CN112961338A - 一种pH敏感的普朗尼克交联剂、制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种pH敏感的普朗尼克交联剂，涉及普朗尼克聚合物载体领域，其结构如式V所示：
Figure DDA0002936274740000011
本发明还提供上述交联剂的制备方法及其应用。本发明的有益效果在于：本发明中的交联剂以普朗尼克L61为母核，在普朗尼克L61的两侧的链端部接有原酸酯和活性酯基团，能够通过诱导细胞产生ROS协同抗肿瘤，同时通过抑制ATP的形成逆转肿瘤细胞多药耐药性；引入原酸酯能够控制药物释放。

Description

一种pH敏感的普朗尼克交联剂、制备方法与应用
技术领域
本发明涉及普朗尼克聚合物载体领域，具体涉及一种pH敏感的普朗尼克交联剂、制备方法与应用。
背景技术
在过去的几十年里，各种纳米药物递送系统作为一种创新和潜在的癌症成像和治疗策略出现，这归因于它们负载各种化合物的能力以及可调和可控的物理化学性质。基于肿瘤的高渗透和长滞留效应(EPR效应)，纳米药物传递体系可以有效地在肿瘤组织中积累，提高药物浓度。并且由于肿瘤微环境和细胞中具有明显的pH梯度，已被广泛应用于抗癌药物的递送。因此，可以利用肿瘤组织相对低pH的特性来设计智能高分子前药控释系统。现有技术如公开号为CN106075460A的专利申请公开一种新型原酸酯交联剂单体及其制备酸敏感纳米药物载体的方法，公开含有原酸酯键的交联剂，并与天然大分子在水溶液中通过自由基聚合得到了几种pH敏感的纳米颗粒。这些纳米颗粒在血液循环中具有良好的稳定性，并在肿瘤的轻度酸性环境中逐渐降解并释放所载药物，表现出优异的抗肿瘤作用。
然而，肿瘤细胞的多药耐药性一直是临床上阻碍成功化疗的主要障碍之一。癌细胞在长期抗癌药物诱导下，在肿瘤细胞上过表达p-糖蛋白(P-gp)和多药耐药蛋白(MRPs)可以显著减少肿瘤细胞内的药物积累。被肿瘤细胞摄取后高分子前药无法短时间内快速释放药物。因此，迫切需要设计和开发新型具有耐多药反转能力的pH敏感纳米颗粒，为肿瘤细胞提供足够的抗癌药物。
普朗尼克(Pluronic)是一种两亲性三嵌段共聚物，由亲水聚环氧乙烷嵌段和疏水聚环氧丙烷嵌段组成。普朗尼克通过抑制线粒体呼吸和ATP合成，抑制P-gp和MRPs的能力，显著提高肿瘤细胞的药物浓度。此外，这些共聚物可以破坏线粒体膜，增加活性氧(ROS)的产生从而诱导细胞死亡。因此，基于普朗尼克设计具有多耐药可逆功能的pH敏感纳米胶束是一个非常有吸引力的策略。
如公开号为CN109679087A的专利公开一种硼酸酯功能化的普朗尼克聚合物、制备方法及在制备药物传递系统中的应用，该聚合物由普朗尼克P123为母核经过酰化反应后，得到羧基修饰的普朗尼克，羧基修饰的普朗尼克能够抑制药物外排泵的作用从而逆转耐药。但现有技术中是利用合成的化合物相聚和形成纳米胶束，聚合形成的纳米胶束是两端双键聚合物反应形成的，结构单一，可改造性相对较低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于现有技术中的普朗尼克聚合物形成的纳米胶束是两端双键聚合物反应形成的，结构单一，可改造性相对较低，提供了一种pH敏感的普朗尼克L61交联剂及其制备方法和应用。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
一种pH敏感的普朗尼克交联剂，其结构如式V所示：
Figure BDA0002936274720000031
有益效果：本发明中的交联剂以普朗尼克L61为母核，在普朗尼克L61的两侧的链端部接有原酸酯和活性酯基团，交联剂上的活性酯可与多种活性基团连接，可改造性强，该交联剂除了能与壳聚糖交联形成纳米胶束外，还能与其他功能性大分子物质交联来赋予纳米胶束更丰富的功能，交联剂引入原酸酯能够控制药物释放。
本发明中的交联剂可以与大分子物质交联构成纳米胶束，通过诱导细胞产生ROS协同抗肿瘤，来逆转肿瘤的多药耐药性，提高肿瘤组织对药物的利用率。
本发明还提供上述pH敏感的普朗尼克交联剂的制备方法，所述pH敏感的普朗尼克交联剂的合成路线如下所示：
Figure BDA0002936274720000041
有益效果：本发明以普朗尼克L61为底物，按照药物骈合原理设计，以普朗尼克L61为母核，在普朗尼克L61的两侧的链端部依次骈合上原酸酯和活性酯基团。
DSC与原酸酯上的氨基反应生成一个活性酯结构获得生成式V的交联剂，该交联剂能够与多种大分子物质交联。
本发明采用上述药物骈合理论所制备得到的聚合物不仅表现出显著的逆转肿瘤细胞多药耐药性且药物释放理想，粒子稳定性较好。
优选地，所述pH敏感的普朗尼克交联剂的制备方法包括以下步骤：
S1、式Ⅲ所示化合物的制备：
将式Ⅰ所示普朗尼克L61、式Ⅱ所示2,2,2-三氟-N-(2-甲氧基-[1,3]-二氧戊烷-4-甲基)乙酰胺、对甲苯磺酸吡啶盐加入至反应器中，减压条件下，升温反应后，经后处理操作，得到式Ⅲ所示化合物；
S2、式Ⅳ所示化合物的制备：
将步骤S1制备得到的式Ⅲ所示化合物用溶剂溶解后，加入NaOH，室温条件下搅拌后，减压除去溶剂，经纯化后干燥，得到式Ⅳ所示化合物；
S3、式V所示pH敏感的普朗尼克交联剂的制备：
将Ⅳ所示化合物和DSC、三乙胺用二氯甲烷溶解，然后在氮气条件下，零摄氏度缓慢滴加三乙胺，滴完常温反应过夜，反应结束后，经纯化干燥得到如式V所示pH敏感的普朗尼克纳米凝胶交联剂。
优选地，所述步骤S1中式Ⅰ所示普朗尼克L61、式Ⅱ所示2,2,2-三氟-N-(2-甲氧基-[1,3]-二氧戊烷-4-甲基)乙酰胺、添加量的摩尔比为1:2～6，对甲苯磺酸吡啶盐的添加量为适量。
有益效果：普朗尼克两端两个羟基，通过负压酯交换连接2,2,2-三氟-N-(2-甲氧基-[1,3]-二氧戊烷-4-甲基)乙酰胺(OE)，因此OE应当过量且至少为两倍以上，OE分子质量小好除去，过量可以使反应充分进行。对甲苯磺酸吡啶盐为催化剂，只起到催化作用，适量即可。
优选地，所述步骤S1中的升温反应温度为110～130℃，反应时间为6h。
优选地，升温反应目的在于将可逆的酯交换反应中产生的水蒸出和提高反应速率。
优选地，所述步骤S1中的后处理操作包括以下步骤：反应结束后，反应液静置至室温，用二氯甲烷溶解反应物，以0.5％NaHCO3溶液和饱和食盐水萃取反应液，收集下层有机相，有机相旋蒸浓缩后，得到得到式Ⅲ所示化合物。
优选地，所述步骤S2中的溶剂为THF。
优选地，所述步骤S2中的纯化干燥包括以下步骤：减压除去溶剂后，采用透析袋透析，经旋蒸冷冻干燥。
优选地，所述透析液为乙醇溶液，所述透析时间为24h。
优选地，所述步骤S3中式Ⅳ所示化合物、DSC添加量的摩尔比为1：2～4，三乙胺的添加量为过量。
有益效果：式Ⅳ化合物两端两个氨基裸露在外，连接两个DSC，且DSC为小分子易除去，因此DSC应该过量且为式Ⅳ化合物的两倍以上。三乙胺为催化剂，且需要维持碱性环境防止原酸酯降解，因此过量。
优选地，所述步骤S3中式Ⅳ所示化合物、DSC添加量的摩尔比为1：2～4：3。
优选地，所述步骤S3中的纯化干燥包括以下步骤：反应结束后，将反应液用透析袋进行透析，经旋蒸冷冻干燥。
优选地，所述透析液为乙醇溶液，所述透析时间为72h。
优选地，所述透析袋为截留分子量3500Da的透析袋。
优选地，所述乙醇溶液为质量分数为80％的乙醇水溶液。
本发明还提供上述pH敏感的普朗尼克交联剂在制备载药纳米胶束中的应用，包括以下步骤：
(1)pH敏感的普朗尼克壳聚糖纳米胶束溶液的制备：将壳聚糖溶于水中制得壳聚糖溶液，将pH敏感的普朗尼克交联剂溶于丙酮中，然后将pH敏感的普朗尼克丙酮溶液加入壳聚糖溶液中，搅拌获得pH敏感的壳聚糖纳米胶束；
(2)采用NaOH溶液调节pH敏感的普朗尼克壳聚糖纳米胶束溶液的pH值至8.0，然后加入抗肿瘤药物，搅拌后，离心，即获得pH敏感的普朗尼克壳聚糖载药纳米胶束。
有益效果：pH敏感的普朗尼克交联剂与壳聚糖交联形成的纳米胶束能够在循环稳定系统中稳定传递药物，相较于裸药等能够增强在肿瘤部位聚集。本发明中的纳米胶束具有很强的细胞毒性，更容易被摄取而发挥功能。在轻度酸性肿瘤环境下，pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束能够更快地释放药物，从而增加药物在肿瘤组织的靶向富集。
可以通过调节交联剂与大分子物质(壳聚糖)的比例改变纳米胶束的粒径、载药效率和药物释放率。本发明纳米胶束与生物大分子相连接，具有更好的生物相容性。聚合形成纳米胶束的生物相容性相对较差。
优选地，所述抗肿瘤药物包括阿霉素。
优选地，所述抗肿瘤药物还包括药物制剂上能够接受的辅料。
本发明的优点在于：本发明中的交联剂以普朗尼克L61为母核，在普朗尼克L61的两侧的链端部接有原酸酯和活性酯基团，交联剂上的活性酯可与多种活性基团连接，可改造性强，该交联剂除了能与壳聚糖交联形成纳米胶束外，还能与其他功能性大分子物质交联来赋予纳米胶束更丰富的功能，交联剂引入原酸酯能够控制药物释放。
本发明以普朗尼克L61为底物，按照药物骈合原理设计，以普朗尼克L61为母核，在普朗尼克L61的两侧的链端部依次骈合上原酸酯和活性酯基团。
DSC与原酸酯上的氨基反应生成一个活性酯结构获得生成式V的交联剂，该交联剂能够与多种大分子物质交联。
本发明采用上述药物骈合理论所制备得到的聚合物不仅表现出显著的逆转肿瘤细胞多药耐药性且药物释放理想，粒子稳定性较好。
pH敏感的普朗尼克交联剂与壳聚糖交联形成的纳米胶束能够在循环稳定系统中稳定传递药物，相较于裸药等能够增强在肿瘤部位聚集。本发明中的纳米胶束具有很强的细胞毒性，更容易被摄取而发挥功能。在轻度酸性肿瘤环境下，pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束能够更快地释放药物，从而增加药物在肿瘤组织的靶向富集。
可以通过调节交联剂与大分子物质(壳聚糖)的比例改变纳米胶束的粒径、载药效率和药物释放率。本发明纳米胶束与生物大分子相连接，具有更好的生物相容性。聚合形成纳米胶束的生物相容性相对较差。
附图说明
图1是本发明实施例2中式Ⅳ所示化合物的1H NMR图；
图2是本发明实施例2中pH敏感的普朗尼克L61交联剂的1H NMR图；
图3是本发明实施例3中pH敏感的普朗尼克L61交联剂交联壳聚糖后得到的空白纳米胶束的粒径分布图；
图4是本发明实施例3中pH敏感的普朗尼克L61交联剂交联壳聚糖后载阿霉素得到的纳米胶束的粒径分布图；
图5是本发明实施例3中pH敏感的普朗尼克L61交联剂交联壳聚糖后得到的空白纳米胶束扫描电镜下的形貌特征图；
图6是本发明实施例3中pH敏感的普朗尼克L61交联剂交联壳聚糖后载阿霉素得到的纳米胶束扫描电镜下的形貌特征图；
图7是本发明实施例4中pH敏感的普朗尼克L61交联剂交联壳聚糖后得到的空白纳米胶束在不同pH值的磷酸缓冲液中孵育后的粒径变化统计图；
图8是本发明实施例4中pH敏感的普朗尼克L61交联剂交联壳聚糖后得到的空白纳米胶束在不同pH值的磷酸缓冲液中孵育后的纳米胶束浓度变化统计图；
图9是本发明实施例4中pH敏感的普朗尼克L61交联剂交联壳聚糖后得到的空白纳米胶束在不同pH值的磷酸缓冲液中孵育后的纳米胶束形貌变化图；
图10是本发明实施例5中的普朗尼克L61交联剂交联壳聚糖后载阿霉素得到的载药纳米胶束中阿霉素的体外释放结果量；
图11是本发明实施例5中pH敏感的普朗尼克L61交联剂交联壳聚糖后载阿霉素得到的载药纳米胶束中阿霉素的体外释放结果量；
图12是本发明实施例6中人源肝癌细胞的一小时定性摄取结果图；
图13是本发明实施例6中人源肝癌细胞的四小时定性摄取结果图；
图14是本发明实施例7中人源肝癌细胞的ROS荧光强度图；
图15是本发明实施例8中游离的阿霉素及pH敏感的载药纳米胶束和非pH敏感的载药纳米胶束对鼠源肝癌细胞毒性图；
图16是本发明实施例8中pH敏感的空白纳米胶束和非pH敏感的空白纳米胶束对鼠源肝癌细胞毒性图；
图17是本发明实施例8中游离的阿霉素及pH敏感的载药纳米胶束和非pH敏感的载药纳米胶束对人源肝癌细胞毒性图；
图18是本发明实施例8中游离的阿霉素及pH敏感的载药纳米胶束和非pH敏感的载药纳米胶束对人源肝癌细胞毒性图；
图19是本发明实施例9中肿瘤体积变化对比图；
图20是本发明实施例9中各种药物注射14天后解剖肿瘤直观对比图；
图21是本发明实施例9中小鼠体重变化对比图；
图22是本发明实例10中静脉注射游离的阿霉素后随着时间的变化阿霉素在小鼠体内的分布统计图；
图23是本发明实例10中静脉注射非pH敏感的载药纳米胶束后随着时间的变化阿霉素在小鼠体内的分布统计图；
图24是本发明实例10中静脉注射pH敏感的载药纳米胶束后随着时间的变化阿霉素在小鼠体内的分布统计图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
一种pH敏感的普朗尼克L61交联剂，交联剂的结构如式V所示：
Figure BDA0002936274720000111
实施例2
pH敏感的普朗尼克L61交联剂的制备，其合成路线如下：
Figure BDA0002936274720000121
pH敏感的普朗尼克L61交联剂的制备步骤包括：
S1、式Ⅲ所示化合物的制备：
向100mL的圆底反应瓶中依次加入式Ⅰ所示普朗尼克L61(2.1g,1mmol)，式Ⅱ所示2,2,2-三氟-N-(2-甲氧基-[1,3]-二氧戊烷-4-甲基)乙酰胺(1.0g，4.36mmol)，对甲苯磺酸吡啶盐(Py-PTSA)(8.54mg，0.037mmol)，用油泵抽真空，120℃油浴条件下反应6h，根据实验气泡产生情况在颜色保持金色没变棕色的前提下，可继续反应2小时使反应更充分。反应结束后，静置，直至恢复室温。用二氯甲烷溶解反应物，以0.5％NaHCO3溶液和饱和食盐水萃取反应液，收集下层有机相，有机相旋蒸浓缩后，得到式Ⅲ所示化合物；
S2、式Ⅳ所示化合物的制备：
往步骤S1制备得到的式Ⅲ所示化合物中，以50mL THF溶解，加入NaOH(0.1M)，高速搅拌6h，旋蒸除去THF。之后用截留分子量3500Da的透析袋透析24h，透析液为质量分数80％乙醇水溶液，旋蒸冷冻干燥，得到式Ⅳ所示化合物。
S3、式V所示pH敏感的普朗尼克L61交联剂的制备：
向100mL的圆底反应瓶中依次加入式Ⅳ所示化合物(1.1g,0.5mmol)，DSC(N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，2.7g,1.25mmol)，三乙胺(1.8g,1.5mmol)，通氮气0℃滴加三乙胺，滴加完毕后常温反应过夜，用截留分子量3500Da的透析袋透析，透析液为质量分数80％的乙醇水溶液，透析72h之后旋蒸冷冻干燥，得到pH敏感的普朗尼克L61交联剂。
式Ⅳ所示化合物的结构表征如图1所示，pH敏感的普朗尼克L61交联剂(式V)的结构表征如图2所示。
实施例3
纳米胶束的制备及其粒径与形貌
(1)pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖空白纳米胶束的制备：
将20mg壳聚糖溶于2ml水中得到壳聚糖水溶液，再将40mg实施例2中制得的L61-OE-CS溶于4ml丙酮中。将上述溶液缓慢加入壳聚糖水溶液中，室温搅拌2h，得到pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖空白纳米胶束溶液，然后在10000rpm下离心10min收集纳米颗粒。
通过DLS和扫描电镜检测纳米胶束的粒径分布及形貌，粒径分布图如图3所示，形貌特征图如图4。
由图3、图4可知：pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖空白纳米胶束粒径约在185nm，呈球形形貌。
(2)pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束的制备：
用10ml用0.5M的NaOH溶液调节pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖纳米胶束溶液的pH值至8.0，取1ml阿霉素的溶液(4mg/mL)加入。搅拌2h后，以1×104rpm离心20分钟，去除未装载的阿霉素。然后将沉淀分散在3.0mL pH 7.4PBS溶液中，即获得pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束。
通过DLS和扫描电镜检测纳米胶束的粒径分布及形貌，粒径分布图如图5所示，形貌特征图如图6。
由图5、图6可知：pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束粒径约在220nm，呈球形形貌。
采用酶标仪在481nm波长处测定上述pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束的载药量及包封率。
其中，载药量(％)＝胶束中阿霉素的量/载药胶束的总量×100％；包封率(％)＝胶束中阿霉素的量/加入的总共阿霉素的量×100％；结果如表1所示：
Figure BDA0002936274720000141
实施例4
pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖空白纳米胶束的粒径与形貌降解
将实施例3中制得的纳米颗粒分别分散在pH 7.4、6.0和5.0的PB缓冲液中，在设定的时间点使用DLS测其粒径变化。对纳米胶束降解起始、降解过程中及彻底降解后的产物使用扫描电镜进行形貌观察，降解粒径动态变化如图7、图8所示，pH 7.4、6.0和5.0缓冲液中降解形貌变化如图9所示。
由图7、图8可知：在pH 7.4时，纳米胶束的尺寸及浓度基本无变化，在pH 6.0时，由于粒子原酸酯的断裂，纳米胶束逐渐溶胀，体积增大。在pH 5.0时，粒子在短时间就会发生崩解。根据图9的形貌变化也符合以上特征。
实施例5
pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束和非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束(对照组)的体外释放检测
首先用合成出非pH敏感的普朗尼克L61交联剂：用乙腈溶解DSC(5.4g,2.5mmol)、适量催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)和普朗尼克L61(0.9g,1mmol)，通氮气室温搅拌8h用截留分子量3500Da的透析袋透析，透析液为质量分数80％的乙醇水溶液，透析72h之后旋蒸冷冻干燥，得到非pH敏感的普朗尼克L61交联剂。
接下来同样用将20mg壳聚糖溶于2ml水中得到壳聚糖水溶液，再将40mg非pH敏感普朗尼克L61交联剂溶于4ml丙酮中。将上述溶液缓慢加入壳聚糖水溶液中，室温搅拌2h，得到非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖空白纳米胶束溶液，然后在10000rpm下离心10min收集纳米颗粒，即非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖空白纳米胶束(对照组)。
非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束的制备方法包括以下步骤：
用10ml用0.5M的NaOH溶液调节非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖纳米胶束溶液的pH值至8.0，取1ml阿霉素的溶液(4mg/mL)加入。搅拌2h后，以1×104rpm离心20分钟，去除未装载的阿霉素。然后将沉淀分散在3.0mL pH 7.4PBS溶液中，即获得非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束(对照组载药纳米胶束)。
分别取阿霉素浓度为450μg/ml的非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束(对照组载药纳米胶束)，以及采用实施例3方法制得阿霉素浓度为450μg/ml的pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束1mL于截留分子量为8kD-14kD的透析袋中，用棉线扎紧透析袋，放入到50mL的EP管中，再在EP管中加入5mL 0.05M的缓冲液，缓冲液pH为5.0、6.0和7.4，设3个重复。放入摇床，在37℃，100rpm条件下振荡，分别在0.5、1、2、4........12、24、36、48h、72h取出旧缓冲液，并加入5mL新的缓冲液，然后检测缓冲液中的阿霉素浓度，然后计算阿霉素的释放量，释放结果如图10和图11所示。
可以看出，对于非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束，72h后药物释放量分别为34.7％(pH 5.0)、23.5％(pH 6.0)和16.1％(pH 7.4)。pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束在pH 7.4条件下，在72h时释放量达到16％，在pH 6.0和5.0时分别达到59％和76.5％。这些结果表明，在酸性环境下原酸酯键被水解，导致纳米胶束解体加速了DOX的释放。pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束可在中性环境中稳定装载药物，避免药物在血液循环中过早释放。而在轻度酸性肿瘤环境下，pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束能够更快地释放药物，从而增加药物在肿瘤组织的靶向富集。
实施例6
载药纳米胶束细胞定性摄取：
将人源肝癌细胞(HepG2)加入到细胞培养皿中，培养24h，允许细胞贴壁。然后，吸去旧培养基，加入1.8mL新鲜培养基，以及0.2mL游离阿霉素、采用实施例3中方法合成的pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束和采用实施例5中方法合成的非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束(阿霉素终浓度为4μg/mL)。分别共培养4小时和1小时后，吸去培养基，用PBS清洗两次，4％多聚甲醛液固定细胞(5min)，PBS清洗两次，DAPI染核试剂染细胞核(5min)，PBS再次清洗两次，然后用激光共聚焦显微镜观察，结果如图12和图13。其中，图12为1h定性摄取结果图，图13为4h细胞定性摄取结果图。
由图12、图13可知：游离阿霉素、非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束及pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束均能很好地被乳腺癌细胞摄取；
然而，在耐药细胞中，由于药物外排泵的作用，游离阿霉素的胞内富集被抑制，非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束及pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束能改变这种抑制状态，提高胞内药物的富集。
实施例7
纳米胶束及抗癌药物刺激细胞内ROS产生：
将人源肝癌细胞(HepG2)加入到六孔板中，培养24h，允许细胞贴壁。然后，吸去旧培养基，加入1.8mL新鲜培养基，0.2mL的游离的阿霉素、实施例5中非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖空白纳米胶束、实施例3中pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖空白纳米胶束、实施例5中非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束、实施例3中pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束，共培养4h之后，吸去旧培养基，加入2mL新培养基以及0.1mL稀释的ROS探针DCFH-DA，孵育30min。然后，PBS清洗细胞两次，4％多聚甲醛液固定细胞5min，再次清洗细胞两次，荧光显微镜观察绿色ROS的产生。检测结果如如图14所示。
由图14可知：几种样品均能刺激细胞产生ROS，其中以pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束作用效果最强，明显优于pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖空白纳米胶束、非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束、非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖空白纳米胶束、游离的阿霉素组。
实施例8
细胞毒性检测：
将人源肝癌细胞(HepG2)和鼠源肝癌细胞(H22)加入到96孔板中，每孔细胞约在5,000个，培养24h后，去除培养基，分别加入180μL的新鲜培养基，20μL的游离的阿霉素、实施例5中非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖空白纳米胶束、实施例3中pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖空白纳米胶束、实施例5中非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束、实施例3中pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束。共培养24小时后，去除培养基，加入180μL的新鲜培养基和20μL MTT(5mg/mL)共培养4h后。最后，去除培养基，加入150μL的DMSO，震荡10min后，在570nm波长下检测活细胞产生的结晶紫吸光度，计算细胞存活率，结果如图15、图16(H22)、图17、图18(HepG2)所示。
由图15、图16、图17和图18可以发现，不同的药物均表现出剂量的依赖性，随着药物浓度的提高，细胞的存活率逐渐降低。其中pH敏感的载药纳米胶束表现出更强的细胞毒性，说明它更容易被摄取而发挥功能。
实施例9
抗小鼠皮下肿瘤：
用H22荷瘤小鼠评估聚合物前药的体内抗肿瘤效果，当肿瘤组织生长到约100mm3时，将小鼠随机分为5组(7只/组)。静脉给予相同药物浓度(6mg/kg)的游离的阿霉素、实施例5中的非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖空白纳米胶束、实施例3中pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖空白纳米胶束、实施例5中非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束、实施例3中pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束。对照组为生理盐水。每天测量体重和肿瘤大小(长径“a”和短径“b”)并记录。两周后，牺牲小鼠，取肿瘤称重并拍照。肿瘤体积计算公式:肿瘤体积＝a×b×b/2
结果如图19、图20和图21所示。图19是肿瘤体积变化对比图；图20是各种药物注射14天后解剖肿瘤直观对比图；图21是小鼠体重变化对比图。
由图19、图20、图21可以发现，由于粒子的自身优势以及体内EPR效应，pH敏感的载药纳米胶束表现出较好的抗肿瘤效果。
实施例10
药物在小鼠体内的药物分布：
用H22荷瘤小鼠评估聚合物前药的药代动力学研究，当肿瘤组织生长到约100mm3时，将小鼠随机分为3组(3只/组)。静脉给予相同药物浓度(6mg/kg)的游离的阿霉素、实施例5中非pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束、实施例3中pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束。在不同的时间的牺牲小鼠，取血和肿瘤检测其中阿霉素的含量。结果如图22、图23和图24所示。
由图22、图23和图24所示，pH敏感的普朗尼克L61壳聚糖载药纳米胶束能延长阿霉素在体内的循环时间，并且相较于裸药等能够增强在肿瘤部位聚集。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种pH敏感的普朗尼克交联剂，其特征在于：其结构如式V所示：
Figure FDA0002936274710000011
2.一种制备如权利要求1所述的pH敏感的普朗尼克交联剂的方法，其特征在于：所述pH敏感的普朗尼克交联剂的合成路线如下所示：
Figure FDA0002936274710000012
3.根据权利要求2所述的pH敏感的普朗尼克交联剂的制备方法，其特征在于：所述pH敏感的普朗尼克交联剂的制备方法包括以下步骤：
S1、式Ⅲ所示化合物的制备：
将式Ⅰ所示普朗尼克L61、式Ⅱ所示2,2,2-三氟-N-(2-甲氧基-[1,3]-二氧戊烷-4-甲基)乙酰胺、对甲苯磺酸吡啶盐加入至反应器中，减压条件下，升温反应后，经后处理操作，得到式Ⅲ所示化合物；
S2、式Ⅳ所示化合物的制备：
将步骤S1制备得到的式Ⅲ所示化合物用溶剂溶解后，加入NaOH，室温条件下搅拌后，减压除去溶剂，经纯化后干燥，得到式Ⅳ所示化合物；
S3、式V所示pH敏感的普朗尼克交联剂的制备：
将Ⅳ所示化合物和DSC、三乙胺用二氯甲烷溶解，然后在氮气条件下，零摄氏度缓慢滴加三乙胺，滴完常温反应过夜，反应结束后，经纯化干燥得到如式V所示pH敏感的普朗尼克纳米凝胶交联剂。
4.根据权利要求3所述的pH敏感的普朗尼克交联剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中式Ⅰ所示普朗尼克L61、式Ⅱ所示2,2,2-三氟-N-(2-甲氧基-[1,3]-二氧戊烷-4-甲基)乙酰胺添加量的摩尔比为1:2～6。
5.根据权利要求3所述的pH敏感的普朗尼克交联剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的升温反应温度为110-130℃，反应时间为6h。
6.根据权利要求3所述的pH敏感的普朗尼克交联剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的后处理操作包括以下步骤：反应结束后，反应液静置至室温，用二氯甲烷溶解反应物，以0.5％NaHCO3溶液和饱和食盐水萃取反应液，收集下层有机相，有机相旋蒸浓缩后，得到得到式Ⅲ所示化合物。
7.根据权利要求3所述的pH敏感的普朗尼克交联剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中式Ⅳ所示化合物、DSC添加量的摩尔比为1：2～4，三乙胺的添加量为过量。
8.一种采用权利要求1所述的pH敏感的普朗尼克交联剂交联剂在制备pH敏感的普朗尼克壳聚糖载药纳米胶束中的应用，包括以下步骤：
(1)pH敏感的普朗尼克壳聚糖纳米胶束溶液的制备：将壳聚糖溶于水中制得壳聚糖溶液，将pH敏感的普朗尼克交联剂溶于丙酮中，然后将pH敏感的普朗尼克丙酮溶液加入壳聚糖溶液中，搅拌；
(2)采用NaOH溶液调节pH敏感的普朗尼克壳聚糖纳米胶束溶液的pH值至8.0，然后加入阿霉素溶液，搅拌后，离心，即获得pH敏感的普朗尼克壳聚糖载药纳米胶束。
9.根据权利要求8所述的pH敏感的普朗尼克交联剂交联剂在制备pH敏感的普朗尼克壳聚糖载药纳米胶束中的应用，其特征在于：所述抗肿瘤药物包括阿霉素。
10.根据权利要求8所述的pH敏感的普朗尼克交联剂交联剂在制备pH敏感的普朗尼克壳聚糖载药纳米胶束中的应用，其特征在于：所述抗肿瘤药物还包括药物制剂上能够接受的辅料。
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