CN112972513A - 三七总皂苷在制备治疗结肠炎相关性结肠癌的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了三七总皂苷在制备治疗或预防结肠炎相关性结肠癌的药物中的应用。本发明发现三七总皂苷对结肠炎相关性结肠癌有显著的化学预防及治疗作用；三七总皂苷作为血塞通的活性成分，其安全低毒已经得到充分认可，本发明将为其在临床上预防治疗结肠癌药提供的新的辅助用药方案。

Description

三七总皂苷在制备治疗结肠炎相关性结肠癌的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及三七总皂苷在制备治疗结肠炎相关性结肠癌的药物中的应用。

背景技术

炎-癌转化过程中炎性微环境的动态改变和重塑促进肿瘤细胞的恶性增殖和迁移，诱导癌变重编程。结肠炎相关性结肠癌(Colitis-associated colon cancer， CAC)是典型的炎症相关性肿瘤，炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD) 的罹患是CAC明确的高危因素。炎性因子和造成DNA损伤的活性氧等物质的不断累积使IBD患者发生CAC的几率显著高于普通人群，并随病程延长癌变率逐年升高且与炎症的严重程度、范围等因素呈正相关。CAC患者的临床症状与 IBD患者类似，而且目前的肠镜检查很难辨认恶性增生和早期癌变现象，导致确诊的CAC患者多为中晚期。预防CAC的发生显得尤为重要。

免疫细胞、胞外基质、细胞因子协同作用形成肿瘤免疫微环境，其中CD4+ 辅助性T细胞(Th)，CD8+细胞毒性T细胞(Tc)，调节性T细胞(Treg)，髓样抑制细胞(MDSC)和巨噬细胞(macrophage)等免疫细胞在CAC进程中起关键作用。Treg细胞表面活化PD-1，CTLA-4，CD127、Tim-3和LAG-3等分子导致CD8+细胞毒性T细胞的衰竭，促进免疫逃逸，加速CAC的发展。吲哚胺 2，3双加氧酶1(IDO1)是肝外组织细胞内催化色氨酸(Trp)代谢最重要的一种限速酶，广泛表达于体内多种组织和细胞中，如内皮细胞、参与肿瘤微环境的成纤维细胞、巨噬细胞、髓系抑制细胞(MDSCs)、树突细胞(DCs)等。IDO1 被证实在多种肿瘤组织中过度表达，例如非小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌和肝癌，与肿瘤的恶性程度关系密切，并影响肿瘤患者预后。IDO1能显著抑制T淋巴细胞的增殖、分化及功能，在局部形成免疫耐受微环境，介导肿瘤细胞躲避免疫系统的攻击。IDO1介导的免疫逃逸机制在炎症相关性结肠癌的发生发展中起着重要的调控作用，是促进炎癌转化的关键环节。

三七总皂苷(PNS)是中药材三七中的主要成分，已被证实对神经和心脑血管具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的保护作用，并作为血塞通制剂用于治疗脑缺血，脑出血，心绞痛和高粘度综合征等。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供三七总皂苷在制备治疗结肠炎相关性结肠癌的药物中的应用，为干预和治疗结肠炎相关结肠癌提供新的策略。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

三七总皂苷在制备治疗或预防结肠炎相关性结肠癌的药物中的应用。

三七总皂苷与第二治疗药物联合在制备治疗结肠炎相关性结肠癌的药物中的应用。

作为本申请的优选技术方案，所述治疗结肠炎相关性结肠癌的药物为适于口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、舌下、肌内、直肠、鼻内、吸入、局部、皮下、脂肪内任一给药方式的制剂。

本发明还保护一种制备治疗结肠炎相关性结肠癌的药物，包含三七总皂苷，还包括药学上可接受的载体或辅料。

申请人的研究表明，75mg/kg或150mg/kg三七总皂苷可显著减轻结肠炎症状，表现为相对于模型组体重增加、结肠长度增加、疾病活动指数(DAI)下降；抑制结肠腺瘤的发生发展，表现为结肠肿瘤数目、肿瘤面积、肿瘤负荷减少。结果显示三七总皂苷抑制结肠组织内巨噬细胞的聚集和炎性因子IL-1β的分泌，同时降低外周血、脾脏和结肠组织内Treg细胞的比例。

体外实验表明，三七总皂苷抑制Treg分化的作用是基于STAT1调控的IDO1 表达。不同于经典的P-STAT1调控IDO1基因表达通路，三七总皂苷直接调控 STAT1总蛋白的表达。三七总皂苷作为临床应用成熟的药物，具有服用方便，费用低廉等优点，可为临床上结肠炎相关性结肠癌提供新的更为有效的辅助治疗方案。

附图说明

图1为PNS减轻了AOM-DSS引起的结肠炎，并抑制了结肠癌的生长；其中，图1(A)为小鼠AOM-DSS结肠炎癌的模型建立方案；图1(B)为结肠组织图；图1(C)为相对体重的变化；图1(D)为DAI的平均变化情况；图1 (E)为结肠长度；图1(F)为肿瘤数目；图1(G)为瘤块大小；图1(H)为肿瘤负荷；图1(I)为HE染色。

图2为PNS抑制巨噬细胞在结肠组织的聚集和炎性因子IL-1β的分泌来减轻结肠炎症状；其中，图2(A)为CD11b+F4/80+巨噬细胞在结肠组织比例的流式图；图2(B)为细胞因子IL-1β、IL-6、IL-4和TGF-β在血清中的含量。

图3为PNS抑制了外周血和脾脏中调节性T细胞的比例，发挥了很好的免疫调控作用；其中，图3(A)为外周血中CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞比例的流式图；图3(B)为脾脏中CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞比例的流式图。

图4为800μg/ml PNS抑制了Hela细胞中STAT1和IDO1的基因和蛋白表达；其中，图4(A)和4(B)为给药前后STAT1和IDO1的mRNA表达水平；图 4(C)为给药前后STAT1和IDO1的蛋白表达水平。

图5为PNS很好地抑制了IDO1的酶活和调节性T细胞的增殖分化；图5 (A)为不同剂量下的IDO1酶活；图5(B)为CT26细胞与脾脏细胞共培养模型中CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞比例的流式图。

图6为低剂量2.5μg/ml的PNS代谢物Rh1仍发挥了良好的抑制IDO1酶活的作用；图6(A)为不同剂量的Rh1对IDO1酶活的影响；图6(B)为不同剂量的Rg1对IDO1酶活的影响；图6(C)为不同剂量的R1对IDO1酶活的影响；图6(D)为不同剂量的Rb1对IDO1酶活的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例仅用于说明本发明，而对本发明的保护范围无任何限制作用。

(1)小鼠AOM-DSS(A/D)结肠炎癌模型建立：选取健康C57小鼠或者转基因小鼠50只，体重18-20g，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。适应性饲养1周后每只小鼠腹腔注射10mg/kg的氧化偶氮甲烷(AOM)，正常饮食饮水7天后，给予含有2.5％葡聚糖硫酸钠(DSS)的饮用水，7天后改为正常饮食饮水14天，如此为一个循环。提前一周开始预防性给予75(低剂量组，L)、 150(高剂量组，H)mg/kg PNS。制模过程中每天观察腹泻和肉眼血便等情况，共进行3个循环后，待观察到体重明显下降，出现便血、脱肛等症状后处死小鼠，解剖结肠，进行组织病理学炎症损伤评分，并统计瘤体数量、体积大小。取部分肠段置于10％福尔马林液内固定、包埋、切片、HE染色，进行一般组织病理学观察及评分。

(2)症状及体征观察及评分：造模过程中，观察各组小鼠的体重变化、大便性状、便血、隐血等情况，参照Cooper的经典评分方法，每日将体重下降、大便性状、隐血或便血情况的评分相加，作为疾病活动指数(disease activity index， DAI)。

(3)组织病理学炎症损伤评分：在距肛门2、5、8cm处取3段长约1cm的小鼠结肠组织，制备石蜡切片，进行HE染色，以盲法观察，光镜下观察肠黏膜损伤情况。

(4)脾脏组织单细胞悬液制备：解剖取下脾脏放入含有2ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)的玻璃研磨器中，轻轻碾压后过70μm的筛网获得单细胞悬液，ACK 裂解液以体积比3:1的比例加入，裂解红细胞后，PBS洗2次，待流式检测备用。

(5)外周血淋巴细胞(PBMC)提取：眼球取血后参照小鼠外周血淋巴细胞分离试剂盒(索莱宝，P8620)说明书分离。

(6)结肠组织单细胞悬液制备：处死小鼠，取部分结肠，EDTA消化去除结肠上皮细胞。将剩余的结肠组织剪成小块，放入含Ⅳ型胶原酶(1mg/ml)和透明质酸酶(1％)的消化液中，37℃消化约1小时后过70μm的筛网获得单细胞悬液。PBS清洗重悬后待流式检测备用。

(7)流式细胞技术：取2×10⁵上述获得的PBMC、脾脏或结肠组织细胞， 100μl PBS重悬，根据说明书加入FOXP3打孔试剂3h，PBS清洗后加入一定量的CD4、CD25、FOXP3的流式抗体，4℃孵育过夜，用PBS洗去游离的抗体，用400μl PBS重悬后用流式细胞仪FACSCalibur(BD，USA)检测Treg、 CD4+以及CD8+T细胞的比例。

(8)ELISA检测细胞因子：应用ELISA检测试剂盒(联科，货号分别为 70-EK201B、70-EK206、70-EK204、70-EK981)，参照试剂盒说明书，检测IL-1β、 IL-6、IL-4和TGF-β因子在血清中的含量。

(9)IFN-γ诱导的Hela细胞模型：提前给予100、200、400、800μg/ml PNS 作用24h，之后加入20ng/ml重组IFN-γ蛋白刺激24h后收取细胞待测相关基因或蛋白表达。

(10)Realtime-PCR：Trizol法提取总RNA，按常规分子生物学方法分离 mRNA，以其为模板逆转录合成cDNA第1链，再以此链为模板，Realtime-PCR 扩增目的基因，观察并分析STAT1、IDO1等基因表达的变化。

(11)Westernblot检测：提取总蛋白后电泳分离样品，结束后转移至硝酸纤维素膜，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭，分别与不同一抗反应，再和二抗反应，ECL发光法检测，进一步分析蛋白表达水平的变化。

(12)共培养模型建立：6孔板内接种3×10⁴个CT26细胞，丝裂霉素C 10μg/ml处理3h，待贴壁后，接种分选获得的脾脏T细胞，加入80μg/ml刀豆素 A刺激4天，收集悬浮的T细胞进行流式表型的鉴定。

(13)IDO1酶活检测：犬尿氨酸是IDO1依赖的色氨酸分解代谢的产物，因此通过检测培养基中犬尿氨酸的水平来评估IDO1的生物活性。将100μL培养上清液与25μL用水稀释的30％三氯酸(TCA)混合，涡旋后在50℃振荡器中孵育30分钟。然后以10,000×g离心10分钟。取100μL上清液加入到96孔板中并加入等体积的2％P-二甲基苯甲醛(PDAB，冰醋酸稀释)中，室温下孵育10 分钟。测定在492nm处的吸光度。使用标准曲线对犬尿氨酸的浓度进行定量。

实验结果

(1)三七总皂苷能够有效减轻结肠炎和预防AOM-DSS小鼠结肠腺瘤的发生

我们建立了AOM-DSS小鼠炎癌模型，提前一周预防性给予75、150mg/kg PNS。图1(B-D)结果显示与模型组相比，PNS可增加体重和结肠长度、降低 DAI指数，减轻结肠炎症状。HE显示PNS可减少结肠组织内炎性细胞的浸润和炎性区域。图1(E-H)显示PNS能够减少肿瘤数目、肿瘤面积和肿瘤负荷，抑制结肠腺瘤的生长。以上实验证实PNS能够预防AOM-DSS诱导的小鼠结肠癌的发生。

(2)PNS主要是通过抑制结肠组织巨噬细胞的聚集和炎性因子IL-1β的分泌减轻结肠炎症状

我们检测了血清中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-4、TGF-β的含量以及结肠组织浸润的巨噬细胞比例，如图2所示，PNS能够减少结肠组织中F4/80+CD11b+巨噬细胞的数量并下调血清中IL-1β的水平来减轻结肠炎症，并很好地抑制后续结肠炎癌转化过程。

(3)PNS主要是通过降低Treg细胞比例，刺激CD8+T细胞活化增殖实现的对AOM-DSS模型小鼠结肠炎癌的化学预防作用。

我们利用流式细胞仪检测了外周血和脾脏组织内Treg细胞的比例，结果如图3所示，高低剂量的PNS可显著降低外周血和脾脏组织内Treg的比例，减弱对T淋巴细胞的免疫抑制作用而表现出抗肿瘤的免疫调节作用和化学预防作用。

(4)PNS抑制STAT1和IDO1的基因和蛋白表达

为了探究PNS对Treg细胞的抑制作用，我们建立了IFN-γ诱导的IDO1高表达的Hela细胞模型，结果如图4所示，800μg/ml PNS显著降低IDO1及其上游STAT1的基因和蛋白表达。

(5)PNS抑制IDO1的酶活可进一步抑制Treg细胞分化

基于PNS对IDO1表达的影响，我们以IDO1酶活抑制剂INCB为阳性药检测PNS对IDO1酶活的影响，结果如图5所示，PNS可显著抑制IDO1酶活。IDO1 酶活下降可增加微环境内色氨酸含量、降低犬尿氨酸含量，减弱微环境中的免疫抑制作用。同时我们利用脾脏单细胞和CT26结肠癌细胞共培养模型证实PNS 可降低肿瘤微环境内Treg细胞比例，而且这种免疫调节作用优于IDO1酶活抑制剂INCB。

(6)PNS的体内代谢物之一Rh1显著抑制IDO1酶活

酶活结果如图6所示，低浓度(2.5-10μg/ml)的Rh1表现出了良好的IDO1 酶活抑制作用，提示Rh1可作为重要的单体发挥对IDO1及Treg细胞的免疫调控作用和对结肠炎相关结肠癌的化学预防作用。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (4)

1.三七总皂苷在制备治疗或预防结肠炎相关性结肠癌的药物中的应用。

2.三七总皂苷与第二治疗药物联合在制备治疗结肠炎相关性结肠癌的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗结肠炎相关性结肠癌的药物为适于口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、舌下、肌内、直肠、鼻内、吸入、局部、皮下、脂肪内任一给药方式的制剂。

4.一种制备治疗结肠炎相关性结肠癌的药物，其特征在于，其含有三七总皂苷，还包括药学上可接受的载体或辅料。

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