CN112972502A - 短双歧杆菌ccfm1025在缓解阿尔兹海默症中的应用 - Google Patents

短双歧杆菌ccfm1025在缓解阿尔兹海默症中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了短双歧杆菌CCFM1025在缓解阿尔兹海默症中的应用，属于微生物领域。本发明提供的短双歧杆菌CCFM1025能够显著改善阿尔兹海默症小鼠的认知和记忆障碍，降低阿尔兹海默症小鼠脑内Aβ1‑42蛋白的含量，提高阿尔兹海默症小鼠脑内脑源性神经营养因子和突触后密度蛋白的水平，提高阿尔兹海默症小鼠血清中白介素6的含量；并能够调节肠道菌群及其代谢物。本发明提供的短双歧杆菌CCFM1025可用于制备缓解痴呆、阿尔兹海默症、改善认知障碍的药物组合物，还可以作为微生态制剂应用于药品、发酵食品或保健品，具有非常广泛的应用前景。

Description

短双歧杆菌CCFM1025在缓解阿尔兹海默症中的应用
技术领域
本发明涉及短双歧杆菌CCFM1025在缓解阿尔兹海默症中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
阿尔兹海默症又称为老年性痴呆，是一种神经退行性疾病，临床表现为学习认知能力下降，逐渐丧失生活自理能力。阿尔兹海默症的临床特点是隐袭起病，进行性加重，发病10-20年因并发症而死亡。阿尔兹海默症患者占所有痴呆患者人数的60-80％，是最常见的痴呆类型。
关于阿尔兹海默症的发病机制，目前现代医学有十几种假说，研究较多的主要有胆碱能丢失学说、Tau蛋白过度磷酸化学说、氧化应激学说、β淀粉样蛋白毒性学说、炎症因子学说等。阿尔兹海默症最具特征的两大病理学变化是Aβ沉积形成的老年斑和细胞内异常磷酸化的Tau蛋白聚集引起的神经原纤维缠结。自1992年以来，淀粉样蛋白级联假说在解释阿尔兹海默症发病机制中发挥了重要作用。Aβ被认为是阿尔兹海默症发病机制的关键因素，其中Aβ1-42易形成纤维状淀粉样蛋白聚集体，被称为是老年斑的主要成分。
目前，全球约有5000万人饱受阿兹海默症的困扰，而且这一群体的数量预计还将继续增长。但是，阿茨海默症治疗药物的研发进展却一直相当缓慢。当前治疗阿尔兹海默症的方式包括药物治疗、免疫疗法以及膳食补充天然提取物治疗等方式。乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)是到目前为止，临床上使用最为广泛的阿尔兹海默症治疗药物。FDA批准用于治疗阿尔兹海默症的5种药物中除了美金刚属于NMDA受体拮抗药外，其余4种他克林(Tacrine)、多奈哌齐(Donepezil)、加兰他敏(Galanthamine)和卡巴拉汀(Rivastigmine)均属于乙酰胆碱酯酶抑制剂。在临床上，目前FDA批准的5种阿尔兹海默症治疗药物均属于对症治疗药物，影响疾病进程的药物仍处于初步研究阶段。此外，单一药物药效不显著，且神经性药物副作用较大。因此，探索在阿尔兹海默症发病早期进行干预的方法，以延缓疾病进程显得尤为重要，具有十分广阔的市场潜力。
“脑肠轴”是近年来提出的一个新概念，作为肠内细菌与大脑间的双向通信系统，主要通过神经途径、内分泌途径和免疫途径来调节大脑的功能以及行为。随着对“脑肠轴”研究的不断深入，发现益生菌可通过迷走神经、神经免疫系统、神经递质、微生物代谢产物等途径调节肠道菌群组成，从而缓解神经性疾病。临床试验已经证实通过益生菌、益生元以及粪菌移植治疗可以调节肠道菌群组成，有效改善啮齿动物的抑郁、自闭症等神经性疾病。目前，已知可用于防治神经性疾病的“精神益生菌”种类太匮乏；其次，肠道菌群的复杂性以及研究方法上的困难性，对于肠道菌群的临床研究较少，其参与机体代谢以及相互作用的机制尚未明确；因此，筛选出一种能够介导肠道菌群缓解阿尔兹海默症的益生菌，并深入挖掘其功能，开发更高保健价值的益生菌产品显得十分重要。此外，精神益生菌的开发也将为通过膳食干预缓解阿尔兹海默症开辟出新的途径和解决方案。
发明内容
本发明提供了短双歧杆菌CCFM1025(Bifidobacterium breve)或含短双歧杆菌CCFM1025(Bifidobacterium breve)的菌剂在制备缓解认知障碍、延缓阿尔兹海默症进程和/或调节肠道菌群及其代谢物的药物中的应用；所述短双歧杆菌CCFM1025已于2018年6月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60386，并公开于公开号为CN108949640B的专利文件中。
在一种实施方式中，所述缓解认知障碍、延缓阿尔兹海默症进程包括但不限于：
(a)降低哺乳动物脑内β-淀粉样多肽-42(Aβ1-42)沉积；
(b)提高哺乳动物脑内神经递质水平；
(c)提高哺乳动物脑内突触后密度蛋白水平；
(d)提高哺乳动物血清中白细胞介素6(IL-6)的含量；
在一种实施方式中，所述肠道菌群包括但不限于所述肠道菌群包括但不限于颤螺菌属(Oscillospira)微生物、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。
在一种实施方式中，所述代谢物包括但不限于乙酸、丁酸。
在一种实施方式中，所述药物中短双歧杆菌的细胞数量≥1×108CFU/g或1×108CFU/mL。
在一种实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的载体。
在一种实施方式中，所述载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述药物的剂型是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
在一种实施方式中，所述菌剂为将含有短双歧杆菌CCFM1025的菌液干燥得到的粉剂。
在一种实施方式中，所述干燥是指真空冷冻干燥或其它菌液干燥工艺。
在一种实施方式中，所述菌剂中短双歧杆菌的细胞数量≥1×108CFU/g。
在一种实施方式中，所述菌剂的制备方法是将短双歧杆菌CCFM1025接种至培养基中，在35-39℃厌氧培养24-48h，用pH为6.8-7.2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用保护剂重悬，使菌浓达到1010CFU/mL，再将该悬浮液在温度37℃厌氧条件下预培养50-70min，再于-15～-20℃预冻8-14h，之后进行真空冷冻干燥，得到所述菌剂。
在一种实施方式中，所述保护剂是含100g/L-150g/L脱脂奶粉、100g/L-150g/L麦芽糊精、140g/L-160g/L海藻糖的溶液。
在一种实施方式中，所述培养基为含0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基。
在一种实施方式中，所述培养基在119-123℃条件下灭菌15-25min。
本发明还提供所述短双歧杆菌在制备缓解认知障碍、延缓阿尔兹海默症进程、调节肠道菌群及其代谢物的功能性食品或保健品中的应用。
在一种实施方式中，所述功能性食品是由所述短双歧杆菌长参与发酵制得。
在一种实施方式中，所述发酵食品包括固态食品、液态食品或半固态食品。
在一种实施方式中，所述发酵食品的种类包括乳制品、豆制品或果蔬制品。
在一种实施方式中，所述乳制品包括发酵乳、风味发酵乳、发酵乳饮料等、奶油、乳酪、含乳饮料或乳粉；所述豆制品包括豆奶、豆乳粉；所述果蔬制品包括以白菜、白萝卜、黄瓜、甜菜、黄桃或杨梅制品中至少一种为原料制得的果蔬制品。
本发明有益效果
本发明提供了短双歧杆菌GDMCC NO:60386在改善阿尔兹海默症小鼠的认知和记忆障碍中的新用途，该菌株或含有该菌株的制剂能够降低阿尔兹海默症小鼠脑内Aβ1-42的含量、提高阿尔兹海默症小鼠脑内脑源性神经营养因子和突触后密度蛋白的水平，明显提高阿尔兹海默症小鼠血清中白细胞介素6的含量，提高阿尔兹海默症小鼠粪便中菌群代谢物乙酸和丁酸水平，有效调节阿尔兹海默症小鼠肠道菌群的结构，提高肠道有益菌颤螺菌属(Oscillospira)和罗伊氏乳杆菌种(Lactobacillus reuteri)的相对丰度。因此，本发明所述的短双歧杆菌CCFM1025可用于制备缓解痴呆、阿尔兹海默症、改善认知障碍的药物组合物，还可以作为微生态制剂应用于药品、发酵食品或保健品，具有非常广泛的应用前景。
附图说明
图1为短双歧杆菌CCFM1025干预后，小鼠在Y迷宫实验中的行为学变化。(A)自由交替百分比；(B)总进臂次数；其中，与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
图2为短双歧杆菌CCFM1025干预后，小鼠在水迷宫实验中的行为学变化。(A)定位巡航实验中，各组小鼠逃避潜伏期；(B)空间探索实验中，各组小鼠在原平台所在象限停留的时间百分比；其中，与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
图3为短双歧杆菌CCFM1025干预后，小鼠在避暗实验记忆保持测试中的潜伏期。其中，与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
图4为短双歧杆菌CCFM1025干预后，小鼠海马组织中β淀粉样多肽(Aβ1-42)的含量。其中，与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
图5为短双歧杆菌CCFM1025干预后，小鼠海马组织中突触蛋白的含量变化。(A)脑源神经营养因子(BDNF)的含量；(B)突触后密度蛋白95(PSD95)的含量；其中，与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
图6为短双歧杆菌CCFM1025干预后，小鼠血清中白细胞介素6(IL-6)的含量变化。其中，与模型组相比，*P<0.05。
图7为短双歧杆菌CCFM1025干预后，小鼠粪便中乙酸(图A)和丁酸(图B)的浓度变化。其中，与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图8为短双歧杆菌CCFM1025干预后，小鼠肠道微生物丰度的变化。(A)颤螺菌属(Oscillospira)相对丰度的变化；(B)罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus.reuteri)相对丰度的变化；其中，与模型组相比，*P<0.05，***P<0.001。
具体实施方式
以下实施例中提及的短乳杆菌CCFM1025为保藏编号GDMCC No.60386的菌株，已公开于公开号为CN108949640B的专利文件中。
短双歧杆菌CCFM1025菌悬液的制备：取活化2代的双歧杆菌CCFM1025并于37℃下培养至24h，于4℃、8000r/min离心3min收集菌体，弃去上清并用灭菌后的浓度为100g/L的脱脂乳液重悬菌体，使短双歧杆菌CCFM1025浓度达到5×109CFU/mL。
实施例1：短双歧杆菌CCFM1025改善阿尔兹海默症小鼠的行为学指标
取7周龄雄性C57BL/6J小鼠32只，适应环境一周后，一次性向脑部海马微注射Aβ1-42蛋白建立阿尔兹海默症的动物模型，造模后第3天，将动物分为四组：对照组(注射等体积的生理盐水)、模型组、药物干预组、CCFM1025干预组，每组含8只小鼠。动物分组及处理方法见表1。
表1动物实验分组及处理方法
Figure BDA0003049456180000041
Figure BDA0003049456180000051
脑部微注射Aβ1-42蛋白导致的AD小鼠模型：小鼠适应一周后，各组小鼠经异氟烷(诱导浓度3％，维持浓度1％)麻醉后，将小鼠头顶去毛，用75％酒精消毒后，固定于脑立体定位仪上。手术刀沿正中矢状方向划开一个切口，暴露头骨，医用棉签取双氧水擦拭颅骨以暴露其前囱的交错十字区，找到前囱位置，做好标记。参照小鼠脑立体定位图谱，于前囱后2.0mm，中线旁开1.8mm处打孔。5μL微量进样器自颅骨表面垂直向下进针2.0mm，注射样品量为1μL，进样速度为0.2μL/min。模型组、药物干预组、CCFM1025干预组注射寡聚肽Aβ1-42，浓度为2μg/μL，对照组注射等量无菌生理盐水。注射后，留针5min，后缓慢退针。缝合伤口后，按4万单位/只给予青霉素钠肌注，大约2-3天。整个过程无菌操作。
益生菌灌胃剂：取活化2代的双歧杆菌CCFM1025并于37℃下培养至24h，于4℃、8000r/min离心3min收集菌体，弃去上清并用10％灭菌脱脂乳液重悬菌体，使乳酸菌浓度达到5×109CFU/mL。灌胃体积为0.2mL/只/天。
第五周开始，对所有小鼠进行行为学测试。首先，检测了与抑郁焦虑相关的行为学指标，包括通过强迫游泳实验、悬尾实验、糖水偏好实验、旷场实验和跳台实验检测小鼠行为学变化，结果表明该模型小鼠不具有抑郁样行为。然后，通过Y迷宫实验、水迷宫实验、避暗实验检测了与学习与记忆相关的行为学指标。具体实施方法和结果如下：
(1)Y迷宫实验：
Y迷宫实验可同时观察动物的逃避条件反射能力和空间辨别能力，应用于评价动物的辨别性学习、工作记忆及参考记忆。Y迷宫实验包含两个阶段，第一个阶段为训练期：将小鼠放入Y型迷宫，在起始臂和其他臂中自由活动10min，训练结束后，小鼠被放回饲养笼，24小时后进行下一阶段的测试。第二个阶段为检测期：小鼠由中心点放入迷宫，在3个臂中自由活动8min。录像分析系统记录总进臂次数和连续进入三个不同臂的次数，并按公式计算交替百分比：交替百分比＝连续进入三个不同臂的次数/(总进臂次数-2)×100％。
实验结果如1所示，模型组小鼠在Y迷宫实验中自由交替百分比(图1A)和总进臂次数(图1B)分别降低至48.41％和30.14次，表现出辨别记忆障碍的行为特点；而灌胃CCFM1025能够显著改善以上行为障碍，使交替百分比和总进臂次数分别提高至64.21％和40.43次，且效果明显优于盐酸多奈哌齐药物干预组。因此，短双歧杆菌CCFM1025可改善行为障碍小鼠的短期学习记忆和工作记忆。
(2)水迷宫实验：
水迷宫实验强迫实验小鼠游泳，从而学习寻找隐藏在水中平台，进而测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力，是开展行为学研究尤其是学习与记忆研究的首选经典实验。
水迷宫圆形池被划分为四个象限，水温保持23-25℃。在第0天进行水迷宫适应性训练，第1-5天进行定位巡航实验，每天4次。定位巡航实验时，将小鼠面向池壁从四个随机不同的入水点分别放入水池，记录小鼠从进入水中到找到水下隐蔽的平台并站立于其上所需时间(逃避潜伏期)和在此期间的运动总距离。若入水后60s小鼠未能找到隐藏的平台，则将用长棍将其轻轻引导至平台，并让其在平台上站立30s，逃避潜伏期记为60s。之后在第6天移掉平台，进行空间探索实验，记录60s内小鼠穿越原平台的次数以及原平台所在象限停留的时间及运动距离。
实验结果如图2所示，模型组小鼠在水迷宫实验中逃避潜伏期(图2A)明显升高至51.06s，而在原平台所在象限的停留时间占总时间的百分比显著下降至34.97％(图2B)，表明模型组小鼠空间记忆和学习记忆受损；而灌胃CCFM1025能够显著改善以上行为障碍，使小鼠在水迷宫实验中逃避潜伏期降低至28.68s，在原平台所在象限的停留时间占总时间的百分比升高至65.99％，且效果明显优于盐酸多奈哌齐药物干预组。
(3)避暗实验：
水迷宫实验后小鼠休息1天，然后开展避暗试验，试验共历时2天。第1天为单次电击训练期，将小鼠放置在明亮箱体中，10s后，将明暗箱之间的门打开。多数品系的小鼠有很强的探究行为，喜暗恶光。因此，小鼠会很快进入暗箱。小鼠一旦完全进入暗箱中后，关闭通道门，开始电击(0.3mA，2s)；让小鼠在暗箱内停留10s(以使让动物形成箱与电击之间的关联)，将小鼠放回笼内。第2天为记忆保持测试期，将小鼠放置在明亮箱体中，中门打开，但不给电击。记录小鼠钻入暗箱时间，记为潜伏期。
实验结果如图3所示，模型组小鼠钻入暗箱的潜伏期明显缩短至10.6s，表明小鼠记忆保持能力受损，而CCFM1025干预能显著缓解其记忆障碍，使潜伏期延长至28.68s，优于药物组的14.67s和对照组的20.37s。
实施例2：CCFM1025降低阿尔兹海默症小鼠脑内Aβ蛋白沉积
小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。小鼠行为学实验结束后，隔天采用浓度为1％的戊巴比妥钠溶液对小鼠进行腹腔注射，使其麻醉，对小鼠进行处死，取小鼠脑组织，并于冰上分离海马组织。取一定质量的新鲜海马组织，加入9倍体积的无菌PBS缓冲液(相当于1g组织加9ml的匀浆液)，用组织匀浆器进行匀浆，组织液经过3000g、15min离心后取上清，用ELISA试剂盒检测海马中β淀粉样蛋白(Aβ1-42)的含量。
实验结果如图4所示，结果表明，短双歧杆菌CCFM1025干预能够显著降低模型小鼠海马组织中Aβ1-42蛋白的沉积，相比于模型组由5.68ng/mL降低至4.67ng/mL，甚至优于药物组的5.06ng/mL，缓解效果显著优于盐酸多奈哌齐药物干预。
实施例3：短双歧杆菌CCFM1025提高阿尔兹海默症小鼠脑内神经递质及突触蛋白水平
取一定质量实施例2获得的脑组织，加入9倍体积的无菌PBS缓冲液(相当于1g组织加9ml的匀浆液)，用组织匀浆器进行匀浆，组织液经过3000g、15min离心后取上清，用ELISA试剂盒检测脑组织中脑源性神经营养因子BDNF的含量。
实验结果如图5A所示，结果表明，短双歧杆菌CCFM1025干预显著逆转了阿尔兹海默症模型小鼠大脑中BDNF水平的降低，使BDNF含量由模型组的143.66pg/mL恢复至172.55pg/mL，与对照组的含量相当，且CCFM1025对大脑中BDNF的改善效果显著优于盐酸多奈哌齐，BDNF的升高能够促进神经生成，减少患病大脑的炎症。
实施例4：短双歧杆菌CCFM1025提高阿尔兹海默症小鼠脑内突触蛋白水平
取一定质量实施例2获得的脑组织，加入9倍体积的无菌PBS缓冲液(相当于1g组织加9ml的匀浆液)，用组织匀浆器进行匀浆，组织液经过3000g、15min离心后取上清，用ELISA试剂盒检测脑组织中突触后密度蛋白PSD-95的含量。
实验结果如图5B所示，结果表明，短双歧杆菌CCFM1025干预显著逆转了阿尔兹海默症模型小鼠大脑中PSD-95水平的降低，使CCFM1025组小鼠大脑中PSD95的含量相比于模型组的1.33pg/mL恢复至1.48pg/mL，与正常对照组相当。
实施例5：短双歧杆菌CCFM1025提高阿尔兹海默症小鼠血清中IL-6的含量
小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。行为学实验结束处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，用ELISA试剂盒检测血清中IL-6的含量。
实验结果如图6所示，在阿尔茨海默症模型小鼠血清中，IL-6的水平显著下降至11.56pg/mL，短双歧杆菌CCFM1025干预显著提高了血清中IL-6的水平，使IL-6水平恢复至15.74pg/mL，表现出较好的认知及记忆保护功能，而药物盐酸多奈哌齐干预效果不显著。
实施例6：短双歧杆菌CCFM1025提高阿尔兹海默症小鼠粪便中乙酸和丁酸的含量
小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。小鼠行为学实验结束后，收集小鼠粪便冻存于-80℃，用GC-MS的方法检测小鼠粪便中乙酸和丁酸的含量。具体方法如下：取50mg小鼠粪便样品，加入500μL的饱和NaCl溶液中浸泡混匀；加入20μL 10％硫酸溶液酸化后，再加入800μL乙醚震荡，离心(13000rpm，15min，4℃)；取上层乙醚相，加0.25g无水硫酸钠干燥；充分震荡后静置30min，再次离心(13000rpm，15min，4℃)；吸取上清液加入气相小瓶中，进行气质分析。
GC-MS条件为：使用Rtx-Wax柱(柱长30m，内径25μm)；载气为He，流速为2mL/min；进样体积1μL，按7.5℃/min升温至140℃，然后按60℃/min升温至200℃保持3min,离子化温度为20℃；分析采用全扫描模式，通过外标法测得标准曲线，进而计算出乙酸和丁酸的浓度。
实验结果如图7所示，模型组小鼠粪便中乙酸含量显著低于对照组，且具有统计学意义，短双歧杆菌CCFM1025干预使小鼠粪便中乙酸含量显著恢复至21.585μmol/g，比药物干预组高2.814μmol/g，且比对照组乙酸含量高5.43μmol/g。此外，模型组小鼠粪便中丁酸含量比对照组低0.581μmol/g，但与对照组相比无统计学差异；而短双歧杆菌CCFM1025干预显著提高了丁酸含量至2.876μmol/g，比模型组和药物干预组分别高了1.794μmol/g和0.497μmol/g。
实施例7：短双歧杆菌CCFM1025对阿尔兹海默症小鼠肠道菌群的调节作用
小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。小鼠行为学实验结束后，收集小鼠粪便。按照MP试剂盒的操作步骤提取小鼠粪便中细菌基因组；以小鼠粪便基因组为模板，以上游引物520F(5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)、下游引物802R(5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′)为引物扩增16S rDNA的V3-V4区片段；将PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳进行纯化，按照QIAquick GelExtraction Kit胶回收试剂盒说明书进行目的条带胶回收；按照Qubit DNA3.0试剂盒检测样品DNA浓度，然后根据TurSeq DNA LT Sample Preparation Kit及其说明构建文库；最后按照MiSeq Regent Kit试剂盒的说明进行Illumina Miseq测序仪上机测序。测序完成后，在QIIME平台进行物种分类注释。
实验结果如附图8所示。阿尔兹海默症模型组小鼠粪便内Oscillospira属和Lactobacillus reuteri种的肠道微生物丰度显著降低，短双歧杆菌CCFM1025的摄入可使该两个属的肠道微生物的相对丰度显著回升，其中，颤螺菌属的相对丰度相比于模型组的1.69％回升至2.39％，罗伊氏乳杆菌的相对丰度相对于模型组的0.24％回升至1.25％，并高于对照组的1.17％；而药物盐酸多奈哌齐对这两种肠道微生物的丰度变化无恢复作用。其中，Oscillospira属微生物能够产短链脂肪酸，其丰度与人体健康成正相关；罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)是已公布的可用于保健品的微生物菌种，罗伊氏乳杆菌可在肠道内定植，拮抗有害菌，改善肠道菌群的分布，提高免疫力，对人体健康发挥有益作用。上述结果表明，短双歧杆菌CCFM1025不仅能够在体内定植，还能上调产短链脂肪酸菌和对人体有益菌的相对丰度。
实施例8短双歧杆菌CCFM1025菌剂的制备
(1)培养基的制备：短双歧杆菌的培养基为改良MRS培养基，即MRS培养基+0.05％L-半胱氨酸盐酸盐，调整其pH为6.8±0.2，得到培养基；在119-123℃条件下灭菌15-25min；
(2)保护剂的制备：将含有100g/L-150g/L脱脂奶粉、100g/L-150g/L麦芽糊精、140g/L-160g/L海藻糖的混合溶液作为冻干保护剂；
(3)短双歧杆菌CCFM1025的培养：将短双歧杆菌CCFM1025以所述培养基的质量计2-4％的接种量接种到的步骤(1)的培养基中，然后在温度35-39℃厌氧条件下培养24-48h，用pH为6.8-7.2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用步骤(2)所述的保护剂重悬，使菌浓达到1010CFU/mL；
(4)菌剂的制备：将步骤(3)的悬浮液在温度37℃厌氧条件下预培养50-70min，再在-15～-20℃预冻8-14h，最后进行真空冷冻干燥，得到发酵菌剂。
实施例9：利用本发明短双歧杆菌CCFM1025制造含该菌的果蔬饮料
选用新鲜蔬菜洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温至37℃，再接种实施例8制备的短双歧杆菌CCFM1025发酵菌剂，使蔬菜汁中的短双歧杆菌CCFM1025的浓度达到106CFU/mL以上，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含有本发明短双歧杆菌CCFM1025活菌的果蔬饮料。
实施例10：利用本发明短双歧杆菌CCFM1025制造含该菌的发酵食品
利用本发明能够使用短双歧杆菌CCFM1025发酵生产制备其他发酵食品，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所述乳制品包括牛奶、酸奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜制品。
按照实施例1～7的方法验证实施例9的果蔬饮料与实施例10的发酵食品对阿尔兹海默症小鼠的作用，结果显示，含有短双歧杆菌CCFM1025的发酵食品或果蔬饮料也能够显著改善阿尔兹海默症小鼠的认知和记忆障碍、降低阿尔兹海默症小鼠脑内Aβ1-42蛋白的含量、提高阿尔兹海默症小鼠脑内脑源性神经营养因子和突触后密度蛋白的水平、提高阿尔兹海默症小鼠血清中白介素6的含量；提高阿尔兹海默症小鼠粪便中菌群代谢物乙酸和丁酸水平，改善胃肠道蠕动功能；并能够调节阿尔兹海默症小鼠肠道菌群的结构，提高肠道有益菌颤螺菌属(Oscillospira)和罗伊氏乳杆菌种(Lactobacillus reuteri)的相对丰度。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.短双歧杆菌CCFM1025(Bifidobacterium breve)或含短双歧杆菌CCFM1025的菌剂在制备缓解认知障碍、延缓阿尔兹海默症进程和/或调节肠道菌群及其代谢物的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缓解认知障碍、延缓阿尔兹海默症进程包括(a)～(d)中的至少一种：
(a)降低哺乳动物脑内β-淀粉样多肽-42沉积；
(b)提高哺乳动物脑内神经递质水平；
(c)提高哺乳动物脑内突触后密度蛋白水平；
(d)提高哺乳动物血清中白细胞介素6(IL-6)的含量。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物包括但不限于人类。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肠道菌群包括但不限于颤螺菌属(Oscillospira)微生物、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述菌剂为将含有短双歧杆菌CCFM1025的菌液干燥得到的粉剂。
6.根据权利要求1～5任一所述的应用，其特征在于，所述药物中短双歧杆菌的细胞数量≥1×108CFU/g或1×108CFU/mL。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物还含有药学上可接受的载体。
8.短双歧杆菌CCFM1025在制备缓解认知障碍、延缓阿尔兹海默症进程、调节肠道菌群及其代谢物的功能性食品或保健品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述功能性食品是由所述短双歧杆菌长参与发酵制得的发酵食品。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述发酵食品包括乳制品、豆制品或果蔬制品。
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