CN112972501B - 一种乳酸菌通过干扰脂代谢紊乱制备防治肿瘤功能产品方面中的应用 - Google Patents
一种乳酸菌通过干扰脂代谢紊乱制备防治肿瘤功能产品方面中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种乳酸菌通过干扰脂代谢紊乱制备防治肿瘤药品及功能产品方面中的应用。本发明提供了一种乳酸菌抑制脂代谢紊乱发挥肿瘤防治作用的应用,以乳酸菌破碎上清液为活性物质,实验表明其在抑制脂代谢紊乱肿瘤细胞脂肪变性、降低细胞内油脂含量的同时可通过直接降低细胞中HMGCR、SREBP‑2、SMYD3等基因的表达,抑制肿瘤细胞增殖、迁移,促进肿瘤细胞凋亡以达到调节脂代谢紊乱同时抑制肿瘤发生发展的功能。本发明植物乳杆菌CGMCC No.8198可用于食品、医药等领域,如可用于开发相关功能性食品与药品。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,涉及乳酸菌在肿瘤防治中的新用途,尤其是一种乳酸菌通过干扰脂代谢紊乱制备防治肿瘤药物及功能产品方面中的应用。
背景技术
肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下,局部组织细胞增生所形成的新生物。根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度,又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类,其中恶性肿瘤可分为癌和肉瘤。癌是指来源于上皮组织的恶性肿瘤,具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征。据2019年国家癌症中心统计,肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、甲状腺癌、子宫颈癌、胰腺癌、脑瘤等恶性肿瘤已成为我国第二大死亡因素。目前恶性肿瘤治疗要根据患者的身体状况、肿瘤的病理类型、侵犯范围等情况,综合采用手术、化疗、放疗、免疫治疗、中医中药治疗、介入治疗、微波治疗等手段进行治疗。但能早发现、早期诊断的肿瘤的患者相对较少,故仅有少数患者能行外科手术治疗。在可行外科手术治疗的患者中,亦存在副作用大、术后复发率高、易转移等问题。
代谢重编程是肿瘤的标志之一,可以使得肿瘤细胞在不利的生存环境下保持选择性的生长优势。脂代谢异常是肿瘤发生发展过程中重要的代谢事件,研究发现,多个转录因子及信号通路在调控肿瘤细胞脂代谢中发挥重要作用,其中HMG-CoA还原酶(HMGCR)、甾醇调节元件结合蛋白2(SRBBP-2)等是参与胆固醇合成的重要的转录调控因子,其在肿瘤细胞中的表达水平明显升高。近年来,HMGCR已被视为是一个重要的新型抗肿瘤药物靶点,抑制HMGCR的他汀类降脂药也因而被视为一类富有潜力的抗肿瘤药物。SMYD3是一种与肝癌、乳腺癌等密切相关的组蛋白甲基化酶。在最近的研究中,我们也在国内外率先证实SMYD3可在糖脂代谢紊乱过程中调节HMGCR的转录表达。
植物乳杆菌CGMCC No.8198是本申请人前期筛选获得的一株对人体健康有促进作用的乳酸菌,已被证明具有较高的胆盐耐受性和胆盐水解酶活性(专利号:201310491340.4),同时有降血脂及辅助减肥(专利号:201310518617.8)、抑制黑色素瘤发生发展的功效等。此外,研究表明,乳酸菌存在不同程度的抗菌、抗氧化、及抗肿瘤作用,并且其在预防和治疗包括结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、肝癌等多种疾病方面被广泛应用。针对乳酸菌发挥抗癌作用的机理主要包括抑制致癌酶活性、产生抗诱变化合物、降解癌细胞中致癌物、诱导细胞凋亡等方面。现有报道大多是将乳酸菌提取物应用于高血糖高血脂等心脑血管疾病的应用。本发明解决了现有治疗肿瘤方法中存在的严重副作用的问题及植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液没有用于肿瘤治疗的报道。该发明的上清液是从植物乳杆菌CGMCC No.8198菌体中提取出来的,以其作为治疗肿瘤的药物。本发明的植物乳杆菌CGMCCNo.8198破碎上清液具有明显抑制肿瘤细胞脂肪变性,同时抑制肿瘤细胞增殖、迁移,促进其凋亡的优点。
目前尚未有用植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液经由调节脂代谢紊乱通路治疗肿瘤的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处,提供一种乳酸菌通过干扰脂代谢紊乱制备防治肿瘤药品及功能产品方面中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种乳酸菌在制备防治肿瘤药物方面中的应用。
一种乳酸菌在制备干扰脂代谢紊乱药物方面中的应用。
一种植物乳杆菌CGMCC No.8198在通过干扰脂代谢紊乱制备防治肿瘤药物方面中的应用。
而且,所述植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液加到肿瘤细胞中,肿瘤细胞的生长明显受到抑制。
而且,发挥肿瘤防治作用的物质为植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液。
而且,所述植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液能够抑制脂代谢紊乱肿瘤细胞的脂肪形成、降低细胞内油脂含量,同时抑制HMGCR/SMYD3信号通路中脂代谢关键基因的表达。
而且,所述脂代谢关键基因为SREBP-2、HMGCR、SMYD3等。
而且,所述植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液能够直接抑制肿瘤细胞中SREBP-2、HMGCR、SMYD3基因的表达。
而且,所述植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液能够抑制肿瘤细胞增殖和迁移、促进肿瘤细胞凋亡。
一种植物乳杆菌CGMCC No.8198在通过干扰脂代谢紊乱制备防治肿瘤功能产品方面中的应用。
本发明的优点和积极效果如下:
1、本发明提供了一种乳酸菌抑制脂代谢紊乱的应用,以乳酸菌破碎上清液为活性物质,实验表明其可抑制肿瘤细胞脂肪变性、降低肿瘤细胞内油脂含量;还有降低高脂细胞中HMGCR、SREBP-2、SMYD3等基因表达的作用,以达到调节脂代谢紊乱的功能。
2、本发明提供了一种乳酸菌通过干扰脂代谢紊乱发挥肿瘤防治作用的应用,以乳酸菌破碎上清液为活性物质,实验表明其可直接降低肿瘤细胞中HMGCR、SREBP-2、SMYD3等基因活性,同时抑制肿瘤细胞生长和迁移、促进肿瘤细胞凋亡而表现出干扰脂代谢紊乱发挥防治肿瘤的作用。
3、本发明所用菌株为食品级的益生菌,以此进行相关药物研究具有高度的安全性。
4、本发明为肿瘤的治疗提供了新的理论指导。
5、本发明通过细胞实验说明:植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液对肿瘤细胞脂代谢紊乱有明显的抑制作用,并且对脂代谢紊乱通路中SREBP-2、HMGCR、SMYD3等基因有直接的抑制作用;植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液具有抑制肿瘤细胞增殖和迁移,促进其凋亡的作用。本发明植物乳杆菌CGMCC No.8198可用于医药等领域,如可用于开发相关药品。
附图说明
图1为本发明中不同浓度LpS处理油酸诱导的脂代谢紊乱肿瘤细胞(以肝癌细胞HepG2为例)48h后,油红染色检测对细胞脂代谢情况的影响示意图;
图2为本发明中不同浓度LpS处理油酸诱导的脂代谢紊乱肿瘤细胞(以肝癌细胞HepG2为例)48h后,RT-qPCR检测细胞SREBP-2、HMGCR、SMYD3基因mRNA表达图;
图3为本发明中不同浓度LpS处理油酸诱导的脂代谢紊乱肿瘤细胞(以肝癌细胞HepG2为例)48h后,Western Blot检测细胞SREBP-2、HMGCR、SMYD3蛋白表达图;
图4为本发明中不同浓度LpS处理肿瘤细胞(以肝癌细胞HepG2为例)48h后,Western Blot检测对细胞SREBP-2、HMGCR、SMYD3蛋白表达图;
图5为本发明中不同浓度LpS处理肿瘤细胞(以肝癌细胞HepG2为例)24h,48h后,MTT检测细胞增殖示意图;
图6为本发明中不同浓度LpS处理肿瘤细胞(以肝癌细胞HepG2为例)不同时间,细胞划痕实验检测细胞迁移图;
图7为本发明中不同浓度LpS处理肿瘤细胞(以肝癌细胞HepG2为例)24h,流式细胞术检测细胞凋亡图;
图8为本发明中不同浓度LpS处理肿瘤细胞(以肝癌细胞HepG2为例)48h,流式细胞术检测细胞凋亡图。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明进一步说明,下属实施例是叙述性的,不是限定性的,不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料,如无特殊说明,均为常规市售产品,本发明中所使用的方法,如无特殊说明,均为本领域常规方法,本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一种乳酸菌在制备防治肿瘤药物方面中的应用。
一种乳酸菌在制备干扰脂代谢紊乱药物方面中的应用。
一种植物乳杆菌CGMCC No.8198通过干扰脂代谢紊乱制备防治肿瘤药物方面中的应用。
较优地,所述植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液加到肿瘤细胞中,肿瘤细胞的生长明显受到抑制。
较优地,发挥肿瘤防治作用的物质为植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液。
较优地,所述植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液能够抑制脂代谢紊乱肿瘤细胞的脂肪形成、降低细胞内油脂含量,同时抑制HMGCR/SMYD3信号通路中SREBP-2、HMGCR、SMYD3等脂代谢关键基因的表达。
较优地,所述植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液能够直接抑制肿瘤细胞中SREBP-2、HMGCR、SMYD3等基因的表达。
较优地,所述植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液能够抑制肿瘤细胞增殖和迁移、促进肿瘤细胞凋亡。
较优地,所述植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液的制备方法如下:
⑴菌体的活化:将从-80℃冰箱中取出保存的植物乳杆菌CGMCC No.8198置于室温完全融化,在超净台内以1%~5%的接菌量,移至MRS培养基内,37℃厌氧箱培养12~14h,按此法活化三代;
⑵菌体的收集:将培养好的菌体分入离心管内配平,6000~12000r/min,4℃离心10~15min,收集沉淀,用洗脱缓冲液清洗菌体三次,6000~12000r/min,4℃离心10~15min,收集沉淀得到所需菌体;
其中,所述洗脱缓冲液为:50nM Tris-HCL,pH=7.1,30mM CaCl2;
⑶菌体破碎上清液的获取:将得到的菌体加入与原始培养基等体积的洗脱缓冲液重悬,于振幅300~350W,超声3~10s停4~15s,超声时间15~30min的条件进行超声破碎;离心收集菌体破碎上清液,用0.22μm滤膜过滤,即得,-20℃保存备用。
具体地,相关制备及检测如下:
本发明提供乳酸菌破碎上清液干扰脂代谢紊乱发挥肿瘤防治的应用。
本发明采用的乳酸菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CGMCC No.8198,保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏日期为2013年9月17日,保藏编号为CGMCC No.8198,该菌株的分离、纯化、鉴定方法已在中国专利ZL201310491340.4中公开。其中乳酸菌破碎上清液可以按照如下步骤获得:
-80℃保藏的植物乳杆菌CGMCC No.8198以5%接种量接种于200mL的MRS培养基,37℃厌氧培养12h,连续活化3代。菌液于4℃、6000rpm离心10min收集菌体,将得到的菌体用洗脱缓冲液清洗3次后加入与原始培养基等体积的洗脱缓冲液重悬,于振幅300W,超声3s停4s,超声时间30min的条件进行超声破碎。离心收集菌体破碎上清液(LpS),用0.22μm滤膜过滤,-20℃保存备用。
所采用的植物乳杆菌破碎上清液浓度为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL。
植物乳杆菌CGMCC No.8198破碎上清液的细胞实验相关制备及检测如下:
1、实验试剂准备:
(1)制备DMEM(高糖)培养基
取1袋(13.37g)DMEM(高糖)培养基粉末,倒入装有800mL去离子水的1000mL烧杯中,放置于磁力搅拌器上搅拌溶解,再加入3.7gNaHCO3搅拌溶解。充分溶解后调整pH值至7.0后定容至1000mL,无菌0.22μm孔径的滤器对培养基进行过滤除菌,分装于无菌的玻璃瓶中,密封后放于4℃保存。
(2)制备cell PBS磷酸盐缓冲液
将氯化钠8.00g、氯化钾0.20g、磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠1.44g依次倒入装有800mL高温高压灭菌后的去离子水的1000mL烧杯中,放置于磁力搅拌器上搅拌溶解,定容至1000mL,用无菌0.22μm孔径的滤器进行过滤,分装储存后,置于4℃保存。
(3)制备0.25%胰蛋白酶溶液
准确称取胰蛋白酶粉末0.25g,加入4℃预冷400mLPBS溶液中并置于磁力搅拌器上搅拌溶解,充分溶解后定容至500mL。无菌0.22μm滤膜过滤,分装,封口后4℃储存。
2、细胞培养、传代和冻存(以HepG2肝癌细胞为例):
(1)细胞培养
将HepG2细胞放置于37℃,5%CO2,饱和湿度的细胞培养箱中进行培养;每天于倒置相差显微镜下观察细胞形态及数量,每1~3天换液,当培养基颜色转为橙黄色时进行换液处理;将新鲜的完全培养基与磷酸盐缓冲液cell PBS于超净工作台中紫外照射30min。吸去旧培养基,用PBS清洗一遍,弃去cell PBS。小心沿培养皿壁加入完全培养基8mL。将细胞放回CO2培养箱,继续培养。
(2)细胞传代
实验前将细胞用完全培养基、胰酶、cell PBS于超净工作台中紫外照射30min。吸去旧培养基,用cell PBS清洗一遍,弃去cell PBS加入3mL 0.25%胰酶消化,显微镜下观察,消化至细胞边缘收缩变圆,弃去胰酶,加3mL完全培养基终止消化。将细胞吹悬至单个细胞,根据细胞生长速度,按1:3-1:4比例传入新的培养皿内,补加培养基到10mL。将细胞放回37℃,5%CO2培养箱继续培养。相隔24h更换新鲜的培养基,以使其正常生长。
(3)细胞冻存
将胎牛血清与二甲基亚砜(DMSO)按体积比9:1(即900μL胎牛血清:100μL二甲基亚砜(DMSO))的比例混匀配制成备用冻存液。取对数生长期的细胞,用cell PBS洗两次,再加入3ml 0.25%胰蛋白酶,待细胞胞体回缩变圆时终止消化,用细胞培养液将细胞吹悬,转移至玻璃离心管中,1000r/min离心10min,去上清。将之前配好的细胞冻存液加入到玻璃离心管中,轻轻吹悬细胞。将细胞悬液分装在2mL内旋冻存管中,密封后标记细胞名称和冷冻日期。将冷冻管先置于4℃放30min,然后-20℃停留1-2h,再放到-80℃冷冻冰箱冷冻过夜,最终放入-150℃冷冻冰箱中或液氮罐中保存。
3、MTT法检测细胞增殖
将细胞以3000个/孔接种于96孔板中,在CO2含量5%的37℃培养箱孵育,至细胞单层铺满孔底,更换成含有不同剂量LpS的完全培养基处理24h、48h。每孔加入10μL的MTT溶液(若药物与MTT能够反应,可先弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT溶液培养),继续培养4h。吸弃培养液,每孔加入100μL的DMSO,置于摇床低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在多功能微孔板检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。细胞存活率使用以下公式进行计算:
检测结果如图5所示,结果表明LpS可计量和时间依赖性抑制肿瘤细胞增殖。
4、流式细胞术检测细胞凋亡
将细胞以1×106mL-1接种于6孔板中,待细胞融合度达到70%~80%时,更换成含有不同剂量LpS的完全培养基处理24h。用0.25%胰酶消化,离心收集细胞。加入预冷的PBS清洗,在细胞沉淀中加入1×Bingding Buffer使细胞密度达到1×106mL-1。取100μL细胞悬液至新的EP管中,加入5μLAnnexinV-FITC和5~10μLPI混匀,室温避光孵育15min。然后每管加入400μL 1×Bingding Buffer,混匀后用流式细胞仪进行检测。检测结果如图7和图8显示,结果说明与对照组相比,不同浓度的LpS均可诱导肿瘤细胞凋亡,且呈现时间和计量依赖性。
5、细胞划痕实验
将细胞以1×106mL-1接种于含2mL无抗生素培养基的6孔板中,置于培养箱中培养至融合度达70%~80%,在超净台中用10μL枪头在孔板中划十字或井字,用PBS磷酸盐缓冲液清洗3~4次,加入2mL含有不同剂量LpS的基础培养基,倒置显微镜下观察拍照,此时记为0h,然后将6孔板放到37℃培养箱中培养。在相应时间进行划痕拍照,观察划痕愈合情况。检测结果如如6所示,结果说明给予LpS处理可抑制肿瘤细胞的迁移,且随着浓度的升高,抑制作用更加明显。
6、实时定量荧光PCR(real time PCR,RT-qPCR)
将细胞以1×106mL-1接种于6孔板中,待细胞融合度达到70%~80%时,更换成含有不同剂量LpS的完全培养基处理24h。每孔加入1mL Trizol,于4℃裂解15min提取总RNA。取2μg总RNA用M-MLV逆转录得到cDNA进行实时定量荧光PCR。PCR所用到的引物序列为:18S,上游5'-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3',下游
5'-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3';SMYD3,上游5'-AAGTTCGCAACCGCCAAGAG-3',下游5'-AAGGCAGCGGTCGCAGACGA-3';HMGCR,上游
5'-TGATTGACCTTTCCAGAGCAAG-3',下游5'-CTAAAATTGCCATTCCACGAGC-3';
SREBP-2,上游5'-CCTGGGAGACATCGACGAGAT-3';下游
5'-TGAATGACCGTTGCACTGAAG-3'。PCR反应条件为:预变性,95℃2min;PCR反应,95℃10s,60℃30s,共40个循环;融解曲线,95℃1min,55℃1min,95℃15s,并以ΔΔCt法对结果进行计算。检测结果如图2所示,结果表明LpS可明显下调脂代谢紊乱肿瘤细胞中SREBP-2、HMGCR、SMYD3基因的表达,进而对脂代谢紊乱产生抑制作用。
7、蛋白免疫印迹(Western Blot)
将细胞以1×106mL-1接种于6孔板中,待细胞融合度达到70%~80%时,更换成含有不同剂量LpS的完全培养基处理48h后,用预冷的PBS冲洗2~3次,加入120μL蛋白裂解液于4℃裂解30min,用细胞刮刀刮下孔板底的细胞,收集到EP管中,于沸水中煮沸10min。取20μL蛋白裂解液,加入4μL上样缓冲液涡旋混匀,于沸水中煮沸10min,离心进行SDS-PAGE电泳,然后转移到硝酸纤维素膜上。转移好的膜在含5%的脱脂牛奶中室温封闭1h,然后用相应的一抗HMGCR(兔抗人单克隆抗体;稀释比,1:1000)、SMYD3(兔抗人单克隆抗体;稀释比,1:1000),Bcl-2(兔抗人单克隆抗体;稀释比,1:500)、Bax(鼠抗人单克隆抗体;稀释比,1:500)、β-actin(鼠抗人单克隆抗体;稀释比,1:5000)于4℃过夜孵育。之后收集一抗,PBS清洗2~3次,加入荧光二抗于室温孵育2h,用PBS清洗2~3次,使用Odyssey红外激光成像系统进行分析。检测结果如图3和图4所示,结果表明LpS可通过下调SREBP-2、HMGCR、SMYD3等基因的表达,从而抑制胆固醇生物合成及脂代谢紊乱,进而对肿瘤产生一定的抑制作用。
8、油红染色
将细胞以1×105mL-1接种于带有细胞爬片的12孔板中,待细胞融合度达到50%~60%时,更换成含有不同剂量LpS的完全培养基处理48h。用预冷的PBS清洗2~3次,然后用质量分数为4%的多聚甲醛固定30min,弃去固定液。加入油红O染液颜色10min,弃去染色液,加入体积分数为60%异丙醇漂洗,再用淡苏木染色液复染15s,PBS漂洗2~3次。小心取出爬片并用固封剂将其固定于载玻片上,显微镜下拍照观察。检测结果如图1所示,结果表明LpS可明显降低脂代谢紊乱肿瘤细胞中脂肪的生成。
与传统肿瘤治疗方法相比,本发明所使用植物乳杆菌CGMCC No.8198为食品级益生菌,可缓解传统治疗肿瘤方法中存在的严重副作用的问题;此外,本发明首次证明植物乳杆菌CGMCC No.8198在调控肿瘤细胞脂代谢紊乱的同时存在抑制肿瘤细胞增殖、迁移,促进肿瘤细胞凋亡的肿瘤防治作用,这些作用与其下调HMGCR、SREBP-2、SMYD3,从而下调胆固醇生物合成及脂代谢紊乱有关。本发明为肿瘤的防治提供一些新思路。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例,但是本领域的技术人员可以理解:在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内,各种替换、变化和修改都是可能的,因此,本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种乳酸菌通过干扰脂代谢紊乱制备防治肿瘤功能产品方面中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 18S上游引物(Unknown)
<400> 1
cagccacccg agattgagca 20
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<400> 8
tgaatgaccg ttgcactgaa g 21
Claims (1)
1.一种乳酸菌破碎上清液在制备治疗肝癌药物方面中的应用,其特征在于,所述乳酸菌为植物乳杆菌CGMCC No. 8198。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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