CN112931079A - 一种外源激素喷施提高夏枯草药材品质的方法 - Google Patents

一种外源激素喷施提高夏枯草药材品质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种外源激素喷施提高夏枯草药材品质的方法，该方法步骤如下：a、在夏枯草植株开花期向夏枯草植株喷施0.8～1.2mmol/L的茉莉酸甲酯溶液；b、喷施后，采收夏枯草果穗，干燥，即得夏枯草药材。本发明通过喷施外源茉莉酸甲酯的方法，能够显著提高夏枯草药材的总黄酮、总酚酸、迷迭香酸及金丝桃苷含量，显著增强其抗氧化能力和渗透调节能力，提高夏枯草药材的品质，有利于夏枯草药材资源的开发利用。利用本发明的方法处理后获得的夏枯草药材总黄酮、总酚酸、迷迭香酸及金丝桃苷含量高，抗氧化能力和渗透调节能力强，应用前景广阔。

Description

一种外源激素喷施提高夏枯草药材品质的方法
技术领域
本发明属于中药材栽培技术领域，具体涉及一种对夏枯草进行外源MeJA喷施以提高其药材品质的方法。
背景技术
夏枯草Prunella vulgaris Linn为唇形科夏枯草属多年生草本植物，以干燥果穗入药，是我国常用中药材，历版《中国药典》收录。夏枯草味辛、苦，寒，归肝、胆经，具有清肝泻火，明目，消肿散结等功效。夏枯草具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、降血压等活性，在临床上广泛应用，常用于治疗乳腺炎、甲状腺肿大，抑制发热，消肿，加速伤口愈合等，应用前景广阔。
夏枯草果穗中主要含有黄酮、有机酸等有效成分，有机酸类主要成分为迷迭香酸。这些成分与夏枯草的药理作用有明显的相关性，其含量直接影响药材的品质。《中国药典》(2020版)中要求的夏枯草药材质量标准为：迷迭香酸(C18H16O8)含量不得少于0.20％。
申请号为201810210478.5的中国专利申请公开了一种提高夏枯草药材品质的方法，步骤如下：a、取夏枯草药材；b、紫外光下照射，辐射强度120μW cm-2照射120min，即可。该方法能够提高夏枯草药材的黄酮含量及有机酸含量，增强其抗氧化能力，进而提高夏枯草药材的品质。但是，该方法处理时需要将UV-B荧光灯管悬于干燥样品上方，设备要求较高，操作较为复杂。而且，该方法处理后得到的夏枯草果穗中的迷迭香酸含量仅为0.24％w/w，还有待进一步提高。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种对夏枯草植株进行外源茉莉酸甲酯(MeJA)诱导以提高其药材品质的方法。
本发明提供了一种获得高品质夏枯草药材的方法，步骤如下：
a、在夏枯草植株开花期向夏枯草植株喷施0.8～1.2mmol/L的茉莉酸甲酯溶液；
b、喷施后，采收夏枯草果穗，干燥，即得夏枯草药材。
进一步地，步骤a中，茉莉酸甲酯溶液的浓度为1.0mmol/L。
进一步地，步骤a中，所述茉莉酸甲酯溶液为茉莉酸甲酯的水溶液。
进一步地，步骤b中，所述采收夏枯草果穗的时间为喷施6～24小时后。
进一步地，步骤b中，所述采收夏枯草果穗的时间为喷施12～24小时后。
进一步地，步骤a中，所述夏枯草开花期为4月中旬-6月上旬，优选为5月中旬；
和/或，步骤a中，所述喷施的方式为喷洒整株夏枯草植株使其有液珠滴落。
进一步地，所述喷施的量为：每株13mL～20mL。
进一步地，步骤a中，所述夏枯草植株是按照以下方法栽培到开花期的：取夏枯草种子，播种，出苗，移栽，栽培到开花期。
进一步地，所述夏枯草种子是在25-30℃的水中浸泡2小时后播种的，所述播种时间为9月中下旬；
所述移栽时间为播种时间第二年的4月下旬，所述栽培环境为：相对湿度55～65％、光合有效辐射804μmol·m-2s-1、昼夜温度26/15℃。
进一步地，步骤b中，所述干燥的温度为70℃，时间为12小时。
本发明还提供了一种夏枯草药材，其特征在于：它的总黄酮含量为9.50～9.60mg/g，总酚酸含量为2.35～2.45mg/g，迷迭香酸含量为6.30～6.40mg/g，金丝桃苷含量为1.00～1.10mg/g。
进一步地，它的总黄酮含量为9.53±0.04mg/g，总酚酸含量为2.41±0.12mg/g，迷迭香酸含量为6.32±0.06mg/g，金丝桃苷含量为1.02±0.01mg/g。
进一步地，它是按照上述的方法处理后获得的。
本发明通过喷施外源MeJA的方法，能够显著提高夏枯草药材的总黄酮、总酚酸、迷迭香酸及金丝桃苷含量，显著增强其抗氧化能力和渗透调节能力，提高夏枯草药材的品质，有利于夏枯草药材资源的开发利用。
利用本发明的方法处理后得到的夏枯草药材总黄酮、总酚酸、迷迭香酸及金丝桃苷含量高，抗氧化能力和渗透调节能力强，应用前景广阔。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为不同MeJA喷洒浓度对夏枯草药材主要活性成分影响的测试结果。
图2为不同采收时间对夏枯草药材主要活性成分影响的测试结果。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
MeJA(茉莉酸甲酯，纯度≥98％，批号：M111207)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；迷迭香酸(纯度≥98％，批号：M-024-170508)、芦丁(纯度≥98％，批号：L-001-181216)、没食子酸(纯度≥98％，批号：M-017-181216)购自成都瑞芬思生物科技有限公司；SOD(超氧化物歧化酶)、CAT(过氧化氢酶)、POD(过氧化物酶)、APX(抗坏血酸过氧化物酶)活性以及GSH(谷胱甘肽)及可溶性蛋白含量测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)购自西亚化学科技(山东)有限公司。
实施例1本发明提高夏枯草药材品质的方法
方法如下：
1、采种：筛选夏枯草Prunella vulgaris L.的种子，选择饱满、无病虫害、均匀的种子并密封保存于阴凉干燥处。
2、种子处理：种子用25-30℃的温水浸泡2小时，以提高发芽率达到95％。
3、播种：于当年9月中下旬播种于试验田并进行正常的水肥管理，定期除草，播种10～15天后开始出苗；植株生长1个月之后适当间苗。
4、移栽：第二年4月下旬将试验田的夏枯草苗移植至盆栽中(相对湿度55～65％、光合有效辐射804μmol·m-2s-1、昼夜温度26/15℃)；每盆2-3株。
5、MeJA喷洒处理：于5月中旬夏枯草处于开花期时，对夏枯草植株进行外源MeJA水溶液(1mmol/L)喷洒至整株夏枯草植株有液珠滴落；每株喷洒13mL～20mL。
6、样品采收：于喷洒处理24h后，采收夏枯草叶片用液氮运输保存，采收夏枯草果穗在70℃干燥12小时，打粉，过60目筛备用。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：
试验例1本发明MeJA诱导处理方法对夏枯草品质的影响
一、实验方法
1、分组处理
(1)1mmol/L MeJA组：同实施例1步骤1～6的方法。
(2)对照组：按照实施例1步骤1～6的方法，区别仅在于将步骤5中的MeJA水溶液(1mmol/L)替换为含2％无水乙醇的水溶液。
2、主要活性成分含量测试
用752紫外-可见分光光度计法测定各组夏枯草果穗干燥粉末中的总黄酮及总酚酸含量，高效液相色谱法测定各组夏枯草果穗干燥粉末中的迷迭香酸和金丝桃苷的含量。具体测试方法如下：
(1)紫外分光光度法
(1.1)总酚酸测定：对照品溶液制备：精密称取没食子酸对照品5.15mg，用蒸馏水溶解并定容至50mL，即得0.103mg/mL对照品溶液。
标准曲线的制备：精密吸取没食子酸对照品溶液0、0.1、0.3、0.5、0.6、0.8、1.0mL于10mL容量瓶中，加2mL蒸馏水，加福林酚试剂0.5mL及20％碳酸钠溶液1.7mL，最后加蒸馏水定容，混匀，在暗处室温下放置30min，以试剂为空白，在波长760nm波长处测定A。以吸光度为纵坐标(Y)，对照品含量(mg)为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程Y＝9.6842X+0.0432，R2＝0.9993。
供试样品溶液制备：精密称取夏枯草果穗干燥粉末1g，以80％乙醇，料液比1：10，90℃回流提取1.5小时，重复3次。合并提取液，离心去除上层叶绿素，减压浓缩定容至50mL，加石油醚萃取3次，减压浓缩定容至25mL备用。吸取供试液1mL，定容10mL。取上述溶液2mL按照标准曲线绘制中的方法处理后，用紫外可见分光光度计在760nm波长处测其吸光度A，重复3次。依回归方程计算M。
(1.2)总黄酮测定：对照品溶液制备：精密称取干燥后的芦丁标准品20mg，用30％乙醇溶解，并全部转入100mL容量瓶中，用30％乙醇定容，摇匀，得质量浓度为0.2mg/mL的芦丁标准液。
标准曲线的制备：分别取上述芦丁标准溶液0.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL于6支25mL容量瓶中，加50mg/mL亚硝酸钠0.7mL，摇匀，放置7min，加入100mg/mL硝酸铝0.7mL，摇匀，放置6min，加入1mol/L氢氧化钠5.0mL，混匀，用30％乙醇稀释至刻度，10min后于波长510nm处测定吸光度值A，以试剂空白参比。以吸光度为纵坐标(Y)，对照品含量(mg)为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程Y＝0.516X+0.0018，R2＝0.9999。
供试样品溶液制备：精密称取夏枯草果穗干燥粉末1g，以35％乙醇，料液比1：25，86℃回流提取3.5小时，重复3次。合并提取液过夜，离心20min去除上层叶绿素，减压浓缩定容至50mL，加石油醚萃取3次，减压浓缩定容至25mL备用。吸取供试液1mL，定容至10mL。取上述溶液2mL按照标准曲线绘制中的方法处理后，在紫外可见分光光度计上于510nm波长处测其吸光度A，重复3次，依回归方程计算含量M。
(2)高效液相色谱法：
标准曲线绘制：精密称取迷迭香酸对照品4.5mg，金丝桃苷对照品2.0mg，甲醇溶解并定容至10mL，摇匀，得含迷迭香酸0.45mg·mL-1，，金丝桃苷0.20mg·mL-1对照品混合液。色谱柱：Chromplus C18柱(250mm×4.6mm)；流动相：甲醇：0.2％的磷酸二氢钠梯度洗脱：0至20min，20％甲醇至40％甲醇，20至35min，40％甲醇至70％甲醇，35至45min，70％甲醇至90％甲醇，45至60min，90％甲醇至20％甲醇；流速：0.8mL·min-1；检测波长：325nm/360nm；柱温：30℃。精密吸取迷迭香酸和金丝桃苷对照品混合液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μL进样，以含量(mg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，迷迭香酸回归方程：Y＝3702593X-49.42，R2＝1；金丝桃苷回归方程：Y＝3230414X-32.38，R2＝1。
供试样品制备：精密称取夏枯草果穗干燥粉末2g，置于锥形瓶内，加入80％甲醇15mL，50℃，100W超声提取35min，抽滤，重复两次并合并滤液，浓缩并定容至6mL，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，作为供试液。
3、抗氧化能力测试
制备夏枯草醇提物：取1g夏枯草果穗粉末，加入30mL 70％乙醇，70℃，100w，超声提取30min，过滤，重复提取三次，合并滤液，定容至100mL。
用752紫外-可见分光光度计法测定夏枯草醇提物的清除DPPH●自由基能力；
用试剂盒(购自南京建成生物工程研究所有限公司)测定夏枯草果穗粉末中抗氧化酶(SOD、POD、CAT及APX)活性、非酶抗氧化剂(GSH)的含量。
4、渗透调节能力测试
用试剂盒(购自南京建成生物工程研究所有限公司)测定夏枯草渗透调节物质可溶性蛋白的含量。
5、数据处理
试验数据用Microsoft Excel 2007进行初步处理，再用SPSS21.0软件进行单因素方差分析以及GraphPad Prism 8.0进行DPPH●自由基清除能力(用半数清除率(IC50)表示)计算。
二、实验结果
1、主要活性成分含量比较
表1对照组与1mmol/L MeJA组处理24h后对夏枯草果穗中主要活性成分的影响
Figure BDA0002951138030000051
如表1所示，与对照组相比，1mmol/L MeJA组夏枯草果穗中主要活性成分总黄酮、总酚酸、迷迭香酸与金丝桃苷含量均显著增加。
2、抗氧化能力比较
(1)抗氧化酶活性比较
表2对照组与1mmol/L MeJA组处理24h后对夏枯草果穗中抗氧化酶活性的影响
Figure BDA0002951138030000052
如表2所示，与对照组相比，1mmol/L MeJA组夏枯草果穗中SOD、APX与POD抗氧化酶活性显著增强，CAT活性略微降低。
(2)非酶抗氧化剂(GSH)含量比较
表3对照组与1mmol/L MeJA组处理24h后对夏枯草GSH含量和DPPH●IC50的影响
Figure BDA0002951138030000053
Figure BDA0002951138030000061
如表3所示，与对照组相比，1mmol/L MeJA组夏枯草可溶性蛋白含量显著增加，1mmol/L MeJA组DPPH●的半数清除率(IC50)显著降低，表明1mmol/L MeJA组夏枯草的体外抗氧化能力明显增强。
3、渗透调节能力比较
表4对照组与1mmol/L MeJA组处理24h后对夏枯草可溶性蛋白含量的影响
Figure BDA0002951138030000062
如表4所示，与对照组相比，1mmol/L MeJA组夏枯草可溶性蛋白含量显著增加，表明1mmol/L MeJA组夏枯草的渗透调节能力明显增强。
上述实验结果表明，与对照组相比，利用本发明的方法喷洒1mmol/L MeJA后，夏枯草药材中的主要活性成分(总黄酮、总酚酸、金丝桃苷、迷迭香酸)的含量均明显增加，抗氧化能力和渗透调节能力均明显增强，试验例2、不同MeJA喷洒浓度对夏枯草主要活性成分影响
一、实验方法
1、分组处理
(1)1mmol/L MeJA组：同实施例1步骤1～6的方法。
(2)对照组：按照实施例1步骤1～6的方法，区别仅在于将步骤5中的MeJA水溶液(1mmol/L)替换为含2％无水乙醇的水溶液。
(3)0.5mmol/L MeJA组：按照实施例1步骤1～6的方法，区别仅在于将步骤5中的MeJA水溶液(1mmol/L)替换为MeJA水溶液(0.5mmol/L)。
(4)2mmol/L MeJA组：按照实施例1步骤1～6的方法，区别仅在于将步骤5中的MeJA水溶液(1mmol/L)替换为MeJA水溶液(2mmol/L)。
2、主要活性成分含量测试
用752紫外-可见分光光度计法测定各组夏枯草果穗干燥粉末中的总黄酮及总酚酸含量，高效液相色谱法测定各组夏枯草果穗干燥粉末中的迷迭香酸和金丝桃苷的含量。测试方法同试验例1。
二、实验结果
如图1(a)所示，处理24小时后，与对照组相比，1mmol/L MeJA组总黄酮的含量显著增加，但是0.5mmol/L MeJA组与2mmol/L MeJA组总黄酮含量显著性降低。
如图1(b)所示，处理24小时后，与对照组相比，1mmol/L MeJA组总酚酸的含量显著增加，但是0.5mmol/L MeJA组与2mmol/L MeJA组总酚酸含量显著性降低。
如图1(c)所示，处理24小时后，与对照组相比，1mmol/L MeJA组金丝桃苷的含量显著增加，但是0.5mmol/L MeJA组与2mmol/L MeJA组金丝桃苷含量显著性降低。
如图1(d)所示，处理24小时后，与对照组相比，1mmol/L MeJA组迷迭香酸的含量显著增加，但是0.5mmol/L MeJA组与2mmol/L MeJA组迷迭香酸含量显著性降低。
上述结果表明，与对照组相比，利用本发明的方法喷洒特定浓度(1mmol/L)的MeJA能够显著提高夏枯草药材中总黄酮、总酚酸、金丝桃苷、迷迭香酸的含量。
试验例3、不同采收时间对夏枯草主要活性成分的影响
一、实验方法
1、分组处理
(1)24h组：同实施例1步骤1～6的方法。
(2)6h组：按照实施例1步骤1～6的方法，区别仅在于将步骤6中的采收时间从喷洒处理24h后替换为喷洒处理6h后。
(3)12h组：按照实施例1步骤1～6的方法，区别仅在于将步骤6中的采收时间从喷洒处理24h后替换为喷洒处理12h后。
2、主要活性成分含量测试
用752紫外-可见分光光度计法测定各组夏枯草果穗干燥粉末中的总黄酮及总酚酸含量，高效液相色谱法测定各组夏枯草果穗干燥粉末中的迷迭香酸和金丝桃苷的含量。测试方法同试验例1。
二、实验结果
如图2(a)所示，1mmol/L MeJA处理后，24h组总黄酮含量显著高于其他时间段组别，从图中可以看出，总黄酮含量从高到低分别为：24h＞6h＞12h。
如图2(b)所示，1mmol/L MeJA处理后，24h组与6h组总酚酸含量没有显著性差异，均显著高于12h组，从图中可以看出，总酚酸含量从高到低分别为：24h≈6h＞12h。
如图2(c)所示，1mmol/L MeJA处理后，24h组迷迭香酸含量显著高于其他时间段组别，从图中可以看出，迷迭香酸含量从高到低分别为：24h＞6h＞12h。
如图2(d)所示，1mmol/L MeJA处理后，24h组金丝桃苷含量显著高于其他时间段组别，从图中可以看出，金丝桃苷含量从高到低分别为：24h＞6h＞12h。
上述结果表明，利用本发明的方法喷洒1mmol/L MeJA后，不同采收时间对夏枯草药材主要活性成分的含量有明显的影响，其中，总黄酮、总酚酸、金丝桃苷和迷迭香酸的含量最高的采收时间为24h，其次为6h。
综上，本发明提供了一种通过喷施外源茉莉酸甲酯来提高夏枯草药材品质的方法，本发明的方法能够显著提高夏枯草药材的总黄酮、总酚酸、迷迭香酸及金丝桃苷含量，显著增强其抗氧化能力和渗透调节能力，提高夏枯草药材的品质，有利于夏枯草药材资源的开发利用。利用本发明的方法处理后获得的夏枯草药材总黄酮、总酚酸、迷迭香酸及金丝桃苷含量高，抗氧化能力和渗透调节能力强，应用前景广阔。

Claims (10)

1.一种获得高品质夏枯草药材的方法，其特征在于：步骤如下：
a、在夏枯草植株开花期向夏枯草植株喷施0.8～1.2mmol/L的茉莉酸甲酯溶液；
b、喷施后，采收夏枯草果穗，干燥，即得夏枯草药材。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，茉莉酸甲酯溶液的浓度为1.0mmol/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤a中，所述茉莉酸甲酯溶液为茉莉酸甲酯的水溶液。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：步骤b中，所述采收夏枯草果穗的时间为喷施6～24小时后。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤b中，所述采收夏枯草果穗的时间为喷施12～24小时后。
6.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：步骤a中，所述夏枯草开花期为4月中旬-6月上旬，优选为5月中旬；
和/或，步骤a中，所述喷施的方式为喷洒整株夏枯草植株使其有液珠滴落。
7.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：步骤a中，所述夏枯草植株是按照以下方法栽培到开花期的：取夏枯草种子，播种，出苗，移栽，栽培到开花期。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述夏枯草种子是在25-30℃的水中浸泡2小时后播种的，所述播种时间为9月中下旬；
所述移栽时间为播种时间第二年的4月下旬，所述栽培环境为：相对湿度55～65％、光合有效辐射804μmol·m-2s-1、昼夜温度26/15℃。
9.一种夏枯草药材，其特征在于：它的总黄酮含量为9.50～9.60mg/g，总酚酸含量为2.35～2.45mg/g，迷迭香酸含量为6.30～6.40mg/g，金丝桃苷含量为1.00～1.10mg/g。
10.根据权利要求9所述的夏枯草药材，其特征在于：它是按照权利要求1～8任一项所述的方法处理后获得的。
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