者抑制RelA亚单位的核转位。与JSH-23类似，NO2-OA抑制TNFα诱导的MDA-MB-468细胞中的侵袭(图8D)。
NO2-OA抑制TNBC细胞中TNFα诱导的NF-κB转录活性
JSH-23对MDA-MB-468细胞侵袭的抑制(图8D)表明NO2-OA也可能抑制TNFα诱导的乳腺癌细胞迁移，因为它具有抑制NF-KB信号传导的能力。为了验证这一概念，我们检测了NO2-OA对TNBC细胞中TNFα激活的NF-κB转录活性的影响。用的NF-κB荧光素酶报告质粒瞬时转染MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞，然后用5μMNO2-OA处理2小时，接着用20ng/mL TNFα活化4小时。除NO2-OA外，还检测了非亲电脂质对照组NO2-SA(5μM)和OA(5μM)。与单独TNFα相比，NO2-OA显著抑制两种TNBC细胞系中NF-κB依赖的荧光素酶的转录，而NO2-SA和OA没有作用。此外，NO2-OA对NF-κB依赖性荧光素酶表达的抑制程度与NF-κB抑制剂JSH-23所诱导的相似(20μM，图9，A和B)。这些数据表明，NO2-OA的亲电反应性是抑制TNFα诱导的TNBC细胞NF-κB转录活性的原因。
NO2-OA抑制NF-κB调控的TNBC肿瘤转移相关基因表达
NO2-OA对NF-κB转录活性的抑制表明肿瘤转移相关下游靶基因的表达会降低。为了研究这一点，通过RT2 profiler PCR Array分析用NO2-OA(5μM)处理24小时的MDA-MB-468细胞，由此评估关键的NF-κB靶基因。比较NO2-OA调控的NF-κB靶基因与MDA-MB-468未处理对照细胞的表达水平。数据显示，NO2-OA处理可降低多种NF-κB靶基因的mRNA表达，包括ICAM-1和uPA，这两种关键的肿瘤进展和转移介质(图9C)。TNFα诱导MDAMB-231细胞中ICAM-1和uPA的表达(37,38)。为了更直接地检测NO2-OA是否抑制TNBC细胞中TNFα诱导的ICAM-1和uPA的表达，用5μM NO2-OA和20ng/ml TNFα处理MDA-MD-231或MDA-MD-468细胞。同时用NO2-OA或RelA siRNA处理导致TNFα诱导的TNBC细胞中ICAM-1和uPA基因表达的抑制(图9D，9E；9G，9H)。通过qRT-PCR进一步评估NO2-OA和RelA siRNA对RelA依赖性靶基因表达的影响(图9F；91)。RelA siRNA处理可抑制RelA-mRNA水平，但NO2-OA不抑制。NO2-OA和RelA siRNA均通过NF-κB依赖机制抑制TNFα诱导的ICAM-1和uPA基因表达。为了确定NO2-OA是否在细胞迁移过程中抑制TNFα诱导的促转移性(pro-metastatic)ICAM-1和uPA基因的表达，在Boyden室迁移实验中研究的MDA-MB-468细胞中评估ICAM-1和uPA基因的转录水平(图8C)。在这些条件下，NO2-OA显著抑制移行性肿瘤细胞中TNFα诱导的ICAM-1和uPA的表达，再次支持NO2-OA抑制NF-κB调节的转移相关基因的表达。
NO2-OA抑制TNBC中TNFα诱导的IKKβ/IκBβ信号传导
为了更好地定义NO2-OA抑制TNFα激活的NF-κB信号传导的机制，在TNFα刺激(20ng/mL，5分钟)前用NO2-OA(5μM)或IKK抑制剂BAY11-7082(10μM)预处理MDA-MB-231或MDA-MB-468细胞2小时。TNFα诱导的IKKβ磷酸化被NO2-OA和BAY 11-7082减弱(图10A)。NO2-OA和BAY 11-7082也都抑制TNFα刺激后IκBβ的降解(20ng/mL 10分钟，图10B)。此外，在用NO2-OA或BAY11-7082和蛋白酶体抑制剂MG-132预处理的细胞中，发生IκBβ磷酸化的降低(10μM，图1C)。这表明NO2-OA抑制TNFα诱导的IKKβ磷酸化和IκBβ降解，这些作用反过来抑制TNBC细胞中下游NF-κB信号传导。
NO2-OA烷基化IKKβ和RelA蛋白
Cysl79，位于IKKβ的活化环中，是氧化和亲电烷基化反应的靶标。由于NO2-OA抑制了TNBC细胞中TNFα诱导的IKKβ和IκBβ的磷酸化(图10A，10C)，因此研究了NO2-OA直接修饰IKKβ的可能性。合成生物素化的脂质(Bt-NO2-OA、Bt-NO2-SA和Bt-OA)以促进亲和捕获介导的NO2-OA和对照脂肪酸与IKKβ的加合物的测量。MDA-MB-231或MDA-MB-468细胞用5μm BT-NO2-OA、Bt-NO2-SA或Bt-OA处理2小时，然后使用链霉亲和素结合珠从全细胞裂解物中提取所有烷基化蛋白。免疫印迹显示IKKβ被Bt-NO2-OA拉低，但不被非亲电对照脂肪酸拉低(图10D)。类似地，Bt-NO2-OA(而不是对照脂肪酸)促进了下拉NF-κB RelA(图11A)。NO2-OA抑制LPS诱导的NF-κB转录活性，部分原因是对RelA Cys38的烷基化以及对RelA DNA结合的抑制。LC-MS/MS蛋白质组学分析表明RelA Cysl05也被NO2-OA烷基化，其中NO2-OA对RelACysl05的烷基化的功能意义尚未明确。总之，Bt-NO2-OA促进IKKβ和RelA的下拉，直接蛋白质组学分析显示NO2-OA对RelA的烷基化。这些观察结果强调NO2-OA介导PTM，后者抑制促炎症NF-κB信号传导的多个方面。
NO2-OA刺激RelA蛋白蛋白酶体降解
NF-κB的蛋白水解降解有助于其信号传导的终止。硫醇烷基化和亚硝化剂通过Cys62的PTM诱导HT29和HCT116肿瘤细胞系中NF-κB亚单位p50的降解。由于NO2-OA在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中均可共价加成RelA(图11A)，因此研究了NO2-OA PTMs对RelA蛋白质稳定性的影响。为了验证这个假定的机制，我们首先检测内源性RelA蛋白表达是否对NO2-OA有反应。MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-10A细胞用5μM NO2-OA或对照脂质(NO2-SA和OA)处理24小时。NO2-OA降低TNBC细胞中RelA的丰度，而NO2-SA和OA没有影响(图11B)。相反，MCF-10A细胞中的RelA蛋白水平没有被NO2-OA改变(图11B)。在所有三个细胞系中，RelAmRNA水平没有被NO2-OA改变。这些数据支持NO2-OA通过在TNBC细胞中RelA的烷基化作用影响RelA蛋白的稳定性。RelA由泛素蛋白和蛋白酶体依赖的降解信号调节，这些信号控制NF-κB的激活。为了确定NO2-OA修饰RelA是否诱导TNBC细胞中内源性RelA的泛素化，用5μM NO2-OA或NO2-SA处理MDA-MB-231或MDA-MB-468细胞5小时。免疫沉淀RelA蛋白，抗泛素法检测其多泛素化。NO2-OA而非NO2-SA促进两种TNBC细胞系中RelA的多泛素化(图11C)。这表明NO2-OA与RelA相互作用，通过促进TNBC细胞中的泛素化和蛋白酶体降解使RelA蛋白失稳。
亲电硝基脂肪酸区域异构体在抑制HhDR和对TNBC细胞系杀伤中的结构-功能关系
对Rad51晶体结构的计算分析表明，将硝基烯脂肪酸中的硝基烯取代基重新定位到更靠近C末端的位置，可通过邻近Cys319残基的羧基的氢键稳定来增强Rad51蛋白质结合。在此基础上，我们设计了7-NDA(7-NO2-十九碳-7-烯酸)。与NO2-OA相比，7-NDA显示出更低的IC50，与他拉唑帕尼联合使用时显示出更好的组合指数(图12)。
数据显示，与NFA或PARPi单独相比，用硝基烯脂肪酸联合PARPi治疗的TNBC异种移植小鼠的肿瘤体积显著减少。将lx106个MDA-MB-231细胞原位注射于裸鼠乳腺脂肪垫内。用游标卡尺测量OA+溶媒(n＝8)、NO2-OA+溶媒(n＝7)、OA+他拉唑帕尼(0.3mg/kg)(n＝10)或NO2-OA(15mg/kg)+他拉唑帕尼治疗的小鼠随时间的肿瘤体积。(图14)
鉴于可以应用所公开的发明的原理的许多可能的实施方案，应当认识到，所示的实施方案仅仅是本发明的优选示例，并且不应当被视为限制本发明的范围。

Claims (40)

1.一种方法，包括向患有癌症、疑似患有癌症、有发展成癌症风险或者处于癌症缓解中的个体共同施用以下成分：
治疗有效量的至少一种化合物(a)，所述化合物(a)选自(a)(i)硝基烯脂肪酸、(a)(ii)具有吸电子基团、离去基团和在所述吸电子基团与所述离去基团之间的碳-碳双键的不饱和脂肪酸、(a)(iii)硫醇化硝基脂肪酸、或(a)(iv)含有吸电子基团的二羧酸化合物；和
治疗有效量的至少一种抗肿瘤剂(b)，
其中所述癌症是具有DNA修复基因缺陷的遗传病因的癌症、自发基因组不稳定率高的癌症、用一种或多种DNA损伤剂治疗的癌症、或用一种或多种DNA损伤剂与免疫疗法联合治疗的癌症。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、脑癌或皮肤癌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是三阴性乳腺癌。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤或淋巴瘤。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的方法，其中所述抗肿瘤剂是聚(ADP核糖)聚合酶抑制剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述癌症是三阴性乳腺癌，并且所述个体对gBRCAm呈阴性。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述个体对用聚(ADP核糖)聚合酶抑制剂进行的单药治疗具有抗性。
8.根据权利要求1至4中任意一项所述的方法，其中所述抗肿瘤剂是DNA损伤剂或DNA损伤治疗。
9.根据权利要求1至4中任意一项所述的方法，其中所述抗肿瘤剂是阿霉素、顺铂、奥拉帕尼、鲁卡帕尼、尼拉帕尼、他拉唑帕尼、微利帕尼、喜树碱或辐照治疗。
10.一种方法，包括向患有三阴性癌症、疑似患有三阴性乳腺癌、有发展成三阴性乳腺癌风险或者处于三阴性乳腺癌缓解中的个体施用治疗有效量的至少一种化合物(a)，所述化合物(a)选自(a)(i)硝基烯脂肪酸、(a)(ii)具有吸电子基团、离去基团和在所述吸电子基团与所述离去基团之间的碳-碳双键的不饱和脂肪酸、(a)(iii)硫醇化硝基脂肪酸、或(a)(iv)含有吸电子基团的二羧酸化合物。
11.根据权利要求1至10中任意一项所述的方法，其中所述化合物(a)是RAD51抑制剂。
12.根据权利要求1至11中任意一项所述的方法，其中所述化合物(a)是硝基烯脂肪酸。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述硝基烯脂肪酸是包含至少一个碳-碳双键和至少一个硝基基团的化合物。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述硝基烯脂肪酸为式I者：
Figure FDA0003062146490000021
其中R1是氢、C1-C24烷基、C1-C24烯基或C1-C24炔基；
R2、R3、R7和R8各自独立地为氢、氧、C1-C24烷基、NO2、OH或OOH；
R4是末端COOR6基团，其中R6是氢、C1-C24烷基或药学上可接受的反离子；
R5是氢、C1-C24烷基，或R4和R5一起形成＝C(R9)(R10),其中R9包括C1-C24烷基、C1-C24烯基或C1-C24炔基，或者其中R9是末端COOR6基团，以及R10是氢、NO2、OH或OOH；
n是1至24；以及
其中所述硝基烯脂肪酸包含至少一个NO2基团。
15.根据权利要求14所述的方法，其中R1是C1-C24烷基。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中R2是氢。
17.根据权利要求14至16中任意一项所述的方法，其中R3或R8中的一者是NO2，而R3或R8中的另一者是氢。
18.根据权利要求14至17中任意一项所述的方法，其中R4是-COOH。
19.根据权利要求14至18中任意一项所述的方法，其中R5是氢。
20.根据权利要求14至19中任意一项所述的方法，其中R7是氢。
21.根据权利要求14至17中任意一项所述的方法，其中R4是-COOH；R5是甲基；并且R7是甲基。
22.根据权利要求12所述的方法，其中所述硝基烯脂肪酸是10-硝基-十八碳-9-烯酸。
23.根据权利要求12所述的方法，其中所述硝基烯脂肪酸是9-硝基-十八碳-9-烯酸。
24.根据权利要求12所述的方法，其中所述硝基烯脂肪酸是7-NO2-十九碳-7-烯酸。
25.根据权利要求12所述的方法，其中所述硝基烯脂肪酸是5-NO2-二十碳-5-烯酸。
26.根据权利要求12所述的方法，其中所述硝基烯脂肪酸是(6-NO2-十八碳-6-烯酸)。
27.根据权利要求1至11中任意一项所述的方法，其中所述化合物(a)是化合物(a)(ii),并且化合物(a)(ii)为:
Figure FDA0003062146490000022
其中m和n独立地是1至10的整数。
28.根据权利要求1至11中任意一项所述的方法，其中所述化合物(a)是化合物(a)(iii)，并且化合物(a)(iii)为:
Figure FDA0003062146490000031
其中x是1至5的整数，以及q、m、p和t独立地是1至10的整数。
29.根据权利要求1至11中任意一项所述的方法，其中所述化合物(a)是化合物(a)(iv)，并且化合物(a)(iv)为：
Figure FDA0003062146490000032
其中X是吸电子基团，m和n各自独立地是1至10的整数，或者
Figure FDA0003062146490000033
其中X是吸电子基团，Y和Z各自独立地是氢或C1-C10烷基，以及m和n各自独立地为1至10的整数。
30.根据权利要求1至11中任意一项所述的方法，其中所述化合物(a)为：
Figure FDA0003062146490000034
其中m是1-10；
n是1-10；
双键是顺式到反式的；以及
X是选自以下的吸电子基团：-NO2，-CN，卤化物，CxF2x+1，其中x是1-5，SOR，其中R是H或C1-C6烷基，SO2R，其中R是H或C1-C6烷基，或SO3R，其中R是H或C1-C6烷基。
31.根据权利要求31所述的方法，其中X是-NO2。
32.根据权利要求1至11中任意一项所述的方法，其中所述化合物(a)为：
Figure FDA0003062146490000041
其中m是1-10；
n是1-10；
双键是顺式到反式的；
Y和Z各自独立地是C1-C10烷基、烯基或炔基；
并且X是选自以下的吸电子基团：-NO2，-CN，卤化物，CxF2x+1，其中x是1-5，SOR，其中R是H或C1-C6烷基，SO2R，其中R是H或C1-C6烷基，或SO3R，其中R是H或C1-C6烷基。
33.根据权利要求1至11中任意一项所述的方法，其中所述化合物(a)为：
Figure FDA0003062146490000042
其中m是1-10；
n是1-10；
双键是顺式到反式的；
Y和Z各自独立地为C1-C10烷基、烯基或炔基；
并且X是选自以下的吸电子基团：-NO2，-CN，卤化物，CxF2x+1，其中x是1-5，SOR，其中R是H或C1-C6烷基，SO2R，其中R是H或C1-C6烷基，或SO3R，其中R是H或C1-C6烷基。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中m是2，并且n是2。
35.根据权利要求32至34中任意一项所述的方法，其中Y和Z各自独立地是C1-C6烷基。
36.根据权利要求32至24中任意一项所述的方法，其中Y和Z各自独立地是甲基或乙基。
37.根据权利要求32至36中任意一项所述的方法，其中X是-NO2。
38.根据权利要求1至11中任意一项所述的方法，其中所述化合物(a)为：
Figure FDA0003062146490000043
Figure FDA0003062146490000051
39.一种药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种化合物(a)，所述化合物(a)选自(a)(i)硝基烯脂肪酸、(a)(ii)具有吸电子基团、离去基团和在所述吸电子基团与所述离去基团之间的碳-碳双键的不饱和脂肪酸、(a)(iii)硫醇化硝基脂肪酸、或(a)(iv)含有吸电子基团的二羧酸化合物；以及
治疗有效量的至少一种抗肿瘤剂(b)。
40.一种具有以下结构的化合物：
Figure FDA0003062146490000052
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