CN112996484A - 用于治疗皮下脂肪团的注射技术 - Google Patents

Abstract

这里公开的内容涉及一种方法，该方法通过施用有效量的胶原酶治疗人类受试者大腿或者臀部上皮下脂肪团，并通过一种或者多种量表评价皮下脂肪团严重性的降低。

Description

用于治疗皮下脂肪团的注射技术

相关申请

本申请要求2019年7月11日递交的国际申请PCT/US19/41494、2018年7月12日递交的美国临时申请第62/697,376号和2018年9月18日递交的美国临时申请第62/733,046号的优先权，这些专利的全部内容通过引证在此全部并入本文。

技术领域

本申请涉及评估病治疗皮下脂肪团领域。

背景技术

皮下脂肪团(也称为水肿性纤维硬化性泛神经病变(EFP))是一种美学疾病，可以理解为皮下连接处的结构特征和生物力学特性(即微妙的遏制力和挤出力)之间的不平衡(Rudolph et al，“Structural Gender Dimorphism and the Biomechanics of theGluteal Subcutaneous Tissue：Implications for the Pathophysiology ofCellulite，(“结构性别二型性和臀部皮下组织的生物力学：皮下脂肪团病理生理学的意义)”Plast.Reconstr.Surg.2019；143(4)：1077-1086)。因此，皮下脂肪团治疗的目的是加强皮下界面和/或通过各种类型的皮下注射释放纤维隔膜(Rudolph等人，同上)。通过解剖和图像分析研究，纤维间隔被认为是引起皮下脂肪团的主要原因，也是治疗皮下脂肪团的靶点(Hexsel et al，“Side-by-side comparison of areas with and withoutcellulite depressions using magnetic resonance imaging，”Dermatol Surg.2009；35(10)：1471-1477；Hexsel et al.“Magnetic Resonance Imaging of CelluliteDepressed Lesions Successfully Treated by Subcision，”Dermatol Surg.2016；42(5)：693-696；Mirrashed F，Sharp JC，Krause V，Morgan J，Tomanek B.“Pilot study ofdermal subcutaneous fat structures by MRI in indiViduals who differ ingender，BMI，and cellulite grading，”Skin Res Technol.2004；10(3)：161-168；Nürnberger and Müller，“So-called cellulite：an invented disease，”J Dermatol SurgOncol.1978；4(3)：221-229；Piérard et al，“Cellulite：from standing fat herniationto hypodermal stretch marks，”Am J Dermatopath.2000；22(1)：34-37；Querleux etal，“Anatomy and physiology of subcutaneous adipose tissue by in vivo magneticresonance imaging and spectroscopy：relationships with sex and presence ofcellulite，”Skin Res Technol.2002；8(2)：118-124)。为了有效地治疗皮下脂肪团，需要一种治疗方法来溶解或破坏真皮隔膜，所述真皮隔膜是由胶原蛋白组成的(图1)，并导致皮肤凹陷，困扰许多妇女。

有一些疗法已被用于治疗皮下脂肪团；但是，没有被批准的药物治疗。尽管有多种治疗方式，但几乎没有科学证据表明目前的任何非药物治疗都是有益的。事实上，许多证据都是传闻、主观的，或者仅仅基于患者的自我评估。EFP的一些历史治疗包括减肥、外用药物、按摩、吸脂、介体疗法、射频、分切、动力分切和激光疗法。这些治疗方法中的许多都有不良副作用(Avram MM，“Cellulite：a review of its physiology and treatment，”JCosmet Laser Ther.2004；6(4)：181-185；Collis et al，“Cellulite treatment：a mythor reality：a prospective randomized，controlled trial of two therapies，endermologie and aminophylline cream，”Plast Reconstr Surg.1999；104(4)：1110-1114；Khan MH，Victor F，Rao B，Sadick NS.“Treatment of cellulite：PartI.Pathophysiology.”J Am Acad Dermatol.2010；62(3)：361-370；Hexsel DM，Mazzuco R.“Subcision：a treatment for cellulite.”Int J Dermatol.2000；39(7)：539-544；Boyceet al，“Clinical evaluation of a device for the treatment of cellulite：Triactive.”Am J Cosmet Surg.2005；22：233-237；DiBernardo BE.“Treatment ofcellulite using a 1440-nm pulsed laser with one-year follow-up.”Aesthet SurgJ.2011；31(3)：328-341)。因此，许多医生认为，改善审美条件是不容易的。因此，仍然需要安全有效的非手术疗法来改善患有皮下脂肪团的妇女的美容效果。

发明内容

这里公开的内容满足上述需要，并涉及通过皮下注射治疗有效量的胶原酶(如具体实施方式中所定义)来治疗人类患者的皮下脂肪团的方法。这些方法涉及使用各种量表和评估技术对患者的皮下脂肪团严重程度进行治疗前评估，以建立患者的皮下脂肪团严重程度基线。然后皮下注射胶原酶治疗皮下脂肪团。胶原酶的剂量和给药方式可以变化，并且所述胶原酶可以以药物组合物的形式存在，所述药物组合物包括胶原酶和一种或一种以上医药上可接受的赋形剂。此类赋形剂可包括无菌注射用水、pH调节剂和稳定剂。进行治疗后评估，以确认与基线相比的治疗效果。这里公开的治疗方法可显著减少皮下脂肪团的出现。

如具体实施方案所述，共有四个治疗阶段，尽管它们是选择性的并且并不需要严格限制实施顺序。

1.在第一阶段，临床医生选择皮下脂肪团凹坑进行治疗。接下来，在注射之前，进行评估，例如，临床医生和/或患者使用以下一个或多个量表或其他评估方法(如具体实施方式中所定义)独立地评估皮下脂肪团的治疗前严重程度：

οHexsel皮下脂肪团严重程度分级表(Hexsel CSS)

οHexsel凹陷深度评分表

ο里克特量表

ο凹坑分析

ο临床医生报告的相片数字皮下脂肪团严重程度量表(CR-PCSS)

ο患者报告的相片数字皮下脂肪团严重程度量表(PR-PCSS)

ο研究者全球审美改善量表(I-GAIS)

ο受试者全球审美改善量表(S-GAIS)

ο患者报告的皮下脂肪团影响量表(PR-CIS)

οPR-CIS简化版

ο患者自评表(SSRS)

ο受试者对皮下脂肪团治疗的满意度调查表(SSCT)

ο临床医生对皮下脂肪团严重程度的评估(摄影或其他图像)

οBody-Q

ο菲茨帕特里克量表

ο大腿皮下脂肪团疗效量表(PR-TCES；CR-TCES)

ο任何有效的图像数字或者其他临床使用和/患者用于评价皮下脂肪团严重程度、改善和/或病人满意度的量表(例如，Hexsel-Merz量表(2019年美国皮肤病学会会议海报发布)。

此外，临床医生和患者的治疗前评估可以通过分析一系列3到15张照片、插图、图纸、计算机图像、3-D模型、MRI图像、热像图、超声波图、患者口头反馈等来执行，每一张照片、插图、图纸、计算机图像、3-D模型、MRI图像、热像图、超声波图、患者口头反馈等具有不同的皮下脂肪团严重程度等级或水平。

2.在治疗的第二阶段，临床医生用圆点或其他标记标出待治疗的凹坑(图6)。如果存在最低点，则通常将其放置在凹坑的最低点。可拍摄更多的照片并进行其他评估。

3.在治疗的第三阶段中，在一个或多个治疗区域(如具体实施方式部分的定义)以单剂量或多剂量将治疗有效量的胶原酶皮下注射到凹坑中。剂量和注射技术各不相同。例如，该方法可包括根据以下程序(如图10(治疗IV)所示)的深部和浅部注射：

·当针头与注射部位的皮肤表面成约30°角并朝向受试者头部时，将针头一直推入(1英寸)，并通过轻轻推动注射器柱塞注射0.3毫升胶原酶成分。

·在保持针头与皮肤表面成30°角的同时，轻轻抽出约一半长度的针头(1/2英寸)，并将针头朝受试者一侧重新定位(位置B)。通过轻轻推动注射器柱塞注射约0.3mL胶原酶组合物。

·将针头与皮肤表面保持30°的角度，将针头重新定位到位置A和B之间的中间位置(位置C，朝向受试者的肩膀)，通过轻轻推动注射器柱塞注射约0.3mL胶原酶成分。

·针头与皮肤表面保持30°角，针头与位置B(位置D)完全相反，轻轻推动注射器柱塞注射约0.3mL胶原酶成分。

·将针头与皮肤表面保持30°角，将针头重新定位到位置A和D之间的中间位置(位置E，朝向受试者的另一个肩膀)，通过轻轻推动注射器柱塞注射约0.3mL胶原酶组合物。

·带有1.5毫升胶原酶组合物的3毫升注射器足以用于一个注射部位。

·在每个治疗区域(每个臀部或每个大腿)使用十二(12)支3毫升注射器，在12个注射部位注射12针1.5毫升(总共18.0毫升，5份0.3毫升)。

·每次就诊时，共在2个治疗区域(2个臀部或2个大腿)注射24次。

在另一实施例中，可将针以三个角度注射到凹坑中：与皮肤表面成约90度角，与皮肤表面和凹坑长轴成约45度角，与皮肤表面和凹坑长轴成约135度角。在一个非限制性实施例中，使用带有0.1mL梯度的1mL注射器和30量规1/2英寸针头，将上述三次注射作为三个0.1mL小份直接输送至凹坑中。具体实施方式部分中说明了其它技术。

4.在治疗的第四阶段，使用上述量表和其他评估方法(例如，瘀伤分析)进行注射后评估。特定胶原酶治疗的疗效可基于单个临床医生评级或患者评级，或基于由临床医生评级和患者评级组成的复合终点，其中在同一受试者的两个量表中显示改善，即，临床医生和患者量表都显示了预先规定的改善水平。

胶原酶以约0.01mg至约20mg的量被注射，可以单剂量注射可以被分成几个分剂量注射，并具有以下一个或多个特征：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为大约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，大约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，大约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量为大约60kDa至大约130kDa，或者大约70至大约130kDa，或大约80至大约120kDa，或大约90至大约120kDa，或大约100至大约110kDa。

·通过反相HPLC(高压液相色谱法)测定的纯度(按面积计)至少为80％

·效价(即比活性)约为500至约30,000SRC单位/mg

·效价约为5,000至约30,000f-SRC单位/mg

·效价约为100,000至约400,000GPA单位/mg

·效价约为175,000至约500,00f-GPA单位/mg

·效价约为5,000至约25,000ABC单位/mg

·小于或等于1％(按面积计)的杂质，该杂质选自梭菌蛋白酶、明胶酶和亮肽

·小于或等于1cfu/mL的生物负荷

如本文所用，可使用如本文所述的反应杯测定或微孔板测定(例如，SRC反应杯测定、SRC微孔板测定、GPA反应杯测定和GPA微孔板测定)来测量相关动力学参数。

在一些实施方案中，组合物中存在的胶原酶包含按约1∶1比例存在的胶原酶I和胶原酶II。也可以采用其他比例的胶原酶I和胶原酶II，例如0.1-2∶1，或0.25-2∶1，或0.5-2∶1，或0.75-2∶1，或1∶0.1-2，或1∶0.25-2，或1∶0.5-2，或1∶0.75-2，或1∶0，或0∶1。胶原酶I和胶原酶II中的每一种可具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的面积纯度，如通过反相HPLC测量的。

在另一实施方案中，胶原酶组合物包含CCH(如具体实施方式中所定义的)，CCH中含有的AUX I和AUX II的比率约为1∶1。也可以采用其他比率的AUX I和AUX II，例如0.1-2∶1、或0.25-2∶1、或0.5-2∶1、或0.75-2∶1、或1∶0.1-2、或1∶0.25-2、或1∶0.5-2、或1∶0.75-2、或1∶0、或0∶1。AUX I和AUX II中的每一个可具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的面积纯度，如通过反相HPLC测量的。

在其它实施例中，胶原酶组合物可为液体或由冻干固体形式与稀释剂重组。混合物的剂量通过胶原酶的存在量来测量，而不考虑稀释剂，并且在一次或多次注射中可包含约0.1mg到约20mg的胶原酶。在另一实施方案中，在一次或多次注射中施用的剂量为约0.06mg、0.48mg、0.84mg、1.68mg、2.52mg、3.36mg、4.2mg、5.04mg、5.88mg、6.72mg、7.56mg或8.4mg。例如，在大约12次分次注射中施用约0.06mg、0.48mg、0.84mg或1.68mg。注射的胶原酶组合物的体积可在每次注射0.01mL到3mL之间，或每次治疗随诊的总量约为0.2mL到150mL(如具体实施方式中所定义的)。在特定实施方案中，上述剂量是针对包含CCH的胶原酶组合物。在另一实施方案中，上述剂量用于具有以下一个或多个特征的胶原酶组合物：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，

约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量为大约60kDa至大约130kDa，或者大约70至大约130kDa，或大约80至大约120kDa，或大约90至大约120kDa，或大约100至大约110kDa。

·通过反相HPLC(高压液相色谱法)测定的纯度(按面积计)至少为80％

·效价(即比活性)约为500至约30,000SRC单位/mg

·效价约为5,000至约30,000f-SRC单位/mg

·效价约为100,000至约400,000GPA单位/mg

·效价约为175,000至约500,00f-GPA单位/mg

·效价约为5,000至约25,000ABC单位/mg

·小于或等于1％(按面积计)的杂质，该杂质选自梭菌蛋白酶、明胶酶和亮肽

·小于或等于1cfu/mL的生物负荷

在另一实施方案中，在每个治疗区域约12次等分注射中注射约0.84mg的CCH(约0.07mg x 12次注射＝约0.84mg)。在某些情况下，这种0.84毫克的治疗发生在一次治疗访视中，或每10-40天进行2次、3次、4次或5次治疗访视。在其他情况下，多个治疗区域每10-40天注射0.84毫克，进行2次、3次、4次或5次治疗访视。此类注射可在5次以上的治疗访问中进行。

此外，如具体实施方式部分所述，胶原酶注射对治疗皮下脂肪团是有效的。例如，通过Hexsel凹陷深度评分、里克特量表评分和凹坑分析，可以证明皮下脂肪团外观的显著改善。

从随后的描述、附图、实施例和权利要求书中，本发明组合物、规模、方法等的其他实施方案变得显而易见。从前面和下面的描述中可以理解，这里描述的每个特征以及两个或更多这样的特征的每个组合都包括在本发明的范围内，前提是包括在这样的组合中的特征不是相互不一致的。此外，可以从任何实施例或方面具体排除任何特征或特征的组合。以下描述和权利要求中阐述了其他方面和实施方案，特别是当结合所附示例和附图考虑时。

附图简要说明

专利或申请文件至少包含一幅彩色图纸。经要求并支付必要费用后，专利局将提供本专利或专利申请出版物的彩色图纸副本。

通过参考以下详细描述并与所附附图相结合，各个实施方案的上述特征将更容易理解，其中：

图1是描述胶原隔膜的皮肤和真皮下组织的横截面图。

图2是AUX-I(Seq.ID No.5)的氨基酸序列列表。

图3是AUX-II(Seq.No.ID 6)的氨基酸序列列表。

图4显示了Hexsel皮下脂肪团严重程度量表(CSS)(B)凹陷深度。

图5显示了PR-和CR-大腿皮下脂肪团疗效量表。

图6举例说明了受试者臀部上的凹坑和注射部位标记。

图7描述了治疗I(阴影部分注射，3等分)中使用的注射技术。

图8描述了治疗II(阴影部分注射，1等分)中使用的注射技术。

图9描述了治疗III(深度注射，1等分)中使用的注射技术。

图10描述了治疗IV(深度和阴影部分注射，5等分)中使用的注射技术。

图11描述了治疗V(阴影部分注射，4等分)中使用的注射技术。

图12描述了可有效向皮下脂肪团凹坑中施用胶原酶或者安慰剂的注射技术。

图13是3D网格注册(标记前1天)。

图14是一种彩色距离图，用于图像配准。

图15是目标区域的主要凹坑。

图16是目标区域可变形的主要凹坑。

图17描述了受试者左臀部注射后第4天、第8天和第15天的正常组织和瘀伤组织的轮廓。

图18(A)描述了左臀部注射后第4天、第8天和第15天正常组织和瘀伤组织的轮廓，并提供了这些组织的L*、a*和b*颜色测量值。

图18(B)描绘了左臀部注射后第4天、第8天和第15天正常组织和瘀伤组织的轮廓。根据L*a*b*颜色值计算正常组织和瘀伤组织的平均颜色和ΔEs。

图19(A)-19(C)描述了凹坑分析。图19(A)说明了观察到的和从第1天开始在凹坑分析参数中标记前图像的变化。图19(B)说明了凹坑的最大长度和最大宽度。图19(C)说明了凹坑底部和内插表面之间的表面积和体积。

图20描述了CCH治疗大腿水肿性纤维硬化性泛神经病变的2b期随机、双盲、安慰剂对照研究的研究流程图。

具体实施方式

这里将全面描述各个方面和实施方案。然而，这些方面和实施方面可以以许多不同的形式体现，并且不应被解释为对本发明的限制；相反，这里提供的实施方案使得本公开将是彻底和完整的，并且将向本领域技术人员充分传达本主题的范围。本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文还是下文，均以引用方式全部并入本文。

A.定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有术语和短语具有该术语和短语在本领域中获得的含义，除非从术语或短语使用的上下文中清楚地表明或清楚地看到相反的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述了特定的方法和材料。

除非另有说明，使用个别数值是指使用该数值的近似值，如同在该数值前面有“大约”或“近似”一词。同样，除非另有明确说明，否则本申请中规定的各种范围内的数值被称为近似值，如同所述范围内的最小值和最大值前面都有“大约”或“近似”一词。这样，所述范围以上和以下的变化可用于获得与所述范围内的值基本相同的结果。如本文所使用的，当提及数值时的术语“大约”和“近似”对于与所公开的主题最密切相关的本领域的普通技术人员或与所讨论的范围或元素相关的本领域的普通技术人员应具有其简单和普通的含义。严格数值边界的加宽量取决于许多因素。例如，可以考虑的一些因素包括元素的临界性和/或给定量的变化将对所要求保护的主题的性能产生的影响，以及本领域技术人员已知的其他考虑。如本文所使用的，对不同数值使用不同数量的有效数字并不意味着限制使用词语“大约”或“近似”将如何用于拓宽特定数值或范围。因此，一般来说，“大约”或“近似”拓宽了数值。此外，该范围的公开旨在作为一个连续的范围，包括最小值和最大值之间的每一个值加上使用术语“大约”或“大约”所提供的范围的扩大，本文中对值的范围的叙述仅旨在用作单独引用该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值被并入说明书中，如同其在本文中被单独叙述一样。

如这里所使用的，“受影响区域”或“治疗区域”，是指将要治疗或已经用胶原酶(定义见下文)治疗的人类患者的皮下脂肪团区域。这可能包括一个象限(即左臀、右臀、左后外侧大腿、右后外侧大腿)。受影响区域或治疗区域不限于臀部或大腿。相反，身体上任何有皮下脂肪团的部位都可以作为治疗部位。

“副作用”或“AE”是指身体结构(体征)、身体功能(症状)、实验室结果(如化学、心电图、X光等)的任何不利或非预期变化，或与研究药物的使用暂时相关的先前存在的病情恶化，无论是否被认为与研究药物有关。

“Body-Q”是根据斯隆凯特林纪念癌症中心的许可证在商业上可买到的患者报告结果仪器。它基于患者对身体轮廓和/或体重减轻的感知。它通过18个独立功能的量表测量3个领域：外观、健康相关生活质量(HRQL)和患者的医疗体验。患者报告的结果工具如下文所述：BODY-Q：使用手册BODY-Q：使用手册，第1.0版，2015年7月，斯隆凯特林纪念癌症中心，McMaster大学和Stefan Cano.BODY-Q包括测量皮下脂肪团的量表。参见https：// www.mskcc.org/sites/default/files/node/174457/documents/body-q-users- guide.pdf(2019年7月3日).对于皮下脂肪团，有16个量表项目，在过去一周的时间范围内，从“完全不”到“极度困扰”不等的回答选项，并假设Flesch-Kincaid等级的阅读水平。患者被问到：“考虑到你的皮下脂肪团，在过去的一周里，你有多少烦恼：”[16个问题之后，患者将回答分为1-极度烦恼；2-中度烦恼；3-有点烦恼；4-根本不烦恼]。分数从16分(极度困扰)到64分(完全没有)。

传统上，瘀伤的临床检查包括对瘀伤和周围区域的目视检查，以及对受试者的医疗、手术和伴随用药史的评估。这种解释的结果是主观的，受几个不相关因素的影响，包括观察几何、环境光照、未暴露周围皮肤的颜色以及观察者的经验和视力。本文所用的“瘀伤分析”是指使用美国专利公开号2019/0035080中公开的客观图像捕获和跟踪方法检测从受试者经过胶原酶治疗区域的图像中评估的皮肤颜色的可见变化，该方法统一应用于所有受试者图像。这种客观分析通过提供量化、区别化的方式评估受试者内部(同一受试者在不同时间点内)和受试者之间(不同受试者之间)的瘀伤程度，可以帮助甚至取代医疗保健提供者对瘀伤的目检和临床检查。这一分析利用了国际照明委员会(CIE)定义的L*a*b*颜色空间，该空间遵循颜色对立理论，即两种颜色不能同时是红色和绿色，也不能同时是黄色和蓝色。如下所示，L*显示明/暗，a*是红/绿坐标，且b*是黄/蓝坐标。DeltaL*(ΔL*)，Delta a*(Δa*)和Delta b*(Δb*)可以是正偏差(+)或者负偏差(-).但是总偏差Delta E(ΔE*)总是正的。

·ΔL*(L*样品-L*标准)＝明暗偏差(+＝lighter，-＝darker)；较低的数值(0-50)表示暗并且较高的数值(51-100)表示明。

·Δa*(a*样品-a*标准)＝红绿偏差(+＝更红，-＝更绿)

·Δb*(b*样品-b*标准)＝黄蓝偏差(+＝更黄，-＝更蓝)

需要使用所有这三个值来完整地描述物体的颜色(在这种情况下是在受试者的治疗区域图像中捕捉到的瘀伤)。胶原酶治疗区域(治疗前和治疗后指定时间点的图像)图像分析的客观方法，其数据输出为L*a*b*值，允许快速、简单、准确、可重复和无偏地量化肤色及其任何变化。这种方法排除了固有的变异性与传统的主观视觉估计的图像。ΔE按如下方式计算：

ΔE(瘀伤与正常皮肤之间的色差)＝SQRT[(L^* _B-L^* _N)²+(A^* _B-A^* _N)²+(B^* _B-B^* _N)²]，其中

L^* _B＝瘀伤组织L^*

L^* _N＝正常组织L^*

A^* _B＝瘀伤组织A^*

A^* _N＝正常组织A^*

B^* _B＝瘀伤组织B^*

B^* _N＝正常组织B^*

图18(B)显示了治疗区域的瘀伤分析。

“CCH”指AUX-I(Seq.ID No.5(图2))和AUX-II(Seq.ID No.6(图3))胶原酶混合物，比例约为1∶1，由溶组织梭状芽胞杆菌(又称Hathewava溶组织梭状芽胞杆菌)发酵获得。CCH在市场上作为冻干粉末出售，商标为

它包括AUX-I和AUX-II混合物以及特定的赋形剂，尽管CCH可以与其他合适的赋形剂一起使用。

“临床医生报告的相片数字皮下脂肪团严重程度量表(CR-PCSS)”是PCT专利申请PCT/US2018/020551(2018年9月7日公开的WO2018/160905)中描述的相片数字量表，由医生/临床医生使用，旨在将皮下脂肪团的严重程度评估为5个级别。

除非本文另有规定，“胶原酶”是指以下任何一种：(a)具有EC3.4.24.3规定的活性的胶原酶(包括突变体)(https：//www.brenda-enzymes.org/enzyme.php？ecno＝3.4.24.3(2019年7月3日获得)；(b)溶组织梭菌发酵产生的胶原酶(也称为Hathewayahistolytica)；(c)CCH(如上定义)；(d)BLAST测定的与AUX-I至少50％序列对齐的胶原酶；(e)BLAST测定的与AUX-II至少50％序列对齐的胶原酶；(f)其他来源生物(即非溶组织梭菌)发酵产生的胶原酶，例如哺乳动物、甲壳类动物、真菌、细菌或微生物胶原酶；(g)通过重组技术获得的胶原酶；(h)分子量在约65kDa到约130kDa之间的胶原酶；(i)指定为I类或II类的胶原酶(也称为胶原酶I(或1)、胶原酶II(或2)、I型胶原酶、2型胶原酶)；(j)胶原酶I和II的混合物；(k)来自菌株JCM 1403(ATCC 19401)的胶原酶或其衍生物；(1)来自ATCC21000菌株的胶原酶或其衍生物；(m)来自菌株ATCC 69334的胶原酶或其衍生物；(n)来源于产气荚膜梭菌的胶原酶；(o)来自溶藻弧菌的胶原酶；(p)来自链霉菌的胶原酶；(q)来自假单胞菌的胶原酶；(r)来自无色杆菌的胶原酶，(s)沃辛顿生化公司(www.Worthington-biochem.com；“产品亮点”)描述的胶原酶)；(t)西格玛·奥尔德里奇公司的胶原酶(www.sigma-aldrich.com)(u)具有下列一个或多个特征的胶原酶：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

(v)Nordmark Arzneimittel GmbH&Co.KG.描述的胶原酶；(w)来自菌株004的胶原酶；或(x)上述任何一种的等效物或混合物。美国专利7811560、9757435、9744138和WO2012/125948中描述了可在本文公开中使用的胶原酶的非限制性实施例。

“凹坑分析”是指对一个或多个选定凹坑的分析，其中测量了凹坑的体积、长度、宽度和表面积等参数。可通过各种已知方法进行测量，例如Eckhouse et al.WO 2018/116304和WO 2018/116305中描述的方法，以及通过Cherry成像进行测量(www.cherrymaging.com)和坎菲尔德科学公司。还可以参见Salameh et al.，“Novel Stereoscopic OpticalSystem for Objectively Measuring Above-Surface Scar Volume-First-TimeQuantification of Responses to Various Treatment Modalities.”Dermatol.Surg.00：1-7(2017)；和美国专利第9,996,923号。体积、长度、宽度和表面积的这种测量可以使用数字3-D灰度图像(具有X和Y轴旋转特征)和数字3-D纹理和光照图像(具有X和Y旋转特征)以及分析这种图像的计算机程序来计算。例如，对于臀部治疗区域，可以在治疗前后为每个患者拍摄左治疗臀部和/或右治疗臀部的图像。对于大腿治疗区域，可以在治疗前后以0度、45度和90度拍摄每一个大腿治疗区域的图像。对于大腿治疗区域，可以在治疗前后在0度、45度和90度处使用Canfield Scientific方法对每个大腿治疗区域拍摄图像。

“持久性”指治疗效果持续的时间段。这段时间可以是3个月到20年，或者大约1到19年，或者大约2到18年，或者大约3到17年，或者大约4到16年，或者大约5到15年，或者大约6到14年，或者大约7到13年，或者大约8到12年，或者大约9到11年。该时间段可以是6个月左右、大约1年左右、大约2年左右、大约3年左右、大约4年左右、大约5年左右、大约10年左右、大约15年左右、大约20年左右。

“Fitzpatrick量表”指用于评估受试者皮肤类型的量表，如表1所示。

表1.Fitzpatrick量表

I	浅白色皮肤，蓝色/淡褐色眼	常常是晒伤，不会晒黑
			II	皮肤白皙，蓝眼睛	容易晒伤，不易晒黑
III	黄种人肤色	晒伤之后肤色变深
			IV	浅棕肤色	很少、轻度晒伤，容易晒
V	古铜肤色	极少晒伤，非常容易晒黑
			VI	深棕色或者黑色肤色	从不晒伤，只是晒黑

“Hexsel皮下脂肪团严重程度量表”或“Hexsel CSS”或“皮下脂肪团严重程度量表(CSS)”是指如下所示评估皮下脂肪团5个主要形态特征的相片数字量表(表2)：

表2.Hexsel皮下脂肪团严重程度量表

得分之和导致如下分类

得分	皮下脂肪团分类
		1-5	轻度
6-10	中度
		11-15	重度

Hexsel et al.，J.Eur.Acad.，Dermatol.Venereol.2009；23(5)：523-528.a.Nürnberger and Müller.J.Dermatol.Surg.Oncol.1978；4(3)：221-229。受试者以站立姿势进行评估，臀肌放松。然而，如果受试者没有明显的凹陷症状，则要求他们收缩臀肌或进行挤压试验(通过捏拇指和食指之间的皮肤)，以区分0分或1分/等级。

这里使用“Hexsel凹陷深度评分”指的是仅评估(B)Hexsel CSS的凹陷深度(图4)：

0＝无凹陷

1＝浅凹陷

2＝中等深度的凹陷

3＝深凹陷

本文中所使用的“图像”或者“图片”表示相片、图解、图示、模型、3D模型、计算机生成的图像、MRI图像等。

“里克特量表评分”是指在每次治疗后访视时，由独立的盲评员通过比较第1天治疗前(基线)的皮下脂肪团照片(二维颜色，3-D颜色和3-D灰度)以及治疗后访视的照片。采用以下5级里克特量表记录分数

“可选的”或“任选的”是指随后描述的元素、成分或条件可能发生或不发生，因此该描述包括所述元素、成分或条件发生的情况和不发生的情况

这里使用的“患者报告的皮下脂肪团影响量表(PR-CIS)”是指使用6个问题的调查对皮下脂肪团的视觉和情感影响(快乐、烦恼、自我意识、尴尬、看起来衰老或看起来超重或身体变形)进行评估，每个问题的评量表的数值范围为0(完全没有)到10(极端明显)。更具体的，PR-CIS是一种6-项静态问卷，评价皮下脂肪团的视觉和情感影响(快乐、烦恼、自我意识、尴尬、看起来衰老或看起来超重或身体变形)；当观察其臀部和/或大腿数码照片时，受试者用11级数字评分量表回答每个问题，评分范围从0(一点也不)到10(极端)。这种评估可能是所有大腿和/或臀部在一起，而不是每个单独的区域。PR-CIS总分可由6个单独问题得出：

问题1-想想你选择的治疗部位，你对皮下脂肪团的外观有多满意？

问题2-想想你选择的治疗部位，你对皮下脂肪团的外观有多困扰？

问题3-想想你选择的治疗部位，你对皮下脂肪团的出现有多在意？

问题4-想想你选择的治疗部位，你对皮下脂肪团的出现有多尴尬？

问题5-想想你选择的治疗部位，由于皮下脂肪团的出现，你看起来老了多少？

问题6-想想你选择的治疗部位，由于皮下脂肪团你看起来有多胖或者身材有多走形？

这里使用的“患者报告的皮下脂肪团影响量表(减缩版)(PR-CIS减缩版)”是指使用5个问题的调查对皮下脂肪团的视觉和情感影响(快乐、烦恼、自我意识、尴尬、看起来衰老或看起来超重或身体变形)进行评估，每个问题的评量表的数值范围为0(完全没有)到10(极端明显)。更具体的，PR-CIS是一种5-项静态问卷，评价皮下脂肪团的视觉和情感影响(快乐、烦恼、自我意识、尴尬、看起来衰老或看起来超重或身体变形)；当观察其臀部和/或大腿数码照片时，受试者用11级数字评分量表回答每个问题，评分范围从0(一点也不)到10(极端)。这种评估可能是所有大腿和/或臀部在一起，而不是每个单独的区域。在一个非限制性实施例中，PR-CIS减缩版的总分可由6个单独问题得出：

问题1-想想你选择的治疗部位，你对皮下脂肪团的外观有多满意？

问题2-想想你选择的治疗部位，你对皮下脂肪团的外观有多困扰？

问题3-想想你选择的治疗部位，你对皮下脂肪团的出现有多在意？

问题4-想想你选择的治疗部位，你对皮下脂肪团的出现有多尴尬？

问题5-想想你选择的治疗部位，由于皮下脂肪团你看起来有多胖或者身材有多走形？

PR-CIS减缩版的总分可以从完整版PR-CIS的其他五个问题中得到。

如本文中所使用的“患者报告的相片数字皮下脂肪团严重程度量表(PR-PCSS)”是患者的相片数字量表，如PCT国际申请PCT/US2018/020551(2018年9月7日以WO2018/160905公开号公开)，其被设计用于将皮下脂肪团的严重程度量化为5个级别。

如本文中所使用的“相片数字”是指使用一系列相片、图解、图示、模型、3D模型、计算机生成的图像、MRI图像、图像等，各自在量表中指定了不同级别的皮下脂肪团严重程度。

这里使用的“连续访视”指两次或两次以上的临床医生访视或通过量表评估皮下脂肪团变化的次数。各个探视之间的间隔时间可以是两周左右、一个月左右、两个月左右、三个月左右、四个月左右、五个月左右、六个月左右、一年左右、两年左右、三年左右，或者五年以上。

这里使用的“严重副作用”是指导致死亡、立即危及生命、导致或延长住院患者住院时间、导致永久性或实质性残疾、先天性异常/出生缺陷或被视为重要医疗事件的副作用。

术语“受试者”或者“患者”在这里可互换使用，指的是人类或其他哺乳动物。

这里使用的“受试者整体美感改善量表(S-GAIS)”和“研究者整体美感改善量表(I-GAIS)”是指以下评估皮下脂肪团严重程度和/或改善的量表。向受试者提出以下介绍性问题：“您如何评价治疗后皮下脂肪团的外观？“评分范围从-3(非常差)到+3(非常好)，这取决于受试者的反应，如表3所示。

表3.受试者整体审美改善量表(S-GAIS)和研究者整体审美改善量表(I-GAIS)

这里使用的“受试者对皮下脂肪团治疗的满意度”(SSCT)指的是-2到+2的受试者满意度等级。例如，下表4提供了臀部皮下脂肪团治疗的评估。患者被问到：“今天，你对你接受的臀部特定部位的皮下脂肪团治疗结果满意吗？“然后他们选择一个答案/评分，如表4所示。

表4.受试者对皮下脂肪团治疗的满意度评估-臀部

表5提供了大腿皮下脂肪团治疗的评估。患者会被问到：“今天，你对大腿特定部位的皮下脂肪团治疗结果满意吗？“然后他们选择一个答案/评分，如表5所示。

表5.受试者对皮下脂肪团治疗的满意度评估-大腿

“受试者自评量表(SSRS)”是受试者使用的量表，该量表用于评估他/她与皮下脂肪团相关的外观满意度，表示为7个等级的量表，从0(极度不满意)到6(极度满意)，如图6所示。

表6.受试者自评量表(SSRS)

评分	反应选项
		6	非常满意
5	满意
		4	较为满意
3	既不满意也不失望
		2	较为失望
1	失望
		0	极度失望

本文使用的术语“治疗有效量”是指降低患者或具有统计意义的患者群体中皮下脂肪团严重程度所需的胶原酶量。所使用的胶原酶组合物的量将是递送达到期望结果所需的胶原酶量所必需的量。实际上，这取决于注射的胶原酶、注射技术和治疗区域的酶活性。

本文中使用的术语“治疗紧急副作用”或“TEAE”是指在使用研究药物治疗前不存在，但在治疗后出现，或者在治疗开始时出现，但在治疗期间恶化，或在治疗开始时出现，但在患者接受治疗时消失，然后再次出现(无论治疗开始时AE的强度如何)的任何情况

本文中使用的术语“大腿皮下脂肪团疗效量表”或“TCES”是指由临床医生和患者用于评估大腿皮下脂肪团严重程度、改善和/或患者满意度并协助评估胶原酶疗效的图5所示的相片数字量表(或基本类似的量表)。患者报告的版本称为PR-TCES；临床医生报告的版本称为CR-TCES。

本文中使用的术语“治疗访视”或“治疗”是指对受影响区域进行一次或多次注射或治疗，使用治疗有效量的至少一种活性制剂在一次门诊访视中治疗脂肪团。

本文中使用的术语“有效的”、“有效性”或“有效”是指一个过程，通过此过程证明特定量表是准确可靠的，该过程包括视觉评估的可重复性，以确保能够一致地获得相同的结果。验证进一步检查量表的精密度、准确度和灵敏度，以确认其测量值可靠、可重复和稳健。

B.引入

本发明涉及治疗皮下脂肪团的方法，包括通过使用下文所述的某些注射技术向具有皮下脂肪团外观的受试者施用治疗有效量的一种或多种胶原酶。

一般来说，治疗分为四个阶段：(1)临床医生和患者进行治疗前评估，以确定治疗前基线，临床医生选择要治疗的凹坑；(2)如果存在最低点，临床医生在最低点标记要治疗的凹坑；(3)临床医生用胶原酶治疗患者；和(4)临床医生和患者进行治疗后评估。下面对这些阶段进行详细描述。各个阶段和其中的步骤是可选的，并且各个步骤不需要限制实施顺序，因为顺序可能会有所不同，但会获得可比较的结果。

C.阶段1-治疗前评估

在这里描述的治疗皮下脂肪团的第一阶段，临床医生根据以下标准选择需要治疗的皮下脂肪团凹坑：

·如照片所示，当患者以放松姿势站立(臀部肌肉放松的站立姿势)时，凹坑应清晰可见并自然清楚

·选择的凹坑应是临床医生认为最有可能改善整个臀部、大腿或其他受影响区域美观的凹坑

·当患者以放松姿势站立时，在治疗前拍摄受影响区域的照片

·注射前，进行评估，即临床医生和/或患者独立评估照片，并使用以下一个或多个量表或评估方法对结果进行评分：

οHexsel皮下脂肪团严重程度分级表(Hexsel CSS)

οHexsel凹陷深度评分表

ο里克特量表

ο凹坑分析

ο临床医生报告的相片数字皮下脂肪团严重程度量表(CR-PCSS)

ο患者报告的相片数字皮下脂肪团严重程度量表(PR-PCSS)

ο研究者全球审美改善量表(I-GAIS)

ο主体全球审美改善量表(S-GAIS)

ο患者报告的皮下脂肪团影响量表(PR-CIS)

ο患者自评表(SSRS)

ο受试者对皮下脂肪团治疗的满意度调查表(SSCT)

ο大腿皮下脂肪团疗效量表(PR-TCES；CR-TCES)

οBody-Q

ο菲茨帕特里克量表

ο任何有效的图像数字或者其他临床使用和/患者用于评价皮下脂肪团严重程度、改善和/或病人满意度的量表。

D.阶段2-标记需要治疗的凹坑

在这里描述的治疗的第二阶段，临床医生用点标出待治疗的凹坑。可以拍摄更多的照片。

E.阶段3-胶原酶注射

在治疗的第三阶段，临床医生用胶原酶治疗患者。

1.胶原酶类型

本发明中有用的胶原酶包括上文定义的任何胶原酶。作为进一步的背景，基质金属蛋白酶(MMPs)可由属于本文定义范围内的胶原酶组成。例如，MMP-1包含胶原酶1；MMP-8包含胶原酶2/中性粒细胞胶原酶；MMP-13包含胶原酶3；并且MMP-18包含胶原酶4。此外，组织蛋白酶可归类为胶原酶。

2.胶原酶的酶动力学

本发明中有用的胶原酶也可通过其酶动力学来表征。这里，有效治疗皮下脂肪团的一种或多种胶原酶的近似动力学值包括：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

V_max＝最大速度

K_M＝[底物]50％的V_max

K_cat＝每秒分裂的底物分子

1/K_cat＝裂解底物分子所需要的微秒。

这些值可使用下文所述的微孔板分析进行实验测定，但使用不同的底物和时间。还可以采用其他分析和参数。

这些值反映了基于Michaelis-Menten方程的酶行为的定量表达：

其中V₀是底物浓度[S]下的反应速率(速度)，V_max是可观察到的最大速率，K_M是米氏常数，与产生50％V_max的底物浓度相关。

其中k₁，k_-1和k₂是下列过程的速度常数：

其中E是酶，S是底物，ES是酶-底物复合物，并且P是产品。

催化K_cat指的是转化数，即，ES复合物转化成E+P的速度能有多快。它反映了每单位时间内每个活性中心所经历的催化循环次数。

在某些实施方案中，AUX-I和AUX-II具有以下特征：

·AUX I

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·AUX II

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

加和：

K_cat＝V_max/[AUX]＝(纳摩尔底物/nG AUX*min-1)/nG AUX

催化效率(Kcat/KM)通常表示酶将底物转化为产物的整体能力，并反映结合和催化事件。在另一实施方案中，AUX-I和AUX-II包括以下特征。

·V_max＝最大速度

·K_M＝[底物]50％的Vmax

·K_cat＝每秒分裂的底物分子

·1/K_cat＝从底物中裂解一个分子所需要的时间

·K_cat/K_M常被用来代表酶的催化活性

*通过SRC微板实验

+通过GPA微板实验

3.胶原酶效价(比活性)

已开发出多种测定方法，用于测定胶原酶的比活性(效价)。这种分析方法在a.到c.小节中描述，并通过胶原酶在给定时间段内以预先确定的酶浓度将底物转化为产物的能力来表征胶原酶。在某些非限制性实施方案中，这些分析用于确定AUX-I和AUX-II中的每一个以及结合的CCH药物产物(AUX-I和AUX-II的1∶1比率)的效价。SRC分析(如下所述)使用胶原作为反应底物。SRC分析使用可溶性大鼠(尾)胶原(SRC)作为底物，并用于测量I型胶原酶活性，II型胶原酶约占胶原酶混合物观察活性的20％。SRC分析是荧光法，利用荧光胺检测SRC I型消化产生的肽。反应在pH值为7.2的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液(含15mM二价钙离子)中于25℃下进行2.5h。

牛腱胶原(BTC)分析实验(如下所述)基于Mandl et al.，Arch.Biochem.Biophys.74：465-475(1958)所述的过程进行，并根据Keller and Mandl，Arch.Biochem.Biophys.101：81-88(1963)的描述进行修饰。还参见Rosen，Arch.Biochem.Biophys.67：10-15(1957)。BTC分析使用不溶性牛肌腱胶原作为底物，测量I型和II型活性(如AUX-I和II型胶原酶)。BTC分析方法采用比色法，并利用茚三酮检测BTC I型和II型降解产生的肽。该反应也在pH 7.2下进行，但在37℃下在含有10mM二价钙离子的三(羟甲基)氨基甲烷(tris)缓冲液中进行22h。

第三种胶原酶类型的分析，GPA实验(如下所述)，利用可溶性衍生六肽(羧基-GPGGPA)作为底物。GPA实验主要用于测量II型活性，I型约占观察活性的10％。II型胶原酶将六肽切割成两个三肽，其中一个(GPA)具有游离氨基末端，与荧光素胺反应提供荧光产物。GPA在pH 7.2下，在含有100mM二价钙离子的HEPES缓冲液中于25℃下运行10分钟。

SRC和BTC实验均降解天然底物(胶原蛋白)，这更接近胶原酶注射的治疗作用。GPA实验的优点是它们利用一个定义明确的小分子量六肽作为底物，并产生两个定义明确的三肽。GPA实验产生荧光信号，非常敏感。最后，GPA实验适合于Michaelis-Menten动力学分析，因为它使用单一底物和反应条件(10分钟培养)，其接近初始酶速度。SRC实验非常适合于具有胶原结合域的胶原降解酶，而GPA实验非常适合于不具有胶原结合域的胶原降解酶，通常称为明胶酶

a.GPA单元实验方法和比活性单元

i.GPA实验(比色皿)测定的胶原酶效价

GPA实验主要用于测量II类胶原酶的效力。实验的第一步涉及酶促反应，所述酶促反应包括通过胶原酶样品将底物羧基-甘氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-脯氨酰-L-丙氨酸(ZGPGPA)消化成两种肽：羧基-甘氨酰-L-脯氨酰-甘氨酸(zGPG)和甘氨酰-脯氨酰-L-丙氨酸(GPA)。第二步涉及随后用荧光衍生物荧光素胺测量释放的GPA。实验遵循以下方法，但是本领域的普通技术人员将理解，在实现实验目的的前提下可以进行某些修改(例如稀释浓度和时间)。

总的方法如下。制备亮氨酸标准品。获得胶原酶样品并制备溶液，用于胶原酶对zGPGGPA(以下简称“底物”)的酶裂解过程第一步。在该步骤之后，在室温下用荧光素处理胶原酶处理的样品(含有释放的GPA)和亮氨酸标准品一段时间，以便分别荧光标记产生的GPA和亮氨酸分子中的游离氨基。在392nm激发后，测量每种溶液在480nm处的荧光发射。亮氨酸和胶原酶样品曲线的斜率用于计算效价单位，如下所示：

效价(f-GPA单元/mg)＝(M_样品/M_亮氨酸)x(DF/T)

其中：

M_样品＝胶原酶效价曲线斜率

M_亮氨酸＝亮氨酸标准曲线斜率

DF＝稀释因子

T＝反应时间

除此之外，关于GPA实验方法的非限制性细节在下面进行了表述：

缓冲液和试剂

1.f-Appel缓冲液，pH 7.2(55mM HEPES，100mM醋酸钙)

2.1mM亮氨酸工作储备溶液

3.200mM硼酸盐，pH 9.0

4.0.5mM丙酮中的萤光胺溶液

5.f-Appel’s缓冲液中的2mg/mL zGPGGPA底物

溶液制备

按照如下方法制备溶液：

f-Appel缓冲液：将13.0g HEPES和17.6g醋酸钙溶解在约800mL水中。用氢氧化钠调节pH至7.2，用水调节QS至1L。储存在2-8摄氏度。

10mM亮氨酸储备溶液：将65.5mg亮氨酸溶解在50mL水中。亮氨酸必须直接称重到100毫升(或同等)玻璃烧杯的规模。称取约65mg(目标重量)亮氨酸放入烧杯中。根据所称亮氨酸的重量，使用下式计算加入烧杯的水量。向烧杯中加入计算体积的水，充分混合，确保亮氨酸完全溶解。分为1mL等份。储存在低于或等于20摄氏度下。

V2(mL)＝C2(mg)x V1(50mL)

C1(65.5mg)

其中：

C2＝称量的亮氨酸重量(mg)

V1＝50(毫升水)

C1＝65.5(毫克亮氨酸)

V2＝产生10mM储备溶液(ml)所需要的水的体积

1mM亮氨酸工作储备溶液：解冻一小瓶10mM亮氨酸储备溶液，并结合150μL和1350μL水稀释至1mM。使用前充分搅拌。

0.5N HCl：用水将HCl稀释至0.5N，并充分混合。室温条件下保存。或者，可以使用市售的0.5N HCl。

200nM硼酸盐，pH 9.0：将2.4克硼酸溶解在大约150毫升水中。使用氢氧化钠将pH值调整到9。用水调节QS至200mL并混合均匀。储存在2-8摄氏度。

0.5mM荧光胺溶液：将15毫克荧光胺与100毫升丙酮混合在一起并搅拌溶解。在在2-8摄氏度下避光保存。

底物溶液(2mg/mL zGPGGPA)：用f-Appel缓冲液制备2mg/mL的底物。在机械振动筛/旋转器存在的条件下溶解，留出足够的时间完全溶解(约15分钟)。

亮氨酸标准曲线

根据表7制备亮氨酸标准曲线

表7.亮氨酸标准曲线的制备

“L1”指的是亮氨酸标准样品1

然后，每100μL亮氨酸标准品被分别转入试管并检测其中的荧光胺。

胶原酶样品制备

在两个步骤中用f-Appel缓冲液将胶原酶样品稀释到0.01mg/mL然后轻轻搅拌混合。下面描述了示例性的稀释方案：

1.100μL x 1.0mg/mL-→1000μL＝0.1mg/mL

2.100μL x 0.1mg/mL-→1000μL＝0.01mg/mL

空白制备

通过将45μL稀释制剂与500μL 0.5N盐酸混合以使酶失活来制备空白。添加455μL的zGPGGPA底物溶液并充分搅拌。将100μL空白样品转移到单独的试管中，以检测可能与萤光胺反应的杂质。

效价曲线

为每个胶原酶样品制备一组效价曲线，如下所示：

试管	2mg/mL底物溶液	f-Appel缓冲液(μL)
			1-2	1	45
3-4	1	30
			5-6	1	15

在25℃的水浴中加热含有底物和缓冲液的试管至少15分钟。在第二组试管上贴上标签，并向每个试管中添加50μL 0.5N的盐酸。将稀释的胶原酶样品制剂(0.01mg/mL)按表8加入试管中培养10分钟，混合后返回25℃水浴。将第一种制剂添加到预热的底物中后，开始培养阶段。

表8.样品制剂

制剂	试管	样品(μL)
			效价曲线	1-2	55
效价曲线	3-4	70
			效价曲线	5-6	85

在10分钟培养还剩余1-2分钟的时候，将制剂从水浴中取出，轻轻旋涡混合。将第一种制剂添加到底物中10分钟后，从每根试管中转移50微升到含有50μL 0.5N HCl的试管中。这些制剂应直接加入酸中以抑制消化。在淬火所有制剂之后，旋涡各试管使之充分混合。

检测

将400μL 200mM硼酸盐缓冲液和500μL 0.5mM萤光胺溶液添加到含有100μL每种制剂(空白、胶原酶样品效价曲线和亮氨酸标准品)的所有检测试管中。充分搅拌。让试管在室温下培养至少10分钟。

荧光光度计设置

使用以下仪器参数设置荧光计，并在衍生化1小时后读取每个制剂的荧光。

参数	设置
		激发波长	392nm
激发波长	480nm
		整合	5.0sec.
裂缝(Ex&Em)	5.0nm(通带片)
		路径长度	3mm

计算

根据480nm(Y轴)处的荧光反应绘制每个亮氨酸标准品(X轴)的浓度。确定斜率(m)和确定系数(R2)。测定每个效价曲线制剂的平均荧光。通过绘制每个制剂的浓度(X轴)与480nm(Y轴)处的平均荧光反应，制备胶原酶样品和亮氨酸效价曲线。确定所得线性曲线的斜率(m)和确定系数(R2)。

确定胶原酶样品的效价

效价(f-GPA单位/mg)＝(M_样品/M_亮氨酸)x(DF/T)

其中：

M_样品＝胶原酶样品效价曲线斜率

M_亮氨酸＝亮氨酸标准曲线斜率

DF＝稀释因子(1100μL/50μL＝22)

T＝反应时间(10分钟)

ii.用于确定胶原酶样品中II类胶原酶活性的GPA微板实验

此方法与上述GPA类似，只是在微孔板中进行。与上述测定一样，微孔板测定法测量胶原酶样品在底物羧苄氧基-甘氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-丙基-L-丙氨酸(zGPGGPA)(以下简称“底物”)的酶切中的蛋白水解活性。该实验遵循以下方法，但是本领域的普通技术人员将理解，在实现本实验目的的范围内可以进行某些修改(例如稀释浓度和时间)。

试剂

1.肽底物(zGPGGPA)(Bachem M1260或者等价物)

2.三肽GPA(Bachem H3615或者等价物)

3.荧光胺(Acros 191675000或者等价物)

4.纯净水(Milli-Q-Plus 18.2MΩ系统或者等价物)

5.1M HEPES缓冲液(Gibco 15630-080或者等价物)

6.Surfact-Amps 20^TM(10％吐温溶液)(Pierce Cat.#28320或者等价物)

7.1M醋酸钙(Ca(C₂H₃O₂)₂)(Emerald Biosciences公司Cat.#EBS-100-CAAC或者等价物)

8.硼酸(Sigma B7660或者等价物)

9.2.5N NaOH(J.T Baker 5666-02或者等价物)

10.0.5N盐酸(VWR 101223-134或者等价物)

11.丙酮(Sigma 270725或者等价物)

溶液的制备

(i)实验缓冲液(50mM HEPES pH 7.1/0.05％吐温20/5mM(Ca(C₂H₃O₂)₂)的制备：用移液管将50mL 1M HEPES移到800mL去离子水中。添加5mL 1M的(Ca(C₂H₃O₂)₂)和5mLSurfact-Amps(10％吐温20)。检查pH值，必要时调整pH值至7.1±0.05。添加足量的水以将体积调节至1L，并通过0.22微米过滤器过滤溶液。该实验缓冲液可在室温下储存3个月。

(ii)0.1N NaOH的制备：向48mL去离子水中加入2mL 2.5N NaOH。该溶液可在室温下储存3个月。

(iii)4mg/mL三肽GPA储备液的制备：将400mg(±1mg)三肽GPA溶解于10mL 0.1NNaOH中并旋转直至完全溶解。添加足量的实验缓冲液，使体积为100mL，并将溶液分为0.5mL等份，并在-70℃下储存。4mg/mL三肽GPA储备可在-70℃下储存一年。

(iv)制备4mg/mL(6.8mM)肽底物zGPGGPA：将400mg(+1mg)肽底物zGPGGPA溶解于10ml 0.1N氢氧化钠中，旋涡旋转直至完全溶解。添加足量的实验缓冲液，使体积达到100mL。该溶液可在4℃下储存3个月。

(v)制备pH值为9.0的120mM硼酸：将7.4g(±0.5g)硼酸溶解在800mL去离子水中。用NaOH滴定溶液至pH 9.0。加入足量的去离子水，将体积调节到1升。该溶液可在室温下储存3个月。

(vi)在丙酮中制备1mM萤光胺：将28±2mg萤光胺溶解于100mL丙酮中。这种溶液需要新鲜制备，避免光照和潮湿。

三肽GPA标准品的制备和系列稀释

通过将4mg/mL三肽GPA存储溶液在实验缓冲液中稀释50倍(例如，在980μL实验缓冲液中稀释20μL 4mg/mL三肽GPA)，制备0.08mg/mL(329μM)三肽GPA标准品。在实验平板，A行，用移液管将200μL 329μ M三肽GPA标准品移到A1和A7中。用移液管将100μL实验缓冲液移入A2-A6和A8-A12中。

对于三肽GPA标准系列稀释液，将100μL的量从A1转移到A2中，混合，将100μL的量从A2转移到A3中，重复至A5。从A5孔中取出100μL，使其最终体积为100μL。A6孔仅含有缓冲液。

对于第二个三肽GPA标准系列稀释液，将100μL的量从A7转移到A8，混合，将100μL的量从A8转移到A9，并重复直到A11孔。从A11孔中取出100μL，使其最终体积为100μL。A12孔仅含有缓冲液。

胶原酶样品的制备

对于胶原酶样品(例如，冻干胶原酶药物产品)，在至少十分钟的时间内将样品冷却至室温，并重新配制成500ng/mL储备溶液。可以使用不同的浓度。用实验缓冲液稀释储备溶液制备待检测胶原酶样品(T1A)。重复该程序以制备三份试验样品(T1A、T1B、T1C)。

讨论

在该方法中，在96孔板中将50μL浓度增加的胶原酶待检测样品与50μL过量底物(2.0mg/mL最终浓度)混合。在U型底96孔聚丙烯反应板的C-G行中加入50μL的实验缓冲液。用移液管将150μL胶原酶样品移到B行。然后，使用多通道移液管进行1/1.5的连续稀释，将100μL胶原酶样品从B行移到C行，混合并重复该过程，直到达到G行。从G行中去除并丢弃100μL的量。表9包含将50μL底物添加到B行到H行后的最终胶原酶浓度。

通过向H行移液50μL实验缓冲液制备H行空白。该行不含酶。示例性浓度如表9所示。

表9.添加底物之后的实验目标浓度

胶原酶反应

zGPGGPA底物在室温下15分钟的培养时间内被II类胶原酶切割成zGPG和GPA。打开培养箱和温度探头(向培养板中添加底物前，温度为22±1℃)。将50μL 4mg/mL(6.8mM)zGPGGPA底物逐列添加到B-H行的1-12柱中，然后混合。反应开始时间从底物加入第一个列后开始。将培养板盖上并置于22±1℃培养箱中，总反应时间为15±1分钟。

培养之后，通过添加盐酸来猝灭反应，并且在肽的游离氨基末端与荧光试剂荧光胺反应后，对释放的GPA肽的量进行定量。为了使反应停止，将100μL 0.5N HCl从A行添加到H行的每个孔中，逐列添加，然后混合。反应时间在HCl加入到第一个色谱柱后结束。

检测

向微孔板Greiner聚丙烯黑色阅读板的每个孔中添加195μL 120mM硼酸盐(pH9.0)。将30μL的淬火反应混合物从反应板转移到读数板的相应孔中，并充分混合。然后，将75μL 1mM萤光胺添加到阅读板的每个孔中(使用聚丙烯托盘分配萤光胺/丙酮)，并在每次添加后立即混合。使用分子器件M2荧光板读取器在荧光胺添加后15分钟内读取板，使用以下设置：激发380nm，发射473nm，截止455nm，6次读取/孔，PMT培养基。

绘制了GPA浓度(μM)与473nm发射的关系曲线，胶原酶浓度(ng/mL)与473nm发射的关系曲线。对于每个图，线性回归拟合没有固定参数。对于胶原酶测试样本，从线性拟合中排除零点数据，并使用每个样本的整个三份数据集生成绘图。测定三肽GPA标准品和胶原酶样品的斜率。

效价确定

按照如下方式计算胶原酶样品的比活性：

GPA微板实验单元＝((胶原酶样品斜率)/(三肽GPA斜率x培养时间))x 10⁶。

胶原酶待检测样品的比活性由三肽GPA标准品的斜率确定，并通过曲线拟合程序计算。根据Michaelis-Menton方程，采用微孔板法，可以用不同底物浓度和不同时间计算酶动力学。

iii.GPA实验测定的胶原酶效价

在这里公开的内容中有效的胶原酶可能具有约100,000至约300,000GPA单位/mg或约175,000至约300,000f-GPA单位/mg的效价。在其它实施方案中，效价可为约70,000至约400,000GPA单位/mg，或约100,000至约375,000GPA单位/mg，或约125,000至约350,000GPA单位/mg，或约150,000至约325,000GPA单位/mg，或约175,000至约300,000GPA单位/mg，或约200,000至约275,000GPA单位/mg。或者，效价可为约70,000至约400,000f-GPA单位/mg，或约100,000至约375,000f-GPA单位/mg，或约125,000至约350,000f-GPA单位/mg，或约150,000至约325,000f-GPA单位/mg，或约175,000至约300,000f-GPA单位/mg，或约230,000至约430,000f-GPA单位/mg，或约200,000至约275,000f-GPA单位/mg。胶原酶也可具有约30,100至87100或约43,000至67,000GPA微孔板分析单位的效力。上述GPA可用于分析任何胶原酶的比活性。

b.SRC单位分析方法和比活性单位

i.通过SRC测定(比色杯)的胶原酶效价

SRC实验主要用于测量I类胶原酶的效价。一般方法如下。制备亮氨酸标准品和胶原酶样品溶液。实验的第一步涉及胶原酶消化可溶性鼠尾腱胶原(SRC)的酶促反应。第二步涉及随后用荧光衍生物荧光胺测量释放的肽片段/氨基酸。实验遵循以下方法，但是本领域的普通技术人员将理解，在实现实验目的的情况下可以进行某些修改(例如稀释浓度和时间)。

用试剂处理这种胶原酶和亮氨酸标准样品，以便用荧光素标记生成的GPA。亮氨酸标准品和胶原酶样品在室温下培养10分钟，然后分别在392和480nm激发和发射波长下测定每种溶液的荧光。亮氨酸和胶原酶样品曲线的斜率用于计算效价单位，如下所示：

效价(f-GPA单元/mg)＝(M_样品/M_亮氨酸)x(DF/T)x CF

其中：

M_样品＝胶原酶效价曲线斜率

M_亮氨酸＝亮氨酸标准曲线斜率

DF＝稀释因子(1500μL/100mL＝15)

T＝反应时间(2.5hr x 60min/1hr＝150min)

CF＝转化因子(1000μg/1mg＝1000)

此外，关于SRC实验方法的非限制性细节在下面进行了描述。

缓冲液和试剂

1.F-TC实验缓冲液，pH 7.2(22g HEPES[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸]，4.4克，醋酸钙)

2.F-酶缓冲液，pH 7.2

3.200mM硼酸盐，pH 9.0

4.10mM亮氨酸存储溶液

5.1mM亮氨酸工作存储溶液

6.1mM丙酮中的荧光胺溶液

7.在0.02N醋酸中浓度为2mg/mL的鼠尾部胶原

溶液制备

按照如下步骤制备溶液

F-TC实验缓冲液：将22g HEPES和4.4g醋酸钙溶解在约900mL水中。用氢氧化钠调节pH至7.2，用水调节QS至1L。储存于2-8℃。

F-酶-缓冲液：将4ml F-TC实验缓冲液与16mL水结合来稀释F-TC实验缓冲液。储存于2-8℃。

10mM亮氨酸储备溶液：将65.5mg亮氨酸溶解于50mL水中。亮氨酸必须直接称重到100毫升(或同等规模)玻璃烧杯的规模。称取约65mg(目标重量)亮氨酸放入烧杯中。根据所称亮氨酸的重量，使用下式计算加入烧杯的水量。向烧杯中加入计算体积的水，充分混合，确保亮氨酸完全溶解。分为1毫升等份。在低于或等于-20℃的温度下储存。

V2(mL)＝C2(mg)x V1(50mL)

C1(65.5mg)

其中

C2＝称重的亮氨酸质量(mg)

V1＝50(mL的水)

C1＝65.5(mg的亮氨酸)

V2＝产生10mM存储溶液所需要的水的体积(mL)

1mM亮氨酸工作储备溶液：解冻一小瓶10mM亮氨酸储备溶液，并将150μL与1350μL水混合稀释至1mM。使用前充分搅拌。

0.5N HCl：用水将HCl稀释至0.5N，并充分混合。室温条件下保存。或者，可以使用市售的0.5N HCl。

0.02N醋酸：将1mL 1N醋酸与49mL水混合，充分混合。室温条件下保存。

200mM硼酸盐，pH 9.0：在大约150毫升水中溶解2.4克硼酸。使用氢氧化钠将pH值调节至9.0。加水将QS添加至200ml，混合均匀。储存于2-8℃。

1mM荧光胺溶液：将15毫克荧光胺溶解在50微升的丙酮中并搅拌溶解。于2-8℃条件下避光保存。

底物溶液(2mg/mL鼠尾部胶原)：用0.02N醋酸将鼠尾部胶原稀释至2mg/mL。储存于2-8℃。

亮氨酸标准曲线

根据表10制备亮氨酸标准曲线。

表10.亮氨酸标准曲线的制备

然后将100μL每种亮氨酸标准品转移到单独的离心管中以检测荧光素。

胶原酶样品和空白制备

在两个步骤中用F-酶缓冲液将胶原酶样品稀释到0.01mg/mL然后轻轻漩涡搅拌混合。下面描述了示例性的稀释方案：

1.100μL x 1.0mg/mL→1000μL＝0.1mg/mL

2.100μL x 0.1mg/mL→1000μL＝0.01mg/mL

在室温条件下维持稀释的样品直到被使用。

根据表11，通过首先将样品和0.5N盐酸结合使酶失活来制备空白，随后加入缓冲液和底物。

根据表11标记各个胶原酶样品试管。试管1，2，4和6从一个制剂中制备并且试管3，5和7从重复的制剂中制备。

表11.空白和胶原酶样品制剂

盖上试管的盖子并轻轻旋转以混合。效价曲线制剂在25℃±3℃水浴中培养2.5小时。培养结束后，从水浴中取出效价曲线试管。向每个制剂中添加750μL 0.5N HCl，并彻底旋转以混合。在检测前，制剂可在2-8℃下储存22小时。

检测/荧光光度计设置

按照上面的描述制备亮氨酸标准品。

使用以下仪器参数设置荧光计，并在衍生化1小时后读取每个制剂的荧光。

参数	设置
		激发波长	392nm
激发波长	480nm
		整合	5.0sec.
裂缝(Ex&Em)	5.0nm(通带片)
		路径长度	3mm

计算

根据480nm(Y轴)处的荧光反应绘制每个亮氨酸标准品(X轴)的浓度。确定斜率(m)和确定系数(R2)。测定每个效价曲线制剂的平均荧光。不要强制归零。确定每个重复制剂的平均荧光度。计算每个胶原酶样品制剂的净荧光度

F(净)＝平均胶原酶样品(EM₄₈₀)-空白(EM₄₈₀)

绘制胶原酶样品在每个制剂中的浓度(X-轴)相对于净荧光度(Y轴)的曲线。确定斜率(m)和确定因子(R²)。不要强制归零。

确定胶原酶样品的效价

效价(f-SRC单位/mg)＝(M_样品/M_亮氨酸)x(DF/T)x CF

其中：

M_样品＝胶原酶样品效价曲线斜率

M_亮氨酸＝亮氨酸标准曲线斜率

DF＝稀释因子(1500μL/100mL＝15)

T＝反应时间(2.5hr x 60分钟/1hr＝150min)

CF＝转化因子(1000μg/1mg＝1000)

上述SRC实验可以备用分析任何胶原酶的比活性。

ii.用于确定胶原酶样品中I类胶原酶活性的SRC微板实验

此方法与上述SRC类似，只是在微孔板中进行。与上述SRC实验一样，微孔板测定法测量针对可溶性鼠-尾部胶原(SRC)底物(以下简称“底物”)的酶切中的胶原酶活性。该实验遵循以下方法，但是本领域的普通技术人员将理解，在实现本实验目的的范围内可以进行某些修改(例如稀释浓度和时间)。

试剂

1.可溶性鼠-尾部胶原底物(BD Biosciences 354236)

2.三肽GPA(Bachem H3615或者等价物)

3.荧光胺(Acros 191675000或者等价物)

4.纯净水(Milli-Q-Plus 18.2MΩ系统或者等价物)

5.1M HEPES缓冲液(Gibco 15630-080或者等价物)

6.1M醋酸钙(Ca(C₂H₃O₂)₂)(Emerald Biosciences公司Cat.#EBS-100-CAAC或者等价物)

7.Surfact-Amps 20^TM(10％吐温溶液)(Pierce Cat.#28320或者等价物)

8.1.0N醋酸(Sigma 318590或等价物)

9.0.5N盐酸(VWR 101223-134或者等价物)

10.硼酸(Sigma B7660或等价物)

11.2.5N氢氧化钠(J.T Baker 5666-02或等价物)

12.丙酮(Sigma 270725或者等价物)

溶液的制备

(i)实验缓冲液(50mM HEPES pH 7.1/0.05％吐温20/5mM(Ca(C₂H₃O₂)₂)的制备：用移液管将50mL 1M HEPES移到800mL去离子水中。添加5mL 1M的(Ca(C₂H₃O₂)₂)和5mLSurfact-Amps(10％吐温20)。检查pH值，必要时调整pH值至7.1±0.1。添加足量的水以将体积调节至1L，并通过0.22微米过滤器过滤溶液。该实验缓冲液可在室温下储存3个月。

(ii)0.1N NaOH的制备：向48mL去离子水中加入2mL 2.5N NaOH。该溶液可在室温下储存3个月。

(iii)4mg/mL三肽GPA储备液的制备：将400mg(±1mg)三肽GPA溶解于10mL 0.1NNaOH中并旋转直至完全溶解。添加足量的实验缓冲液，使体积为100mL，并将溶液分为0.5mL等份，并在-70℃下储存。4mg/mL三肽GPA储备可在-70℃下储存一年。

(iv)0.02N醋酸的制备：将1毫升1.0N醋酸加入40mL纯净水中。加入足量的纯净水将体积调整到50毫升。该溶液可以在室温下存储一年。

(v)2mg/mL SRC底物储备溶液的制备：将23.3mL 0.02N的乙酸直接添加到供应底物的试管中(在一个非限制性实施例中以3.75mg/mL的浓度供应100mgSRC)。可以使用其他浓度的SRC底物。计算如下：

100mg÷3.75mg/mL＝26.7mL；

总vol(mL)＝(3.75mg/mL x 26.7mL)/2mg/mL；

总vol(50.0mL)-26.7mL＝23.3mL

通过倒置将溶液充分混合，并可在2-8℃下储存3个月。

(vi)0.6mg/mL SRC底物工作液的制备：在15mL锥形管中加入4.2mL实验缓冲液。然后，添加1.8mL 2mg/mL SRC底物储备溶液，并通过倒置混合该溶液。该溶液应在加入平板前立即制备。

(vii)制备pH值为9.0的120mM硼酸：将7.4g(±0.5g)硼酸溶解在800mL去离子水中。用NaOH滴定溶液至pH 9.0，并加入足够的去离子水将体积调节至1L。该溶液可在室温下储存3个月。

(viii)制备在丙酮中浓度为1mM的萤光胺：将28±2mg萤光胺溶解于100mL丙酮中。这种溶液需要新鲜制备，避免光照和潮湿

三肽GPA标准品的制备和系列稀释

通过将4mg/mL三肽GPA存储溶液在实验缓冲液中稀释50倍(例如，在980μL实验缓冲液中稀释20μL 4mg/mL三肽GPA)，制备0.08mg/mL(329μM)三肽GPA标准品。在实验平板，A行，用移液管将200μL 329μM三肽GPA标准品移到A1和A7中。用移液管将100μL实验缓冲液移入A2-A6和A8-A12中。

对于三肽GPA标准系列稀释液，将100μL的量从A1转移到A2中，混合，将100μL的量从A2转移到A3中，重复至A5。从A5孔中取出100μL，使其最终体积为100μL。A6孔仅含有缓冲液。

对于第二个三肽GPA标准系列稀释液，将100μL的量从A7转移到A8，混合，将100μL的量从A8转移到A9，并重复直到A11孔。从A11孔中取出100μL，使其最终体积为100μL。A12孔仅含有缓冲液。

胶原酶待检测样品的制备

对于胶原酶样品(例如，冻干胶原酶药物产品)，在至少十分钟的时间内将样品冷却至室温，并重新配制成3.0μg/mL储备溶液。可以使用不同的浓度。用实验缓冲液稀释储备溶液制备待检测胶原酶样品(T1A)。重复该程序以制备三份试验样品(T1A、T1B、T1C)。

讨论

在该方法中，在96孔板中将50μL浓度增加的胶原酶待检测样品与50μL过量底物(2.0mg/mL最终浓度)混合。在U型底96孔聚丙烯反应板的C-G行中加入50μL的实验缓冲液。用移液管将150μL胶原酶样品移到B行。然后，使用多通道移液管进行1/1.5的连续稀释，将100μL胶原酶样品从B行移到C行，混合并重复该过程，直到达到G行。从G行中去除并丢弃100μL的量。通过向H行移液50μL实验缓冲液制备H行空白。该行不含酶。表12包含将50μL底物添加到B行到H行后的最终胶原酶浓度。

表12.添加底物之后的实验目标浓度

胶原酶反应

打开培养箱和温度探头(向培养板中添加底物前，温度为22±1℃)。将50μL0.6mg/mL SRC底物添加到B-H行的每个孔中，逐列添加然后混合。反应开始时间从底物加入第一个列后开始。将培养板盖上并置于22±1℃培养箱中，总反应时间为45±5分钟。培养之后，通过向稀释板的每个小孔添加100微升0.5N的盐酸来猝灭反应，逐列添加，然后混合。反应时间在HCl加入到第一个列中后结束。

检测

向微孔板Greiner聚丙烯黑色阅读板的每个孔中添加195μL 120mM硼酸盐(pH9.0)。将30μL的淬火反应混合物从反应板转移到读数板的相应孔中，并充分混合。从反应平板中向阅读平板相应的孔中转移30微升的退火反应混合物并充分混合，然后，将75μL 1mM萤光胺添加到阅读板的每个孔中(使用聚丙烯托盘分配萤光胺/丙酮)，并在每次添加后立即混合。使用分子器件M2荧光板读取器在荧光胺添加后15分钟内读取板，使用以下设置：激发380nm，发射473nm，截止455nm，6次读取/孔，PMT培养基。

绘制了GPA浓度(μM)与473nm发射的关系曲线，胶原酶浓度(ng/mL)与473nm发射的关系曲线。对于每个图，线性回归拟合没有固定参数。对于胶原酶测试样本，从线性拟合中排除零点数据，并使用每个样本的整个三份数据集生成绘图。测定三肽GPA标准品和胶原酶样品的斜率。

比活性和相关效价的确定

按照如下方式计算胶原酶样品的比活性：

SRC微板实验单元＝((胶原酶样品斜率)/(三肽GPA斜率x培养时间))x 10⁶

胶原酶待检测样品的比活性由三肽GPA标准品的斜率确定，并通过曲线拟合程序计算。根据Michaelis-Menton方程，采用微孔板法，可以用不同底物浓度和不同时间计算酶动力学。

iii.SRC实验测定的胶原酶效价

在这里公开的内容中有效的胶原酶的效价约为500至15,000SRC单位/mg。在某些实施方案中，效价为约500至约12,500SRC单位/mg，或约700至约10,000SRC单位/mg，或约1,000至约7,500SRC单位/mg，或1,500至约6,000SRC单位/mg，或约2,500至约5,000SRC单位/mg。或者，效价可为约5,000至约35,000f-SRC单位/mg，或约10,000至约30,000f-SRC单位/mg，或约13,000至约23,000f-SRC单位/mg，或约15,000至约25,000f-SRC单位/mg。胶原酶也可具有约980至3,510或约1,400至2,700SRC微孔板实验单位的效力。

c.BTC单元实验中的胶原酶效价

牛肌腱胶原蛋白胶原酶测定基于Mandl et al.(1958)公开的方法，经Keller和Mandl(1963年)修改。由于牛腱胶原是一种不溶性底物，因此对其进行精细的分离是很重要的。运行胰蛋白酶作为对照，以说明变性胶原蛋白或其他蛋白质杂质的存在。该实验是在胶原酶活性所需的钙离子存在的条件下进行的。可溶解的肽的数量通过肽的N-末端氨基与茚三酮反应并通过比色法测量形成的辅助物的量来确定(Rosen 1957)。

本方法的目的是使用胶原底物检测胶原酶的比活性。

试剂和溶液

1.胶原底物(胶原)

2.去离子水(水)

3.Tris实验缓冲液

4.胰蛋白酶储备溶液

5.0.5M HCl

6.亮氨酸标准实验溶液(1mM亮氨酸)

7.Rosen缓冲液

8.3％茚三酮

9.50％异丙醇

培养

按如下方式设置和标记反应管：三管用于胰蛋白酶对照，六管用于参照溶液，六管用于每个待检测样品。给每根管子贴上标签并打开盖子。按表13的顺序称取10±1mg胶原，将称取的胶原放入各反应管中。

表13.称重顺序和反应试管编号

称重顺序	反应试管#
		1	1
2	4
		3	6
4	8
		5	10
6	12
		7	14
8	16
		9	18
10	20
		11	2
12	3
		13	5
14	7
		15	9
16	11
		17	13
18	15
		19	17
20	19
		21	21

对于受试样品，每个反应管(ACT)中酶的活性应在1.6至5.7nmol leu eq/min之间。未溶解的样品应首先溶解在Tris实验缓冲液中，然后再用于实验分析。浓度(加入反应管前)应不低于0.0065mg/mL。

根据表14设置反应管，使其具有矩阵模式。下表假设有2个待测样品。如果运行更多或更少的样品，调整反应管的数量，但保留模式。表14列出了体积保持不变的情况。

表14.矩阵模式

*建议的最大样品数量是3

盖住反应管。轻轻但彻底地混合内容物。将反应管置于37℃的水浴中。孵育22±0.5小时。记录培养开始的实际时间a，37℃，所用水浴的数量，胶原蛋白脂质的批号，所用批号的胶原蛋白校正系数和所用所有溶液的批号

淬火并过滤

标记滤液管，使其对应于培养的每个反应管。将装有折叠滤纸的漏斗放在每个标记的滤液管上。在培养阶段结束时，从水浴中取出反应管。记录培养结束的实际时间。

打开反应管并丢弃盖子。通过向每个反应管中分配2mL 0.5M HCl来猝灭反应。把试管里的东西充分混合。将每个反应管中的内容物过滤到适当的过滤管中。

前两步需要尽快完成，因为未消化的胶原蛋白可以在短时间内被盐酸溶解。在显色前，滤液可在有盖滤液管中冷藏达95.5小时。记录冷藏和储存时间。

显色

设置煮沸的试管并贴上标签，如下所示：6个试管用于水和亮氨酸对照品(步骤1)，2个试管用于每个滤液桶(步骤1)。将以下量的水和亮氨酸标准分析溶液放入六个亮氨酸对照试管中。

试管#	1	2	3	4	5	6
							水(μL)	1000	900	850	800	750	700
亮氨酸(μL)	0	100	150	200	250	300
							亮氨酸(nmol)	0	100	150	200	250	300

用移液管将0.8mL水移到每个煮沸的试管中(步骤2)。用移液管从每个样品中吸取0.2毫升滤液，放入适当标记的煮沸的试管中。向每个煮沸的试管中加入0.5毫升罗森缓冲液。在密封罩下，向每个煮沸的试管中分配0.5mL 3％茚三酮。在涡流混合器上彻底混合各管中的内容物。将煮沸的试管放入通风柜中的沸水浴中。煮沸15±1分钟。在沸腾期结束时，从水浴中取出煮沸的试管。在密封罩下，将5.0mL 50％异丙醇分配到每个煮沸的试管中，并彻底混合内容物。在读取吸光度之前，让煮沸的试管达到环境温度(至少10分钟)。

吸光度读数

在密封罩下工作时，读取各个试管的吸光度。打开分光光度计并使其预热。将分光光度计的波长设置为570nm。用50％异丙醇调零分光光度计。读取水、亮氨酸、胰蛋白酶对照品和受试样品的吸光度(A₅₇₀)。记录读取第一个样本的时间，以小时为单位。将读数记录为1000X A₅₇₀，并记录读取最后一个样品的时间(以小时为单位)。所有读数应在1小时间隔内完成

计算原则

以分钟为单位计算总读取时间和总培养时间。总读数时间应少于60分钟，总培养时间应在1290-1350分钟之间。使用线性最小二乘法，计算亮氨酸标准品的斜率“b”和相关系数“r”(x＝nmol亮氨酸vs y＝A₅₇₀读数)。“b”值的单位是A₅₇₀/nmol亮氨酸。将“b”值记录到小数点后两位。亮氨酸的b值应在2.88-3.33之间。计算胰蛋白酶对照品的平均读数(T)。胰蛋白酶对照品(T)的平均读数应为221-338。将此平均值记录到最接近的整数(步骤A)。每个反应管的平均重复样品A₅₇₀读数。将这个数字记录到最接近的整数。从平均样品A₅₇₀读数中减去平均胰蛋白酶(步骤A)，得到净样品读数。

按照如下方式计算每个试管的活性(ACT)，以nmol leu eq/min为单位：

式中，20是所形成反应混合物量的稀释系数，“b”是亮氨酸标准曲线的斜率。把这个数字记到小数点后一位。受试样品每个试管的活度应为1.6-5.7nmol leu eq/min。

按照如下方式计算以BTC单元为单位的活性：

BTC单元＝以nmol leu eq/min为单位的活性x胶原相关系数.

按照如下方式计算样品以BTC单元/mL为单位的活性：

按照如下方式计算样品以BTC单元/mm为单位的比活性：

BTC单元向ABC单元的转化：

ABC单元＝BTC单元x 1.09

i.BTC单元和ABC单元

可使用各种胶原酶组合物，其中胶原酶具有约5,000BTC单位/mg至约25,000BTC单位/mg，或约10,000BTC单位/mg至约25,000BTC单位/mg，或约15,000BTC单位/mg，或约17,500BTC单位/mg，或约20,000BTC单位/mg，或约22,500BTC单位/mg，或约9,175BTC单位/0.58mg，或15,817BTC单位/mg的比活性，其中“mg”指存在于组合物中的胶原酶的量(不同于赋形剂和其它成分)。

此外，可使用各种胶原酶组合物，其中胶原酶具有约5,000ABC单位/mg至约25,000ABC单位/mg，或约10,000ABC单位/mg至约25,000ABC单位/mg，或约15,000ABC单位/mg或约17,500ABC单位/mg，或约20,000ABC单位/mg，或约22,500ABC单位/mg，或约10,000ABC单位/0.58mg，或17,241ABC单位/mg的比活性，其中“mg”指存在于组合物中的胶原酶的量(不同于赋形剂和其他成分)。

d.其他实验

用来标记胶原的实验方法记载在Gisslow et al.，Anal.Biochem.，68：70-78(1975)；Robertson et al.，Clinica Chimica Acta，42：43-45(1972)；Sakamoto et al.，ANew Method for the Assay of Tissue Collagenase(36297)(1972).中。其他方法还包括Worthington生物化学公司的实验方法(http：//www.worthington-biochem.com/CLS/assay.html)(2019年7月3日登录的).

4.胶原酶剂量

至于本文所采用的胶原酶剂量，本发明提供了治疗有效量的胶原酶，其足以在皮下注射时结合并溶解隔膜，从而与预治疗基线相比减少皮下脂肪团的出现。

在一个实施方案中，胶原酶可单次或分次注射约0.01mg至约20mg的量。在另一实施方案中，胶原酶可单次或分次注射约0.05mg至约15mg的量。在另一实施方案中，胶原酶可单次或分次注射约0.10mg至约10mg的量。在另一实施方案中，胶原酶可单次或分次注射约0.15mg至约5mg的量。在另一实施方案中，胶原酶可单次或分次注射约0.20mg至约3mg的量。在另一实施方案中，胶原酶可单次或分次注射约0.25mg至约2mg的量。在依旧另一个实施方案中，所述胶原酶可以注射大约0.05mg，大约0.10mg，大约0.15mg，大约0.20mg，大约0.25mg，大约0.30mg，大约0.35mg，大约0.40mg，大约0.45mg，大约0.50mg，大约0.55mg，大约0.60mg，大约0.65mg，大约0.70mg，大约0.75mg，大约0.80mg，大约0.85mg，大约0.90mg，大约0.95mg，大约1.00mg，1.05mg，大约1.10mg，大约1.15mg，大约1.20mg，大约1.25mg，大约1.30mg，大约1.35mg，大约1.40mg，大约1.45mg，大约1.50mg，大约1.55mg，大约1.60mg，大约1.65mg，大约1.70mg，大约1.75mg，大约1.80mg，大约1.85mg，大约1.90mg，大约1.95mg，大约2.00mg，2.05mg，大约2.10mg，大约2.15mg，大约2.20mg，大约2.25mg，大约2.30mg，大约2.35mg，大约2.40mg，大约2.45mg，大约2.50mg，大约2.55mg，大约2.60mg，大约2.65mg，大约2.70mg，大约2.75mg，大约2.80mg，大约2.85mg，大约2.90mg，大约2.95mg，大约3.00mg，3.05mg，大约3.10mg，大约3.15mg，大约3.20mg，大约3.25mg，大约3.30mg，大约3.35mg，大约3.40mg，大约3.45mg，大约3.50mg，大约3.55mg，大约3.60mg，大约3.65mg，大约3.70mg，大约3.75mg，大约3.80mg，大约3.85mg，大约3.90mg，大约3.95mg，大约4.00mg，4.05mg，大约4.10mg，大约4.15mg，大约4.20mg，大约4.25mg，大约4.30mg，大约4.35mg，大约4.40mg，大约4.45mg，大约4.50mg，大约4.55mg，大约4.60mg，大约4.65mg，大约4.70mg，大约4.75mg，大约4.80mg，大约4.85mg，大约4.90mg，大约4.95mg，大约5.00mg，5.05mg，大约5.10mg，大约5.15mg，大约5.20mg，大约5.25mg，大约5.30mg，大约5.35mg，大约5.40mg，大约5.45mg，大约5.50mg，大约5.55mg，大约5.60mg，大约5.65mg，大约5.70mg，大约5.75mg，大约5.80mg，大约5.85mg，大约5.90mg，大约5.95mg，或者大约6.00mg。

在一个实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶具有大约2.6min^-1到5.2min^-1的V_max。在其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶具有大约3.0min^-1到5.0min^-1的V_max。在其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶具有大约3.4min^-1到4.8min^-1的V_max。在依旧另一个实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶具有大约3.5min^-1到4.5min^-1的V_max。在依旧另一个实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶具有大约2.0min^-1，大约2.1min^-1，大约2.2min^-1，大约2.3min^-1，大约2.4min^-1，大约2.5min^-1，大约2.6min^-1，大约2.7min^-1，大约2.8min^-1，大约2.9min^-1，大约3.0min^-1，大约3.1min^-1，大约3.2min^-1，大约3.3min^-1，大约3.4min^-1，大约3.5min^-1，大约3.6min^-1，大约3.7min^-1，大约3.8min^-1，大约3.9min^-1，大约4.0min^-1，大约4.1min^-1，大约4.2min^-1，大约4.3min^-1，大约4.4min^-1，大约4.5min^-1，大约4.6min^-1，大约4.7min^-1，大约4.8min^-1，大约4.9min^-1，大约5.0min^-1，大约5.1min^-1，大约5.2min^-1，大约5.3min^-1，大约5.4min^-1，大约5.5min^-1，大约5.6min^-1，大约5.7min^-1，大约5.8min^-1，大约5.9min^-1，或者大约6.0min^-1的V_max。在其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶具有大约0.7min^-1到7.6min^-1、或者大约1到6、或者大约2到5、或者大约3到4min^-1的V_max。

在一个实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶具有大约135min^-1到268min^-1的V_max。在其他实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶具有大约150min^-1到250min^-1的V_max。在其他实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶具有大约175min^-1到225min^-1的V_max。在依旧另一个实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶具有大约130min^-1，大约135min^-1，大约140min^-1，大约145min^-1，大约150min^-1，大约155min^-1，大约160min^-1，大约165min^-1，大约170min^-1，大约175min^-1，大约180min^-1，大约185min^-1，大约190min^-1，大约195min^-1，大约200min^-1，大约205min^-1，大约210min^-1，大约215min^-1，大约220min^-1，大约225min^-1，大约230min^-1，大约235min^-1，大约240min^-1，大约245min^-1，大约250min^-1，大约255min^-1，大约260min^-1，大约265min^-1，大约270min^-1，大约275min^-1，或者大约280min^-1的V_max。在其他实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶具有大约4min^-1到400min^-1的V_max，或者根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶具有大约0.3到30.5、或者大约10到375、或者大约20到350、或者大约50到300，或者大约100到275min^-1的V_max。

在一个实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_m是大约75mM到147mM。在其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_m是大约80mM到140mM。在其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_m是大约85mM到130mM。在其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_m是大约90mM到120mM。在依旧其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_m是大约70mM，大约72mM，大约75mM，大约77mM，大约80mM，大约82mM，大约85mM，大约87mM，大约90mM，大约92mM，大约95mM，大约97mM，大约100mM，大约102mM，大约105mM，大约107mM，大约110mM，大约112mM，大约115mM，大约117mM，大约120mM，大约122mM，大约125mM，大约127mM，大约130mM，大约132mM，大约135mM，大约137mM，大约140mM，大约142mM，大约145mM，大约147mM，大约150mM，大约152mM，大约155mM，或者大约157mM。在其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_m是大约4.4mM到437mM，或者根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_m是大约5到400，或者大约20到375或者大约50到325，或者大约100到275，或者大约150到250mM，或者大约4.1到410钠摩尔。

在一个实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_m是大约0.03mM到3.1mM。在其他实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_m是大约1.00mM到1.60mM。在其他实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_m是大约1.10mM到1.50mM。在其他实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_m是大约1.15mM到1.40mM。在依旧其他实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_m是大约0.80mM，大约0.82mM，大约0.85mM，大约0.87mM，大约0.90mM，大约0.92mM，大约0.95mM，大约0.97mM，大约1.00mM，大约1.02mM，大约1.05mM，大约1.07mM，大约1.10mM，大约1.12mM，大约1.15mM，大约1.17mM，大约1.20mM，大约1.22mM，大约1.25mM，大约1.27mM，大约1.30mM，大约1.32mM，大约1.35mM，大约1.37mM，大约1.40mM，大约1.42mM，大约1.45mM，大约1.47mM，大约1.50mM，大约1.52mM，大约1.55mM，大约1.57mM，大约1.60mM，大约1.62mM，大约1.65mM，或者大约1.67mM。在其他实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_m是大约0.027mM到2.7mM，或者根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_m是大约0.1到2，或者大约0.5到1.5或者大约1到1.35mM。

在一个实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat在大约36sec^-1到671sec^-1之间。在其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat在大约50sec^-1到600sec^-1之间。在其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat在大约60sec^-1到500sec^-1之间。在其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat在大约70sec^-1到400sec^-1之间。在依旧另一个实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat在大约100sec^-1到350sec^-1之间。在其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的Kcat是大约30sec^-1，大约40sec^-1，大约50sec^-1，大约60sec^-1，大约70sec^-1，大约80sec^-1，大约90sec^-1，大约100sec^-1，大约110sec^-1，大约120sec^-1，大约130sec^-1，大约140sec^-1，大约150sec^-1，大约160sec^-1，大约170sec^-1，大约180sec^-1，大约190sec^-1，大约200sec^-1，大约210sec^-1，大约220sec^-1，大约230sec^-1，大约240sec^-1，大约250sec^-1，大约260sec^-1，大约270sec^-1，大约280sec^-1，大约290sec^-1，大约300sec^-1，大约310sec^-1，大约320sec^-1，大约330sec^-1，大约340sec^-1，大约350sec^-1，大约360sec^-1，大约370sec^-1，大约380sec^-1，大约390sec^-1，大约400sec^-1，大约410sec^-1，大约420sec^-1，大约430sec^-1，大约440sec^-1，大约450sec^-1，大约460sec^-1，大约470sec^-1，大约480sec^-1，大约490sec^-1，大约500sec^-1，大约510sec^-1，大约520sec^-1，大约530sec^-1，大约540sec^-1，大约550sec^-1，大约560sec^-1，大约570sec^-1，大约580sec^-1，大约590sec^-1，大约600sec^-1，大约610sec^-1，大约620sec^-1，大约630sec^-1，大约640sec^-1，大约650sec^-1，大约660sec^-1，大约670sec^-1，大约680sec^-1，大约690sec^-1，大约700sec^-1，大约710sec^-1，大约720sec^-1，大约730sec^-1，大约740sec^-1，大约750sec^-1或者大约760sec^-1。在其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat在大约1sec^-1到107sec^-1之间，或者根据SRC实验的测定结果，在大约10到100，或者大约20到80，或者大约30到70，或者大约40到60sec^-1之间。

在一个实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat在大约90sec^-1到10000sec^-1之间，或者在41,000sec^-1到81,000sec^-1之间。在其他实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat在大约45,000sec^-1到75,000sec^-1之间。在其他实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat在大约50000sec^-1到70000sec^-1之间。在其他实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat在大约55000sec^-1到65000sec^-1之间。在依旧另一个实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat是大约35,000sec^-1，大约37,500sec^-1，大约40,000sec^-1，大约42,500sec^-1，大约45,000sec^-1，大约47,500sec^-1，大约50,000sec^-1，大约52,500sec^-1，大约55,000sec^-1，大约57,500sec^-1，大约60,000sec^-1，大约62,500sec^-1，大约65,000sec^-1，大约67,500sec^-1，大约70,000sec^-1，大约72,500sec^-1，大约75,000sec^-1，大约77,500sec^-1，大约80,000sec^-1，大约82,500sec^-1，或者大约85,000sec^-1。在其他实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat在大约1215sec^-1到大约120,000sec^-1之间，或者根据GPA实验的测定结果，在大约2,000到100,000，或者大约10,000到90,000，或者大约20,000到80,000，或者大约30,000到70,000，或者大约40,000到60,000sec^-1之间。

在一个实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的1/K_cat在大约376到38,000μsec之间，或者大约14,000μsec到大约28,000μsec之间。在其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的1/K_cat在大约16,000μsec到大约26,000μsec之间。在一个实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的1/K_cat在大约18,000μsec到大约24,000μsec之间。在一个实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的1/K_cat在大约20,000μsec到大约22,000μsec之间。在依旧另一个实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的1/K_cat是大约12,500μsec，大约12,750μsec，大约13,000μsec，大约13,250μsec，大约13,500μsec，大约13,750μsec，大约14,000μsec，大约14,250μsec，大约14,750μsec，大约15,000μsec，大约15,250μsec，大约15,500μsec，大约15,750μsec，大约16,000μsec，大约16,250μsec，大约16,500μsec，大约16,750μsec，大约17,000μsec，大约17,250μsec，大约17,500μsec，大约17,750μsec，大约18,000μsec，大约18,250μsec，大约18,500μsec，大约18,750μsec，大约19,000μsec，大约19,250μsec，大约19,500μsec，大约19,750μsec，大约20,000μsec，大约20,250μsec，大约20,500μsec，大约20,750μsec，大约21,000μsec，大约21,250μsec，大约21,500μsec，大约21,750μsec，大约22,000μsec，大约22,250μsec，大约22,500μsec，大约22,750μsec，大约23,000μsec，大约23,250μsec，大约23,500μsec，大约23,750μsec，大约24,000μsec，大约24,250μsec，大约24,500μsec，大约24,750μsec，大约25,000μsec，大约25,250μsec，大约25,500μsec，大约25,750μsec，大约26,000μsec，大约26,250μsec，大约26,500μsec，大约26,750μsec，大约27,000μsec，大约27,250μsec，大约27,500μsec，大约27,750μsec，大约28,000μsec，大约28,250μsec，大约28,500μsec，大约28,750μsec，大约29,000μsec，或者大约29,250μsec。在其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的1/K_cat在大约370μsec到大约36,700μsec之间，或者根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的1/K_cat在大约750到30,000，或者大约2,500到25,000，或者大约5,000到20,000，或者大约10,000到18,000，或者大约15,000μsec。

在一个实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的1/K_cat在大约4到430μsec之间之间。在其他实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的1/K_cat在大约14μsec到大约23μsec之间。在另一个实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的1/K_cat在大约16μsec到大约21μsec之间。在依旧另一个实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的1/K_cat是大约10.0μsec，大约10.2μsec，大约10.4μsec，大约10.6μsec，大约10.8μsec，大约11.0μsec，大约11.2μsec，大约11.4μsec，大约11.6μsec，大约11.8μsec，大约12.0μsec，大约12.2μsec，大约12.4μsec，大约12.6μsec，大约12.8μsec，大约13.0μsec，大约13.2μsec，大约13.4μsec，大约13.6μsec，大约13.8μsec，大约14.0μsec，大约14.2μsec，大约14.4μsec，大约14.6μsec，大约14.8μsec，大约15.0μsec，大约15.2μsec，大约15.4μsec，大约15.6μsec，大约15.8μsec，大约16.0μsec，大约16.2μsec，大约16.4μsec，大约16.6μsec，大约16.8μsec，大约17.0μsec，大约17.2μsec，大约17.4μsec，大约17.6μsec，大约17.8μsec，大约18.0μsec，大约18.2μsec，大约18.4μsec，大约18.6μsec，大约18.8μsec，大约19.0μsec，大约19.2μsec，大约19.4μsec，大约19.6μsec，大约19.8μsec，大约20.0μsec，大约20.2μsec，大约20.4μsec，大约20.6μsec，大约20.8μsec，大约21.0μsec，大约21.2μsec，大约21.4μsec，大约21.6μsec，大约21.8μsec，大约22.0μsec，大约22.2μsec，大约22.4μsec，大约22.6μsec，大约22.8μsec，大约23.0μsec，大约23.2μsec，大约23.4μsec，大约23.6μsec，大约23.8μsec，大约24.0μsec，大约24.2μsec，大约24.4μsec，大约24.6μsec，大约24.8μsec，大约25.0μsec，大约25.2μsec，大约25.4μsec，大约25.6μsec，大约25.8μsec，大约26.0μsec，大约26.2μsec，大约26.4μsec，大约26.8μsec，大约27.0μsec，大约27.2μsec或者大约27.4μsec。在其他实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的1/K_cat在大约0.3μsec到大约32μsec之间，或者根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的1/K_cat在大约1到30，或者大约5到25，或者大约10到20，或者大约15μsec。

在一个实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat/K_m在大约5,140mM^-1sec^-1到大约508,814mM^-1sec^-1之间。在另一个实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat/K_m在大约0.50mM^-1sec^-1到大约7.75mM^-1sec^-1之间。在另一个实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat/K_m在大约0.75mM^-1sec^-1到大约7.00mM^-1sec^-1之间。在依旧另一个实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat/K_m在大约1.00mM^-1sec^-1到大约6.00mM^-1sec^-1之间。在依旧另一个实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat/K_m是大约0.10mM^-1sec^-1，大约0.20mM^-1sec^-1，大约0.30mM^-1sec^-1，大约0.40mM^-1sec^-1，大约0.50mM^-1sec^-1，大约0.60mM^-1sec^-1，大约0.70mM^-1sec^-1，大约0.80mM^{- 1}sec^-1，大约0.90mM^-1sec^-1，大约1.00mM^-1sec^-1，大约1.10mM^-1sec^-1，大约1.20mM^-1sec^-1，大约1.30mM^-1sec^-1，大约1.40mM^-1sec^-1，大约1.50mM^-1sec^-1，大约1.60mM^-1sec^-1，大约1.70mM^{- 1}sec^-1，大约1.80mM^-1sec^-1，大约1.90mM^-1sec^-1，大约2.00mM^-1sec^-1，大约2.10mM^-1sec^-1，大约2.20mM^-1sec^-1，大约2.30mM^-1sec^-1，大约2.40mM^-1sec^-1，大约2.50mM^-1sec^-1，大约2.60mM^{- 1}sec^-1，大约2.70mM^-1sec^-1，大约2.80mM^-1sec^-1，大约2.90mM^-1sec^-1，大约3.00mM^-1sec^-1，大约3.10mM^-1sec^-1，大约3.20mM^-1sec^-1，大约3.30mM^-1sec^-1，大约3.40mM^-1sec^-1，大约3.50mM^{- 1}sec^-1，大约3.60mM^-1sec^-1，大约3.70mM^-1sec^-1，大约3.80mM^-1sec^-1，大约3.90mM^-1sec^-1，大约4.00mM^-1sec^-1，大约4.10mM^-1sec^-1，大约4.20mM^-1sec^-1，大约4.30mM^-1sec^-1，大约4.40mM^{- 1}sec^-1，大约4.50mM^-1sec^-1，大约4.60mM^-1sec^-1，大约4.70mM^-1sec^-1，大约4.80mM^-1sec^-1，大约4.90mM^-1sec^-1，大约5.00mM^-1sec^-1，大约5.10mM^-1sec^-1，大约5.20mM^-1sec^-1，大约5.30mM^{- 1}sec^-1，大约5.40mM^-1sec^-1，大约5.50mM^-1sec^-1，大约5.60mM^-1sec^-1，大约5.70mM^-1sec^-1，大约5.80mM^-1sec^-1，大约5.90mM^-1sec^-1，大约6.00mM^-1sec^-1，大约6.10mM^-1sec^-1，大约6.20mM^{- 1}sec^-1，大约6.30mM^-1sec^-1，大约6.40mM^-1sec^-1，大约6.50mM^-1sec^-1，大约6.60mM^-1sec^-1，大约6.70mM^-1sec^-1，大约6.80mM^-1sec^-1，大约6.90mM^-1sec^-1，大约7.00mM^-1sec^-1，大约7.10mM^{- 1}sec^-1，大约7.20mM^-1sec^-1，大约7.30mM^-1sec^-1，或者大约7.40mM^-1sec^-1。在其他实施方案中，根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat/K_m在大约0.0048mM^-1sec^-1到大约0.47mM^-1sec^-1之间，或者根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat/K_m在大约0.009到大约0.3，或者大约0.01到大约0.25，或者大约0.1到大约0.25mM^-1sec^-1之间。

在一个实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat/K_m在大约60mM^{- 1}sec^-1到大约6000mM^-1sec^-1之间。在另一个实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat/K_m在大约30,000mM^-1sec^-1到大约85,000mM^-1sec^-1之间。在另一个实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat/K_m在大约36,000mM^-1sec^-1到大约77,000mM^-1sec^-1之间。在依旧另一个实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat/K_m在大约40,000mM^-1sec^-1到大约70,000mM^-1sec^-1之间。在依旧另一个实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat/K_m是大约40,000mM^-1sec^-1，大约42,000mM^-1sec^-1，大约44,000mM^-1sec^-1，大约46,000mM^-1sec^-1，大约48,000mM^-1sec^-1，大约50,000mM^-1sec^-1，大约52,000mM^-1sec^-1，大约54,000mM^-1sec^-1，大约56,000mM^-1sec^-1，大约58,000mM^-1sec^-1，大约60,000mM^-1sec^-1，大约62,000mM^-1sec^-1，大约64,000mM^-1sec^-1，大约66,000mM^-1sec^-1，大约68,000mM^-1sec^-1，大约70,000mM^-1sec^-1，大约72,000mM^-1sec^-1，大约74,000mM^-1sec^-1，大约76,000mM^-1sec^-1，大约78,000mM^-1sec^-1，大约80,000mM^-1sec^-1，大约82,000mM^-1sec^-1，大约84,000mM^-1sec^-1，大约86,000mM^-1sec^-1，大约88,000mM^-1sec^-1，大约90,000mM^-1sec^-1，大约92,000mM^-1sec^-1，大约94,000mM^-1sec^-1，或者大约96,000mM^-1sec^-1。在其他实施方案中，根据GPA实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat/K_m在大约900mM^-1sec^-1到大约90,000mM^-1sec^-1之间，或者根据SRC实验的测定结果，所述胶原酶的K_cat/K_m在大约2,000到大约80,000，或者大约10,000到大约70,000，或者大约20,000到大约60,000mM^-1sec^-1，或者大约30,000到50,000，或者大约40,000到45,000mM^-1sec^-1之间。

在一个实施方案中，所述胶原酶的分子量在大约60kDa到大约130kDa之间。在其他实施方案中，所述胶原酶的分子量在大约70kDa到大约130kDa之间。在其他实施方案中，所述胶原酶的分子量在大约80kDa到大约120kDa之间。在依旧另一个实施方案中，所述胶原酶的分子量在大约90kDa到大约120kDa之间。在其他实施方案中，所述胶原酶的分子量在大约100kDa到大约110kDa之间。在依旧另一个实施方案中，所述胶原酶的分子量是大约55kDa，大约57kDa，大约60kDa，大约62kDa，大约65kDa，大约67kDa，大约70kDa，大约72kDa，大约75kDa，大约77kDa，大约80kDa，大约82kDa，大约85kDa，大约87kDa，大约90kDa，大约92kDa，大约95kDa，大约97kDa，大约100kDa，大约102kDa，大约105kDa，大约107kDa，大约110kDa，大约112kDa，大约115kDa，大约117kDa，大约120kDa，大约122kDa，大约125kDa，大约127kDa，大约130kDa，大约132kDa，大约135kDa，或者大约137kDa。

在一个实施方案中，通过反向HPLC测定的所述胶原酶的纯度为至少80％。在其他实施方案中，通过反向HPLC测定的所述胶原酶的纯度为至少大约80％，大约81％，大约82％，大约83％，大约84％，大约85％，大约86％，大约87％，大约88％，大约89％，大约90％，大约91％，大约92％，大约93％，大约94％，大约95％，大约96％，大约97％，大约98％，或者大约99％。在依旧另一个实施方案中，所述胶原酶可以包括按面积计少于或者等于1％的梭菌蛋白酶。在其他实施方案中，所述胶原酶还包括按面积计少于或者等于1％的白明胶酶。在其他实施方案中，所述胶原酶还可以包括按面积即小于或者等于1％的亮抑蛋白酶肽。在依旧另一个实施方案中，所述胶原酶包括少于或者等于1cfu/mL生物污染物。

在一个实施方案中，所述胶原酶的效价(即，比活性)在大约500到大约30,000SRC单位/mg。在其他实施方案中，所述胶原酶的效价在大约2,500到大约25,000SRC单位/mg之间。在其他实施方案中，所述胶原酶的效价在大约5,000到大约20,000SRC单位/mg之间。在依旧另一个实施方案中，所述胶原酶的效价是大约500，大约1,000，大约1,500，大约2,000，大约2,500，大约3,000，大约3,500，大约4,000，大约4,500，大约5,000，大约5,500，大约6,000，大约6,500，大约7,000，大约7,500，大约8,000，大约8,500，大约9,000，大约9,500，大约10,000，大约10,500，大约11,000，大约11,500，大约12,000，大约12,500，大约13,000，大约13,500，大约14,000，大约14,500，大约15,000，大约15,500，大约16,000，大约16,500，大约17,000，大约17,500，大约18,000，大约18,500，大约19,000，大约19,500，大约20,000，大约20,500，大约21,000，大约21,500，大约22,000，大约22,500，大约23,000，大约23,500，大约24,000，大约24,500，大约25,000，大约25,500，大约26,000，大约26,500，大约27,000，大约27,500，大约28,000，大约28,500，大约29,000，大约29,500或者大约30,000SRC单位/mg。

在一个实施方案中，所述胶原酶的效价(即，比活性)在大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg之间。在其他实施方案中，所述胶原酶的效价在大约7,500到大约25,000f-SRC单位/mg之间。在其他实施方案中，所述胶原酶的效价在大约10,000到大约20,000f-SRC单位/mg之间.在依旧另一个实施方案中，胶原酶的效价是大约2,500，大约3,000，大约3,500，大约4,000，大约4,500，大约5,000，大约5,500，大约6,000，大约6,500，大约7,000，大约7,500，大约8,000，大约8,500，大约9,000，大约9,500，大约10,000，大约10,500，大约11,000，大约11,500，大约12,000，大约12,500，大约13,000，大约13,500，大约14,000，大约14,500，大约15,000，大约15,500，大约16,000，大约16,500，大约17,000，大约17,500，大约18,000，大约18,500，大约19,000，大约19,500，大约20,000，大约20,500，大约21,000，大约21,500，大约22,000，大约22,500，大约23,000，大约23,500，大约24,000，大约24,500，大约25,000，大约25,500，大约26,000，大约26,500，大约27,000，大约27,500，大约28,000，大约28,500，大约29,000，大约29,500，或者大约30,000f-SRC单位/mg。

在一个实施方案中，所述胶原酶的效价(即，比活性)在大约100,000到大约400,000GPA单位/mg之间。在其他实施方案中，所述胶原酶的效价在大约150,000到大约350,000GPA单位/mg之间。在其他实施方案中，所述胶原酶的效价在大约200,000到大约300,000GPA单位/mg之间。在依旧另一个实施方案中，所述胶原酶的效价是大约100,000，大约110,000，大约120,000，大约130,000，大约140,000，大约150,000，大约160,000，大约170,000，大约180,000，大约190,000，大约200,000，大约210,000，大约220,000，大约230,000，大约240,000，大约250,000，大约260,000，大约270,000，大约280,000，大约290,000，大约300,000，大约310,000，大约320,000，大约330,000，大约340,000，大约350,000，大约360,000，大约370,000，大约380,000，大约390,000或者大约400,000GPA单位/mg。

在一个实施方案中，所述胶原酶的效价在大约175,000到大约500,000f-GPA单位/mg之间。在其他实施方案中，所述胶原酶的效价在大约250,000到大约450,000f-GPA单位/mg之间。在其他实施方案中，所述胶原酶的效价在大约300,000到大约400,000GPA单位/mg之间。在依旧另一个实施方案中，所述胶原酶的效价是大约175,000，大约185,000，大约195,000，大约205,000，大约215,000，大约225,000，大约235,000，大约245,000，大约255,000，大约265,000，大约275,000，大约285,000，大约295,000，大约305,000，大约315,000，大约325,000，大约335,000，大约345,000，大约355,000，大约365,000，大约375,000，大约385,000，大约395,000，大约405,000，大约415,000，大约425,000，大约435,000，大约445,000，大约455,000，大约465,000，大约475,000，大约485,000，或者大约495,000f-GPA单位/mg。

在一个实施方案中，所述胶原酶的效价在大约5,000到大约25,000ABC单位/mg之间。在一个实施方案中，所述胶原酶的效价在大约7,500到大约20,000ABC单位/mg之间。在一个实施方案中，所述胶原酶的效价在大约10,000到大约17,500ABC单位/mg之间。在其他实施方案中，所述胶原酶的效价是大约5,000，大约5,500，大约6,000，大约6,500，大约7,000，大约7,500，大约8,000，大约8,500，大约9,000，大约9,500，大约10,000，大约10,500，大约11,000，大约11,500，大约12,000，大约12,500，大约13,000，大约13,500，大约14,000，大约14,500，大约15,000，大约15,500，大约16,000，大约16,500，大约17,000，大约17,500，大约18,000，大约18,500，大约19,000，大约19,500，大约20,000，大约20,500，大约21,000，大约21,500，大约22,000，大约22,500，大约23,000，大约23,500，大约24,000，大约24,500，或者大约25,000ABC单位/mg。

在一些实施方案中，在组合物中存在的胶原酶包括胶原酶I和胶原酶II，胶原酶I和胶原酶II的比例是大约1∶1。还可以使用其他比例的胶原酶I和胶原酶II，例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1。胶原酶I和胶原酶II的每种的纯度是按面积计至少80％、或者85％、或者90％、或者91％、或者92％、或者93％、或者94％、或者95％、或者96％、或者97％、或者98％、或者99％、或者100％，如通过反向HPLC测量的。

在其他实施方案中，所述胶原酶组合物包括CCH，所述CCH包括比例大约为1∶1的AUX I和AUX II。还可以使用其他比例的AUX I和AUX II，例如0.1-2∶1、或者0.25-2∶1、或者0.5-2∶1、或者0.75-2∶1、或者1∶0.1-2、或者1∶0.25-2、或者1∶0.5-2、或者1∶0.75-2、或者1∶0、或者0∶1.每个AUX I和AUX II的纯度按面积计至少是80％、或者85％、或者90％、或者91％、或者92％、或者93％、或者94％、或者95％、或者96％、或者97％、或者98％、或者99％、或者100％，如使用反向HPLC所测量的。

在其他实施例中，所述胶原酶组合物可以是液体，或者可以从冷冻干燥形式用稀释剂重新配制。所述混合物的剂量仅以存在的胶原酶的量来测定，不涉及稀释剂，并且，在一个或者一个以上注射剂中可以包括大约0.1mg到大约20mg。在其他实施方案中，施用的剂量是在单一注射剂或者多个注射剂中含大约0.06mg，0.48mg，0.84mg，1.68mg，2.52mg，3.36mg，4.2mg，5.04mg，5.88mg，6.72mg，7.56mg，或者8.4mg。

例如，大约0.06mg，0.48mg，0.84mg，或者1.68mg被分配在大约12个注射剂中被施用。被注射的胶原酶组合物的体积可以在每注射剂0.01mL到3mL范围内，或者总治疗访问大约0.2mL到150mL。在具体的实施方案中，上述剂量是包括CCH的胶原酶组合物的剂量。在其他实施方案中，上述剂量是含有一种或者一种以上下述特征的胶原酶组合物的剂量：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1是5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量为大约60kDa到大约130kDa、或者大约70到大约130kDa、或者大约80到大约120kDa、或者大约90到大约120kDa、或者大约100到大约110kDa。

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测量，纯度为按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计，杂质的含量小于或者等于1％，并且杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担。

在其他实施方案中，在每个治疗区域，大约0.84mg的CCH被分在大约12个等分额注射剂中被注射(大约0.07mg x 12次注射＝大约0.84mg)。在一些情况下，每10-40天进行0.84mg的上述治疗，可以分2、3、4或者5次面诊进行。在其他情况下，在一次面诊时或者每10-40天在2、3、4、或者5次面诊时，对一个以上治疗区域注射0.84mg。在其他实施方案中，共有超过五次治疗访问(面诊)。

在另一方面中，在一次或多次注射中，每次治疗访问时，可注射到治疗区域的胶原酶的量约为0.001mg到20mg，可在一个注射剂中也可在多个注射剂中，例如，这些剂量被平均分成3到大约100次注射剂中。这些胶原酶是液态的，或用稀释剂从冻干固体中重组。胶原酶的剂量通过胶原酶的量来测量，而不考虑稀释剂，并且可以包括约0.1mg到1mg，或者0.25mg到0.75mg、或者0.1mg到2mg、或者0.25mg到1.75mg、或者0.5mg到1mg，0.1mg到3mg、或者0.25mg到2.75mg、或者0.5mg到2.5mg、或者0.75mg到2.25mg、或者1mg到2mg、或者0.1mg到4mg、或者0.25mg到3.75mg、或者0.5mg到3.5mg、或者0.75mg到3mg、或者1mg到3mg。在其他实施方案中，所述剂量是每个注射剂或者多个注射剂大约0.001mg，0.01mg，0.04mg，0.05mg，0.07mg，0.1mg，0.2mg，0.3mg，0.4mg，0.5mg，0.6mg，0.7mg，0.8mg，0.9mg，1mg，1.1mg，1.2mg，1.3mg，1.4mg，1.5mg，1.6mg，1.7mg，1.8mg，1.9mg，2mg，2.25mg，2.5mg，2.75mg，3mg，3.25mg，3.5mg，3.75mg，4.0mg，4.25mg，4.5mg，4.75mg，5.0mg，5.25mg，5.5mg，5.75mg，6mg，6.25mg，6.5mg，6.75mg，7mg，7.25mg，7.5mg，7.75mg，8mg，8.25mg，8.5mg，8.75mg，9mg，9.25mg，9.5mg，9.75mg，10mg，11mg，12，mg，13mg，14mg，15mg，16mg，17mg，18mg，19mg、或者20mg。

在其他实施方案中在一次或多次注射中施用的剂量约为0.06mg、0.48mg、0.84mg、1.68mg、2.52mg、3.36mg、4.2mg或5.04mg。在另一实施例中，将0.06mg、0.48mg、0.84mg、1.68mg、2.52mg、3.36mg、4.2mg或5.04mg分12次注射剂注射给治疗区域。在其他实施例中，胶原酶的剂量分为3次或更多次注射。每次注射胶原酶组合物的体积可在0.01mL到3mL之间，或每次治疗访视的总体积约为1mL到150mL。

在一个方面中，上述AUX I和II混合物(“CCH”)可在一次或多次注射中以每次治疗访视约0.01mg至10mg胶原酶的量注射，例如，所述剂量被平均分配在大约3到大约50个注射剂中。胶原酶可以是液体，或者可以用稀释剂从冻干形式中重组。所述混合物的剂量通过胶原酶的量来测量，而不考虑稀释剂，并且在一次或者一次以上的注射中可以包括约0.1mg到1mg，或者0.25mg到0.75mg，或者0.1mg到2mg，或者0.25mg到1.75mg，或者0.5mg到1mg，0.1mg到3mg，或者0.25mg到2.75mg，或者0.5mg到2.5mg，或者0.75mg到2.25mg，或者1mg到2mg，或者0.1mg到4mg，或者0.25mg到3.75mg，或者0.5mg到3.5mg，或者0.75mg到3mg，或者1mg到3mg，或者大约0.05mg，0.1mg，0.2mg，0.3mg，0.4mg，0.5mg，0.6mg，0.7mg，0.8mg，0.9mg，1mg，1.1mg，1.2mg，1.3mg，1.4mg，1.5mg，1.6mg，1.7mg，1.8mg，1.9mg，2mg，2.25mg，2.5mg，2.75mg，3mg，3.25mg，3.5mg，3.75mg，4.0mg，4.25mg，4.5mg，4.75mg，5.0mg，5.25mg，5.5mg，5.75mg，6mg，6.25mg，6.5mg，6.75mg，7mg，7.25mg，7.5mg，7.75mg，8mg，8.25mg，8.5mg，8.75mg，9mg，9.25mg，9.5mg，9.75mg或者10mg。在其他实施方案中，施用的CCH的剂量是每个注射剂或者多个注射剂中含有大约0.06mg，0.48mg，0.84mg，或者1.68mg 2.52mg，3.36mg，4.2mg，或者5.04mg。例如，大约0.06mg，0.48mg，0.84mg，或者1.68mg 2.52mg，3.36mg，4.2mg，或者5.04mg被分配到12个注射剂中被施用。被注射的胶原酶组合物的体积可以在每注射剂0.01ml到3ml范围内，或者每次医疗访视总共施用大约1ml到80ml。

胶原酶的剂量也可以以每次注射mg表示(同样不考虑稀释剂)，例如从每次注射约0.001mg到0.5mg、每次注射约0.01mg到大约5mg、或每次注射约0.005mg到大约0.1mg、或每次注射约0.005mg、0.04mg或0.07mg。

在某些方面，本发明预计每次治疗访视注射约500个ABC单位到大约50,000个ABC单位，或每次治疗访视注射约10,000个ABC单位到大约25,000个ABC单位。在其他实施方案中，每次注射胶原酶的剂量约为50ABC单位到大约2,500ABC单位，或约为85ABC单位到大约2,000ABC单位，或约为1,500ABC单位到大约1,750ABC单位，或约为200ABC单位到大约1,500ABC单位，或约为300ABC单位到1,500ABC单位，或大约300ABC单位到大约1,250ABC单位，或者约为500ABC单位到大约1,000ABC单位。

在某些实施方案中，所述剂量是以以下各种比活性为基础的：

*用SRC单位和SRC单位/mg的比活度乘以SRC单位与SRC单位/mg的比活度的倒数，计算毫克。例如，当剂量为500SRC单位且比活度为500SRC单位/mg时，相当于500SRC单位剂量的毫克量为(500SRC单位)*(1/(500SRC单位/mg))＝1.00mg

SRC单位和ABC单位/mg比活度的毫克计算方法是：SRC单位乘以6.3ABC单位/SRC单位，然后乘以ABC单位/mg比活度的倒数。例如，当剂量为500SRC单位且比活度为10000ABC单位/0.58mg时，相当于500SRC单位的毫克量为(500SRC单位)*(6.3ABC单位/SRC单位)*(1/(10000ABC单位/0.58mg))＝0.18mg。

在某些方面，本发明预计注射胶原酶的量为约5,000BTC单位到大约25,000BTC单位，或大约10,000BTC单位到大约25,000BTC单位，或大约15,000BTC单位，或约17,500BTC单位，或约20,000BTC单位，或约22,500BTC单位，或约9,175BTC单位，大约15,817个BTC单位。

5.制剂

所述CCH或者其他胶原酶可以以药物组合物的形式存在，所述药物组合物包括CCH或者胶原酶和药学上可接受的赋形剂。这些赋形剂可以包括用于注射的无菌水或者氯化钠或者氯化钙、pH调节剂和稳定剂。

一个非限制性实施例是

由申请人以一次性玻璃瓶的形式商业化提供，其中含有0.9mg CCH作为无菌冻干粉末用于重组。一次性玻璃瓶中还提供用于重组的无菌稀释剂。非活性成分包括盐酸、蔗糖和氨丁三醇。稀释剂中含有0.9％氯化钠中的二水氯化钙。

Prescribing Information(2018)。

在其他实施方案中，CCH以无菌冷冻干燥粉末的形式存在，包括0.92mg CCH、蔗糖、Tris，甘露糖和盐酸，处于5ml试管中。用于重组的无菌稀释液可以包括用于注射的水、正常盐水或者0.6％氯化钠和在水中浓度为0.03％的二水合氯化钙，用于注射，填充进单独的5ml试管中。

所述胶原酶或者CCH还可以充入其他尺寸的试管，例如，10ml、15ml、20ml或者30ml。其他pH调节剂、糖、多醇和稳定剂可以在Rowe et al.，Handbook of Pharmaceutical Excipients(5^th Ed.)中找到。

6.治疗方法：注射技术和剂量方案

上述胶原酶组合物可有效用于治疗或降低人体皮下脂肪团严重程度的方法中。本发明涉及一种降低人类患者中皮下脂肪团严重程度的方法，该方法包括：提供包含至少一种胶原酶的组合物；以及将治疗有效量的组合物注射到一个或多个凹坑中，其中，与治疗前的基线严重程度相比，患者表现出皮下脂肪团严重程度的降低。如下文进一步详述，该组合物可通过各种注射技术施用并且通过若干量表及其它测量工具来测量功效。

申请人先前已经描述了相关的治疗方法，并在此通过引用将其专利申请全部在此并入本文，所述专利申请例如PCT专利申请PCT/US2018/020551(于2018年9月7日公开，公开号为WO2018/160905)；于2018年7月12日提交的，标题为“治疗水肿性纤维硬化性泛神经病变的注射技术”的美国临时申请第62/697376号申请；于2018年9月18日提交的，标题为“四象限单剂量胶原酶治疗水肿性纤维硬化性泛神经病变的组成和方法”的美国临时申请第62/733046号申请；和于2018年3月28日提交的，标题为“胶原酶的生产方法”的美国专利申请公开号US20180327731。

本文所述胶原酶组合物的施用可以是在治疗访视期间对单个受试者的双侧(两个大腿或两个臀部)或全部4个象限(两个臀部和两个大腿)的施用。此类治疗访视可能每10-40天进行一次，为期一年的2次、3次、4次或5次治疗访视。

表15概述了胶原酶的各种注射参数和用于治疗患者的相关技术。

表15.胶原酶的各种注射参数和用于治疗患者的相关技术

表16概述了本发明所设想的注射技术和治疗的五个非限制性示例，它们对应于图7-11所示的注射技术。

下面对治疗I到V进行详细的介绍。

治疗I：胶原酶浅注射，3等分

如图7所示，在本实施例中(“治疗I”)，当受试者处于俯卧位置时，垂直于凹坑的长轴皮下注射胶原酶。每次注射包括单次皮肤注射胶原酶，分为三份0.1毫升等分(总注射量为0.3毫升)注射。在每次治疗访视期间，准备8支注射器(每个治疗区域4支注射器)进行给药。每支注射器含有0.9毫升胶原酶组合物(每支注射器注射3次)。每个受试者的剂量可能不同，每个治疗区域的总剂量约为0.5毫克到大约5mg胶原酶。

更具体的，进行如下步骤：

·如果凹坑是一个细长的槽状凹坑(位置a)，将针头垂直于皮肤表面并垂直于凹坑的长轴，则将针头一直推入(1/2英寸)，并通过轻轻推动注射器柱塞注射0.1毫升胶原酶组合物。在大多数情况下，包含注射点A、B和C的平面将平行于受试者身体的长轴。

·轻轻抽出针头，并将其重新定位，使其与皮肤表面成约45°的角度，朝向受试者头部(位置B)，将针头完全推入，并通过轻轻推动注射器柱塞注射0.1mL胶原酶组合物。位置B最好朝向被受试者的头部。

·轻轻抽出针头，并将其重新定位，使其与皮肤表面成约45°的角度，朝向受试者的脚部(位置C)，将针头完全推入，并通过轻轻推动注射器柱塞注射0.1mL胶原酶组合物。位置B最好朝向被受试者的脚部。

·从注射位点完全抽出针头并移动至下一个注射位点。

·含有0.9ml胶原酶组合物的注射器足以进行三个注射位点注射。

·在每个治疗部位(每个臀部或每个大腿)使用四(4)个0.9ml注射器，在12个注射部位共注射12次0.3ml(3等份，每份0.1ml)。

·每次治疗访视时，在两个治疗区域(2个臀部或者2个大腿)总共进行24次注射。

治疗II：胶原酶浅注射，1等份

如图8所示，在本实施例中(“治疗II”)，当受试者处于俯卧位置时，使用胶原酶进行皮下注射。每次注射包括胶原酶的单次皮肤注射，即0.3毫升等份的单次浅注射。在每次治疗访视期间，准备8支注射器(每个治疗区域4支注射器)进行给药。每支注射器含有0.9毫升胶原酶(每支注射器注射3次)。每个受试者的剂量在每个治疗区域的胶原酶总剂量约为0.5毫克到5毫克。

在每次治疗访视期间，准备8支注射器(每个治疗区域4支注射器)进行给药。每支注射器含有0.9毫升胶原酶组合物(每支注射器注射3次)。更具体地说，遵循以下程序：

·定位针头，使其在注射位点与皮肤表面成约30°的角度，朝向受试者头部，将针头一直推入(1/2英寸)，并通过轻轻推动注射器柱塞注射0.3mL胶原酶组合物。

·从注射位点完全抽出针头并移动到下一个注射位点。

·含有0.9ml胶原酶组合物的注射器足以进行三个注射位点注射。

·在每个治疗部位(每个臀部或每个大腿)使用四(4)个0.9ml注射器，在12个注射部位共注射12次0.3ml(3等份，每份0.1ml)。

·每次治疗访视时，在两个治疗区域(2个臀部或者2个大腿)总共进行24次注射。

治疗III：胶原酶深注射，1等分

如图9所示，在本实施例中(“治疗III”)，当受试者处于俯卧位置时，使用胶原酶进行皮下注射。每次注射包括胶原酶的单次皮肤注射，即0.3毫升等份的单次深注射。在每次治疗访视期间，准备8支注射器(每个治疗区域4支注射器)进行给药。每支注射器含有0.9毫升胶原酶(每支注射器注射3次)。每个受试者的剂量在每个治疗区域的胶原酶总剂量约为0.5毫克到5毫克。

更具体地说，遵循以下程序：

·定位针头，使其在注射位点与皮肤表面成约30°的角度，朝向受试者头部，将针头一直推入(1英寸)，并通过轻轻推动注射器柱塞注射0.3mL胶原酶组合物。

·定位针头，使其在注射位点与皮肤表面成约30°的角度，朝向受试者头部，将针头一直推入(1英寸)，并通过轻轻推动注射器柱塞注射0.3mL胶原酶组合物。

·含有0.9ml胶原酶组合物的注射器足以进行三个注射位点注射。

·在每个治疗部位(每个臀部或每个大腿)使用四(4)个0.9ml注射器，在12个注射部位共注射12次0.3ml(3等份，每份0.1ml)。

·丢弃使用后的针头和注射器。

·每次治疗访视时，在两个治疗区域(2个臀部或者2个大腿)总共进行24次注射。

治疗IV：胶原酶深和浅注射，5等分

如图10所示，在治疗IV中，当受试者处于俯卧位置时，使用胶原酶进行皮下注射。每次注射包括胶原酶的单次皮肤注射，每次注射0.3毫升等份进行五次(总注射体积为1.5mL)。在每次治疗访视期间，准备24支注射器(每个治疗区域12支注射器)进行给药。每支注射器含有1.5毫升胶原酶(每支注射器每次注射0.3mL，注射5次)。每个受试者的剂量在每个治疗区域的胶原酶总剂量在约0.5毫克到5毫克范围内。

在每次治疗访视期间，准备24支注射器(每个治疗区域12支注射器)进行给药。每支注射器含有1.5毫升胶原酶(每支注射器每次注射0.3mL，注射5次)。更具体的，遵循以下程序：

·定位针头，使其在注射位点与皮肤表面成约30°的角度，朝向受试者头部，将针头一直推入(1英寸)，并通过轻轻推动注射器柱塞注射0.3mL胶原酶组合物。

·轻轻地将针头抽出(1/2英寸)，并维持与皮肤表面成约30°的角度，朝向受试者头部(位置B)重新定位。并通过轻轻推动注射器柱塞注射0.3mL胶原酶组合物。

·维持针头与皮肤表面成约30°的角度，在位置A和位置B之间的中间位置(位置C，朝向受试者肩膀)重新定位针头并通过轻轻推动注射器柱塞注射0.3mL胶原酶组合物。

·维持针头与皮肤表面成约30°的角度，在位置B的对面(位置D)重新精确定位针头并通过轻轻推动注射器柱塞注射0.3mL胶原酶组合物。

·维持针头与皮肤表面成约30°的角度，在位置A和位置D之间的中间位置(位置E，朝向受试者肩膀)重新定位针头并通过轻轻推动注射器柱塞注射0.3mL胶原酶组合物。

·含有1.5mL胶原酶组合物的3ml注射器足够进行一个注射位点的注射。

·在每个治疗部位(每个臀部或每个大腿)使用十二(12)个3ml注射器，在12个注射部位共注射12次1.5ml(5等份，每份0.3ml，总剂量18mL)。

·每次治疗访视时，在两个治疗区域(2个臀部或者2个大腿)总共进行24次注射。

治疗V：胶原酶浅注射，4等分

如图11所示，在本实施例中(“治疗V”)，当受试者处于俯卧位置时，使用胶原酶进行皮下注射。每次注射包括胶原酶的单次皮肤注射，即0.3毫升等份的四次深注射(总注射体积为1.2mL)。在每次治疗访视期间，准备24支注射器(每个治疗区域12支注射器)进行给药。每支注射器含有1.2毫升胶原酶(4等分每分0.3mL)。每个受试者的剂量在每个治疗区域的胶原酶总剂量约为0.5毫克到大约5毫克。

在每次治疗访视期间，准备24支注射器(每个治疗区域12支注射器)进行给药。每支注射器含有1.2毫升胶原酶组合物(4等分每分0.3mL)。更具体的，遵循以下程序：

·定位针头，使其在注射位点与皮肤表面成约30°的角度，朝向受试者一侧，将针头一直推入(1/2英寸)，并通过轻轻推动注射器柱塞注射0.3mL胶原酶组合物。

·维持针头与皮肤表面成约30°的角度，在位置A重新定位针头使其与位置A成大约60°角并朝向患者的肩膀(位置B)，通过轻轻推动注射器柱塞注射0.3mL胶原酶组合物。

·维持针头与皮肤表面成约30°的角度，重新定位针头使其与位置B成大约60°角并朝向患者的另一个肩膀(位置C)，通过轻轻推动注射器柱塞注射0.3mL胶原酶组合物。

·维持针头与皮肤表面成约30°的角度，在位置A重新定位针头并朝向受试者的另一侧(位置D)，通过轻轻推动注射器柱塞注射0.3mL胶原酶组合物。

·含有1.2mL胶原酶组合物的3ml注射器足够进行一个注射位点的注射。

·在每个治疗部位(每个臀部或每个大腿)使用十二(12)个3ml注射器(每个含有1.2mL胶原酶组合物)，在12个注射部位共注射12次1.2ml(4等份，每份0.3ml，总剂量14.4mL)。

·在两个治疗区域(2个臀部或者2个大腿)总共进行24次注射。

在进一步的实施方案中，所述胶原酶被注射进入如图12所述的受影响的区域。注射间隔在大约0.1cm到大约15cm、或者大约1cm到大约10cm、或者大约0.5cm到大约2cm的范围内变化。如图12所示，每次注射剂被分成三个0.1ml的等分(每次注射0.3ml)被使用。用垂直于皮肤表面的针头给药第一等分。对于第二份和第三份等分样品，将针头稍微抽出，并朝向垂直轴左侧约45°和右侧约45°的角度定位。

如图7-11所示的治疗I到V和图12所示的注射技术可以使用不同的剂量、注射角度、体积、注射器数目、注射深度和其他参数，如表15和16中的详细介绍。所有这种变化都被包括在本发明范围内。

在另一个实施例中，将约0.84mg的CCH分成12等分注射剂注射到受影响区域，例如象限(即，右臀或左臀或右大腿或左大腿)(约0.07mg x 12次注射＝约0.84mg CCH)。在某些情况下，每10-40天进行一次0.84毫克的治疗，进行2次、3次、4次或5次治疗。在其他情况下，每10-40天向一个以上的受影响区域或象限注射0.84毫克，进行2、3、4或5次治疗。

在某些实施方案中，如表17所示，患者被施用胶原酶。

表17.胶原酶剂量和体积

^a每次胶原酶注射0.3mL，分成三个等分施用每等分0.1mL。

进一步的，在某些实施方案中，治疗受试者的参数提供在表18和19中。

表18.CCH冷冻干燥制剂参数

表19.CCH稀释参数

在一个实施方案中，重组产品的渗透压是大约50到大约1,000，大约100到大约900，大约200到大约800，大约300到大约700，大约400到大约600，大约50，大约100，大约150，大约200，大约250，大约300，大约350，大约400，大约450，大约500，大约550，大约600，大约650，大约700，大约750，大约800，大约850，大约900，大约950，或者大约1,000mOsm/kg。在依旧另一个实施方案中，重组产品的渗透压是大约512mOsm/kg，大约275mOsm/kg，大约281mOsm/kg，或者大约227mOsm/kg。

除上述方法外，本发明还提供了一种治疗或减少需要的受试者中EFP的方法，其中该方法与EFP的常规程序和治疗相比具有以下至少一个优点：

a.医生容易施用；

b.治疗时间较短；

c.意料之外的疗效，考虑到医生普遍认为审美条件的改善是很难获得的；

d.不需要施用透明质酸酶；

e.不需要加热；

f.不需要施用激光；

g.无分割；

h.不需要麻醉(尽管有瘀伤)；

i.不需要穿紧身衣；以及

j.不使用真空。

在其他实施方案中，治疗或者降低皮下脂肪团的方法对待治疗的皮下脂肪团的严重性没有要求，即，例如，胶原酶治疗是安全和有效的，无论脂肪团的流行程度或严重程度如何。

F.阶段4-治疗结束和疗效测定

本文所述的治疗方法通过下文所述的多种措施有效地治疗皮下脂肪团。如本文所用，“天”是指研究日；因此，例如，第22天是第一次注射后的21天，等等。此外，在一个实施例中，“天”是+/-7天。

1.CR-PCSS和PR-PCSS测定的功效

各个患者在任何就诊时的改善是指与基线或任何先前得分或评级相比至少提高1个水平或1级。一组患者在任何一次就诊时的平均得分或评分比基线检查或任何先前的平均得分或评分提高约0.1。应答者是指从基线检查结果看，最大总分或评分至少提高25％的患者。在某些实施方案中，通过CR-PCSS和/或PR-PCSS测量确定，以上详细描述的治疗方法产生以下一个或多个疗效终点：

1.与基线相比，在CR-PCSS和/或PR-PCSS评分中分数至少提高0.1。

2.由目标大腿的临床医生现场评估，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，CR-PCSS的严重程度至少有2级改善。

3.由受试者观察目标大腿的数字图像评估，从基线(第一天)开始第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，PR-PCSS的严重程度至少由2级改善。

4.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天通过2级复合反应证明的改善，被定义为受试者在CR-PCSS中比基线时的严重程度至少改善2级，在PR-PCSS中比基线时的严重程度至少改善2级.

5.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天，由目标大腿的临床医生现场评估CR-PCSS中皮下脂肪团的严重程度与基线相比至少有1级改善。

6.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天，由受试者观察目标大腿的数字图像评估PR-PCSS中皮下脂肪团的严重程度与基线相比至少有1级改善。

7.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或730天，通过1级综合反应所证明的改善，定义为受试者在CR-PCSS中与基线相比严重程度至少改善1级，PR-PCSS中与基线相比严重程度至少改善1级。

8.在所有CR-PCSS评分均为中度或重度的患者群体中，与安慰剂相比，至少一个治疗区域的改善在统计学上具有显著性，其中，所述改善为上述1到7中的一个或多个。

9.该治疗使至少5％的患者在初始剂量后71天内保持了与治疗前基线相比的改善水平。在某些情况下，至少有10％、或20％、或30％、或40％、或50％的患者在初次给药后至少6个月、或者9个月、或者12个月、或18个月、或2年或3年、或4年、或5年内保持这种水平。在其他情况下，治疗至少有5％的患者表现出与治疗前基线相比的改善，并且随着时间的推移表现出更多的改善。一些治疗导致至少10％，或20％，或30％，或40％或50％的患者在首次给药后1个月，或3个月，或6个月，或9个月，或12个月，或18个月，或24个月表现出改善，并伴有更多的改善。

10.第180天在CR-PCSS中观察到的相对于基线的改善在左侧和右侧大腿上是一致的。

11.在所有CR-PCSS评分均为中度或重度的患者群体中，至少一个治疗区域最早出现2级CR-PCSS和/或PR-PCSS改善的中位时间约为50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

12.在所有CR-PCSS评分为中度或重度的患者群体中，至少一个治疗区域中最早出现1级CR-PCSS和/或PR-PCSS改善的中位时间约为15天，或20天，或30天，或40天，或50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

13.在所有CR-PCSS评分均为中度或重度的患者群体中，受试者CR-PCSS和/或PR-PCSS的平均得分在第一次治疗21天后与安慰剂分离，并在随后的治疗后显示出持续和显著的改善。

14.在所有CR-PCSS评分均为中度或重度的患者群体中，在第71天至少一个治疗区域通过CR-PCSS和/或PR-PCSS测量具有2级复合反应的受试者百分比约为1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％或大于50％。

15.在所有CR-PCSS评分均为中度或重度的患者群体中，在第71天至少在一个治疗区域通过CR-PCSS和/或PR-PCSS测量的实现1级复合反应的受试者所占百分比约为1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％或大于50％。

16.在所有CR-PCSS评分为中度或重度的患者群体中，超过三分之一、二分之一、三分之二或四分之三的患者在治疗后第71天，至少有一个治疗区域的CR-PCSS和/或PR-PCSS反应至少为1级，其中CR-PCSS结果与年龄，BMI或肤色无关。

17.皮下脂肪团的严重程度在首次治疗后7天、14天、21天、30天、35天、40天、45天或50天内迅速减轻。

在其他实施方案中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射约1mg到大约20mg胶原酶产生上述第1至17号结果中的一个或多个，其中胶原酶具有以下一个或多个特征：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到17中的一个或者一个以上。

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到17中的一个或者一个以上，其中，所述胶原酶具有以下特征中的一个或者一个以上：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(see^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在另一个实施例中，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到17中的一个或者一个以上。

在某些实施方案中，在至少一次治疗访视中，大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的胶原酶I和胶原酶II被注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到17中的一个或者一个以上，其中所述胶原酶I和胶原酶II具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)，进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

在某些实施方案中，在至少一次治疗访视中，大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的胶原酶I和胶原酶II被注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到17中的一个或者一个以上，其中所述胶原酶I和胶原酶II具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)，进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

在其他实施方案中，响应于上述治疗，受试者是2级CR-PCSS应答者，是指其在评估时间点显示CR-PCSS评级比基线至少提高2级(改变-2、-3或-4)。1级CR-PCSS应答者是指受试者在评估时间点CR-PCSS评分较基线至少提高1级(变化为-1、-2、-3或-4)。受试者是2级PR-PCSS应答者，是指受试者在评估时间点PR-PCSS评分比基线至少提高2级(变化为-2、-3或-4)。1级PR-PCSS应答者是指在评估时间点，受试者PR-PCSS评分比基线至少提高1级(变化为-1、-2、-3或-4)。在其它方面，2级复合应答者是指所述受试者在评估时间点既是2级PR-PCSS应答者又是2级CR-PCSS应答者。1级复合应答者是指在评估时间点所述受试者既是1级PR-PCSS应答者又是1级CR-PCSS应答者。

2.通过Hexsel皮下脂肪团严重程度量表(Hexsel CSS)测量疗效

在Hexsel CSS中，个体患者在任何就诊时的改善是指相对于基线或任何先前得分至少提高1个水平或1级。一组患者在任何就诊时的改善都是从基线或任何先前的HexselCSS平均得分或评级改善约0.1。应答者是指从基线检查结果看，最大总分或评分至少提高25％的患者。在某些实施方案中，以上详述的治疗方法产生通过Hexsel CSS测量的一个或多个以下疗效终点：

1.在所有具有基线第1天Hexsel CSS评分的患者群体中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射胶原酶导致在统计学上显著数量的此类患者满足以下一个或多个疗效终点：

·从严重转为中度(评分从11-15变为6-10)

·从严重转为轻度(评分从11-15变为1-5)

·从严重转为零(评分从11-15变为0)

·从中度转为轻度(评分从6-10变为1-5)

·从中度转为零(评分从6-10变为0)

·从轻度转为零(评分从1-5变为0)

2.由目标大腿的临床医生现场评估，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，Hexsel CSS的严重程度至少有2级改善。

3.由受试者观察目标大腿的数字图像评估，从基线(第一天)开始第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，Hexsel CSS的严重程度至少有2级改善。

4.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天通过2级复合反应证明的改善，被定义为由临床医生评估受试者在Hexsel CSS中比基线时的严重程度至少改善2级，由受试者评估比基线时的严重程度至少改善2级。

5.从基线(第一天)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天，由目标大腿的临床医生现场评估Hexsel CSS中皮下脂肪团的严重程度与基线相比至少有1级改善。

6.从基线(第一天)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天，由受试者观察目标大腿的数字图像评估Hexsel CSS中皮下脂肪团的严重程度与基线相比至少有1级改善。

7.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天通过1级复合反应证明的改善，被定义为由临床医生评估受试者在Hexsel CSS中比基线时的严重程度至少改善1级，由受试者评估比基线时的严重程度至少改善1级。

8.在所有Hexsel CSS评分均为中度或重度的患者群体中，与安慰剂相比，至少一个治疗区域的改善在统计学上具有显著性，其中，所述改善为上述2到7中的一个或多个。

9.该治疗使至少5％的患者在初始剂量后71天内保持了与治疗前基线相比的改善水平。在某些情况下，至少有10％、或20％、或30％、或40％、或50％的患者在初次给药后至少6个月、或者9个月、或者12个月、或18个月、或2年或3年、或4年、或5年内保持这种水平。在其他情况下，治疗至少有5％的患者表现出与治疗前基线相比的改善，并且随着时间的推移表现出更多的改善。一些治疗导致至少10％，或20％，或30％，或40％或50％的患者在首次给药后1个月，或3个月，或6个月，或9个月，或12个月，或18个月，或24个月表现出改善，并伴有更多的改善。

10.第180天在Hexsel CSS中观察到的相对于基线的改善在左侧和右侧大腿上是一致的。

11.在所有Hexsel CSS评分均为中度或重度的患者群体中，至少一个治疗区域最早出现2级Hexsel CSS改善的中位时间约为50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

12.在所有Hexsel CSS评分为中度或重度的患者群体中，至少一个治疗区域中最早出现1级Hexsel CSS改善的中位时间约为15天，或20天，或30天，或40天，或50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

13.在所有Hexsel CSS评分均为中度或重度的患者群体中，受试者Hexsel CSS的平均得分在第一次治疗21天后与安慰剂分离，并在随后的治疗后显示出持续和显著的改善。

14.在所有Hexsel CSS评分均为中度或重度的患者群体中，在第71天至少一个治疗区域通过Hexsel CSS测量具有2级复合反应的受试者所占百分比约为1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％或大于50％。

15.在所有Hexsel CSS评分均为中度或重度的患者群体中，在第71天至少在一个治疗区域通过Hexsel CSS测量的实现1级复合反应的受试者所占百分比约为1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％或大于50％。

16.在所有Hexsel CSS评分为中度或重度的患者群体中，超过三分之一、二分之一、三分之二或四分之三的患者在治疗后第71天，至少有一个治疗区域的Hexsel CSS反应至少为1级，其中Hexsel CSS结果与年龄，BMI或肤色无关。

17.皮下脂肪团的严重程度在首次治疗后7天、14天、21天、30天、35天、40天、45天或50天内迅速减轻。

在其他实施方案中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射约1mg到大约20mg胶原酶产生上述第1至17号结果中的一个或多个，其中胶原酶具有以下一个或多个特征：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到17中的一个或者一个以上。

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到17中的一个或者一个以上，其中，所述胶原酶具有以下特征中的一个或者一个以上：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在另一个实施例中，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到17中的一个或者一个以上。

在某些实施方案中，在至少一次治疗访视中，大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶被注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到17中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)，进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

在某些实施方案中，在至少一次治疗访视中，大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶被注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到17中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)，进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

3.Hexsel凹陷深度评分测定的疗效

在Hexsel凹陷深度评分中，个体患者在任何就诊时的改善是相对于基线或任何先前评分至少提高1个水平或1级。一组患者在任何一次就诊时的改善是，平均Hexsel凹陷深度得分或评分比基线或任何先前的平均Hexsel凹陷深度得分或评分提高约0.1。应答者是指从基线检查结果看，最大总分或评分至少提高25％的患者。在某些实施方案中，以上详述的治疗方法产生通过Hexsel凹陷深度评分测量的以下一个或多个疗效终点：

1.在所有具有基线检查第1天Hexsel凹陷深度评分的患者群体中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射胶原酶导致统计显著患者数目需符合以下一个或多个疗效终点：

·从深度凹陷(3)改为中度凹陷(2)

·从深度凹陷(3)改为浅凹陷(1)

·从深度凹陷(3)改为不凹陷(0)

·从中度凹陷(2)改为浅凹陷(1)

·从中度凹陷(2)改为不凹陷(0)

·从浅凹陷(1)改为不凹陷(0)

2.由目标大腿的临床医生现场评估，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天，Hexsel凹陷深度评分的严重程度至少有2级改善。

3.由受试者观察目标大腿的数字图像评估，从基线(第一天)开始第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，Hexsel凹陷深度评分的严重程度至少有2级改善。

4.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天通过2级复合反应证明的改善，被定义为由临床医生评估受试者在Hexsel凹陷深度评分中比基线时的严重程度至少改善2级，由受试者评估在Hexsel凹陷深度评分中比基线时的严重程度至少改善2级。

5.从基线(第一天)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天，由受试者观察目标大腿的数字图像评估Hexsel凹陷深度评分中皮下脂肪团的严重程度与基线相比至少有1级改善。

6.从基线(第一天)开始在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天，由受试者观察目标大腿的数字图像评估Hexsel凹陷深度评分中皮下脂肪团的严重程度与基线相比至少有1级改善。

7.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天通过1级复合反应证明的改善，被定义为由临床医生评估受试者在Hexsel凹陷深度评分中比基线时的严重程度至少改善1级，由受试者评估在Hexsel凹陷深度评分中比基线时的严重程度至少改善1级。

8.在所有Hexsel CSS评分均为中度或重度的患者群体中，与安慰剂相比，至少一个治疗区域的改善在统计学上具有显著性，其中，所述改善为上述2到7中的一个或多个。

9.该治疗使至少5％的患者在初始剂量后71天内保持了与治疗前基线相比的改善水平。在某些情况下，至少有10％、或20％、或30％、或40％、或50％的患者在初次给药后至少6个月、或者9个月、或者12个月、或18个月、或2年或3年、或4年、或5年内保持这种水平。在其他情况下，治疗至少有5％的患者表现出与治疗前基线相比的改善，并且随着时间的推移表现出更多的改善。一些治疗导致至少10％，或20％，或30％，或40％或50％的患者在首次给药后1个月，或3个月，或6个月，或9个月，或12个月，或18个月，或24个月表现出改善，并伴有更多的改善。

10.在第180天，在Hexsel凹陷深度评分中观察到的相对于基线的改善在左侧和右侧大腿上是一致的。

11.在所有Hexsel凹陷深度评分均为中度或重度的患者群体中，至少一个治疗区域最早出现2级Hexsel凹陷深度评分改善的中位时间约为50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

12.在所有Hexsel凹陷深度评分为中度或重度的患者群体中，至少一个治疗区域中最早出现1级Hexsel凹陷深度评分改善的中位时间约为15天，或20天，或30天，或40天，或50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

13.在所有Hexsel凹陷深度评分均为中度或重度的患者群体中，受试者Hexsel凹陷深度评分的平均得分在第一次治疗21天后与安慰剂分离，并在随后的治疗后显示出持续和显著的改善。

14.在所有Hexsel凹陷深度评分均为中度或重度的患者群体中，在第71天至少一个治疗区域通过Hexsel凹陷深度评分测量具有2级复合反应的受试者所占百分比约为1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％或大于50％。

15.在所有Hexsel凹陷深度评分均为中度或重度的患者群体中，在第71天至少一个治疗区域通过Hexsel凹陷深度评分测量具有1级复合反应的受试者所占百分比约为1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％或大于50％。

16.在所有Hexsel凹陷深度评分为中度或重度的患者群体中，超过三分之一、二分之一、三分之二或四分之三的患者在治疗后第71天，至少有一个治疗区域的Hexsel凹陷深度评分反应至少为1级，其中Hexsel凹陷深度评分结果与年龄，BMI或肤色无关。

17.皮下脂肪团的严重程度在首次治疗后7天、14天、21天、30天、35天、40天、45天或50天内迅速减轻。

18.在一个或者一个以上治疗区域，从基线到第71天评分的变化在大约-0.1到大约-2.0范围内。

19.在具有统计学显著性的患者群体内，一个或多个治疗区域的最小二乘(LS)平均值约为-0.1到大约-1.5(95％置信区间(CI))。

在其他实施方案中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射约1mg到大约20mg胶原酶产生上述第1至19号结果中的一个或多个，其中胶原酶具有以下一个或多个特征：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到19中的一个或者一个以上。

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到19中的一个或者一个以上，其中，所述胶原酶具有以下特征中的一个或者一个以上：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在另一个实施例中，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到19中的一个或者一个以上。

在某些实施方案中，使用治疗I到V中任意一个将大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶被注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到19中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)，进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

在某些实施方案中，使用治疗I到V中任意一个将大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶被注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到19中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)，进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II.

4.用里克特美感量表测量疗效

在里克特量表中，各个患者在任何就诊时的改善是指与基线或任何先前得分或评级相比至少提高1个水平或1级。一组患者在任何一次就诊时的平均得分或评分比基线检查或任何先前的平均得分或评分提高约0.1。在某些实施方案中，通过里克特量表评分测量确定，以上详细描述的治疗方法产生以下一个或多个疗效终点：

1.在皮下脂肪团患者群体中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射胶原酶导致符合以下一个或多个疗效终点的此类患者的统计显著性数量：

·里克特量表评分为“改善的”(1)

·里克特量表评分为“显著改善”(2)

·里克特量表评分为“非常显著的改善”(3)

2.由目标大腿的临床医生现场评估，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，里克特量表评分显示的治疗区域外观与治疗前相比至少有2级改善。

3.由受试者观察目标大腿的数字图像评估，第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，里克特量表评分显示的治疗区域外观与治疗前相比至少有2级改善。

4.由目标大腿的临床医生现场评估，第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，里克特量表评分显示的治疗区域外观与治疗前相比至少有1级改善。

5.由受试者观察目标大腿的数字图像评估，第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，里克特量表评分显示的治疗区域外观与治疗前相比至少有1级改善。

6.在患有皮下脂肪团的患者中，在至少一个治疗区域里克特量表评分的改善是具有统计学显著性的，其中所述改善为上述2到7中的一个或多个。

7.该治疗使至少5％的患者在初始剂量后71天内保持了与治疗前基线相比的改善水平。在某些情况下，至少有10％、或20％、或30％、或40％、或50％的患者在初次给药后至少6个月、或者9个月、或者12个月、或18个月、或2年或3年、或4年、或5年内保持这种水平。在其他情况下，治疗至少有5％的患者表现出与治疗前基线相比的改善，并且随着时间的推移表现出更多的改善。一些治疗导致至少10％，或20％，或30％，或40％或50％的患者在首次给药后1个月，或3个月，或6个月，或9个月，或12个月，或18个月，或24个月表现出改善，并伴有更多的改善。.

8.第180天在里克特量表评分分级中观察到的相对于基线的改善在左侧和右侧大腿上是一致的。

9.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，至少一个治疗区域最早出现2级里克特量表评分改善的中位时间约为50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

10.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，至少一个治疗区域最早出现2级里克特量表评分改善的中位时间约为15天，或20天，或30天，或40天，或50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

11.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，受试者里克特量表的平均得分在第一次治疗21天后与安慰剂分离，并在随后的治疗后显示出持续和显著的改善。

12.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，在第71天至少一个治疗区域通过里克特量表的测量具有2级反应的受试者所占百分比约为1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％或大于50％。

13.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，在第71天至少一个治疗区域通过里克特量表的测量具有1级反应的受试者所占百分比约为1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％或大于50％。

14.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，超过三分之一、二分之一、三分之二或四分之三的患者在治疗后第71天，至少有一个治疗区域的里克特量表评分反应至少为1级，其中里克特量表评分结果与年龄，BMI或肤色无关.

15.皮下脂肪团的严重程度在首次治疗后7天、14天、21天、30天、35天、40天、45天或50天内迅速减轻。

在其他实施方案中，在其他实施方案中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射约1mg到大约20mg胶原酶产生上述第1至15号结果中的一个或多个，其中胶原酶具有以下一个或多个特征：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到15中的一个或者一个以上。

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到15中的一个或者一个以上，其中，所述胶原酶具有以下特征中的一个或者一个以上：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在另一个实施例中，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到15中的一个或者一个以上。

在某些实施方案中，在至少一次治疗访视中，大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶被注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到15中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)，进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

在某些实施方案中，使用治疗I到V中的任意一个将大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到17中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)，进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

5.凹坑分析

在某些实施方案中，用胶原酶治疗皮下脂肪团能够减少凹坑尺寸参数，如下所述：

·深度：减少大约100％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，25％，或者20％，或者15％，或者10％，或者5％，或者2.5％，或者2％，或者1％

·宽度：减少大约100％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，25％，或者20％，或者15％，或者10％，或者5％，或者2.5％，或者2％，或者1％

·长度：减少大约100％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，25％，或者20％，或者15％，或者10％，或者5％，或者2.5％，或者2％，或者1％

·总体积：减少大约100％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，25％，或者20％，或者15％，或者10％，或者5％，或者2.5％，或者2％，或者1％

·表面面积：减少大约100％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，25％，或者20％，或者15％，或者10％，或者5％，或者2.5％，或者2％，或者1％

在某些实施方案中，该治疗使至少5％的患者在初始剂量后71天内保持了与治疗前基线相比的改善水平。在某些情况下，至少有10％、或20％、或30％、或40％、或50％的患者在初次给药后至少6个月、或者9个月、或者12个月、或18个月、或2年或3年、或4年、或5年内保持这种水平。在其他情况下，治疗至少有5％的患者表现出与治疗前基线相比的改善，并且随着时间的推移表现出更多的改善。一些治疗导致至少10％，或20％，或30％，或40％或50％的患者在首次给药后1个月，或3个月，或6个月，或9个月，或12个月，或18个月，或24个月表现出改善，并伴有更多的改善。

在其他实施方案中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射约1mg到大约20mg胶原酶，能够使至少一个凹坑的尺寸参数减少至少5％、或者至少10％或者至少20％，其中，所述胶原酶具有一个或者一个以上以下特征：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶，能够使至少一个凹坑的尺寸参数减少至少5％、或者至少10％或者至少20％。

在其他实施方案中，根据治疗I到V向至少一个治疗区域注射约1mg到大约20mg胶原酶，能够使至少一个凹坑的尺寸参数减少至少5％、或者至少10％或者至少20％，其中，所述胶原酶具有一个或者一个以上以下特征：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(see^-1)of about 1.1 to 107(SRC实验)，或者，大约93 to 9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在另一个实施例中，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的CCH，能够使至少一个凹坑的尺寸参数减少至少5％、或者至少10％或者至少20％。

在某些实施方案中，在至少一次治疗访视中，大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶被注射到至少一个治疗区域，能够使至少一个凹坑的尺寸参数减少至少5％、或者至少10％或者至少20％，其中，所述胶原酶具有一个或者一个以上以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，see^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)，进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

在某些实施方案中，使用治疗I到V中的至少一个将大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶注射到至少一个治疗区域，能够使至少一个凹坑的尺寸参数减少至少5％、或者至少10％或者至少20％，其中，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)，进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

6.受试者整体审美改善量表(S-GAIS)和研究者整体审美改善量表(I-GAIS)测量 的疗效

根据S-GAIS和I-GAIS的测量，上述治疗方法可获得改善的治疗效果。2级S-GAIS应答者是指在评估时间点S-GAIS评分至少为2(+2或+3)的受试者。1级S-GAIS应答者是指在评估时间点S-GAIS评分至少为1(+1、+2或+3)的受试者。2级I-GAIS应答者是指在评估时间点I-GAIS评分至少为2(+2或+3)的受试者。1级I-GAIS应答者是指在评估时间点I-GAIS评分至少为1(+1、+2或+3)的受试者。个别患者在任何就诊时的改善是指与基线或任何先前得分相比至少提高1级或1级。一组患者在任何一次就诊时的平均得分或评分比基线检查或任何先前的平均得分或评分提高约0.1。

在某些实施方案中，通过S-GAIS和/或I-GAIS测量，上面详细描述的治疗方法产生了的一个或多个以下疗效终点：

1.在患有皮下脂肪团的患者群体中，在至少一次治疗访视期间将胶原酶注射到至少一个治疗区域会产生统计学显著数量的符合以下一个或多个疗效终点的此类患者：

·S-GAIS和/或I-GAIS评分为“改善的”(+1)

·S-GAIS和/或I-GAIS评分为“显著改善的”(+2)

·S-GAIS和/或I-GAIS评分为“非常显著改善的”(+3)

2.由目标大腿的临床医生现场评估，在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天可以在I-GAIS中观察到至少2级改善

3.由受试者观察目标大腿的数字图像评估，在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天可以在S-GAIS中观察到至少2级改善。

4.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天通过2级复合反应证明的改善，被定义为由临床医生评估受试者在I-GAIS中比基线时的严重程度至少改善2级，由受试者评估受试者在S-GAIS中比基线时的严重程度至少改善2级.

5.由目标大腿的临床医生现场评估，在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天可以在I-GAIS中观察到至少1级改善

6.由受试者观察目标大腿的数字图像评估，在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天可以在S-GAIS中观察到至少1级改善。

7.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天通过1级复合反应证明的改善，被定义为由临床医生评估受试者在I-GAIS中比基线时的严重程度至少改善1级，由受试者评估受试者在S-GAIS中比基线时的严重程度至少改善1级.

8.在患有皮下脂肪团的患者群体中，在所有评分均为中度或重度的患者群体中，与安慰剂相比，至少一个治疗区域的I-GAIS和/或S-GAIS改善在统计学上具有显著性，其中，所述改善为上述2到7中的一个或多个。

9.该治疗使至少5％的患者在初始剂量后71天内保持了与治疗前基线相比的改善水平。在某些情况下，至少有10％、或20％、或30％、或40％、或50％的患者在初次给药后至少6个月、或者9个月、或者12个月、或18个月、或2年或3年、或4年、或5年内保持这种水平。在其他情况下，治疗至少有5％的患者表现出与治疗前基线相比的改善，并且随着时间的推移表现出更多的改善。一些治疗导致至少10％，或20％，或30％，或40％或50％的患者在首次给药后1个月，或3个月，或6个月，或9个月，或12个月，或18个月，或24个月表现出改善，并伴有更多的改善。

10.第180天在I-GAIS和/或S-GAIS中观察到的相对于基线的改善在左侧和右侧大腿上是一致的。

11.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，至少一个治疗区域最早出现2级I-GAIS和/或S-GAIS评分改善的中位时间约为50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

12.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，至少一个治疗区域中最早出现1级I-GAIS和/或S-GAIS评分改善的中位时间约为15天，或20天，或30天，或40天，或50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

13.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，受试者I-GAIS和/或S-GAIS的平均得分在第一次治疗21天后与安慰剂分离，并在随后的治疗后显示出持续和显著的改善。

14.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，在第71天至少一个治疗区域通过I-GAIS和/或S-GAIS的测量具有2级反应的受试者所占百分比约为1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％或大于50％。

15.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，在第71天至少一个治疗区域通过I-GAIS和/或S-GAIS的测量具有1级反应的受试者所占百分比约为1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％或大于50％。

16.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，在所有Hexsel CSS评分为中度或重度的患者群体中，超过三分之一、二分之一、三分之二或四分之三的患者在治疗后第71天，至少有一个治疗区域的I-GAIS和/或S-GAIS的测量评分反应至少为1级，其中I-GAIS和/或S-GAIS的测量评分结果与年龄，BMI或肤色无关。

17.皮下脂肪团的严重程度在首次治疗后7天、14天、21天、30天、35天、40天、45天或50天内迅速减轻。

在其他实施方案中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射约1mg到大约20mg胶原酶产生上述第1至17号结果中的一个或多个，其中胶原酶具有以下一个或多个特征：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到17中的一个或者一个以上。

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到17中的一个或者一个以上，其中，所述胶原酶具有以下特征中的一个或者一个以上：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在另一个实施例中，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到17中的一个或者一个以上。

在某些实施方案中，在至少一次治疗访视中，大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶被注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到17中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)，进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

在某些实施方案中，使用治疗I到V中的任意一个将大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到17中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)，进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

7.PR-CIS测定的疗效

根据PR-CIS测定，上面详细描述的治疗方法可实现改善的治疗效果。PR-CIS总分是量表上六个项目的总和。PR-CIS中的第1项询问受试者对脂肪团外观的满意程度，通过从10中减去受试者报告的评估值来逆转。PR-CIS总分可以在0到60之间，数值越大，说明脂肪团的负面影响越大。对于PR-CIS总分，应答者是指在评估时间点PR-CIS总分比基线至少降低12分的受试者。对于个人PR-CIS影响分数，反应是在每个时间点从基线至少2个分数间隔的改善。此外，应答者是任何显示出比基线检查时的最大总分至少提高20％的患者。个别患者在任何就诊时的改善是指与基线或任何先前得分相比至少提高1个水平或1级。一组患者在任何一次就诊时的平均得分或评分比基线检查或任何先前的平均得分或评分提高约0.1。此外，改善是指相对于基线60分中至少有1个水平的变化。

在某些实施方案中，根据PR-CIS的测定结果，上面详细描述的治疗方法可以实现一个或多个以下疗效终点：

1.在患有皮下脂肪团的患者群体中，在至少一次治疗访视期间将胶原酶注射到至少一个治疗区域会产生具有统计学显著性数量的符合以下一个或多个疗效终点的患者：

·PR-CIS显示至少有一个领域的改善，这些领域选自快乐、烦恼、自我意识、尴尬、看起来老了、看起来超重/不健康的组中选择的

·在一个或多个评估时间点，PR-CIS总分比基线至少降低12分

·PR-CIS影响分数显示在一个或多个评估时间点从基线至少2个分数间隔的改善

·改善是指相对于基线60分中至少有1个水平的变化

2.对于目标大腿，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，PR-CIS测定的严重程度至少改善12分。

3.在患有皮下脂肪团的患者群体中，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天PR-CIS测定的严重程度与安慰剂相比，严重程度具有统计学显著性改善是指改善至少为12分。

4.该治疗使至少5％的患者在初始剂量后71天内保持了与治疗前基线相比的改善水平。在某些情况下，至少有10％、或20％、或30％、或40％、或50％的患者在初次给药后至少6个月、或者9个月、或者12个月、或18个月、或2年或3年、或4年、或5年内保持这种水平。在其他情况下，治疗至少有5％的患者表现出与治疗前基线相比的改善，并且随着时间的推移表现出更多的改善。一些治疗导致至少10％，或20％，或30％，或40％或50％的患者在首次给药后1个月，或3个月，或6个月，或9个月，或12个月，或18个月，或24个月表现出改善，并伴有更多的改善。

5.第180天在PR-CIS评分中观察到的相对于基线的改善在左侧和右侧大腿上是一致的。

6.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，在至少一个治疗区域，在一个或者一个以上评估时间点测定的与基线相比PR-CIS总分减少至少12的中位时间约为15天，或20天，或30天，或40天，或50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

7.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，受试者PR-CIS平均得分在第一次治疗21天后与安慰剂分离，并在随后的治疗后显示出持续和显著的改善。

8.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，超过三分之一、二分之一、三分之二或四分之三的患者在治疗后第71天，在一个或者一个以上评估时间点与基线相比PR-CIS总分减少至少12，其中PR-CIS的评分结果与年龄，BMI或肤色无关。

9.皮下脂肪团的严重程度在首次治疗访视后7天、14天、21天、30天、35天、40天、45天或50天内迅速减轻。

在其他实施方案中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射约1mg到大约20mg胶原酶产生上述第1至9号结果中的一个或多个，其中胶原酶具有以下一个或多个特征：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到9中的一个或者一个以上。

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到9中的一个或者一个以上，其中，所述胶原酶具有以下特征中的一个或者一个以上：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在另一个实施例中，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到9中的一个或者一个以上.

在某些实施方案中，在至少一次治疗访视中，大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶被注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到9中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)。进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

在某些实施方案中，使用治疗I到V中的任意一个将大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到9中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)。进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

8.PR-CIS减缩版测定的疗效

通过PR-CIS减缩版测量证明，上面详细描述的治疗方法可以实现改善的治疗效果。PR-CIS减缩版总分是量表上五个项目的总和。PR-CIS中的第1项询问受试者对脂肪团外观的满意程度，将通过从10中减去受试者报告的评估来逆转。PR-CIS减缩版的总分可以在0到50之间，数字越高，说明脂肪团的负面影响越大。对于PR-CIS减缩版的总分，应答者是指在评估时间点PR-CIS总分比基线至少降低10分的受试者。对于个人PR-CIS减缩版影响分数，反应是在每个时间点从基线至少2个分数间隔的改善。此外，应答者是任何显示出比基线检查时的最大总分至少提高20％的患者。个别患者在任何就诊时的改善是指与基线或任何先前得分相比至少提高1个水平或1级。一组患者在任何一次就诊时的平均得分或评分比基线检查或任何先前的平均得分或评分提高约0.1。此外，改善是从基线的50分中至少改变了1分的水平。

在某些实施方案中，通过PR-CIS减缩版测定，上面描述的治疗方法能够实现以下一个或者一个以上的下述功效：

1.在患有皮下脂肪团的患者群体中，在至少一次治疗访视期间将胶原酶注射到至少一个治疗区域可以产生统计学显著数量的符合以下一个或多个疗效终点的患者：

·PR-CIS减缩版显示至少有一个领域的改善，这些领域选自由快乐、烦恼、自我意识、尴尬、看起来老了、看起来超重/不健康所组成的组中

·在一个或多个评估时间点，PR-CIS减缩版总分比基线至少降低10分

·PR-CIS减缩版影响分数显示在一个或多个评估时间点从基线至少2个分数间隔的改善

·进一步的，改善是指相对于基线50分中至少有1个水平的变化

2.对于目标大腿，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，PR-CIS减缩版测定的严重程度至少改善12分。

3.在患有皮下脂肪团的患者群体中，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天PR-CIS减缩版测定的严重程度与安慰剂相比，严重程度具有统计学显著性改善是指改善至少为10分。

4.该治疗使至少5％的患者在初始剂量后71天内保持了与治疗前基线相比的改善水平。在某些情况下，至少有10％、或20％、或30％、或40％、或50％的患者在初次给药后至少6个月、或者9个月、或者12个月、或18个月、或2年或3年、或4年、或5年内保持这种水平。在其他情况下，治疗至少有5％的患者表现出与治疗前基线相比的改善，并且随着时间的推移表现出更多的改善。一些治疗导致至少10％，或20％，或30％，或40％或50％的患者在首次给药后1个月，或3个月，或6个月，或9个月，或12个月，或18个月，或24个月表现出改善，并伴有更多的改善。

5.第180天在PR-CIS减缩版评分中观察到的相对于基线的改善在左侧和右侧大腿上是一致的。

6.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，在至少一个治疗区域，在一个或者一个以上评估时间点测定的与基线相比PR-CIS减缩版测定的总分减少至少10的中位时间约为15天，或20天，或30天，或40天，或50天，或60天，或70天，或80天，或90天.

7.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，受试者PR-CIS减缩版平均得分在第一次治疗21天后与安慰剂分离，并在随后的治疗后显示出持续和显著的改善。

8.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，超过三分之一、二分之一、三分之二或四分之三的患者在治疗后第71天，在一个或者一个以上评估时间点与基线相比PR-CIS减缩版总分减少至少10，其中PR-CIS的评分结果与年龄，BMI或肤色无关.

9.皮下脂肪团的严重程度在首次治疗访视后7天、14天、21天、30天、35天、40天、45天或50天内迅速减轻。

在其他实施方案中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射约1mg到大约20mg胶原酶产生上述第1至9号结果中的一个或多个，其中胶原酶具有以下一个或多个特征

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(see^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到9中的一个或者一个以上。

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到9中的一个或者一个以上，其中，所述胶原酶具有以下特征中的一个或者一个以上：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在另一个实施例中，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到9中的一个或者一个以上。

在某些实施方案中，在至少一次治疗访视中，大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶被注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到9中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)。进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

在某些实施方案中，使用治疗I到V中的任意一个将大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到9中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)。进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

9.受试者自评量表(SSRS)测定的疗效

根据SSRS的测量，上面详细描述的治疗方法产生改善的治疗效果。SSRS应答者是对第71天大腿上脂肪团的外观至少稍微满意(稍微满意[4]、非常满意[5]或非常满意[6])的受试者。此外，应答者是指与基线相比最大总分改善至少17％的任何患者。个别患者在任何就诊时的改善是指与基线或任何先前得分相比至少提高1个水平或1级。一组患者在任何一次就诊时的平均得分或评分比基线检查或任何先前的平均得分或评分提高约0.1。在某些实施方案中，通过SSRS评级测量，治疗方法产生的以下一个或多个疗效终点：

1.在患有皮下脂肪团的患者群体中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射胶原酶导致在统计学上显著数量的此类患者满足以下一个或多个疗效终点：

·SSRS评分为“比较满意”

·SSRS评分为“满意”

·SSRS评分为“非常满意”

2.对于目标大腿，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，SSRS评分测定的严重程度至少改善2级。

3.对于目标大腿，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，SSRS评分测定的严重程度至少改善1级。

4.在患有皮下脂肪团的患者群体中，在至少一个治疗区域内SSRS评分测定的改善与安慰剂相比是具有统计学显著性的，其中，所述改善是以上2到3中的一个或者多个。

5.该治疗使至少5％的患者在初始剂量后71天内保持了与治疗前基线相比的改善水平。在某些情况下，至少有10％、或20％、或30％、或40％、或50％的患者在初次给药后至少6个月、或者9个月、或者12个月、或18个月、或2年或3年、或4年、或5年内保持这种水平。在其他情况下，治疗至少有5％的患者表现出与治疗前基线相比的改善，并且随着时间的推移表现出更多的改善。一些治疗导致至少10％，或20％，或30％，或40％或50％的患者在首次给药后1个月，或3个月，或6个月，或9个月，或12个月，或18个月，或24个月表现出改善，并伴有更多的改善。

6.第180天在SSRS评分中观察到的相对于基线的改善在左侧和右侧大腿上是一致的。

7.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，至少一个治疗区域最早出现2级SSRS评分改善的中位时间约为50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

8.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，至少一个治疗区域中最早出现1级SSRS评分改善的中位时间约为15天，或20天，或30天，或40天，或50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

9.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，受试者SSRS平均得分在第一次治疗21天后与安慰剂分离，并在随后的治疗后显示出持续和显著的改善。

10.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，在第71天至少一个治疗区域通过SSRS评分的测量具有2级反应的受试者所占百分比约为1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％或大于50％。

11.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，在第71天至少一个治疗区域通过SSRS评分的测量具有1级反应的受试者所占百分比约为1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％或大于50％。

12.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，超过三分之一、二分之一、三分之二或四分之三的患者在治疗后第71天，至少有一个治疗区域的SSRS测量评分反应至少为1级，其中SSRS的测量评分结果与年龄，BMI或肤色无关。

13.皮下脂肪团的严重程度在首次治疗访视后7天、14天、21天、30天、35天、40天、45天或50天内迅速减轻。

在其他实施方案中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射约1mg到大约20mg胶原酶产生上述第1至13号结果中的一个或多个，其中胶原酶具有以下一个或多个特征：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到13中的一个或者一个以上。

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到13中的一个或者一个以上，其中，所述胶原酶具有以下特征中的一个或者一个以上。

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在另一个实施例中，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到13中的一个或者一个以上。

在某些实施方案中，在至少一次治疗访视中，大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶被注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到13中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)。进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

在某些实施方案中，使用治疗I到V中的任意一个将大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到13中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)。进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

10.根据受试者对脂肪团治疗(SSCT)的满意度来测量疗效

根据SSCT的测量，上面详细描述的治疗方法产生改善的治疗效果。SSCT评估中，在第71天对大腿上脂肪团的反应为：“满意”或者“非常满意”的受试者被认为是显示疗效的响应者。个体患者在任何就诊时的改善是指与基线或任何先前得分相比至少提高1个水平或1级。一组患者在任何一次就诊时的平均得分或评分比基线检查或任何先前的平均得分或评分提高约0.1。进一步的，对于SSCT，改善是与安慰剂相比至少提高0.1。在某些实施方案中，通过SSCT评级测量，治疗方法产生的以下一个或多个疗效终点：

1.在患有皮下脂肪团的患者群体中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射胶原酶导致在统计学上显著数量的此类患者满足以下一个或多个疗效终点：

·SSCT评分为“满意”

·SSCT评分为“非常满意”

2.对于目标大腿，第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，SSCT评分增加(例如，1到2，等等)。

3.在患有皮下脂肪团的患者群体中，在第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，在至少一个治疗区域SSCT评分的增加与安慰剂相比具有统计学上的显著性。

4.该治疗使至少5％的患者在初始剂量后71天内保持了与治疗前基线相比的改善结果。在某些情况下，至少有10％、或20％、或30％、或40％、或50％的患者在初次给药后至少6个月、或者9个月、或者12个月、或18个月、或2年或3年、或4年、或5年内保持这种水平。在其他情况下，治疗至少有5％的患者表现出与治疗前基线相比的改善，并且随着时间的推移表现出更多的改善。一些治疗导致至少10％，或20％，或30％，或40％或50％的患者在首次给药后1个月，或3个月，或6个月，或9个月，或12个月，或18个月，或24个月表现出改善，并伴有更多的改善。

5.第180天在SSCT评分中观察到的相对于基线的改善在左侧和右侧大腿上是一致的。

6.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，至少一个治疗区域中最早出现SSCT评分改善的中位时间约为15天，或20天，或30天，或40天，或50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

7.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，受试者SSRS平均得分在第一次治疗21天后与安慰剂分离，并在随后的治疗后显示出持续和显著的改善。

8.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，在第71天在至少一个治疗区域具有改善的SSCT评分的受试者所占百分比约为1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％或大于50％。

9.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，超过三分之一、二分之一、三分之二或四分之三的患者在治疗后第71天，至少有一个治疗区域具有改善的SSCT评分，其中SSRS的测量评分结果与年龄，BMI或肤色无关。

10.皮下脂肪团的严重程度在首次治疗访视后7天、14天、21天、30天、35天、40天、45天或50天内迅速减轻。

在其他实施方案中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射约1mg到大约20mg胶原酶产生上述第1至10号结果中的一个或多个，其中胶原酶具有以下一个或多个特征：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到10中的一个或者一个以上。

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到10中的一个或者一个以上，其中，所述胶原酶具有以下特征中的一个或者一个以上：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在另一个实施例中，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到10中的一个或者一个以上。

在某些实施方案中，在至少一次治疗访视中，大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶被注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到10中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，see^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οm_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)。进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

在某些实施方案中，使用治疗I到V中的任意一个将大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到10中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οm_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)。进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

11.大腿脂肪团疗效量表(CR-TCES；PR-TCES)测定的疗效

个体患者在任何就诊时的改善是指相对于基线或任何先前得分至少提高1个水平或1级。一组患者在任何就诊时的改善都是与基线或任何先前的平均得分相比改善约0.1。应答者是指从基线检查结果看，最大总分或评分至少提高20％的患者。在某些实施方案中，以上详述的治疗方法产生通过CR-TCES和/或PR-TCES测量的一个或多个以下疗效终点：

1.CR-TCES和/或PR-TCES评分与基线相比改善至少0.1。

2.对于目标大腿，由临床医生现场进行评价，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，CR-TCES评分测定的严重程度至少改善2级。

3.对于目标大腿，由临床医生现场进行评价，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、43天、71天、90天、180天、365天或730天，PR-TCES评分测定的严重程度至少改善2级。

4.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天通过2级复合反应证明的改善，被定义为在CR-TCES中比基线时的严重程度至少改善2级，在PR-TCES中比基线时的严重程度至少改善2级。

5.从基线(第一天)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天，由目标大腿的临床医生现场评估CR-TCES中皮下脂肪团的严重程度与基线相比至少有1级改善。

6.从基线(第一天)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天，由目标大腿的临床医生现场评估PR-TCES中皮下脂肪团的严重程度与基线相比至少有1级改善。

7.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天通过1级复合反应证明的改善，被定义为在CR-TCES中比基线时的严重程度至少改善1级，在PR-TCES中比基线时的严重程度至少改善1级。

8.在所有CR-TCES评分均为中度或重度的患者群体中，与安慰剂相比，至少一个治疗区域的改善在统计学上具有显著性，其中，所述改善为上述1到7中的一个或多个。

9.该治疗使至少5％的患者在初始剂量后71天内保持了与治疗前基线相比的改善水平。在某些情况下，至少有10％、或20％、或30％、或40％、或50％的患者在初次给药后至少6个月、或者9个月、或者12个月、或18个月、或2年或3年、或4年、或5年内保持这种水平。在其他情况下，治疗至少有5％的患者表现出与治疗前基线相比的改善，并且随着时间的推移表现出更多的改善。一些治疗导致至少10％，或20％，或30％，或40％或50％的患者在首次给药后1个月，或3个月，或6个月，或9个月，或12个月，或18个月，或24个月表现出改善，并伴有更多的改善。

10.第180天在CR-TCES和/或PR-TCES评分中观察到的相对于基线的改善在左侧和右侧大腿上是一致的。

11.在所有CR-TCES评分均为中度或重度的患者群体中，至少一个治疗区域最早出现2级CR-TCES和/或PR-TCES评分改善的中位时间约为50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

12.在所有CR-TCES评分均为中度或重度的患者群体中，至少一个治疗区域最早出现1级CR-TCES和/或PR-TCES评分改善的中位时间约为15天，或20天，或30天，或40天，或50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

13.在所有CR-TCES评分均为中度或重度的患者群体中，受试者CR-TCES和/或PR-TCES平均得分在第一次治疗21天后与安慰剂分离，并在随后的治疗后显示出持续和显著的改善。

14.在所有CR-TCES评分均为中度或重度的患者群体中，在第71天至少在一个治疗区域通过CR-TCES和/或PR-TCES测量的实现2级复合反应的受试者所占百分比约为1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％或大于50％。

15.在所有CR-TCES评分均为中度或重度的患者群体中，在第71天至少在一个治疗区域通过CR-TCES和/或PR-TCES测量的实现1级复合反应的受试者所占百分比约为1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％或大于50％。

16.在所有CR-TCES评分均为中度或重度的患者群体中，超过三分之一、二分之一、三分之二或四分之三的患者在治疗后第71天在至少一个治疗区域具有至少1级CR-TCES和/或至少1级PR-TCES响应，其中，CR-TCES的测量评分结果与年龄，BMI或肤色无关。

17.皮下脂肪团的严重程度在首次治疗访视后7天、14天、21天、30天、35天、40天、45天或50天内迅速减轻。

在其他实施方案中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射约1mg到大约20mg胶原酶产生上述第1至17号结果中的一个或多个，其中胶原酶具有以下一个或多个特征：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到17中的一个或者一个以上。

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到17中的一个或者一个以上，其中，所述胶原酶具有以下特征中的一个或者一个以上：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在另一个实施例中，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到17中的一个或者一个以上。

在某些实施方案中，在至少一次治疗访视中，大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶被注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到10中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)。进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

在某些实施方案中，使用治疗I到V中的任意一个将大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到17中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)。进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

12.Body-Q测定的疗效

根据Body-Q的测量，上面详细描述的治疗方法产生改善的治疗效果。对于皮下脂肪团，共有16个量表项目测量过去一周时间段内的患者反应，选项从“完全没有”到“非常困扰”，并综合成Flesch-Kincaid等级读数水平。分数在16(非常困扰)到64(完全没有)范围内变化。对于Body-Q总分，响应者是指在评估时间点与基线相比Body-Q总分增加至少16分的患者。对于各个Body-Q影响分数，反应是指在每个时间点与基线相比至少增加一个分数间隔的改善。在作为选择的实施方案中，评分的项目可以大于或者小于16，并且，所述响应者是指与基线相比最大总分的改善至少为25％的患者。

在某些实施方案中，以上详述的治疗方法产生通过Body-Q测量的一个或多个以下疗效终点：

1.在患有皮下脂肪团的患者群体中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射胶原酶导致在统计学上显著数量的此类患者满足以下一个或多个疗效终点：

·Body-Q显示在选自以下所组成的组中的至少一个方面具有改善：

ο在一个或者一个以上评估时间点，与基线相比Body-Q测量的总分至少增加16；

ο对于各个Body-Q影响分数，在每个时间点与基线相比至少改善1分；并且

ο从基线开始至少改善最大总分的25％。

·在一个或者一个以上评估时间点，与基线相比Body-Q总分至少增加16。

·Body-Q影响分数在每个时间点与基线相比至少改善1分

·Body-Q鉴定皮下脂肪团时与基线相比的平均改变发生在第90天和/或第180天

2.对于目标大腿，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天后严重程度的改善为Body-Q评分至少增加16分。

3.在患有皮下脂肪团的患者群体中，对于，目标大腿，从基线(治疗前第一天)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天或第730天后Body-Q测定结果显示与安慰剂相比，严重程度的改善具有统计学显著性，即，至少增加16分。

4.该治疗使至少5％的患者在初始剂量后71天内保持了与治疗前基线相比的改善水平。在某些情况下，至少有10％、或20％、或30％、或40％、或50％的患者在初次给药后至少6个月、或者9个月、或者12个月、或18个月、或2年或3年、或4年、或5年内保持这种水平。在其他情况下，治疗至少有5％的患者表现出与治疗前基线相比的改善，并且随着时间的推移表现出更多的改善。一些治疗导致至少10％，或20％，或30％，或40％或50％的患者在首次给药后1个月，或3个月，或6个月，或9个月，或12个月，或18个月，或24个月表现出改善，并伴有更多的改善。

5.在第一次注射后第180天，与基线相比，Body-Q评分后观察到的改善在左侧和右侧大腿上是一致的。

6.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，Body-Q评分总分与基线相比至少增加16的中位时间约为15天，或20天，或30天，或40天，或50天，或60天，或70天，或80天，或90天。

7.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，受试者Body-Q平均得分在第一次治疗21天后与安慰剂分离，并在随后的治疗后显示出持续和显著的改善。

8.在所有患有皮下脂肪团的患者群体中，超过三分之一、二分之一、三分之二或四分之三的患者在治疗后第71天，至少有一个治疗区域的在一个或者一个以上评价时间点Body-Q评分总分与基线相比至少增加16，其中Body-Q的测量评分结果与年龄，BMI或肤色无关。

9.皮下脂肪团的严重程度在首次治疗访视后7天、14天、21天、30天、35天、40天、45天或50天内迅速减轻。

在其他实施方案中，在至少一次治疗访视期间向至少一个治疗区域注射约1mg到大约20mg胶原酶产生上述第1至9号结果中的一个或多个，其中胶原酶具有以下一个或多个特征：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到9中的一个或者一个以上。

在其他情况下，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的胶原酶会产生上述结果1到9中的一个或者一个以上，其中，所述胶原酶具有以下特征中的一个或者一个以上：

·V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)

·K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)

·K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，约93到9,179(GPA实验)

·1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)

·K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)

·分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内，

·通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％

·效价(即，比活性)为大约500到大约30,000SRC单位/mg

·效价为大约5,000到大约30,000f-SRC单位/mg

·效价为大约100,000到大约400,000GPA单位/mg

·效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg

·效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg

·按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中

·小于或者等于1cfu/mL的生物负担

在另一个实施例中，根据治疗I到V中的任意一个注射大约1mg到大约20mg的CCH会产生上述结果1到9中的一个或者一个以上。

在某些实施方案中，在至少一次治疗访视中，大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶被注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到9中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，see^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)。进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

在某些实施方案中，使用治疗I到V中的任意一个将大约1mg到大约20mg的比例为大约1∶1的I型胶原酶和II型胶原酶注射到至少一个治疗区域并得到上述结果1到9中的一个或者一个以上，其中所述I型胶原酶和II型胶原酶具有以下特征：

·I型

ο实验：SRC微孔板

οVmax，min^-1：大约0.08到7.70

οK_M：大约4.1到410纳摩尔

οK_cat，sec^-1：大约1.1到107

ο1/K_cat，微秒：大约376到37,222

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

·II型

ο实验：GPA微孔板

οV_max，min^-1：大约0.3到30.5

οK_M，mM：大约0.03到3.1

οK_cat，sec^-1：大约93到9,179

ο1/K_cat，微秒：大约4到428

οK_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934

还可以使用其他比例，(例如，0.1-2∶1，或者0.25-2∶1，或者0.5-2∶1，或者0.75-2∶1，或者1∶0.1-2，或者1∶0.25-2，或者1∶0.5-2，或者1∶0.75-2，或者1∶0，或者0∶1)。进一步的，I型和II型胶原酶可以分别被表示为AUX-I和AUX-II。

13.通过三维摄影/图像测量评估治疗效果

如以下实施例中的描述，三维摄影或其他图像可用于治疗效果的评估，尤其是凹坑分析。使用三维图像进行的凹坑分析(如上所述)可包括计算凹坑体积、长度、宽度和面积。可通过各种已知方法来执行计算，例如Eckhouse et al.WO 2018/116304和WO 2018/116305，Cherry Imaging中描述的方法以及可从Canfield Scientific，Inc.获得的方法。可使用数字3-D灰度图像(具有X和Y轴旋转特征)来计算体积、长度、宽度和面积的此类测量值，以及数字3-D纹理和照明图像(具有X和Y旋转功能)以及分析此类图像的计算机程序。在一个实施方案中，在臀部治疗区，可在治疗前后为每位患者拍摄左侧治疗臀部和/或右侧治疗臀部的图像。在其他实施方案中，大腿治疗区域，可在治疗前后以0度、45度和90度的角度拍摄大腿治疗区域中的每一个的图像。

临床医生和患者可以使用照片和成像工具来评估脂肪团的严重程度，无论是否使用本文所述的量表和其他工具。在一个实施方案中，临床医生/研究人员或合格指定人员使用提供的标准化三维摄像机以标准化方式拍摄每个治疗区域(每个臀部或每个大腿)。拍摄对象代表每一个摄影环节，穿着标准化的摄影服装。临床医生/研究人员或合格指定人员在受试者以一致的标准放松姿势站立时，对2个治疗部位(2个臀部或2个大腿)中的每个部位进行拍照。这些照片和上述图像可用于下述疗效分析。

G.效果的持久性

本文所述的胶原酶治疗具有通过本文所公开的任何量表或评估方法测量的持久有效性。这种持久性可能从3个月到5年或更长。单次注射或一系列注射可维持脂肪团的改善，或持续改善脂肪团的外观，或长时间降低脂肪团外观的严重程度，例如6个月、1年、2年、3年、4年或5年或更长时间。

在特定的实施方案中，接受胶原酶注射的患者在治疗后约6个月时，CR-PCSS和PR-PCSS评分中的一个或两个评分与基线相比持续改善≥1分，或在治疗后约12个月时，CR-PCSS和PR-PCSS评分中的一个或两个评分与基线相比持续改善≥1分。此外，这些患者在治疗后约22天、43天、90天或180天的CR-PCSS和PR-PCSS评分与基线相比有≥1分的改善。例如，至少约有10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％的患者表现出这种持久性。

在另一个方面，该治疗方法评估了2级复合反应者(PR-PCSS和CR-PCSS中至少有2级脂肪团严重程度改善的患者)的疗效持久性，从而得出在6个月和12个月时显示疗效持久性的统计显著数。在某些实施例中，至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％的患者证明了这种持久性。

持久性非限制性实施例包括：

a.CR-PCSS评分的下降一直维持到第180天，再加上受试者对脂肪团治疗满意度量表的评分，证明像两侧臀部或者两侧大腿上每治疗区域(x 2个治疗区域)12次皮下注射CCH0.84mg 3个疗程的有效性。

b.在第180天，CR-PCSS评分从基线检查(筛查访视)开始的下降在左右两侧是一致的。

c.在第180天，观察到至少一个治疗区域的CR-PCSS评分有2级改善。臀部和大腿左右两侧的反应相似。

d.在第180天，观察到至少一个治疗区域的CR-PCSS评分有1级改善。臀部和大腿左右两侧的反应相似。

e.在至少一个区域可以最早观察到2-级CR-PCSS评分响应的中位时间是83天。

f.最早观察到1-级CR-PCSS评分响应的中位时间是41天。

g.在第180天，超过一半以上的患者对治疗效果是满意的或者非常满意的。

h.与其基线分类为重度(11-15)相比较，患者在一段时间内在Hexsel-CSS上的得分首先被分为中度(6-10)或轻度(1-5)，然后继续被分为中度(6-10)或轻度(1-5)。

i.使用CR-PCSS、PR-PCSS、Hexsel CSS、Hexsel凹陷深度评分、里克特量表、凹坑分析、I-GAIS、S-GAIS、PR-CIS、PR-CIS减缩版、SSRS、SSCT、CR-TCES，PR-TCES，Body-Q中的一个或多个，通过摄影或其他图像进行的评估，或临床医生和/或患者用于评估脂肪团严重程度、改善和/或患者满意度的任何其他经验证的相片数字或其他量表测量患者恢复到基线或比基线更差的时间段。

j.使用CR-PCSS、PR-PCSS、Hexsel CSS、Hexsel凹陷深度评分、里克特量表、凹坑分析、I-GAIS、S-GAIS、PR-CIS、PR-CIS减缩版、SSRS、SSCT、CR-TCES，PR-TCES，Body-Q中的一个或多个，通过摄影或其他图像进行的评估或临床医生和/或患者用于评估脂肪团严重程度、改善和/或患者满意度的任何其他经验证的相片数字或其他量表测量从改善之日起到受试者不在对治疗有明显反应之日止的时间段。

k.测量从治疗反应的参考时间点到受试者的反应发生变化(包括对治疗最初反应的改善)的时间段。可通过CR-PCSS、PR-PCSS、Hexsel CSS、Hexsel凹陷深度评分、里克特量表、凹坑分析、I-GAIS、S-GAIS、PR-CIS、PR-CIS减缩版、SSRS、SSCT、CR-TCES、PR-TCES、Body-Q中的一种或者一种以上方法，通过摄影或其他图像进行的评估或使用的任何其他经验证的摄影数字或其他量表由临床医生和/或患者评估脂肪团的严重程度、改善和/或患者满意度，从而测量反应和/或改善的变化。在一些实施方案中，参考时间点是基线(给药前，第1天)或治疗后第71天。

l.从受试者根据CR-PCSS和PR-PCSS测定成为2级复合响应者的访视日期开始测量的一段时间，直到两次连续访视评估评分恢复并维持到基线评分的第一天。

m.从受试者根据CR-PCSS和PR-PCSS测定成为1级复合响应者的访视日期开始测量的一段时间，直到两次连续访视评估评分恢复并维持到基线评分的第一天。

H.胶原酶注射的安全性

到目前为止所做的研究(其中一些在下面的实施例中进行了详细说明)确定了本文所述治疗的安全性。例如，这些研究证实，在四个治疗区域同时皮下注射3.36毫克CCH后，胶原酶缺乏全身暴露。事实上，在四个治疗区域同时给药时没有观察到胶原酶在安全性方面的新问题。通常报告的事件与目前已知的胶原酶不良事件相一致。

大多数接受CCH治疗的受试者至少出现一次轻度到中度的TEAE。受试者在大腿或臀部治疗部位发生TEAE没有显著差异。TEAE最常见的类型是注射部位反应，特别是注射部位瘀伤，治疗部位(臀部或大腿)之间没有差异。大多数TEAE在21天内解决。临床和血液学实验室参数、尿液分析结果、生命体征或联合用药均无临床意义的变化。在临床上没有发现与抗药物抗体或中和抗体相关的受试者。

如实施例1和图16-18中的定义所述，可以进行瘀伤分析以测量瘀伤的程度。在某些实施方案中，由胶原酶治疗引起的任何瘀伤可在治疗访视后约3天、或4天、或5天、或6天、或7天、或8天、或9天、或10天、或11天、或12天、或13天、或14天、或15天或20天时消退或颜色强度显著降低。

I.实施例1

下面包括的实施例用以演示本发明的某些实施方案。然而，根据本发明的公开，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在所公开的特定实施例中进行修改，并且仍然获得类似的结果。因此，所有提出的问题都应解释为说明性的，而不是限制性的。例如，在使用CCH的研究中，其他胶原酶的使用量(治疗有效量)足以产生与CCH相当的活性和反应。在下文所述的临床试验结果中，应理解，所报告的每个数值并不打算严格限制。本发明公开的范围包括围绕与本文所述发明的事实和原理一致的每个值的范围。因此，每个值可以上下变化约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在某些情况下，根据特定值的上下文和环境，它可以上下变化约125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％或300％。例如，在一个实施方案中，治疗后第71天，大腿窝体积与基线相比的平均减少百分比为10％。然而，这样的降幅可能是30％。

实施例1-评价5种不同CCH注射技术治疗EFP的安全性和有效性的临床研究(研究209)

进行了一项开放性多中心研究，以评估五种不同注射技术在皮下注射CCH治疗成年女性所患轻度、中度，或重度EFP时的安全性和有效性(由研究者使用临床医生报告的相片数字皮下脂肪团严重程度量表(CR-PCSS)进行评估。

注射技术I(浅注射，3等分).在注射技术I中，当受试者俯卧时，使用1mL注射器(梯度为0.1mL)皮下注射CCH。针头是30号和1/2英寸长。每次注射包括单次皮肤注射CCH，分三等分每份0.1毫升，注射到位置A、位置B和位置C(总注射量为0.3毫升)。如图7所示，治疗I中使用的注射技术如下：(1)如果凹坑是细长的槽状凹坑，将针头垂直于皮肤表面并垂直于凹坑的长轴放置，则将针头的长度插入皮肤而不向注射器施加任何向下压力(位置A)，注射研究药物0.1ml；(2)轻轻抽出针头，并将其重新定位，使其与皮肤表面成约45°的角度并朝向受试者的头部，插入剩余长度的针头，无需从注射器(位置B)向下施加任何压力，并注射0.1mL研究药物；(3)轻轻抽出针头，并将其重新放置在与皮肤表面成约45°的角度处并朝向受试者的脚部，插入剩余长度的针头，不从注射器(位置C)向下施加任何压力，并注射0.1mL研究药物；以及(4)将针从注射部位完全抽出，然后继续下一个注射部位。在每次治疗期间，在每个治疗区域的12个注射点使用4个0.9ml注射器给药0.3ml研究药物(3等分每份0.1ml)。

注射技术II(浅注射，1等分)。在注射技术II中，当受试者处于俯卧位置时，使用1毫升注射器(梯度为0.1毫升)和30号1/2英寸针头皮下注射CCH。每次注射包括单次皮肤注射CCH，作为单次浅注射0.3mL研究药物。如图8所示，治疗II中使用的注射技术如下：(1)将针头与注射处的皮肤表面成约30°的角度并朝向受试者头部，将针头的长度插入皮肤，注射0.3mL研究药物；(2)将针头从注射部位完全抽出，进入下一注射部位。在每次治疗期间，在每个治疗区域的12个注射点使用4个0.9ml注射器给药0.3ml研究药物。

注射技术III(深注射，1等分)。在注射技术III中，当受试者处于俯卧位置时，使用1毫升注射器(梯度为0.1毫升)和30号1英寸针头皮下注射CCH。每次注射包括单次皮肤注射CCH，每次1英寸注射0.3毫升研究药物。如图9所示，治疗III中使用的注射技术如下：(1)将针头与注射处的皮肤表面成约30°的角度并朝向受试者头部，将针头的长度插入皮肤，并注射0.3mL研究药物；(2)将针头从注射部位完全抽出，进入下一注射部位。在每次治疗期间，在每个治疗区域的12个注射点使用含有0.9mL研究药物的四个注射器施用0.3mL研究药物。

注射技术IV(深注射和浅注射，5等分)。在注射技术IV中，当受试者处于俯卧位置时，使用3毫升注射器(梯度为0.1毫升)和30号1英寸针头皮下注射CCH。每次注射包括单次皮肤注射CCH，在位置A、B、C、D和E处分5次给药0.3毫升(总注射量为1.5毫升)。如图10所示，治疗IV中使用的注射技术如下：(1)将针头与皮肤表面成约30°的角度，并朝向受试者头部，将针头长度(1英寸)穿过皮肤(位置A)，注射0.3毫升研究药物：(2)在保持针头与皮肤表面成30°角的同时，将针头拔出约半英寸，并朝受试者一侧重新定位(位置B)，然后注射0.3毫升研究药物；(3)在保持针头与皮肤表面成30°角的同时，将针头重新定位到位置A和B之间的中间位置(位置C，朝向受试者肩部)，注射0.3mL研究药物；(4)保持针与皮肤表面成30°角的同时，重新定位针对向位置B(位置D)，注射0.3mL研究药物；(5)保持针与皮肤表面成30°角的同时，将针头重新定位到位置A和D之间的中间位置(位置E，朝向受试者的另一个肩膀)，并注射0.3mL研究药物；以及(6)将针头从注射部位完全抽出，继续下一个注射部位。在每次治疗期间，使用12支含有1.5mL的注射器在每个治疗区域的12个注射部位以0.3mL等分的量给药1.5mL研究药物。

注射技术V(浅注射，4等分).在注射技术V中，当受试者处于俯卧位置时，用3毫升注射器(梯度为0.1毫升)和30号1/2英寸针头皮下注射CCH。每次注射包括单次皮肤注射CCH，分为4等分每份0.3毫升，分别注射到位置A、B、C和D(总注射量为1.2毫升)。如图11所示，治疗V中使用的注射技术如下：(1)将针头与皮肤表面成约30°的角度，并朝向受试者头部，将针头长度(1/2英寸)穿过皮肤(位置A)，注射0.3毫升研究药物；(2)在保持针头与皮肤表面成30°角的同时，将针头从位置A向受试者肩部(位置B)重新定位约60°，并注射0.3mL研究药物；(3)在保持针头与皮肤表面成30°角的同时，将针头从位置B向受试者另一侧肩部(位置C)重新定位约60°，并注射0.3mL研究药物；(4)在保持针头与皮肤表面成30°角的同时，将针头从位置A向受试者另一侧(位置D)重新定位，注射0.3ml研究药物；(5)将针头从注射部位完全抽出，进入下一注射部位。

所述研究药物CCH是一种无菌冻干粉末，包括0.92mg溶组织梭菌胶原酶、蔗糖、Tris、甘露醇和pH值为8.5的盐酸。CCH无菌稀释液为0.6％氯化钠和0.03％脱水氯化钙水溶液。稀释液作为最终灭菌液体提供，每瓶4毫升。将CCH储存在2-8℃的温控冰箱中，并在重组后尽快施用重组CCH溶液。

研究对象为18岁或以上的未怀孕女性。每位受试者在筛查访视时的两条大腿或两个臀部得分为2分(轻度)、3分(中度)或4分(重度)，由研究者使用CR-PCSS量表确定。受试者在每个治疗区域至少有两个凹坑，这些凹坑与任何其他凹坑至少相隔5厘米，在Hexsel凹陷深度量表上得分为2或3分，并且有宽长比大于或等于0.5。所有受试者根据病史、体检结果和筛查时的实验室资料被认为健康状况良好。共有64名受试者参加了这项研究。臀部治疗组共纳入32名受试者，其中31名受试者纳入安全人群，29名受试者纳入可评价人群。臀部治疗组的一名受试者因未接受治疗而被排除在安全性和可评价人群之外。大腿治疗组共纳入32名受试者，其中32名受试者纳入安全人群，29名受试者纳入可评价人群。大腿治疗组的三名受试者被排除在可评估人群之外，因为没有里克特量表数据。

在治疗前第1天的访视中，对指定的治疗区域(两个臀部或两条大腿)进行拍照，并以与筛查时相同的方式评估其合格性。在确认纳入/排除标准后，研究者选择并标记明确定义的治疗区域(左和右臀部，或左和右大腿后外侧)的凹坑，当受试者以一致的放松姿势站立(不使用任何操作，如捏皮或肌肉)时，这些凹坑清晰可见收缩，适合治疗。如果两个臀部和两条大腿都符合单一受试者的入组标准，那么大腿就要接受治疗。在这项研究中，没有受试者的臀部和大腿同时接受EFP治疗。

研究者确定每个治疗区域至少有2个凹坑，这些凹坑与其他凹坑间隔≥5cm，在Hexsel CSS(B)凹陷深度量表上得分为2或3。对选定治疗区域的凹坑进行标记治疗，并在标记凹坑后再次拍摄该区域。

第1天，按顺序将治疗分配给五种注射技术中的一种，并对受试者进行24次注射(每个治疗区域12次注射)。在每次治疗访视时，无论指定的治疗组(注射技术)如何，所有符合条件的受试者在每个指定的治疗区域注射等量的CCH(0.84mg)。受试者最多再返回接受额外2个疗程的治疗，并遵循相同的程序(摄影、评估、评分、摄影、治疗)。每次治疗间隔约21天。每名受试者的所有24次注射(每个治疗区域12次)都必须在指定的治疗区域内进行3个疗程。每个受试者接受所有3次治疗。如果在第2个疗程没有注射，受试者仍然返回第3疗程，再次对治疗区域进行拍照和评估。研究结束(EOS)是最后一名受试者完成第71天研究结束访视的时间。在EOS/提前终止(ET)就诊时，对每个受试者的每个治疗区域进行拍照和评估，并进行安全性评估。

表20概括了每个治疗臂的注射体积和浓度。

本研究的疗效终点包括：(a)各治疗组在第22、43和71天时，各治疗部位(臀部或大腿)的美感评分与基线检查时相比的变化，(b)治疗部位与正常皮肤相比的瘀伤值的变化，以及(c)与对照组相比的变化治疗组在第22、43和71天的Hexsel CSS(B)凹陷深度量表基线检查。用三维摄影分析了凹陷体积。

里克特量表得分测定的功效。如下表所示，使用线性模型分析了从基线检查时开始的美学外观改善的里克特量表得分，其中每种注射类型(I-V)、研究访视、治疗臂的相互作用和研究访视为固定效应。给出了治疗组和研究访视的交互作用效应的固定效应估计和95％置信区间。使用每个治疗区域(即左臀、右臀、左大腿和右大腿)的响应以及治疗区域左右两侧的平均值(即左臀和右臀的平均值；左大腿和右大腿的平均值)来拟合该模型。每个治疗区域的美学外观比基线改善情况由盲中心评估员使用5点Likert量表进行评估。

使用计数和百分比(按治疗组和研究访视/天(第22天、第43天和第71天)对每个治疗区域上与基线相比里克特美学外观评分改善程度的平均值和标准差进行总结。使用上述拍摄的图像，中心评估员完成了5点里克特量表，以衡量每个治疗区域的美学改善水平。美感改善得分为差(-1)，-保持不变(0)，改善(1)，显著改善(2)和非常显著的改善(3)。在第22、43和71天评估疗效。在第22天、43天和71天，由盲中心评估员使用5点里克特量表对每个治疗臂的每个治疗区域(臀部或大腿)的美感改善情况进行评估。里克特评分为：差(-1)、无变化(0)、改善(1)、显著改善(2)、非常显著的改善(3)。评估员同时获得两张图像，基线位于屏幕左侧，就诊图像位于屏幕右侧。评估员将访视图像与基线进行比较，并记录里克特评分。对于臀部，每次访问只有一个方向图像与基线图像进行比较。然而，对于大腿，有3个方向图像；因此，每次就诊时有3对图像；1对0°(侧位)、1对45°(斜位)和1对90°(后位)。因此，评估员必须查看所有三对(即基线侧位和第71天侧位、基线斜位和第71天斜位、基线后位和第71天后位)，然后记录整个大腿的单个里克特评分(1个值)。

一般来说，如下表21和22所示，根据每个治疗臂的里克特评分，左、右臀部在美学外观方面比基线水平有相似的平均改善。

如表21所示，平均左、右臀部，在第71天，所有注射类型与基线相比在美观方面都有改善，注射类型I、II、III和V有显著改善；注射类型IV仅在第22天和第43天有显著改善。总的来说，从第22天到第71天，除了注射型IV外，与基线检查时相比，注射型IV的受试者臀部美学外观的平均改善程度趋于改善。与基线检查时相比，注射型IV的受试者中有一半在第71天左右臀部的里克特评分没有变化或更差。一般来说，左大腿和右大腿在每个治疗臂的美学外观方面比基线有相似的平均改善。平均左大腿和右大腿，在第71天，与基线相比，所有注射类型均能改善美学外观，注射类型I能实现显著改善。一般来说，在所有注射类型中，从第22天到第71天，与基线相比，大腿美学外观的平均改善率都呈下降趋势。虽然在右大腿和左大腿，一些受试者在第71天的里克特得分比基线时更差，但申请人认为使用3对产生1个完整大腿得分的方法可能有缺陷。

下表22和23总结了里克特量表评分数据的进一步疗效结果。

表22.里克特量表按治疗区域与基线相比进行评分分析美貌改善情况

表23.治疗区域里克特量表评分相对于基线的美学外观改善总结

Hexcel CSS(B)凹陷深度.Hexsel CSS是一个相片数字量表，用于评估脂肪团的5个关键形态特征：(a)明显凹陷的数量，(B)凹陷的深度，(C)皮肤表面改变的形态外观，(D)皮肤松弛、松弛或下垂，以及(E)基于医学文献的当前分类量表(Hexsel，2010；Nürnberger，1978).在这项研究中，只评估了“B-凹陷深度”。研究人员或合格的指定人员使用HexselCSS评估每个臀部或大腿的EFP凹陷深度。评估是在受试者处于站立姿势，臀肌放松的情况下进行的。研究人员在第22天、第43天和第71天的筛查访视时，使用Hexsel CSS(B)凹陷深度量表评估凹陷深度，并将其分级为：无凹陷(0)、浅表凹陷(1)、中等深度凹陷(2)和深凹陷(3)。分析和总结每个治疗区域的Hexsel CSS(B)凹陷深度量表评分在基线检查后的变化。

在第22天、第43天和第71天，按注射类型对Hexsel CSS(B)凹陷深度量表与基线相比的变化进行评估，并将其分级为：无凹陷(0)、浅表凹陷(1)、中等深度凹陷(2)和深凹陷(3)。从第1天到第71天，Hexsel CSS(B)的负变化表明凹陷深度有所改善。一般来说，左臀和右侧臀在Hexsel CSS(B)凹坑凹陷深度方面与基线检查时有相似的平均改善。在第71天左右臀部平均，所有注射类型的平均凹陷深度都有所改善。注射型I改善最大(-1.17)，其次是注射型IV(-0.83)，改善有统计学意义。这些结果汇总在下表24中。

在注射类型I中，从第22天到第71天臀部组(平均左侧和右侧)的凹坑凹陷深度改善LS平均值有所改善。在注射类型V中，从第22天到第71天臀部组(平均左侧和右侧)的凹坑凹陷深度改善LS平均值维持不变。

一般来说，左大腿和右大腿在每种注射类型的Hexsel CSS(B)凹坑凹陷深度方面与基线相比有相似的平均改善。在第71天，平均左大腿和右大腿，所有注射类型的平均凹陷深度都有所改善。注射型IV改善最大(-1.40)，其次是注射型V(-0.80)，改善有统计学意义。在IV和V两种注射类型中，大腿组(平均左侧和右侧)的凹坑凹陷深度平均改善，从第22天到第71天有所改善。

3-D照片的图像分析.采用三维摄影图像评价治疗效果。研究人员或合格的指定人员在注射前用标准化的数码相机对每个治疗部位(臀部或大腿)进行拍照，在治疗第1天、第22天和第43天标记凹坑和注射部位前后进行拍照。在筛选和所有其他非给药访视时，对每个治疗区域拍摄一组照片。在第4天、第8天、第15天、第22天、第43天和第71天(研究结束/ET)拍摄的照片由一名对治疗组和研究访视日不知情的中央评估员进行审查。

下面讨论用于评估瘀伤、体积、表面积和最大长度/宽度的标准图像分析(IA)程序。本研究使用的相机系统是购自Canfield Scientific公司的IntelliStudio，配备有定制照明、Vectra M1相机和Canfield Capture软件(3.5版)。图像类型、属性、视图和访问窗口被定义并将其直接输入研究方案内的数字监控系统(DMS)。DMS中的研究设置包括以下内容：

图像被捕获并分阶段放入DMS中，供审查。摄影访问包括：筛选、第1天/预评分、第1天/后评分、第4天、第8天、第15天、第22天/预评分、第22天/后评分、第43天/预评分、第43天后评分和第71天/ET。

凹坑分析：检查图像，确保每个象限中的主凹坑都标有“X”。如果未标记主凹坑，则采取以下步骤：

1.拍照并用PowerPoint打开图像；

2.联系现场并要求该现场的调查员在PowerPoint内将主凹坑标记为X。

3.保存信件并于图像分析(IA)小组共享。

在第1天(预标记)、22天、43天和71天进行凹坑分析。

IAT(图像分析小组)使用第1天标记后图像作为参考，以确定第1天标记前图像上目标凹陷的位置。在第1天-预标记时，在凹坑凹陷边缘周围进行追踪。将凹坑追踪转移到第22天预标记、第43天预标记和第71天/ET图像。该追踪用于测量(i)最大长度(即，穿过凹坑的最长直线距离)；(ii)最大宽度(即，垂直于最大长度测量的最长直线距离)；(iii)凹坑的表面积；以及(iv)凹坑底部和内插表面之间的体积。

瘀伤分析：检查图像，确保每幅图像和瘀伤区域外都有白色参考标签。如果参考标签不存在或阻碍了瘀伤区域，则要求重新拍摄(如果可以)。在第1天(标记前)、第4天、第8天和第15天进行瘀伤分析。

现场标记分析：检查图像以确保在标记后第1天就诊时标记凹坑。如果没有标记凹坑，则要求重新拍摄(如适用)。现场标记分析：

图像分析(IA)工作流程图：所有选择用于分析的图像都被分配了随机跟踪号，这使得图像分析技术人员(IAT)不能知晓诸如调查地点、受试者二级识别码和/或治疗臂等信息。特定就诊的分析程序是根据就诊名称预先确定的。对预先确定的主凹陷进行凹陷分析，包括体积、表面积和最大长度/宽度的测量。瘀伤分析包括在未受影响的皮肤上感知到的瘀伤区域和感知到的瘀伤外部区域的L*a*b*颜色测量。现场标记分析包括最大长度/宽度以及跟踪的表面积测量。

图像注册：在接受第1天的预标记(基线)检查后，IAT在Vectra分析模块(VAM)软件中打开预标记图像，并将图像居中放置在三维空间的网格上。使用网格作为参考，IAT定位基线图像，使图像的近似中心位于网格的原点。大腿/臀部朝+z方向向前，大腿/臀部上部朝+y方向，大腿/臀部下部朝-y方向(图13)。所有后续时间点，包括第1天的标记后图像，都使用算法注册函数注册到基线图像在网格中的位置。

在VAM中生成了一张彩色距离图，IAT使用该图来审查登记。基于+5到-5毫米(mm)(图14)的色阶，颜色-距离映射表示两(2)个图像模型之间的距离。IAT确保了大部分图像都是绿色的，这表明两个图像之间的距离可以忽略不计，并且它们是正确对齐的。

颜色	与基线的距离
		绿色	0或者可忽略的举例
青色→蓝色	正向距离(高达+5mm)
		黄色→红色	负向距离(低至-5mm)

表面跟踪处理：图像注册后，对第1天(预标记)、第4天、第8天、第15天、第22天、第43天和第71天的图像进行表面跟踪处理。IAT首先使用一个脚本来创建第一天的高密度网格模板，即基线图像。在VAM软件中一次打开一张随访图像，同时打开基线和网格模板。跟踪种子地标被放置在可识别的皮肤特征上作为参考。运行跟踪脚本以编程方式创建和保存三(3)个新的三维图像，一个跟踪基线图像、一个跟踪的随访图像和一个质量控制(QC)图像，这是跟踪跟踪图像的形状，并传递有关跟踪质量的信息。

质量检查IAT审查了跟踪的随访图像和QC图像的质量，以验证跟踪是否成功。对于接受凹坑分析的访视，IAT还将QC图像覆盖在跟踪的随访图像上，以确保在主要凹坑区域的QC图像上没有大的孔。QC图像的网格上有一个洞，表明丢失区域的跟踪信息。如果由于分析区域内的信息丢失，IAT认为跟踪不可接受，则调整跟踪种子地标并再次运行跟踪脚本。IAT指出，由于眩光、深阴影、衣服在皮肤上留下的印记、受试者体位的大变化或皮肤色素沉着的大变化，不可避免地会出现表面跟踪质量差的情况。QC图像的网格中的孔预计位于强瘀伤区域。

主要凹陷感兴趣区域(AOI)划分：在成功的表面跟踪之后，IAT打开跟踪的基线图像，并在VAM中注册标记后第1天的图像。在第1天的标记图像上，IAT追踪了主要凹陷部位标记的外缘。该追踪用于测量现场标记的表面积、穿过现场标记的最大轴(最大凹坑长度)及其最大垂直轴的长度(最大凹坑宽度)。这种追踪并没有用于描绘凹坑或瘀伤分析的AOI。如果现场未发现主要凹坑，IAT会追踪他/她认为最大的凹坑。

IAT使用第1天-标记后图像作为参考，在第1天-标记前图像上定位目标凹坑。然后，IAT在跟踪的预标记图像上跟踪主凹坑的边界。根据需要调整跟踪，直到刚好超出凹坑变凹的脊线，并描绘出用于凹坑分析的主凹坑AOI。(图15).根据每个随访图像与基线(图16)的唯一表面跟踪关系，将跟踪预标记图像上的凹坑跟踪转置到第22天、第43天和第71天的随访图像上。IAT注意到任何影响转置AOI的图像质量差的情况。

感兴趣的瘀伤区域(AOI)划定：IAT创建了一个“瘀伤组织”AOI，即在第4天图像(17)上最大可感知瘀伤周围的一个连续追踪。IAT追踪了他/她可以确定瘀伤皮肤和未受影响皮肤之间皮肤色素沉着差异的周长。如果皮肤呈现与周围肤色不同的蓝色/紫色、绿色或黄色/棕色色素沉着，则认为皮肤有瘀伤。如果在第4天的图像上无法分辨出瘀伤，则受试者未能进行瘀伤分析。

此外，IAT还创建了第二个跟踪，“正常组织”AOI。正常组织AOI是在不受衣服压线、异常发红或痤疮或疤痕组织等皮肤特征造成的皮肤纹理扭曲影响的皮肤区域创建的。在可能和适用的情况下，正常组织AOI试图匹配第一天预标记瘀组织AOI曲率上出现的任何阴影、光泽或眩光。正常组织AOI的大小和形状因受试者不同而不同，这取决于可用的自然外观皮肤的数量。追踪后，IAT根据第4天图像的表面追踪关系，将第4天图像中的瘀组织织和正常组织AOI转换为第1天-预标记、第8天和第15天图像。如果某一特定受试者或受试者一侧的其他瘀伤分析访视的边缘之外有一个或多个AOI，则应对AOI进行调整，直到所有访视的AOI一致。

IAT在第1天-预标记、第4天、第8天和第15天的图像上手动追踪白色参考标签，并将追踪标记为“白色”。如果白色参考标签放置在瘀伤区域内，IAT追踪标签的边界，并在每次受影响的就诊时从瘀伤AOI中减去。在图像上不存在白色参考标签的情况下，该图像不符合擦伤分析的目的。

质量控制(QC)检查：QC检查由独立于对图像进行分析的IAT执行。根据给定就诊的分析程序，进行一组单独的QC检查。QC IAT在整个QC检查过程中所做的任何调整都会被记录下来，并在通过分析之前由另一个IAT重新进行QC。在开始QC之前，QC IAT审查了原始IAT关于图像质量问题的任何注释。

·QC IAT审查第1天-预标记图像，以便正确登记到VAM网格。QC IAT还参考了第1天(后标记)的图像，以确保在第1天(预标记)的图像上正确识别和追踪了主凹坑。QC IAT审查了主要凹坑AOI，以确认AOI的周长刚好落在凹坑变凹的脊线之外。然后，QC IAT检查是否存在正常组织和瘀组织AOI，确保正常组织AOI是代表性的颜色样本。QC IAT仅在必要时调整每个AOI的周长，并记录所做的任何更改。如果对AOI或地标位置进行了更改，IAT将更新后的AOI转置到相应的后续图像上.

·第1天-标记后图像由QC IAT审查，以确保沿着现场凹坑标记的外边界进行适当追踪，如果选择不当，则调整AOI。不正确的选择包括在现场标记的内边界上进行跟踪或跟踪未指定为主要凹坑的凹坑。

·QC IAT对第22天、第43天和第71天的图像进行检查，以获得可接受的跟踪质量。质量控制IAT参考质量控制跟进图像，以确保主凹坑AOI内的质量控制图像上没有孔。如果一个洞落在主要酒窝AOI内，质量控制IAT会为访问添加一个“跟踪质量差”的注释。在大多数主要凹坑AOI由表面跟踪脱落组成的情况下，QC IAT建议图像失效。

·首先对第4天、第8天和第15天的随访图像进行检查，以确定正确的瘀伤轮廓。QCIAT调整了第4天图像上瘀伤AOI的周长，以防原始周长始终包含更多的瘀伤变色，或者周长包含未擦伤的皮肤。QC IAT注意到了对瘀组织AOI的任何调整，并且还推荐了一个受试者作为挫伤分析失败案例，该受试者在瘀伤和正常肤色之间没有可识别边界。然后，QC IAT检查是否存在正常组织AOI，确保AOI的命名正确，并且正常组织AOI是一致且具有代表性的颜色样本。基底皮肤AOI内任何异常、不可避免的着色均会被QC IAT所注意。如果对第4天的图像上的瘀组织织或正常组织AOI进行了任何调整，IAT将调整后的轨迹转换到第1天-预标记、第8天和第15天的图像。最后，IAT确保每张图像上的白色参考标签被追踪并正确命名为“白色”。如果参考标签被放置在损伤组织内，则QC IAT确保标签从瘀组织AOI中减去。没有白色参考标签的图像无法进行瘀伤分析。

分析测量：图像通过QC后，分析IAT审查QC IAT的记录。然后，分析IAT运行一个脚本化的分析过程。根据给定的访视，不同图像的程序和分析终点不同。对于凹坑体积分析，在主凹坑AOI顶部创建插值曲面。体积测量表示内插表面和凹坑底部之间的空间。

在第1天-标记后图像的情况下，表面积测量为主要凹陷AOI或现场跟踪AOI的总表面积。最大凹坑长度测量为穿过主凹坑AOI的最大点对点轴。最大凹坑宽度测量为垂直于最大凹坑长度轴的最大点到点距离。

瘀伤分析由两个L*a*b*颜色测量所组成。L*a*b*在瘀组织和正常组织AOI(图18(A))内测量颜色值。下表总结了所进行的分析(表25)。

表25.瘀伤分析总结

接受数据：一旦图像分析完成，分析IAT要么接受图像，要么分析图像失败。图像可能部分失败，例如，第1天的预标记访视可能因第4天没有可见瘀伤而未能通过瘀伤分析，但仍然可以接受凹坑分析。所有故障都会收到一份强制性故障通知单，详细说明图像模型无法接受分析的原因。图像故障可能是由于图像质量差、跟踪质量差或AOI内的障碍物等因素造成的。QC IAT建议图像失效，分析IAT审查图像。如果分析IAT同意失败建议，则图像失败。

瘀伤分析.在第1、4、8和15天使用两个L*A*B*颜色测量在3维照片上进行瘀伤组织和正常组织分析(图18(B)).L*A*B*颜色强度测量值越大，瘀伤越严重。下表26显示了每个治疗区域和注射类型的两种颜色的瘀伤组织和正常组织之间的视觉感知变化。

在第1天预标记时，所有注射类型的颜色坐标相似。在臀部(左侧和右侧)，注射类型I、III、IV和V在第4天达到瘀伤峰值；注射类型II在第8天达到瘀伤峰值。臀部瘀伤在注射类型III和IV中最大。所有注射类型的臀部瘀伤在第15天都显著减少。在大腿(左侧和右侧)，所有注射类型在第4天达到瘀伤高峰。大腿在注射类型I中瘀伤最大。所有注射类型的大腿瘀伤在第15天都显著减少。

凹坑体积分析。对于每个治疗的臀部和大腿，四个凹坑参数包括最大长度(穿过凹坑的最大直线距离)、最大宽度(垂直于最大长度测量的最大直线距离)、表面积，评估目标凹坑的体积(凹坑底部和内插表面之间)。在每一条大腿上，测量目标凹陷的最大长度、最大宽度、表面积和体积。从第1天开始的负变化表明情况有所改善。结果摘要见下表27：

在臀部，所有注射类型的凹坑表面积都比基线检查时有平均百分比的改善，其中注射类型V(左臀部)和注射类型IV(右臀部)能够实现最大的改善。在大腿中，注射类型IV(左大腿)和注射类型II(右大腿)的表面积改善最大，而注射类型III在左大腿的表面积没有改善。

一般来说，左臀和右臀在每种注射类型的酒窝体积方面比基线检查时有相似的平均改善。平均左臀部和右臀部，在第71天，与基线相比，所有注射类型的凹坑体积均有改善，注射类型II和注射类型V有显著改善。总的来说，从第22天到第71天，除了注射型III外，臀部凹坑体积与基线相比的改善趋向于更好。

一般来说，左侧大腿和右侧大腿在所有注射类型的凹坑体积方面都比基线水平有相似的平均改善。在第71天，注射类型I、II、IV和V的左侧大腿和右侧大腿的平均值显示，与基线相比，凹坑体积有所改善。在大腿，治疗臂之间的凹坑体积差异非常小，因此无法对注射类型进行比较。一般来说，从第22天到第43天，与基线相比，大腿处的凹坑体积的改善趋向于变好，注射类型III除外。

在第22天、第43天和第71天，通过使用描述性统计(图19(A)-19(C))按治疗区域和注射类型总结观察到的和第1天预标记图像在凹坑分析参数、最大长度、最大宽度、表面积和凹坑底部与内插表面之间的体积方面的变化。此外，采用线性模型对体积进行了分析。提供了凹坑分析参数列表。

结论和总结。本研究的主要目的是评估不同注射技术对EFP患者CCH的治疗效果。通过使用三维摄影和里克特评分评估每个治疗组的美学外观改善，使用三维摄影分析每个治疗组的凹坑参数变化，并使用Hexsel CSS(B)凹陷深度量表评估凹坑深度凹陷评分的变化来评估这一目标。

功效/臀部：在第71天(EOS)，使用5点里克特量表和左右臀部平均值评估美貌改善情况，所有治疗均显示与基线相比美貌改善，注射类型I、II、III和V均有显著改善。

分析凹坑参数的变化并平均左右臀部，在第71天，所有治疗显示凹坑体积与基线相比有所改善，治疗II和V有显著改善。此外，在臀部，所有注射类型产生的凹坑表面积比基线平均百分比改善，注射类型5产生最大的改善。

使用Hexsel CSS(B)凹陷深度量表评估凹坑凹陷深度的变化，并平均左右臀部，在第71天，所有治疗组的LS平均凹陷深度都有所改善。然而，注射类型I在臀部的改善最大(-1.17)，其次是注射类型IV(-0.83)，且改善具有统计学意义。综上所述，在臀部，注射类型I和V是最有效的，因为每种类型在≥2个疗效终点上都有最大的益处。也就是说，注射型I在美感改善(里克特评分)和凹坑凹陷深度改善(Hexsel CSS(B))方面显示出最好的疗效，注射型V在美感改善(里克特评分)和凹坑参数评估(表面积和体积)方面显示出最好的疗效。

功效/大腿：在第71天(EOS)，使用5点里克特量表评估美感外观的改善，并平均左大腿和右大腿，与基线相比，所有注射类型的美感外观均有改善，注射类型I有显著改善。然而，假设使用三对产生一个完整大腿评分的里克特评分方法是有缺陷的，因此大腿的里克特评分由盲中心评估员重新评估，以产生每张图像的一个里克特评分。

分析凹坑参数的变化并平均左右大腿，在第71天，注射类型I、II、IV和V显示与基线相比凹坑体积有所改善。然而，治疗臂之间的凹陷体积差异很小，因此无法对注射类型进行比较。

使用Hexsel CSS(B)评估凹坑凹陷深度的变化，并平均左大腿和右大腿，在第71天，所有注射类型的LS平均凹陷深度都有所改善。然而，注射类型IV组的大腿改善最大(-1.40)，其次是注射类型V组(-0.80)，改善有统计学意义。综上所述，在大腿，注射类型I和V是最有效的，因为每种类型在≥2个疗效终点上都有最大的益处。也就是说，根据美貌改善(里克特评分)和凹坑凹陷深度改善(Hexsel CSS[B])结果，注射类型I显示出最佳疗效，根据美貌改善(里克特评分)和凹坑参数评估(表面积和体积)结果，注射类型V显示出最佳疗效。

安全性：本研究的第二个目的是评估在EFP受试者中使用不同注射技术给予CCH的安全性。这一目标通过不良事件、注射部位反应/局部耐受性、生命体征、心电图、临床实验室参数(包括血液学、血液化学和尿液分析)、瘀伤和免疫原性(结合抗体和中和抗体)来实现。为了使注射类型被认为是安全的，它需要在整个人群中是安全的和良好的耐受性，无论是任何区域。

对不良事件的评估表明，注射部位结节在注射类型II和III中最常见(分别为10例[76.9％]受试者和39例，10例[83.3％]受试者和26例)。注射部位变色最常见于注射类型II(6名受试者[46.2％]，13例)。注射III型受试者中有最大比例的受试者有严重的SOC全身紊乱和给药部位状况。具体而言，注射III型受试者中注射部位严重瘀伤(6例，50％)、注射部位疼痛(4例，33.3％)和注射部位结节(3例，25.0％)的比例最高。注射类型II治疗相关TEAE发生频率最高，持续时间＞21天(31个事件，16.7％)，所有治疗相关TEAE的中位持续时间最高(12.5天，范围：1,52)。

在臀部(左侧和右侧)，注射类型I、III、IV和V的瘀伤在第4天达到峰值；注射类型II的瘀伤在第8天达到峰值。在大腿(左侧和右侧)，所有注射类型的瘀伤在第4天达到高峰。在第15天，所有注射类型和区域的瘀伤都显著减少。通过测量作为对照的正常组织的颜色坐标变化来评估瘀伤分析(L*A*B*颜色测量)结果的可靠性。对正常组织进行的分析显示，瘀伤测量中存在一定的噪声，这可能与技术本身或拍摄环境有关。然而，在经过治疗的组织中，随着时间的推移，瘀伤的改善程度远远大于噪音水平。因此，瘀伤分析可以被认为是有意义的数据。没有死亡或治疗相关的中断发生。在研究期间，实验室评估、生命体征、体检结果或其他观察结果中未观察到与临床相关的趋势。在研究期间，实验室评估、生命体征、体检结果或其他观察结果中未观察到与临床相关的趋势。

考虑到注射类型II和III与安全的问题最为有关，无论疗效如何，都不建议在臀部或大腿使用这些浅和深静脉推注技术。根据综合的安全性和有效性数据，建议臀部采用注射类型I(3次浅注射)或技术IV和V的组合(例如，4次浅注射，第五次注射根据凹坑深度可以是深注射或者浅注射)。如果凹陷较深，大腿应采用注射类型IV(单次深部注射加4次浅注射)，如果凹陷较浅/水平，应进行五次浅注射。

实施例2-A 2a期，CCH治疗成人女性大腿后外侧水肿性纤维硬化性泛神经病变的开放标记研究(研究212)

根据2a期和2b期EFP研究的疗效和安全性结果，每个治疗区域(两个治疗区域；臀部或大腿1.68mg)的CCH剂量为0.84mg，需要对大腿进行进一步研究。除其他目的外，本研究还将尝试观察治疗后凹坑区域的变化，以评估CCH对引起凹坑的组织和/或隔膜的影响。将这些数据与组织病理学和MRI数据进行比较，试图了解CCH的作用机制。因此，本研究是一项2a期开放标签研究，探讨CCH治疗成年女性大腿EFP的有效性和安全性。

研究的持续时间如下：

筛查阶段：最多28天(第-28天到第-1天)(持续时间包括在活检或给药前安排和进行MRI成像)

·滴定阶段：N/A

·治疗阶段：71天

·长期随访阶段：109天(第72-180天)的长期功效评估，到第180天(研究结束)

所有受试者将根据预先确定的纳入和排除标准进行筛选，例如，18岁或以上的非孕妇大腿有EFP，体重指数为20-35kg/m2。受试者必须在每个选定的治疗区域(每个大腿)至少有两(2)个清晰的孤立凹坑，其中3个将被选择用于MRI和活检(组织病理学)程序。所有受试者将根据病史、体检和筛查时的实验室资料判断为健康状况良好。

受试者将接受一个疗程，最多包括3次治疗访视(疗程)，间隔21天(即第1天、第22天和第43天)。每次治疗访视时的注射量和剂量将根据上述治疗IV确定。三次治疗访视共施用5.04mg CCH。CCH制剂如上所述。

待处理凹坑的选择将由研究人员决定。疗效评估将在第43、106、150和180天的研究访视期间进行。在基线和第71、120和180天进行功效评估。将在第71天评估结束时进行MRI和组织病理学检查。

每次治疗访视时，当受试者保持一致的、标准化的放松站立姿势时，在标记凹坑和注射部位前后，对每个选定受试者的治疗区域(选定的大腿)进行拍照。研究者将在第22、43、64、85、106、150和180天使用研究者整体美学改善量表(I-GAIS)和Hexsel CSS评估治疗区域。在第1天、第22天、第43天、第64天、第85天、第106天、第150天和第180天就诊时受试者的治疗区域将进行Cherry成像(www.cherrymaging.com)。此外，受试者将在第22天、第43天、第64天、第85天、第106天、第150天和第180天使用受试者整体美感改善量表(S-GAIS)评估治疗区域。受试者评估将在每次治疗访视时独立于研究者评估之前完成。此外，疗效评估将在注射用酒窝标记前进行。

研究人员将使用CR-PCSS寸治疗后的大腿进行现场评估。受试者(S-GAIS)和研究者(I-GAIS)将完成总体评估。具体而言，评价标准如下：

1.功效：

a.每个治疗区域的研究者整体美学改善量表(I-GAIS)：7级量表，范围从3(非常显著的改善)到-3(非常显著的变差)(在第43、106、150和180天测量)

b.每个治疗区域的受试者整体美学改善量表(I-GAIS)：7级量表，范围从3(非常显著的改善)到-3(非常显著的变差)(在第43、106、150和180天测量)

c.在第106、150和180天进行Body-Q量表

d.Hexsel CSS将在筛选时以及第106、150和180天进行评估

e.组织病理学(通过皮肤活检)将在基线检查第71天和第180天以及基线检查第150天和第180天进行评估.

f.磁共振成像(MRI)将在基线、第71天和第180天对同一受试者进行组织病理学评估。

2.在整个研究过程中，将通过记录以下内容来评估安全性：

a.副作用(AEs)(包括特别关注的事件(AESI)；是指发生在远离给药部位的瘀伤、瘀斑、血肿和挫伤等不良事件，或任何过敏反应，包括过敏反应)

b.生命体征

c.临床实验室检查

d.免疫原性评估(即通过测定结合和中和抗-AUX-I和抗-AUX-II抗体水平进行评估)

研究的主要终点是第180天至少一条大腿的2级I-GAIS应答者(在研究者GAIS评估中定义为+2或更多的受试者)的比例。研究的主要终点是第180天至少一个臀部的2级I-GAIS应答者(在研究者GAIS评估中定义为+2或更多的受试者)的比例。

次级终点：

·在第22天、第43天、第64天、第85天、第106天、第150天和第180天，受试者在治疗大腿I-GAIS各个水平的比例

·在第22天、第43天、第64天、第85天、第106天、第150天和第180天，受试者在治疗臀部I-GAIS各个水平的比例

·在第22天、第43天、第64天、第85天、第106天、第150天和第180天，受试者在治疗大腿S-GAIS各个水平的比例

·在第22天、第43天、第64天、第85天、第106天、第150天和第180天，受试者在治疗臀部S-GAIS各个水平的比例

·在第22天、第43天、第64天、第85天、第106天、第150天和第180天，受试者在治疗大腿I-GAIS 1-级响应者(定义为I-GAIS评估中得分+1或更高的受试者)的比例

·在第22天、第43天、第64天、第85天、第106天、第150天和第180天，受试者在治疗臀部I-GAIS 1-级响应者(定义为I-GAIS评估中得分+1或更高的受试者)的比例

·在第22天、第43天、第64天、第85天、第106天、第150天和第180天，受试者在治疗大腿S-GAIS 2-级响应者(定义为S-GAIS评估中得分+2或更高的受试者)的比例

·在第22天、第43天、第64天、第85天、第106天、第150天和第180天，受试者在治疗臀部S-GAIS 2-级响应者(定义为S-GAIS评估中得分+2或更高的受试者)的比例

·在第22天、第43天、第64天、第85天、第106天、第150天和第180天，受试者在治疗大腿S-GAIS 1-级响应者(定义为S-GAIS评估中得分+1或更高的受试者)的比例

·在第22天、第43天、第64天、第85天、第106天、第150天和第180天，受试者在治疗臀部S-GAIS 1-级响应者(定义为S-GAIS评估中得分+1或更高的受试者)的比例

·在第22天、第43天、第64天、第85天、第106天、第150天和第180天，大腿HexselCSS总分与基线相比的变化

·第150天和第180天大腿皮下脂肪团Body-Q鉴定

所有终点将使用适当的描述性统计数据(按时间点)或其他适当的统计数据包进行汇总。对于组织病理学(活检)分析，病理学家将报告与基线检查的任何组织差异。对于MRI分析，将获取图像并显示治疗前后的任何组织变化和任何隔膜形态差异。

申请人希望本研究将根据上述终点确定CCH的疗效和安全性。

实施例3-一项多中心、开放标签、多剂量、3B期研究，评估CCH对轻度和中度EFP成年妇女的安全性和疗效(研究305)

这是一项多中心、开放标记、多剂量、3b期研究，旨在评估CCH对轻度和中度EFP成年女性的安全性和有效性。将筛选大约200名受试者，以便在2个队列中登记大约150名受试者。所有受试者将根据预先确定的纳入和排除标准进行筛选，例如，18-60岁的非孕妇，大腿和臀部有EFP，体重指数为18-30kg/m²。所有受试者将根据病史、体检和筛查时的实验室资料判断健康状况良好。

经过大约14天的筛选期后，合格受试者将被随机分配到2个队列中的1个。第一组约有80名受试者的大腿后外侧有轻度或中度EFP；第二组约有70名受试者的臀部有轻度或中度EFP。

在3个疗程(第1天、第22天(+7天)和第43天(+14天)中，所有受试者将在每个治疗区域(臀部或大腿)接受0.84mg CCH(如上所述)，在两个大腿或者两侧臀部接受的总剂量为每疗程1.68mg。受试者将在第90天和第180天返回现场进行终点和其他研究评估及随访。

对于每个臀部，根据治疗I，体积为3.6mL，剂量为0.84mg的CCH将作为12次皮下注射(0.3mL注射剂，作为三个每次注射0.1mL等分的注射剂施用)施用。

根据治疗IV，每只大腿将皮下注射0.84毫克CCH(18.0毫升)，作为12支皮下注射剂施用(1.5毫升注射剂，分成五个0.3毫升的等分施用)，但经过修改，医生可以选择1/2英寸或1英寸的注射深度作为中心部分。对于每根大腿，每次注射体积为1.5毫升CCH，分为5个0.3毫升的等分注射，并且每次注射0.07毫克CCH，共注射0.84毫克CCH，总注射体积为18.0毫升。对于双大腿治疗，每次注射1.68毫克CCH，总注射体积36毫升。三次治疗访视的总剂量为5.04mg CCH。建议研究者/医生根据其对凹坑类型的临床判断(基于深度、长度、宽度等)来决定是否需要深(1英寸针头呈30度角)或浅(0.5英寸针头呈30度角)给药中央等份(图10中的小份A)。根据这一决定，研究人员将使用1英寸或0.5英寸的针头对大腿脂肪团凹坑进行5等分注射技术。

每隔约21-30天进行3次相同剂量的治疗。所有完成的受试者将有3个疗程，间隔21-30天。每个受试者的总研究时间约为208天。

以下临床终点将使用适当的描述性统计数据按时间点和队列进行总结：

·在第90天，在I-GAIS中从基线发生变化

·在臀部或者大腿上的功效，通过在第90天7分I-GAIS量表上得分提高(+1)或多的受试者百分比确定

·在臀部或者大腿上的功效，通过在第180天7分I-GAIS量表上得分提高(+1)或多的受试者百分比确定

·在臀部的功效，通过在第90天CR_PCSS中测定的从基线开始的平均变化来确定

·在臀部的功效，通过在第180天CR_PCSS中测定的从基线开始的平均变化来确定

·患者对臀部或者大腿的满意程度，通过第90天Body-Q皮下脂肪团鉴定报告中从基线开始的平均变化确定

·患者对臀部或者大腿的满意程度，通过第180天Body-Q皮下脂肪团鉴定报告中从基线开始的平均变化确定

·治疗区域内完全/成功治疗的凹坑比例

·每次治疗访视时，与基线检查相比，凹坑总数平均减少

·每次治疗访视时每个皮下脂肪团凹坑的平均剂量

·为了评价调查者对CCH给药的满意程度

ο给药便利性(5点里克特量表)

ο作为皮下脂肪团治疗方法的可行性(5点里克特量表)

ο总之，对施用CCH治疗患者皮下脂肪团的便利性分级？(5点里克特量表)

ο易于在同一天内增加其他美容治疗(脂肪团除外)(5点里克特量表)

·通过皮肤超声成像中观察到的真皮(或其各层)回声测量治疗区域的真皮厚度

ο从基线到第90天，用CCH治疗脂肪团后皮肤厚度的平均变化

ο从基线到第180天，用CCH治疗脂肪团后皮肤厚度的平均变化

·为了评价治疗区域的3维图像(使用Cherry成像系统和3-D成像系统)

ο从基线到第90天，用CCH治疗脂肪团后的平均容积变化

ο从基线到第180天，用CCH治疗脂肪团后的平均容积变化

ο从基线到第90天，用CCH治疗脂肪团前后皮肤粗糙程度评分的平均变化

ο从基线到第180天，用CCH治疗脂肪团前后皮肤粗糙程度评分的平均变化

不良事件将按报告每个事件的受试者的比例进行总结。描述性统计将提供每次就诊时生命体征和每个临床实验室测试参数的实际变化和基线变化。抗-AUX-I和抗-AUX-II抗体水平将采用描述性统计方法总结出就诊时的实际值。

CR-PCSS(仅臀部)、脂肪团的Body-Q评估、I-GAIS、5点里克特量表、Cherry成像皮肤粗糙度量表、身体畸形问卷(参见，例如，Lifespan.org；bddfoundation.org网站)，而菲茨帕特里克皮肤类型将用于疗效评估。在此实施例中，CR-TCES和PR-TCES量表也可代替CR-PCSS和PR-PCSS量表或与之一起使用。

申请人希望根据之前描述的终点，该研究可以建立CCH的功效和安全性。

实施例4-CCH治疗大腿水肿性纤维硬化性泛神经病变的2B期随机、双盲、安慰剂对照研究(研究211)

以前的研究表明，每21天在一个治疗区域(例如，一个臀部或一个大腿)接受三次皮下注射总剂量0.84毫克CCH的受试者的皮下脂肪团严重程度有所改善。大多数不良事件发生在注射部位，性质为轻度至中度，并在数周内解决，无复发。

在本实施例中，将对CCH治疗成年女性大腿EFP的疗效和安全性进行第2阶段、随机、双盲、安慰剂对照研究。将要施用的CCH(AUX-I和AUX-II的1∶1比率)如上所述。受试者将在报名参加本研究前14天内接受研究资格筛选。所有受试者将根据预先确定的纳入和排除标准进行筛选，例如，18岁或以上的非孕妇大腿有EFP，体重指数为20-35kg/m²。所有受试者将根据病史、体检和筛查时的实验室资料判断健康状况良好。

受试者使用PR-TCES量表以及研究者使用CR-TCES量表独立评估的左右两侧大腿中度或重度脂肪团的受试者，以及大腿Hexsel脂肪团严重程度量表(CSS)不大于13的受试者，将符合条件，且Hexsel脂肪团严重程度量表(CSS)不大于13并且Hexsel CSS凹陷深度评分为2或3分。大腿的资格将在第一天确认。

一旦确定指定大腿的合格性，其中一条大腿将被随机指定为目标大腿；另一条大腿将被视为非目标大腿。受试者将被随机分配到一个治疗组(每套大腿施用0.84mg CCH或安慰剂)。受试者的两条大腿将接受CCH治疗或安慰剂治疗。每个受试者将接受一个疗程，该疗程包括3个部分(即第1天、第22天和第43天)。每次治疗部分包括在大腿各注射12次注射(每次注射1.5毫升CCH 0.07毫克/支或安慰剂)，总体积为36毫升(1.68毫克)。在指定的大腿上选择要治疗的凹坑，将由研究者决定。主要终点分析将基于第71天的评估。第120天将进行随访。受试者、研究人员、现场人员和申办方将对目标大腿的识别和指定的治疗不知情。研究设计的流程图如图20所示。

本研究中使用的注射技术为上述治疗IV。在每次治疗期间以及第71天和第120天，当受试者保持一致的放松站立姿势时，将在凹坑标记前后对每个大腿进行拍照。受试者将使用PR-PCSS评估每个指定大腿的数字摄影图像(预标记)，以确定每个大腿EFP的严重程度。受试者将使用受试者整体美学改善量表(S-GAIS)、患者报告的脂肪团影响量表(PR-CIS)、受试者自评量表(SSRS)、受试者对脂肪团治疗的满意度(SCTA)和Body Q-脂肪团评估来评估大腿。随后，研究人员将使用CR-TCES对每个大腿进行现场评估。受试者评估将在每次治疗访视时独立于研究者评估之前完成。研究者将使用研究者全球美感改善量表(I-GAIS)评估每一条治疗后的大腿。每次访问时，必须在凹坑标记之前完成所有评估。在完成第71天的访视评估之后和第120天访视之前，将对随机选择的盲法受试者子集进行半定性退出访谈，以评估受试者对治疗效果、治疗经验、参与经验和意外效果的评估。

安全性将在整个研究过程中进行评估，包括特别关注的不良事件，包括所有不良事件，如远离给药部位的瘀伤、瘀斑、血肿和挫伤，或任何过敏反应，包括过敏反应，将在本研究中记录并评估严重性和严重性。此外，与注射部位相关的局部不良事件，包括急性(如红斑、瘀伤、疼痛、结节/肿块、溃疡、水泡、瘙痒、肿胀和/或硬化)和/或慢性(如皮肤增厚、纤维硬化、橘色变化)皮肤不良事件，将记录并评估严重性和严重性(视情况而定)。

主要终点是第71天2级复合响应者的比例，其定义受试者至少有一条大腿符合以下标准：

·从基线检查(第1天就诊)开始，研究人员现场评估CR-TCES的严重程度至少有2级改善，以及

·在观察同一大腿的数字图像时，受试者使用PR TCES评估的严重程度与基线相比至少提高2级

次级终点是

·第71天目标大腿中2级复合响应者的比例，其被定义为具有以下特征的受试者：

ο从基线检查(第1天就诊)开始，研究人员在目标大腿处实时评估CR-TCES中至少有2级严重程度的改善，以及

ο在观察同一大腿的数字图像时，受试者使用PR TCES评估的严重程度比基线相比至少提高2级

·1级PR-TCES响应者的比例，定义为第71天PR-TCES严重程度评分至少有一条大腿比第1天改善≥1级的受试者

·2级PR-TCES响应者的比例，定义为第71天PR-TCES严重程度评分至少有一条大腿比第1天改善≥2级的受试者

·在第71天对至少一条大腿的S-GAIS评估中，1级或2级S-GAIS响应者的比例被定义为≥1级改善(改善、显著改善或非常显著的改善)或≥2级改善(显著改善或非常显著的改善)的受试者

·第71天PR-TCES、CR-TCES、SSRS、PR-CIS总分、Body Q-脂肪团、Hexsel凹坑数、Hexsel凹坑深度得分、Hexsel总分与基线的变化

对于结果，申请人希望所有主要和次要终点都能达到，并且患者不会经历任何意外的不良事件。

实施例5-一项1期开放标记研究，评估单剂量CCH(3.36MG)在水肿性纤维硬化性泛神经病变受试者中的安全性和药代动力学

以前的研究表明，每21天在一个治疗区域(例如一个臀部或一个大腿)皮下注射三次剂量为0.84毫克CCH的受试者皮下脂肪团的严重程度有所改善。大多数不良事件发生在注射部位，性质为轻度至中度，并在数周内解决，无复发。其他1期药代动力学(PK)研究涉及一个和两个治疗区域的皮下CCH治疗，显示治疗后没有全身暴露。实际上，医生可能希望在一个疗程中对一个患者的两个以上治疗区域实施CCH。因此，在这种情况下，CCH安全状况非常重要。

在本实施例中，进行了一项第1阶段开放性PK和安全性研究，在该研究中，向受试者注射单剂量3.36mg，在左臀部、右臀部、左大腿后外侧和右大腿后外侧各皮下注射12次(即，每个治疗区域注射0.84mg CCH)。

经过21天的筛选期后，12名受试者在服用CCH前一天(第1天)被送入临床研究室。受试者在第1天给药。在给药后24小时的第2天，从每位受试者身上获取PK样本，受试者从临床研究室出院。受试者于第3天、第8天和第22天返回，进行门诊随访PK和安全性评估(即给药后48小时、给药后168小时和给药后504小时)。所有受试者均为18岁或以上的非孕妇，在四个治疗区域均有EFP，体重指数为20-35kg/m2。所有受试者根据病史、体检和筛查时的实验室资料判断健康状况良好。

CCH的施用如上所述。每个注射部位接受研究药物的单次皮肤注射，分为三份0.1mL的小份，每次注射的总注射量为0.3mL，每个治疗区域的注射量为3.6mL，总注射量为14.4mL。准备16支注射器(每个治疗区域4支)在第1天给药。每支注射器含有0.9毫升研究药物，每支注射器可注射三次。

在相关时间段从每个受试者抽取血样，以获得各种PK参数(例如AUC_0-t，AUC_0-inf，C_max，T_max)。一名受试者在所有采集时间点的AUX-I给药前和给药后血浆值均大于定量限值(5ng/mL)，这与AUX-I ELISA中可能存在的干扰一致。在所有其他受试者中，由于注射了3.36mg研究药物，在给药后的任何时间点，血浆中都没有可量化的AUX-I水平。此外，由于注射了3.36mg研究药物，在给药后的任何时间点，血浆中都没有可量化的AUX-II水平。因此，没有获得PK参数。这证实了在四个治疗区域同时皮下注射3.36mg CCH后，CCH缺乏全身暴露。

所有12名女性受试者在第1天接受了全部48次注射，每个治疗区域12次注射，总剂量为3.36mg CCH。所有受试者至少经历过一次因治疗引起的不良事件，均未导致停止治疗或死亡。无严重不良事件发生。最常见的不良反应为注射部位红斑(5例，41.7％)、注射部位瘀伤(2例，16.7％)、注射部位结节(2例，16.7％)。因此，在四个治疗区域同时给药时，没有观察到CCH安全性方面的新问题。本研究中常见的不良事件与目前已知的CCH不良事件相一致。

尽管本研究的目的不是确定疗效作为终点，受试者仅接受一剂研究药物治疗，但CCH根据CR-PCSS评分的改善证明EFP有所改善，如表28所示。研究结束时和筛查时CR-PCSS评分之间的负变化反映了脂肪团严重程度的改善。如表所示，在所有四个治疗区域中观察到脂肪团严重程度均有所改善，这反映在所有四个治疗区域的平均值相对于基线的负变化中。一名受试者右臀部和左大腿的脂肪团严重程度降低了两点。许多患者在四个治疗区域中都有一点改善。由于研究结束时CR-PCSS评分缺失，一名受试者被排除在分析之外。

表28.对在四个治疗区域施用单剂量3.36mg CCH(每个治疗区域0.84mg)的患者进行CR-PCSS分级和与基线相比的变化(皮下脂肪团严重群体)

本文所描述的实施方案仅为示例性的。本领域技术人员将理解，可以在不脱离以下权利要求所涵盖的本发明的范围的情况下进行变化和修改。

Claims (52)

1.一种降低人类患者大腿皮下脂肪团严重程度的方法，包括以下步骤：

a.提供一种胶原酶组合物，所述胶原酶组合物具有至少两个以下特征：

i.V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)；

ii.K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)；

iii.K_cat(sec^-1)为大约1.1到大约107(SRC实验)，或者，大约93到9,179(GPA实验)；

iv.1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)；

v.K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)；

vi.分子量为大约60kDa至大约130kDa，或者大约70至大约130kDa，或大约80至大约120kDa，或大约90至大约120kDa，或大约100至大约110kDa；

vii.通过反相HPLC(高压液相色谱法)测定的纯度按面积计至少为80％；

viii.效价约为5,000至约30,000f-SRC单位/mg；

ix.效价约为175,000至约500,00f-GPA单位/mg；

x.效价约为5,000至约25,000ABC单位/mg；

xi.小于或等于按面积计1％的杂质，所述杂质选自梭菌蛋白酶、明胶酶和亮肽组成的组；

xii.小于或等于1cfu/mL的生物负荷；以及

b.根据选自治疗I到V所组成的组的治疗方案注射治疗有效量的胶原酶组合物，其中，皮下脂肪团外观的改善是由量表或者其他测量工具建立的，所述量表或者其他测量工具选自下组：Hexsel皮下脂肪团严重程度分级表(Hexsel CSS)，Hexsel凹陷深度评分表，里克特量表，凹坑分析，临床医生报告的相片数字皮下脂肪团严重程度量表(CR-PCSS)，患者报告的相片数字皮下脂肪团严重程度量表(PR-PCSS)，研究者全球审美改善量表(I-GAIS)，受试者全球审美改善量表(S-GAIS)，患者报告的皮下脂肪团影响量表(PR-CIS)，PR-CIS简化版，患者自评表(SSRS)，受试者对皮下脂肪团治疗的满意度调查表(SSCT)，临床医生对皮下脂肪团严重程度的评估(摄影或其他图像)，Body-Q，大腿皮下脂肪团疗效量表(PR-TCES；CR-TCES)，以及任何有效的图像数字或者其他临床使用和/患者用于评价皮下脂肪团严重程度、改善和/或病人满意度的量表。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述胶原酶按照治疗IV被注射。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述胶原酶组合物包括AUX-I和AUX-II，并具有以下特征：

a.AUX-I(SRC实验)：

i.V_max，min^-1：大约0.08到7.70

ii.K_M：约4.1到410纳摩尔

iii.K_cat，sec^-1：大约1.1到大约107

iv.1/K_cat，微秒：大约376到37,222

v.K_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

b.AUX-II(GPA实验)

i.V_max，min^-1：大约0.3到30.5

ii.K_M，mM：大约0.03到3.1

iii.K_cat，sec^-1：大约93到9,179

iv.1/K_cat，微秒：大约4到428

v.K_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述胶原酶组合物包括AUX-I和AUX-II，具有以下特征：

a.AUX-I(SRC实验)：

i.Vmax，min^-1：大约3.8

ii.K_M，mM：大约2.07x10^-4

iii.K_cat，sec^-1：大约53

iv.1/K_cat，微秒：大约18,799

v.k_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约256,977

b.AUX II(GPA实验)：

i.Vmax，min^-1：大约15.4

ii.K_M，mM：大约1.6

iii.K_cat，sec^-1：大约4,636

iv.1/K_cat，微秒：大约216

v.k_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约2,997。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包括至少3个特征。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包括至少4个特征。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包括至少6个特征。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包括大约1mg到20mg的一种或者更多种胶原酶。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包括CCH。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物具有的功效是大约10,000ABC单位/0.58mg并且所述治疗有效量是大约1mg到20mg。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物具有的功效是大约15,000ABC单位/mg到20,000ABC单位/mg并且所述治疗有效量是大约1mg到20mg。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量是大约1mg到10mg并且所述组合物具有的功效是大约20,000到大约30,000f-SRC单位/mg或者大约175,000到大约300,000f-GPA单位/mg。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗是指向患者群体给药，所述治疗使至少5％的患者在给药初始剂量至少71天后与治疗前基线相比维持改善的水平。

14.根据权利要求13所述的方法，其中至少10％的患者在给药初始剂量至少71天后与治疗前基线相比维持改善的水平。

15.根据权利要求13所述的方法，其中至少20％的患者在给药初始剂量至少71天后与治疗前基线相比维持改善的水平。

16.根据权利要求1所述的方法，其中当向患者群体给药时，所述治疗使至少5％的患者与治疗前基线相比具有改善的效果，并且随着时间改善变得更加显著。

17.根据权利要求1所述的方法，其中通过CR-PCSS和/或PR-PCSS测量确定，所述治疗产生以下一个或多个疗效终点：

a.由目标大腿的临床医生现场评估，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、43天、71天、90天、180天或365天，CR-PCSS的严重程度至少有2级改善；

b.由受试者观察目标大腿的数字图像评估，从基线(第一天)开始第22天、43天、71天、90天、180天或365天，PR-PCSS的严重程度至少有2级改善；

c.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天或第365天通过2级复合反应证明的改善，被定义为受试者在CR-PCSS中比基线时的严重程度至少改善2级，在PR-PCSS中比基线时的严重程度至少改善2级；

d.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天或第365天，由目标大腿的临床医生现场评估CR-PCSS中皮下脂肪团的严重程度与基线相比至少有1级改善；

e.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天、第365天，由受试者观察目标大腿的数字图像评估PR-PCSS中皮下脂肪团的严重程度与基线相比至少有1级改善；

f.第22天、第43天、第71天、第90天、第180天或第365天，通过1级综合反应所证明的改善，定义为受试者在CR-PCSS中与基线相比严重程度至少改善1级，PR-PCSS中与基线相比严重程度至少改善1级；以及

g.在所有CR-PCSS评分均为中度或重度的患者群体中，与安慰剂相比，至少一个治疗区域的改善在统计学上具有显著性，其中，所述改善为上述a到f中的一个或多个。

18.根据权利要求1所述的方法，其中通过Hexsel凹陷深度量表测量确定，所述治疗产生以下一个或多个疗效终点：

a.由目标大腿的临床医生现场评估，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天或第365天，Hexsel凹陷深度评分的严重程度至少有2级改善；

b.由受试者观察目标大腿的数字图像评估，从基线(第一天)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天或第365天，Hexsel凹陷深度评分的严重程度至少有2级改善；

c.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天或第365天通过2级复合反应证明的改善，被定义为由临床医生评估受试者在Hexsel凹陷深度评分中比基线时的严重程度至少改善2级，由受试者评估在Hexsel凹陷深度评分中比基线时的严重程度至少改善2级；

d.从基线(第一天)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天或第365天，由临床医生现场评估目标大腿Hexsel凹陷深度评分中皮下脂肪团的严重程度与基线相比至少有1级改善；

e.从基线(第一天)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天或第365天，由受试者观察目标大腿的数字图像评估Hexsel凹陷深度评分中皮下脂肪团的严重程度与基线相比至少有1级改善；

f.从基线(第一天)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天或第365天，通过1级复合反应证明的改善，被定义为由临床医生评估受试者在Hexsel凹陷深度评分中比基线时的严重程度至少改善1级，由受试者评估在Hexsel凹陷深度评分中比基线时的严重程度至少改善1级；以及

g.在所有Hexsel CSS评分均为中度或重度的患者群体中，与安慰剂相比，至少一个治疗区域的改善在统计学上具有显著性，其中，所述改善为上述a到f中的一个或多个。

19.根据权利要求1所述的方法，其中由凹坑分析测定的治疗产生以下一个或多个疗效终点：

a.深度减少至少5％；

b.宽度减少至少5％；

c.长度减少至少5％；

d.总体积减少至少5％；以及

e.表面积减少至少5％。

20.一种减少人类患者大腿处皮下脂肪团严重程度的方法，包括以下步骤：

a.提供一种胶原酶组合物，所述胶原酶组合物具有至少两个以下特征：

i.V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)；

ii.K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)；

iii.K_cat(sec^-1)为大约1.1到107(SRC实验)，或者，大约93到9,179(GPA实验)；

iv.1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)；

v.K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)；

vi.分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内；

vii.通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％；

viii.效价(即，比活性)为大约5000到大约30,000SRC单位/mg；

ix.效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg；

x.效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg；

xi.按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中；

xii.小于或者等于1cfu/mL的生物负担；以及

b.根据选自治疗I到V所组成的组的治疗方案注射治疗有效量的胶原酶组合物，其中在治疗访视大约3天和20天之间，瘀伤的颜色强度显著降低或者缓解。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，根据治疗IV注射胶原酶。

22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述胶原酶组合物包括AUX-I和AUX-II，具有以下特征：

a.AUX-I(SRC实验)：

i.V_max(min^-1)：大约0.08到7.70

ii.K_M：约4.1到410纳摩尔

iii.K_cat，sec^-1：大约1.1到大约107

iv.1/K_cat，微秒：大约376到37,222

v.K_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

b.AUX-II(GPA实验)

i.V_max，min^-1：大约0.3到30.5

ii.K_M，mM：大约0.03到3.1

iii.K_cat，sec^-1：大约93到9,179

iv.1/K_cat，微秒：大约4到428

v.K_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934。

23.根据权利要求20所述的方法，其中，所述胶原酶组合物包括AUX-I和AUX-II，具有以下特征：

a.AUX-I(SRC实验)：

i.V_max，min^-1：大约3.8

ii.K_M，mM：大约2.07x10^-4

iii.K_cat，sec^-1：大约53

iv.1/K_cat，微秒：大约18,799

v.k_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约256,977

b.AUX II(GPA实验)：

i.V_max，min^-1：大约15.4

ii.K_M，mM：大约1.6

iii.K_cat，sec^-1：大约4,636

iv.1/K_cat，微秒：大约216

v.k_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约2,997。

24.根据权利要求20所述的方法，其中，所述组合物包括至少3个特征。

25.根据权利要求20所述的方法，其中，所述组合物包括至少4个特征。

26.根据权利要求20所述的方法，其中，所述组合物包括至少5个特征。

27.根据权利要求20所述的方法，其中，所述组合物包括大约1mg到20mg的一种或者更多种胶原酶。

28.根据权利要求20所述的方法，其中，所述组合物包括CCH。

29.根据权利要求20所述的方法，其中，所述组合物具有的功效是大约10,000ABC单位/0.58mg并且所述治疗有效量是大约1mg到20mg。

30.根据权利要求20所述的方法，其中，所述组合物具有的功效是大约15，000ABC单位/mg到20，000ABC单位/mg并且所述治疗有效量是大约1mg到20mg。

31.根据权利要求20所述的方法，其中，所述治疗有效量是大约1mg到10mg并且所述组合物具有的功效是大约20,000到大约30,000f-SRC单位/mg或者大约175,000到大约300,000f-GPA单位/mg。

32.根据权利要求20所述的方法，其中，所述治疗是指向患者群体给药，所述治疗使至少5％的患者在给药初始剂量至少71天后与治疗前基线相比维持改善的水平。

33.根据权利要求32所述的方法，其中至少10％的患者在给药初始剂量至少71天后与治疗前基线相比维持改善的水平。

34.根据权利要求32所述的方法，其中至少20％的患者在给药初始剂量至少71天后与治疗前基线相比维持改善的水平。

35.根据权利要求20所述的方法，其中，当向患者群体给药时，所述治疗使至少5％的患者与治疗前基线相比具有改善的效果，并且随着时间改善变得更加显著。

36.一种减少人类患者大腿处皮下脂肪团严重程度的方法，包括以下步骤：

a.提供一种胶原酶组合物，所述胶原酶组合物具有至少两个以下特征：

i.V_max(min^-1)为大约0.08到7.70(SRC实验)，或者，大约0.3到30.5(GPA实验)；

ii.K_M，为约4.1到410纳摩尔(SRC实验)，或者，约0.03到3.1mM(GPA实验)；

iii.K_cat(sec^-1)of大约1.1到107(SRC实验)，或者，大约93到9,179(GPA实验)；

iv.1/K_cat，微秒为大约376到37,222(SRC实验)，或者，大约4到428(GPA实验)；

v.K_cat/K_M，mM^-1sec^-1为大约5,140到508,814(SRC实验)，或者，大约60到5,934(GPA实验)；

vi.分子量在大约60kDa到大约130kDa，或者大约70到大约130kDa，或者大约80到大约120kDa，或者大约90到大约120kDa，或者大约100到大约110kDa范围内：

vii.通过反向HPLC(高压液相色谱)测定的纯度按面积计为至少80％；

viii.效价(即，比活性)为大约5000到大约30,000SRC单位/mg；

ix.效价为大约175,000到大约500,00f-GPA单位/mg；

x.效价为大约5,000到大约25,000ABC单位/mg；

xi.按面积计杂质的纯度小于或者等于1％，所述杂质选自由梭菌蛋白酶、白明胶酶和亮肽素所组成的组中；

xii.小于或者等于1cfu/mL的生物负担；以及

b.根据选自治疗I到V所组成的组的治疗方案注射治疗有效量的胶原酶组合物，其中，通过大腿皮下脂肪团功效量表(PR-TCES和/或CR-TCES)测定的皮下脂肪团外观改善。

37.根据权利要求36所述的方法，其中，根据治疗IV注射胶原酶。

38.根据权利要求36所述的方法，其中，所述胶原酶组合物包括AUX-I和AUX-II，具有以下特征：

a.AUX-I(SRC实验)：

i.V_max(min^-1)：大约0.08到7.70

ii.K_M：约4.1到410纳摩尔

iii.K_cat，sec^-1：大约1.1到大约107

iv.1/K_cat，微秒：大约376到37,222

v.K_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约5,140到508,814

b.AUX-II(GPA实验)

i.V_max，min^-1：大约0.3到30.5

ii.K_M，mM：大约0.03到3.1

iii.K_cat，sec^-1：大约93到9,179

iv.1/K_cat，微秒：大约4到428

v.K_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约60到5,934。

39.根据权利要求36所述的方法，其中，所述胶原酶组合物包括AUX-I和AUX-II，具有以下特征：

a.AUX-I(SRC实验)：

i.V_max，min^-1：大约3.8

ii.K_M，mM：大约2.07x10^-4

iii.K_cat，sec^-1：大约53

iv.1/K_cat，微秒：大约18,799

v.k_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约256,977

b.AUX II(GPA实验)：

i.V_max，min^-1：大约15.4

ii.K_M，mM：大约1.6

iii.K_cat，sec^-1：大约4,636

iv.1/K_cat，微秒：大约216

v.k_cat/K_M，mM^-1sec^-1：大约2,997。

40.根据权利要求36所述的方法，其中，所述组合物包括至少3个特征。

41.根据权利要求36所述的方法，其中，所述组合物包括至少4个特征。

42.根据权利要求36所述的方法，其中，所述组合物包括至少5个特征。

43.根据权利要求36所述的方法，其中，所述组合物包括大约1mg到20mg的一种或者更多种胶原酶。

44.根据权利要求36所述的方法，其中，所述组合物包括CCH。

45.根据权利要求36所述的方法，其中，所述组合物具有的功效是大约10,000ABC单位/0.58mg并且所述治疗有效量是大约1mg到20mg。

46.根据权利要求36所述的方法，其中，所述组合物具有的功效是大约15，000ABC单位/mg到20，000ABC单位/mg并且所述治疗有效量是大约1mg到20mg。

47.根据权利要求36所述的方法，其中，所述治疗有效量是大约1mg到10mg并且所述组合物具有的功效是大约20,000到大约30,000f-SRC单位/mg或者大约175,000到大约300,000f-GPA单位/mg。

48.根据权利要求36所述的方法，其中，所述治疗是指向患者群体给药，所述治疗使至少5％的患者在给药初始剂量至少71天后与治疗前基线相比维持改善的水平。

49.根据权利要求48所述的方法，其中至少10％的患者在给药初始剂量至少71天后与治疗前基线相比维持改善的水平。

50.根据权利要求48所述的方法，其中至少20％的患者在给药初始剂量至少71天后与治疗前基线相比维持改善的水平。

51.根据权利要求48所述的方法，其中，当向患者群体给药时，所述治疗使至少5％的患者与治疗前基线相比具有改善的效果，并且随着时间改善变得更加显著。

52.根据权利要求36所述的方法，其中，通过CR-TCES和/或PR-TCES测定，所述治疗产生以下一个或多个疗效终点：

a.由目标大腿的临床医生现场评估，从基线(治疗前“第一天”)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天或第365天，CR-TCES评分的严重程度至少有2级改善；

b.由受试者观察目标大腿的数字图像评估，从基线(第一天)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天或第365天，PR-TCES评分的严重程度至少有2级改善；

c.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天或第365天通过2级复合反应证明的改善，被定义为在CR-TCES测量中与基线时相比严重程度至少改善2级，在PR-TCES测量中与基线时相比的严重程度至少改善2级；

d.由目标大腿的临床医生现场评估，从基线(第一天)开始第22天、第43天、第71天、第90天、第180天或第365天，CR-TCES评分的严重程度至少有1级改善；

e.由受试者观察目标大腿的数字图像评估，从基线(第一天)开始第22天、43天、71天、90天、180天或365天，PR-TCES评分的严重程度至少有1级改善；

f.在第22天、第43天、第71天、第90天、第180天或第365天通过1级复合反应证明的改善，被定义为在CR-TCES测量中与基线时相比严重程度至少改善1级，在PR-TCES测量中与基线时相比的严重程度至少改善1级；

g.在所有CR-TCES评分均为中度或重度的患者群体中，与安慰剂相比，至少一个治疗区域的改善在统计学上具有显著性，其中，所述改善为上述a到f中的一个或多个。

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