CN112986107A - 基于非对称正弦流道的细胞流式电阻抗检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于非对称正弦流道的细胞流式电阻抗检测方法，采用透明质酸溶液对流道内的被测细胞的聚焦位置进行调整，采用多频混合交流电信号对细胞进行电阻抗检测。悬浮于透明质酸溶液中的细胞在非对称正弦流道中受到惯性力与弹性力共同作用，可在较广流速范围内实现细胞的单列聚焦，提高了电阻抗检测精度。多频交流电信号施加于细胞检测区域，电流信号经过处理后得到不同频率信号下细胞引起的电流变化。提取不同频率下细胞引起的电流变化信号峰值，利用机器学习方法训练细胞种类的分类模型，用于细胞混合样本中细胞鉴别与计数。本发明适用于血液中各种细胞及其他生物样本中生物颗粒的检测与计数。
Description
技术领域
本发明涉及细胞检测技术领域，尤其是一种基于非对称正弦流道的细胞流式电阻抗检测方法。
背景技术
细胞的非标记检测与计数是生物传感器领域的重要研究内容。传统的细胞检测与计数一般利用特定的生物化学反应，对细胞进行种类鉴别以及计数。例如针对癌症病人血液中须有循环肿瘤细胞的检测与计数，现有的成熟商业仪器为美国强生公司的CellSearch系统。该系统采用免疫磁珠标记和荧光染色的方式来捕获和检测肿瘤细胞，因此被捕获的肿瘤细胞已失去生物活性，而不能用于后续的抗药性检测等。此外，CellSearch系统检测费用极高(～5000元/次)。
而非标记的细胞检测方法一般利用不同种类细胞的生物物理特性对细胞进行检测，具有对细胞损伤小、成本低等特点，成为生物传感器领域的重要研究内容。现有的细胞非标记检测技术主要从细胞的尺寸、质量(密度)、力学性能以及电学性能等方面研究细胞的生理状态以及细胞种类的鉴别。其中，仅仅依靠细胞尺寸这单一参量无法精准鉴别细胞种类(如微筛以及滤膜等技术手段)，而细胞的质量(密度)以及力学性能的研究往往需要较为精密的硬件设备支持。得益于电学理论基础的成熟以及电学检测设备的完善，细胞电学性能的研究具有充足的可行性。
由于细胞的异质性，不同种类的细胞群体往往具有不同的介电特性。一般而言，细胞膜与细胞核膜可被视为具有电容性，其细胞质与细胞核内部遗传物质展现出电导性。不同频率的交流电信号可不同程度地穿透细胞膜与细胞核膜，从而可以深入研究细胞内部的介电属性。但是，细胞非标记电阻抗检测的检测精度和检测通量通常难以兼顾。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种基于非对称正弦流道的细胞流式电阻抗检测方法，实现细胞电阻抗信号的精确、高通量流式的检测。
本发明采用的技术方案如下：
一种基于非对称正弦流道的细胞流式电阻抗检测方法，将单一种类细胞样品经离心、重悬后得到细胞样本，重悬液为溶解透明质酸的磷酸盐缓冲液；然后将所述细胞样本注入电阻抗检测芯片经过非对称正弦流道进行单列聚焦；利用电阻抗检测仪器对单列聚焦后的细胞进行电阻抗检测，利用信号处理分析系统对细胞引起的信号峰值进行提取；重复上述过程，得到两种或两种以上细胞样本在不同频率信号下的幅值与相位峰值；将不同频率信号下的幅值与相位峰值输入至机器学习系统，训练产生细胞鉴别与计数的模型；再将上述过程中使用的两种或两种以上细胞样本制成多种细胞的混合细胞样本，重复上述实验操作，利用所述细胞鉴别与计数模型对所述混合细胞样本中的细胞进行种类鉴别与计数。
其进一步技术方案为：
具体包括以下步骤：
步骤一：将单一种类细胞样品离心处理，并悬浮于溶解透明质酸的磷酸盐缓冲液中制成单一种类细胞样本；
步骤二：将所述单一种类细胞样本通入电阻抗检测芯片中，并使细胞样本流经所述电阻抗检测芯片内的非对称正弦流道进行单列聚焦；
步骤三：设置与所述电阻抗检测芯片连接的电阻抗检测仪器的参数，通过电阻抗检测仪器将混合多频交流电信号通过施加电极传输到经非对称正弦流道聚焦后的细胞样本；
步骤四：所述电阻抗检测仪器通过反馈电极将接收细胞样本的反馈信号，并对反馈信号进行处理：放大、差分以及锁相放大；
步骤五：利用信号处理系统对所述步骤四中处理后的信号进行储存与分析；将锁相放大得到的不同频率下的幅值与相位信号进行基线修正，对细胞样本引起的信号峰值进行提取；
步骤六：重复步骤一至步骤五以对另一种或多种单一种类细胞样品分别进行检测；
步骤七：将两种或以上的细胞样本在不同频率信号下的幅值与相位峰值输入至机器学习系统，训练产生细胞鉴别与计数的模型；
步骤八：将步骤六中使用的各单一细胞样品混合后，重复步骤一至步骤五，获得混合细胞样本在不同频率信号下的幅值与相位峰值信号峰值，再利用所述细胞鉴别与计数模型对所述混合细胞样本进行细胞种类鉴别与计数。
所述步骤一中，所述溶解透明质酸的磷酸盐缓冲液为溶解0.1％(w/v)透明质酸的浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液。
所述步骤二中，将步骤一种制成的单一种类细胞样本通过样品进样装置输入电阻抗检测芯片中，所述电阻抗检测芯片包括玻璃基底、设于玻璃基底上的芯片上盖板，所述非对称正弦流道设于所述芯片上盖板中，所述施加电极、所述反馈电极在所述玻璃基底镀金玻璃经过软光刻制成。
所述施加电极、所述反馈电极位于所述非对称正弦流道出口下游的直流道位置；非对称正弦流道包括膨胀段和收缩段，所述膨胀段内、外壁曲率不同，所述收缩段的内、外壁曲率不同。
所述步骤三中，电阻抗检测仪器通过连接线将混合多频交流电信号施加于施加电极，所述混合多频交流电信号的频率范围为500kHz-50MHz。
所述混合多频交流电信号为1-8个频率混合的交流电信号，每个交流电信号的幅值范围为0.01V-5V，频率范围为1Hz-50MHz。
本发明的有益效果如下：
本发明采用透明质酸溶液对流道内的被测细胞的聚焦位置进行调整以提高电阻抗检测精度，解决了细胞粒子在检测区域流道内分布位置杂乱导致电阻抗信号不均一、检测精度低的问题。
悬浮于透明质酸溶液中的细胞在非对称正弦流道中受到惯性力与弹性力的共同作用，可在较广流速范围内实现细胞的单列聚焦。
本发明利用分别测得的不同种类细胞样本在不同频率信号下的幅值与相位峰值，训练得到细胞鉴别与计数模型，再利用该细胞鉴别与计数模型对混合细胞样本进行鉴别分析，无需进行大量参数计算，识别和计数的计算过程简单高效，准确性高，极大地提升了算力。
本发明采用多频混合交流电信号对细胞进行电阻抗检测，并使用机器学习的方法建立细胞种类识别模型以用于真实样本中细胞的种类鉴别与计数，可用于血液中各种细胞的检测与计数，也可用于其他生物样本中生物颗粒的检测，具有重要价值和商业前景。
附图说明
图1为本发明检测方法所基于的电阻抗检测系统图。
图2为电阻抗检测芯片结构示意图。
图3为本发明检测方法的流程图。
图4是本发明具体实施例中非对称正弦流道的结构示意图。
图5是本发明具体实施例中10微米粒子在非对称正弦流道中不同聚焦状态下测得的原始信号图。
图6是本发明具体实施例中不同尺寸粒子在低频下阻抗幅值与粒子体积的线性关系图。
图7是本发明具体实施例中机器学习模型的混淆矩阵图。
图中：1、样品前处理装置；2、进样装置；3、电阻抗检测芯片；4、电阻抗检测仪器；5、计算机；6、信号处理分析系统；31、进样管；32、进液池；33、芯片上盖板；34、玻璃基底；35、施加电极；36、反馈电极；37、出样管；38、废液池；39、非对称正弦流道；391、直流道。
具体实施方式
以下结合附图说明本发明的具体实施方式。
如图3所示，本实施例的一种基于非对称正弦流道的细胞流式电阻抗检测方法，将单一种类细胞样品经离心、重悬后，得到细胞样本，重悬液为溶解透明质酸(HyaluronicAcid，简称HA)的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，简称PBS)；然后将细胞样本注入电阻抗检测芯片3经过非对称正弦流道39进行单列聚焦；利用电阻抗检测仪器4对单列聚焦后的细胞进行电阻抗检测，利用信号处理分析系统6对细胞引起的信号峰值进行提取；重复上述过程，得到两种或两种以上细胞样本在不同频率信号下的幅值与相位峰值；将不同频率信号下的幅值与相位峰值输入至机器学习系统，训练产生细胞鉴别与计数的模型；再将上述过程中使用的两种或两种以上细胞样本制成多种细胞的混合细胞样本，重复上述实验操作，利用所述细胞鉴别与计数模型对所述混合细胞样本中的细胞进行种类鉴别与计数。
上述实施例的方法具体操作步骤如下：
步骤一：将单一种类细胞样品离心、悬浮于溶解HA的PBS溶液中得到单一种类细胞样本；
步骤二：如图1和图2所示，将电阻抗检测芯片3与电阻抗检测仪器4通过连接线相连，单一种类细胞样本通过进样装置2通过进样管31注入电阻抗检测芯片3中，使样本流过非对称正弦流道39；
步骤三：设置电阻抗检测仪器4的激励交流电信号的频率、幅值以及个数，将混合频率的交流电信号由电阻抗检测仪器4输出至电信号的施加电极35；单个激励交流电信号的幅值范围为0.01V-5V，频率范围为1Hz-50MHz；激励交流电信号的个数为1-8个；
步骤四：反馈电流由电信号的反馈电极36通过连接线输出至电阻抗检测仪器4，由电阻抗检测仪器4对电信号进行放大、差分以及锁相放大；
步骤五：对步骤四采集到的信号进行储存与分析；将锁相放大得到的不同频率下的幅值与相位信号进行基线修正，对细胞引起的信号峰值进行提取；
步骤六：将另一种或多种单一种类细胞样品重复所述步骤一至步骤五；
步骤七：将两种或多种细胞样本在不同频率信号下的幅值与相位峰值输入至机器学习系统，训练产生细胞鉴别与计数的模型；
步骤八、将步骤六中的多种细胞样品混合，重复步骤一至步骤五，得到混合细胞样本在不同频率信号下的幅值与相位峰值，利用所述步骤七中的细胞鉴别与计数模型对混合细胞样本中的细胞进行种类鉴别与计数。
作为优选例，悬浮液为溶解0.1％(w/v)HA的1XPBS溶液，其目的在于使得细胞在较宽的流速范围内流经非对称正弦流道39后形成单列聚焦依次流经电信号的施加电极35和电信号的反馈电极36上方；
作为优选例，激励交流电信号为8个频率混合的交流电信号，频率范围为500kHz-50MHz；
作为优选例，基于两种或以上细胞样品在不同频率信号下的幅值与相位峰值，使用matlab利用机器学习的方法训练出细胞种类的鉴别与计数模型，使得混合细胞样本中细胞进行种类的鉴别与计数高效与精准。
上述实施例中，采用的电阻抗检测系统包括：样品前处理装置1、进样装置2、电阻抗检测芯片3、电阻抗检测仪器4、计算机5以及安装在计算机5中的信号处理分析系统6。
样品前处理装置1用于对细胞样品进行离心与重悬，重悬液为HA的PBS；如图2所示，电阻抗检测芯片3包括玻璃基底34、设于玻璃基底34上的芯片上盖板33，非对称正弦流道39设于芯片上盖板33中，施加电极35、反馈电极36在玻璃基底34镀金玻璃经过软光刻制成。施加电极35、反馈电极36位于非对称正弦流道39出口下游的直流道391位置；如图4所示，非对称正弦流道39包括膨胀段(图中波谷部分)和收缩段(图中波峰部分)，膨胀段内、外壁曲率不同，收缩段的内、外壁曲率不同。
施加电极35、反馈电极36均为共面电极。
如图2所示，电阻抗检测芯片3上还设置有进样管31、进液池32、出样管37、废液池38，非对称正弦流道39入口通过进液池32与进样管31连接，进样管31入口与进样装置2出口连接，进样装置2入口与样品前处理装置1出口连接；
非对称正弦流道39出口通过废液池38与出样管37连接，出样管37出口与外部废液回收装置(图中为示出)连接。
电阻抗检测仪器4包括电流放大模块、电流差分模块以及锁相放大模块，通过连接线将混合多频交流电信号施加于电信号的施加电极35，电信号的反馈电极36通过连接线将电流输入电阻抗检测仪器4；
信号处理分析系统6包括电信号峰的提取、统计、机器学习模型的训练以及机器学习模型对掺杂样本中的细胞种类进行鉴别与计数。
下面以标准聚苯乙烯微球以及细胞的电阻抗检测为例来说明本发明的原理和效果。
聚苯乙烯粒球直径为7，10，15以及20μm，细胞为人血液中的白细胞WBC、人乳腺癌细胞株MCF7以及非小细胞肺癌细胞株A549。
作为优选方式，如图4所示，非对称正弦流道39出口下游的直流道391位置的长宽高尺寸为：1000μm、50μm、25μm；膨胀段内、外壁半径分别为：250μm、350μm，收缩段内、外壁半径分别为：50μm、150μm。
将10μm直径的聚苯乙烯微球分别悬浮于1XPBS以及溶解0.1％(w/v)HA的1XPBS溶液中，并通过液体进样装置2以80μL/min的流速将样品通入电阻抗检测芯片3中。
图5(a)左侧为悬浮于PBS溶液中的微球未流经非对称正弦流道39而测得的500kHz频率下的电阻抗信号，图5(a)右侧为粒子的聚焦情况叠加图。由图可知，未聚焦的粒子在检测区域流道内分布位置杂乱，导致电阻抗信号不均一。
因为检测电极为共面电极，其在流道内产生的电场为非均匀电场。图5(b)左侧为悬浮于PBS溶液中的微球流经非对称正弦流道39后而测得的500kHz频率下的电阻抗信号。图5(b)右侧为微球的聚焦情况叠加图，由图可知微球流经非对称正弦流道39后在惯性力的作用下形成了单束聚焦，但是并非所有微球都聚焦在同一流道高度位置上，因为有些微球轮廓清晰，有些较为模糊，说明并非所有微球都在显微镜的焦平面上。其点阻抗信号图也说明微球以不同高度流经电极上方所产生的信号也呈现二值分布的趋势。
图5(c)左侧为悬浮于溶解0.1％(w/v)HA的1XPBS溶液中的微球流经非对称正弦流道39时在惯性力与弹性力的耦合作用下产生单列聚焦的现象候测得的阻抗信号。图5(c)右侧为微球的聚焦情况叠加图。图5(c)说明在溶解HA的PBS溶液能够有效提高电阻抗检测的精度。
由此可知，悬浮于透明质酸溶液中的细胞在非对称正弦流道中受到惯性力与弹性力的共同作用下，可在较广流速范围内实现细胞的单列聚焦。其中细胞在流道中所受惯性力包括惯性升力与迪恩拽力。其中惯性升力为剪切诱导惯性升力与壁面诱导惯性升力的合力
式(1)中，fL为升力系数，ρ为溶液密度，U为溶液平均流速，ap为粒子直径，Dh为水力直径，Dh＝2wh/(w+h)，w与h分别为流道的宽度与高度。
迪恩拽力FD由弯流道中的二次流产生，
式(2)中，r为流道的曲率半径。
FL与FD的大小及比例决定了粒子的聚焦模式以及粒子在流道中聚焦的横向位置。在溶液中添加HA后，在溶液中引入弹性力：
式(3)中，λ为非牛顿流体的弛豫时间，Q为溶液体积流速。
在上述三种力的共同作用下，粒子在流道中最终平衡在横截面上单一的平衡位置，从而实现粒子的单列聚焦。HA溶液由于其自身特殊的流变学特性，既具有湍流减阻的特性又具有良好的生物兼容性，所以HA溶液可实现细胞在流道内高流速下的单列聚焦。
图6为不同直径微球(7，10，15以及20μm)在500kHz频率下阻抗幅值与粒子体积之间的线性关系图。由图可知本发明可以准确测量粒子以及细胞的尺寸。
将人白细胞WBC、人乳腺癌细胞株MCF7以及非小细胞肺癌细胞株A549作为细胞样品，按照实施上述实施例中的检测方法进行实施，所用电信号频率为500kHz和2MHz。多频交流电信号施加于细胞检测区域，电流信号经过放大、差分与解调后得到不同频率信号下细胞引起的电流变化。提取不同频率下细胞引起的电流变化信号峰值，利用机器学习的方法训练细胞种类的分类模型，用于不同种类细胞混合样本中的细胞鉴别与计数。图7为基于500kHz频率下细胞阻抗幅值以及2MHz频率下的细胞阻抗幅值和相位变化值而训练出的机器学习模型的混淆矩阵图。图7(a)为WBC与MCF7两种细胞的机器学习分类模型的混淆矩阵图，由图可知WBC鉴别准确率可达99.8％，MCF7识别准确率可达97.6％。图7(b)为WBC与A549两种细胞的机器学习分类模型的混淆矩阵图，由图可知WBC鉴别准确率可达99.9％，A549识别准确率可达97.9％。图7(c)为WBC、MCF7与A549三种细胞的机器学习分类模型的混淆矩阵图，由图可知WBC鉴别准确率可达99.8％，MCF7识别准确率可达95％，A549识别准确率可达92.3％。
Claims (7)
1.一种基于非对称正弦流道的细胞流式电阻抗检测方法，其特征在于，将单一种类细胞样品经离心、重悬后得到细胞样本，重悬液为溶解透明质酸的磷酸盐缓冲液；然后将所述细胞样本注入电阻抗检测芯片(3)经过非对称正弦流道(39)进行单列聚焦；利用电阻抗检测仪器(4)对单列聚焦后的细胞进行电阻抗检测，利用信号处理分析系统(6)对细胞引起的信号峰值进行提取；重复上述过程，得到两种或两种以上细胞样本在不同频率信号下的幅值与相位峰值；将不同频率信号下的幅值与相位峰值输入至机器学习系统，训练产生细胞鉴别与计数的模型；再将上述过程中使用的两种或两种以上细胞样本制成多种细胞的混合细胞样本，重复上述实验操作，利用所述细胞鉴别与计数模型对所述混合细胞样本中的细胞进行种类鉴别与计数。
2.根据权利要求1所述的基于非对称正弦流道的细胞流式电阻抗检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤一：将单一种类细胞样品离心处理，并悬浮于溶解透明质酸的磷酸盐缓冲液中制成单一种类细胞样本；
步骤二：将所述单一种类细胞样本通入电阻抗检测芯片(3)中，并使细胞样本流经所述电阻抗检测芯片(3)内的非对称正弦流道(39)进行单列聚焦；
步骤三：设置与所述电阻抗检测芯片(3)连接的电阻抗检测仪器(4)的参数，通过电阻抗检测仪器(4)将混合多频交流电信号通过施加电极(35)传输到经非对称正弦流道(39)聚焦后的细胞样本；
步骤四：所述电阻抗检测仪器(4)通过反馈电极(36)将接收细胞样本的反馈信号，并对反馈信号进行处理：放大、差分以及锁相放大；
步骤五：利用信号处理系统(6)对所述步骤四中处理后的信号进行储存与分析；将锁相放大得到的不同频率下的幅值与相位信号进行基线修正，对细胞样本引起的信号峰值进行提取；
步骤六：重复步骤一至步骤五以对另一种或多种单一种类细胞样品分别进行检测；
步骤七：将两种或以上的细胞样本在不同频率信号下的幅值与相位峰值输入至机器学习系统，训练产生细胞鉴别与计数的模型；
步骤八：将步骤六中使用的各单一细胞样品混合后，重复步骤一至步骤五，获得混合细胞样本在不同频率信号下的幅值与相位峰值信号峰值，再利用所述细胞鉴别与计数模型对所述混合细胞样本进行细胞种类鉴别与计数。
3.根据权利要求2所述的基于非对称正弦流道的细胞流式电阻抗检测方法，其特征在于，所述步骤一中，所述溶解透明质酸的磷酸盐缓冲液为溶解0.1％(w/v)透明质酸的浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求3所述的基于非对称正弦流道的细胞流式电阻抗检测方法，其特征在于，所述步骤二中，将步骤一种制成的单一种类细胞样本通过样品进样装置(2)输入电阻抗检测芯片(3)中，所述电阻抗检测芯片(3)包括玻璃基底(34)、设于玻璃基底(34)上的芯片上盖板(33)，所述非对称正弦流道(39)设于所述芯片上盖板(33)中，所述施加电极(35)、所述反馈电极(36)在所述玻璃基底(34)镀金玻璃经过软光刻制成。
5.根据权利要求4所述的基于非对称正弦流道的细胞流式电阻抗检测方法，其特征在于，所述施加电极(35)、所述反馈电极(36)位于所述非对称正弦流道(39)出口下游的直流道(391)位置；非对称正弦流道(39)包括膨胀段和收缩段，所述膨胀段内、外壁曲率不同，所述收缩段的内、外壁曲率不同。
6.根据权利要求2所述的基于非对称正弦流道的细胞流式电阻抗检测方法，其特征在于，所述步骤三中，电阻抗检测仪器(4)通过连接线将混合多频交流电信号施加于施加电极(35)，所述混合多频交流电信号的频率范围为500kHz-50MHz。
7.根据权利要求6所述的基于非对称正弦流道的细胞流式电阻抗检测方法，其特征在于，所述混合多频交流电信号为1-8个频率混合的交流电信号，每个交流电信号的幅值范围为0.01V-5V，频率范围为1Hz-50MHz。
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