CN112921059A - 蕉芋rs3抗性淀粉的制备方法及在功能食品和抗帕金森药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种蕉芋RS3抗性淀粉的制备方法及在功能食品和抗帕金森药物中的应用，包括以下步骤：步骤一.将蕉芋天然淀粉置于磷酸盐缓冲溶液中，并在沸水中完全糊化；步骤二.将0.1‑5U/gα‑淀粉酶加入到步骤一糊化后的淀粉中，水解1‑15min；步骤三.将0.1‑4ASPU/g普鲁兰酶加入到步骤二中，水解1‑8h；步骤四.将步骤三中得到的淀粉冷却至室温并在4℃下保存12h回生；步骤五.将步骤四中的淀粉进行离心收集重结晶淀粉，干燥，研磨，并过滤，得到Ce‑RS3。通过实施本发明的技术方案，蕉芋RS3型抗性淀粉主要为B型晶型结构，与一般RS相比，具较高结晶度和较长聚合度链。其独特新颖的结构特征，保障了CE‑RS3具其较好的治疗帕金森疾病的活性。

Description

蕉芋RS3抗性淀粉的制备方法及在功能食品和抗帕金森药物 中的应用

技术领域

本发明涉及功能食品及医药技术领域，具体涉及一种蕉芋RS3抗性淀粉及在功能食品和抗帕金森药物中的应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的神经系统退行性疾病，其发病率和患病率均随年龄的增高而增加。大多患者在60岁以上发病，是一种慢性进展性疾病，具有高度异质性，不同病人疾病进展的速度不同，目前尚不能治愈。我国65岁以上人群PD的患病率大约是1.7％。帕金森病的发病机制主要是中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而致病，导致这一病理改变的确切病因目前仍不清楚。

目前帕金森病的临床治疗可选择的药物较多，目前临床上主要采用对症治疗方法为主，辅以康复治疗。PD常用的药物主要有：中枢性抗胆碱药如苯海索、金刚烷胺、复方左旋多巴、非麦角类DR激动剂比如盐酸普拉克索(森福罗)、MAO-B抑制剂比如司来吉兰和雷沙吉兰、儿茶酚-氧位-甲基转移酶(COMT)抑制剂比如括恩他卡朋和托卡朋等；但尚未发现能够逆转或治愈PD的确切药物或疗法，因此亟需开发PD治疗的新型药物或治疗方法。

近年来，随着肠道微生态与脑病的研究逐步深入，微生物-肠-脑轴与帕金森之间的密切关系已受到越来越多的重视，并有望在PD治疗领域取得新的突破。越来越多的研究发现，帕金森病患者中菌群结构失衡的一个明显特征是调节产生短链脂肪酸(short chainfatty acids,SCFA)的菌属丰度减少，特别是帕金森疾病特异性菌群包括普氏菌科(Prevotellaceae)乳杆菌科(Lactobacillaceae)以及免疫性炎症相关的阿克曼菌(Akkermansia)越来越成为帕金森疾病调控“微生物-肠-脑轴”的明星细菌。因此，基于“微生物-肠-脑轴”治疗帕金森药物的开发已成为研究的热点。蕉芋RS3型抗性淀粉，来源于美人蕉科植物蕉芋(Canna edulis)的根茎的蕉芋淀粉，经酶工艺处理而获得。目前，蕉芋RS3抗性淀粉研究比较少。

因此，本行业一种能够解决上述问题的技术方案。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种蕉芋RS3抗性淀粉及在功能食品和抗帕金森药物中的应用。从美人蕉科植物蕉芋(Canna edulis)根茎制备的蕉芋RS3型抗性淀粉，在没有引入新的化学基团的情况下保持了B型结晶结构特征，具有较强的治疗帕金森效果，能够用于制备帕金森病的药物、药物辅料及功能食品。

本发明公开了一种蕉芋RS3抗性淀粉的制备方法，包括以下步骤：

步骤一.将蕉芋天然淀粉置于磷酸盐缓冲溶液中，并在沸水中完全糊化；

步骤二.将0.1-5U/gα-淀粉酶加入到步骤一糊化后的淀粉中，水解1-15min；

步骤三.将0.1-4ASPU/g普鲁兰酶加入到步骤二中，水解1-8h；

步骤四.将步骤三中得到的淀粉冷却至室温并在4℃下保存12h回生；

步骤五.将步骤四中的淀粉进行离心收集重结晶淀粉，干燥，研磨，并过滤，得到Ce-RS3。

进一步的，包括以下步骤：

步骤一.将蕉芋天然淀粉置于磷酸盐缓冲溶液中，并在沸水中完全糊化；

步骤二.将1.3-5U/gα-淀粉酶加入到步骤一糊化后的淀粉中，水解1-15min；

步骤三.将0.1-4ASPU/g普鲁兰酶加入到步骤二中，水解1-8h；

步骤四.将步骤三中得到的淀粉冷却至室温并在4℃下保存12h回生；

步骤五.将步骤四中的淀粉进行离心收集重结晶淀粉，干燥，研磨，并过滤，得到Ce-RS3。

进一步的，包括以下步骤：

步骤一.将蕉芋天然淀粉置于磷酸盐缓冲溶液中，并在沸水中完全糊化；

步骤二.将2.2U/gα-淀粉酶加入到步骤一糊化后的淀粉中，水解14.9min；

步骤三.将3.53ASPU/g普鲁兰酶加入到步骤二中，水解7.55h；

步骤四.将步骤三中得到的淀粉冷却至室温并在4℃下保存12h回生；

步骤五.将步骤四中的淀粉进行离心收集重结晶淀粉，干燥，研磨，并过滤，得到Ce-RS3。

进一步的，所述步骤一中糊化时间为20min。

进一步的，所述步骤五中的干燥温度为105℃。

进一步的，所述步骤五中粒径数为200目筛。

进一步的，所述步骤五中制备的蕉芋RS3抗性淀粉为B晶型结构。

进一步的，所述步骤五中制备的蕉芋RS3抗性淀粉的相应结晶度为39.40％。

进一步的，所述的蕉芋RS3抗性淀粉的含量为11.32％-49.11％。

进一步的，所述的蕉芋RS3抗性淀粉的含量为35.37％-49.11％。

进一步的，所述的蕉芋RS3抗性淀粉的含量为49.11％。

进一步的，一种根据所述制备方法制备蕉芋RS3抗性淀粉。

进一步的，一种所述制备方法制备的蕉芋RS3抗性淀粉在功能食品中的应用。

进一步的，一种所述制备方法制备的蕉芋RS3抗性淀粉在抗帕金森药物中的应用。

进一步的，所述蕉芋RS3抗性淀粉单独使用或者与药物或辅料两种或两种以上混合使用。

进一步的，所述抗帕金森药物的剂型包括膏剂、糊剂、贴剂、滴剂、含漱剂、栓剂、舌下片剂、粘贴片、贴膜剂、泡腾片或滴丸剂中的任一一种。

有益效果：

通过实施本发明的技术方案，蕉芋RS3型抗性淀粉主要为B型晶型结构，与一般RS相比，具较高结晶度和较长聚合度链。其独特新颖的结构特征，保障了CE-RS3具其较好的治疗帕金森疾病的活性。

蕉芋RS3抗性淀粉，其治疗帕金森的总有效率达25％-95％，其作用机制与蕉芋RS3抗性淀粉通过促进一系列产生短链脂肪酸(SCFA)的细菌增殖、增加对治疗帕金森(PD)疾病有益的阿克曼菌(Akkermansia)、普氏菌科(Prevotellaceae)、粪棒状菌属Faecalibaculum等的丰度，通过“菌群-肠-脑轴”的调控有关。

附图说明

图1为蕉芋RS3抗性淀粉的制备方法的工艺流程图；

图2为NS(A，B，C)和Ce-RS3(D，E，F)的扫描电子显微镜(SEM)图；

图3中A为NS和Ce-RS3的FT-IR光谱，B为NS和Ce-RS3的X射线衍射图谱；

图4为Ce-RS3的降血脂作用的示意图；

图5为肠道微生物群落结构改变示意图；

图6为Ce-RS3对帕金森模型小鼠转棒时间的影响示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。

本发明公开了一种蕉芋RS3抗性淀粉的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：

步骤一.将蕉芋天然淀粉置于磷酸盐缓冲溶液中，并在沸水中完全糊化；

步骤二.将0.1-5U/gα-淀粉酶加入到步骤一糊化后的淀粉中，水解1-15min；

步骤三.将0.1-4ASPU/g普鲁兰酶加入到步骤二中，水解1-8h；

步骤四.将步骤三中得到的淀粉冷却至室温并在4℃下保存12h回生；

步骤五.将步骤四中的淀粉进行离心收集重结晶淀粉，干燥，研磨，并过滤，得到Ce-RS3。

实施例1一种蕉芋RS3抗性淀粉的制备方法

材料：

芭蕉天然淀粉来自贵州伊利泰生物科技有限公司。普鲁兰酶(1000ASPU/ml)购自诺维信投资有限公司(中国北京)。高温α-淀粉酶(10000U/g)购自Solarbio有限公司(中国北京)。马铃薯直链淀粉标准品、戊基葡萄糖苷酶、猪胰α-淀粉酶由西格玛有限公司(美国密苏里州圣路易斯)提供。D-葡萄糖分析试剂盒从Megazyme国际有限公司(爱尔兰Wicklow公司)获得。采用Milli-Q系统(美国马萨诸塞州milipore公司)净化去离子水。

蕉芋RS3制备：

将150g蕉芋天然淀粉置于1000ml磷酸盐缓冲溶液(pH5.0)中，并在沸水中完全糊化20min。此后，添加高温α-淀粉酶，200rpm搅拌，将煮熟的淀粉调至60℃，pH调至5.0，然后立即加入普鲁兰酶进行培养。随后，将淀粉糊冷却至室温并在4℃下保存12h回生；最后，3000rpm离心收集重结晶淀粉，在105℃干燥，研磨，并用200目筛过滤以供进一步分析。

蕉芋RS3的含量测定：

按照AOAC方法测定RS浓度(AOAC国际，2007年)。具体而言，将葡萄糖醛酸酶和淀粉酶与样品在37℃下培养16h。然后，添加无水乙醇终止反应。将混合物离心以沉淀，并用乙醇冲洗颗粒，用2M KOH在冰上培养20min。用乙酸缓冲液(pH 3.8)中和悬浮液并用葡萄糖苷酶处理。最后用Megazyme-GOPOD试剂盒检测葡萄糖含量。

表1：蕉芋RS3在双酶解极端剂量条件下制备的含量测定结果。

表2:Ce-RS3响应面二次模型的方差分析结果。

R²＝0.9784R²-Adj＝0.9567

Experimental values corresponding to optimization results＝49.11(±0.42)％

优化结果对应的实验值＝49.11(±0.42)％。

表3：最佳制备工艺条件下Ce-RS3的含量测定。

样本	RS(％)
		NS	5.8％±0.5
Ce-RS3	49.11±0.42

根据表1-3实验结果可知，本发明制备的Ce-RS3含量可达11.32％-49.11％；优选的，α-淀粉酶水解1.3-5u/g时，Ce-RS3含量可达35.37％-49.11％(表1-3)；当最佳工艺条件为：α-淀粉酶水解2.22u/g，水解时间14.9min；普鲁兰酶水解3.53aspu/g，水解时间7.55h，在此条件下，Ce-RS3含量可达49.11％。普鲁兰酶是一种去支链酶，能特异性水解α-1,6糖苷键，而α-淀粉酶则缩短淀粉分子的链长。这些结果支持以下结论：淀粉酶和普鲁兰酶的双酶水解可以形成较大比例的具有适当链长的线性淀粉分子，这有助于其重结晶。

测试例1蕉芋RS3的物理特性分析

根据美国谷物化学家协会(AACC，2000)的方法测定蛋白质、脂肪和灰分的含量。淀粉样品的水分通过在105℃烘箱中干燥1g样品24小时来测定，直到获得恒定重量。淀粉中的白细胞通过先前描述的方法(Mao等人，2018)进行测定，并稍作修改。简言之，通过搅拌60分钟将每个样品(3g，干重)与蒸馏水(45ml)混合。在3000g下离心10分钟后，收集所有上清液以排出10分钟。然后，称量沉淀物中的湿淀粉。

与蕉芋原淀粉(NS)相比，改性后的蕉芋RS3抗性淀粉(CE-RS3)，其理化性质发生了变化(表4)。长支链淀粉可被淀粉酶和普鲁兰酶水解，逐渐去支链成分子量较低的直链片段，形成RS3与NS相比，Ce-RS3的直链淀粉含量显著增加，达到31.08％。Ce-RS3的蛋白质、脂肪和灰分含量均显著低于天然淀粉，表明其在加工过程中结构遭到破坏。RS的持水能力主要与淀粉链间的氢键有关。分子内更多的氢键和共价键与更少的水结合位点相关，导致持水力减少。经过处理后，Ce-RS3的持水能力由66.7％显著提高到186.78％，澄明度由1.26％提高到1.73％。这可能与加工过程中亲水性基团的增加和疏水性基团的减少有关；另外，相对结晶度也由原淀粉的34.71％提升到了39.40％。

表4Ce-RS3的理化性质分析表

蛋白质、脂类、灰分、水分、抗性淀粉(RS)、水结合力(WBC)、淀粉糊澄清度、相对结晶度、NS和Ce-RS3的直链淀粉含量。*与NS相比，p＜0.05，**p＜0.01Ce-RS3。

注：蕉芋原淀粉(NS)；蕉芋(Ce-RS3)；抗性淀粉(RS)；持水力(WBC)；Ce-RS3与NS比，*p＜0.05,**p＜0.01。

测试例2蕉芋RS3抗性淀粉的结构特点表征

扫描电子显微镜(SEM)分析

在真空条件下，将干淀粉粉末粘附在涂有钯金涂层的玻璃载玻片上。然后，用场发射扫描电子显微镜观察样品中的颗粒。

傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析

将干淀粉粉末与溴化钾粉末(1:100w/w)混合，然后在真空压缩下压片。随后，以纯化的溴化钾片为背景，通过红外分光光度计(Perkinellmer，Waltham，USA)扫描所得样品片。对于红外分光光度计，设置以下参数：每个光谱16次扫描，平均值；范围4000-400cm^-1；光谱分辨率4cm^-1。

X射线衍射(XRD)分析

采用XRD图像处理器(Bruker，d8advance，德国)分别在40ma和40kv的电流和电压下记录淀粉样品的XRD图谱。在扫描速度为8°(2θ)/min，角度范围为5-30°(2θ)，步长为0.02°(2θ)的条件下得到了衍射图样。根据衍射峰面积与总衍射面积之比，使用Jade软件(v6.5)计算相关结晶度(Mao et al.，2018)。

蕉芋RS3的扫描电子显微镜(SEM)分析

如图2所示，与蕉芋原淀粉NS相比(图2A,B，C)，Ce-RS3形成了致密的块状结构(图2D，E，F)，随着直链淀粉的浸出，其表面形成了不规则的片状结构。据报道，紧密的微观结构形态大大提高了其抗酶攻击的能力，并有助于不同微生物群对抗性淀粉的反应。这些结果表明Ce-RS3可能具有良好的肠道微生物群发酵特性。

蕉芋RS3结构的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)表征

FT-IR分析结果(图3A)显示，天然淀粉NC和Ce-RS3的FT-IR光谱995和1047cm^-1处的吸收带与淀粉的有序结构和结晶敏感性有关，而1022cm^-1处的吸收带代表无定形区域。995/1022cm^-1和1047/1022cm^-1条带比值是定量淀粉样品有序度的代表性和敏感指标，较高的比值代表较高的晶区比例。红外光谱分析表明，天然淀粉的995/1022cm^-1和1047/1022cm^-1条带比分别为0.946和0.982，Ce-RS3条带比分别为1.04和1.21。这些结果表明Ce-RS3的结晶度高于天然淀粉，XRD分析进一步证实了这一点。此外，3700-3000cm^-1处的吸收带主要由分子内或分子间氢键的OH伸缩振动控制。RS3在3100～3700cm^-1范围内的吸收强度大于天然淀粉，这可能是由于加工过程中分子内或分子间氢键的增强引起的-OH增加所致。

蕉芋RS3结构的X射线衍射(XRD)表征

XRD图谱(图3B)显示，天然淀粉在17°、15°、22°和24°处产生强烈的衍射峰，在5°(2θ)处产生典型的衍射峰，表明存在B型晶型(图3B)。经过处理后，Ce-RS3保持了B型晶型模式，具有相似的(2θ)峰位，但显示出更为强烈和明确的峰位。为了更直观地研究淀粉结晶信息的变化，采用相应的结晶度指数对NS和Ce-RS3淀粉进行了表征。淀粉相对结晶度的变化反映了淀粉晶体双螺旋相互作用的程度和微晶纤维比例的差异。Ce-RS3的相应结晶度(39.40％)高于天然淀粉(34.71％)，较高的结晶度表明Ce-RS3在双酶解后具有更为有序的双螺旋结构。这可能归因于释放更多低分子量线性链片段，这有助于在再生过程中形成更有序的双螺旋结构，从而最终提高晶体完整性。结合FT-IR分析表明，双酶水解可促进天然淀粉中脱支淀粉链的释放和重排，形成更有组织的双螺旋结构，提高晶体的完整性。以往的体外研究发现，双螺旋结构和结晶度可以通过改变发酵过程中晶体的可及性来影响菌群，RS的益生元性质，尤其是RS3的益生元性质随着B型微晶丝比例的增加而增加。以上结果提示Ce-RS3在体内可能具有生理功能和良好的肠道微生物发酵特性。

图中显示了NS和Ce-RS3的链长分布(CLDs)分布，低、中、高分子量峰的三峰分布分别指定为组分1、2和3。为了更好地量化和解释CLD，将链区域分为三部分，即短链(A链，DP为6-24)、支链淀粉的中间链(B链，DP为25-100)和长链(C链，DP≥100)直链淀粉或长支链淀粉。双酶水解后，Ce-RS3样品的长链C(DP≥100)峰与天然淀粉明显不同，向低分子量方向移动。同时，与天然淀粉相比，Ce-RS3中链比例显著增加，短链比例显著降低。这些结果表明，支链淀粉和直链淀粉的链长在脱支前均随淀粉酶的攻击而减少，其超长链和长链均已转化为长链和中链，而中短链则可能进一步水解。

测试例4蕉芋RS3对帕金森模型鼠运动障碍的影响

实验动物

8周龄20g左右健康SPF级C57BL/6J雄性小鼠20只，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号SCXK(京)2009-0015，在恒温恒湿(温度维持23～25℃)环境、食水充足条件下喂养。

实验方法：

实验动物分组：根据体质量随机分组后进行编号，分别为模型组(Model)、Ce-RS3(蕉芋RS3抗性淀粉)组(1.5g/kg)每组10只。

PD动物模型的复制及给药：

8周龄雄性C57BL/6J先适应1周后，连续9周每天皮下注射鱼藤酮(1.25mg/kg)。与此同时Ce-RS3组给予抗性淀粉，按1.5g/kg灌胃给药。

转棒检测：

各组小鼠分别在0-9周，每周测1次体重。鱼藤酮注射9周后首先进行转棒检测。第1天上午9时训练3次，第2天上午9时训练1次，检测1次。Rotamex转棒仪起始转速为4r/min，最大转速为40r/min，加速度为0.12r/min，训练和检测时间均设为5min，记录每只小鼠从转棒旋转开始至离开转棒的时间作为小鼠在转棒上的时间。

测试结果如下：

Ce-RS3对PD模型小鼠转棒时间的影响：

鱼藤酮注射及给药9周后，在转棒实验中PD模型小鼠的转棒时间显著低于Ce-RS3组小鼠(P＜0.01)，总有效率达91.82％，提示蕉芋RS3抗性淀粉具有显著的抗帕金森运动障碍作用(图6)。

测试例5蕉芋RS3对帕金森模型鼠肠道菌群的影响

DNA抽提试剂盒(美国OMEGA公司)；琼脂糖(西班牙biowest公司)。QL-901小型涡旋器(中国海门其林贝尔仪器制造有限公司)；BioTek EL800酶标仪(美国Biotek公司)；ABIGeneAmp 9700型PCR扩增仪(美国ABI公司)；DYY-6C电泳仪(北京市六一仪器厂)；H1650-W冷冻离心机(上海沪粤明科学仪器有限公司)。

实验方法：

实验动物分组：根据体质量随机分组后进行编号。分别为正常组(Control)、模型组(Model)、Ce-RS3(蕉芋RS3抗性淀粉)组(1.5g/kg)每组10只。

PD动物模型的复制及给药：

8周龄雄性C57BL/6J先适应1周后，连续9周每天皮下注射鱼藤酮(1.25mg/kg)。与此同时Ce-RS3组给予抗性淀粉，按1.5g/kg灌胃给药。

动物实验与粪便样本收集：在9周给药结束后，使用排挤法收集每只小鼠新鲜粪便，约为100mg，迅速放入无菌EP管中液氮速冻，转入-80℃冰箱中待用。

粪便总DNA的提取与扩增：用QIAamp-Fast-DNA-Stool试剂盒提取总DNA，用nanodrop2000分光光度计测定DNA浓度。使用以下引物进行PCR扩增细菌16S rDNA的V3-V4区域：338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGAG-3'，正向)和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'，反向)。扩增条件如下：首先设定3min95℃的预变性温度，设置27个循环(95℃变性30s，55℃退火30s,72℃延伸30s)，最后72℃延伸10min。扩增体系为20μl，4ul 5×FastPfu缓冲液，2μl2.5mM dNTPs，0.8μl引物(5uM)，0.4μlFastPfu聚合酶；10ng DNA模板。α多样性指标，包括Chao1和Shannon指数，根据OTU表确定物种丰富度。此外，根据OTU程度，采用基于UniFrac距离的主坐标分析法(PCoA)对样本间的β多样性指数进行了可视化测量。此外，利用线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)对肠道生物标志物进行分类鉴定。

Illumina Miseq测序及数据处理：利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。数据处理使用了Trimmomatic及FLASH软件对原始序列进行质控与拼接；使用UPARSE软件进行OTU聚类，剔除嵌合体。利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库(SSU123)，使用美吉云平台进行后续数据的数据分析。

测试结果如下：

本研发现与正常组相比，模型组降低了Bacteroidales、Akkermansia、Prevotellaceae属的丰度，升高了Lachnospiraceae、Faecalibaculum、Lachnospiraceae、Lactobacillus等属的丰度，说明PD小鼠与正常小鼠相比较，其菌群结构发生了一定的改变。与PD模型组相比，蕉芋RS3抗性淀粉组干预9周后，降低了Lachnospiraceae、Faecalibaculum、Lactobacillus等属的丰度；提高了Akkermansia、Bacteroidales_、Prevotellaceae、Faecalibaculum的丰度，向正常组的方向回调。

本申请中，Ce-RS3能促PD模型小鼠肠道中系列产生短链脂肪酸(SCFA)的细菌增殖，包括别普雷沃菌(Alloprevotella),丁酸球菌(Butyricicoccus),和反刍梭菌(Ruminiclostridium)。

总之，Ce-RS3通过促进PD鼠肠道Akkermansia、Bacteroidales、Prevotellaceae、Faecalibaculum以及系列产生短链脂肪酸(SCFA)的细菌增殖的丰度，有助于减轻PD模型小鼠肠道免疫性炎症，然后通过肠-脑轴改善PD运动障碍，这可能是蕉芋RS3抗性淀粉抗PD作用的主要机制之一。

主要细菌对Ce-RS3有反应：

富含SCFAs产生菌调节宿主健康是抗性淀粉的主要健康机制之一，已被大量文献证实。产生SCFA的细菌可以维持肠道的完整性，为肠道细胞提供营养，减少肠道炎症。有针对性地恢复这些产生SCFA的细菌是预防和治疗代谢紊乱的一种潜在策略(Zhao等人，2018)。在这项研究中，Ce-RS3显著富集了一系列短链脂肪酸(SCFA)产生菌，包括别普雷沃菌、丁酸杆菌和反刍梭菌。然而，富含Ce-RS3的SCFAs产生菌与RS文献中的报道并不完全一致。Jones报道，水稻RS3s富集的SCFAs产生菌主要集中在牛肝菌科的植物区系中，如Blautia和Roseburia，然而，Xu的研究发现，给小鼠施用RS3增加了SCFA产生菌，包括反刍动物科和梭状芽孢杆菌，本研究中没有发现这些细菌。这一结果可能主要是由于具有不同精细结构的rs3被肠道微生物群不同地利用/这些不同结果的一个潜在解释可能是由于具有不同精细结构的rs3被肠道微生物群不同地利用而不同的发酵。此外，粪便微生物群组成在SCFAs产生中具有功能冗余性，虽然许多属的细菌具有产生SCFAs的功能，但由于检测方法、采样地点和供体的不同，特定的SCFAs反应菌会发生变化。然而，尽管SCFAs产生菌的组成在个体间存在显著差异，但不同供者之间不同rs3产生的丁酸量相似。由此可见，Ce-RS3对SCFAs产生菌具有增殖作用，是其潜在的保健机制之一。

如图5所示，图5肠道微生物群落结构改变：(A)门(分类等级)水平的肠道微生物群组成；(B)香农指数；(C)Chao1指数；(D)基于未加权UniFrac距离的主坐标分析(PCoA；每组n＝6)；(E)LEfSe结果的分支图；分类代表统计和生物学上一致的差异。只有对数LDA阈值显著大于2.5且p<0.05的类群被显示出来。

在这项研究中，高脂血症小鼠的肠道微生物群表现出微生物多样性显著降低，富含促炎性细菌成分，包括泰泽雷拉、泰泽雷拉和厌氧菌(图5E)；然而，Ce-RS3显著改善了这些趋势。肠道微生物群的总体多样性越高，意味着肠道健康越好，而多样性的降低是患有各种代谢疾病(如肥胖和高脂血症)的个体的共同特征(Krych、Nielsen、Hansen和Hansen，2015)。更重要的是，肠道微生物群可以促进脂质循环，并且肠道微生物群的多样性与较低的TC浓度显著相关。Tyzzerella和Tyzzerella_是与代谢紊乱相关的潜在病原体，以前在肥胖小鼠中发现这些病原体丰富。厌氧菌数量的增加与促炎性趋化因子和炎症的升高有关，提示厌氧菌是代谢紊乱的重要危险因素。另一方面，Ce-RS3干预增加了Akkermansia和Faecalibaculum的丰度。阿克曼菌(Akkermansia)是一种已知的有益细菌，在肠道中具有重要的功能，可以对抗肥胖相关的代谢综合征。据报道，粪便具有抗炎作用，有助于缓解克罗恩病患者的炎症症状。

结构功能关系：不同来源的抗性淀粉的物理性质和生物活性差异较大。本文报道了美人蕉3型抗性淀粉Ce-RS3对高脂血症小鼠TC、TG、LDL-C、ALT和AST水平的改善作用。病理切片进一步证实Ce-RS3能减轻糖尿病大鼠肝脏脂质积聚。众所周知，RS的大部分代谢益处可归因于结肠微生物群的发酵。因此，Ce-RS3所表现出的良好生理效应可能与其固有的、独特的理化性质所介导的益生元性质密切相关。我们注意到，Ce-RS3能够有效调节肠道微生物群失调，从而增加生态系统多样性，并支持恢复健康促进SCFA生产商的平衡社区，这与高脂血症的改善密切相关。不同的RS化学结构和物理结构对SCFAs的发酵速率、发酵程度和产量有很大的影响。这可归因于Ce-RS3的精细分子结构和物理结构，推测是由于高RS含量和高结晶度的B型淀粉所致。以往的研究表明，B型淀粉颗粒一般比其他类型的淀粉颗粒更耐消化。A型结晶率高的RS3发酵性能差，降解速度慢，细菌产生的scfa和scfa较少丁酸。RS3只有B型结晶具有较高的发酵能力，并能产生较高的SCFA和丁酸盐含量。生物活性研究表明，以B晶型为主的绿豆和马铃薯抗性淀粉的抗淀粉酶活性比以V晶型为主的板栗抗性淀粉强。此外，SEM图像显示Ce-RS3具有致密的块状结构，这可能使其具有较慢的水解特性。因此，我们推测Ce-RS3在高脂血症小鼠结肠内有较好的发酵方式，使物质在肠道分布更加均匀，并被结肠细菌充分利用。我们的发现得到了Zhang等人工作的支持，即RS3比其他类型的抗性淀粉具有更好的益生元能力。特别是，具有多晶型B的RS3可以改善肠道微生态健康，并选择性地富集产生SCFAs的细菌。有趣的是，Ce-RS3富集的SCFAs产生菌与文献报道的不完全一致。更重要的是，Ce-RS3具有更广泛的肠道菌群调节作用，包括减少一系列炎症细菌和增加宿主有益细菌，尤其是Akkermansia，这在以前的体外研究中很少被报道。这些发现通过调控SCFAs以外的免疫和炎症介质，拓展了Ce-RS3对微生物群的潜在有益机制，并进一步强调了Ce-RS3分子结构对微生物群的特异性调控作用。与文献报道的其它RS3相比，Ce-RS具有更高的结晶度和DP链长，这可能是Ce-RS3更广泛地调控菌群特征的另一个潜在因素。血清生化指标及组织病理学分析：如图4所示，图4为Ce-RS3的降血脂作用；(A)血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的水平；(B)Ce-RS3对脂肪细胞面积的影响(HE×400)；(C)小鼠肝脏和脂肪组织的组织病理学检查(肝脏，×400；脂肪×400)*p<0.05，**p<0.01模型与对照组比较，#p<0.05，##Ce-RS3和辛伐他汀与模型组比较p<0.01(x±SD，n＝6)。采用全自动生化分析仪(AU480，Beckman-Coulter，USA)测定血清TG、TC、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。脂肪和肝组织切片进行苏木精-伊红(H&E)染色。光学显微镜(日本东京奥林巴斯)用于组织学分析。脂肪细胞的大小用Image-Pro-Plus软件(IPP，6.0版，Media controlnetics，USA)估计。

蕉芋RS3抗性淀粉具有明显的降脂、减肥和降血糖作用。蕉芋RS3抗性淀粉具有显著的肠道菌群调控作用及帕金森症状改善作用，总有效率为25％-95％。蕉芋RS3抗性淀粉其热稳定性-220℃–130℃。持水能力为50％-186.78％，澄明度为1.2％-1.3％，结晶度30％-40％。蕉芋RS3抗性淀粉的制备工艺：0.1-2U/gα-淀粉酶水解1-15min，0.1-4ASPU/g普鲁兰酶水解1-8h，RS含量从5-9％(天然淀粉)大幅提高到10％-48.23％(Ce-RS3)。红外光谱分析表明，天然淀粉的995/1022cm^-1和1047/1022cm^-1条带比分别为0.946和0.982，而Ce-RS3条带比分别为1.04和1.21。这些结果表明Ce-RS3的结晶度高于天然淀粉；此外，3700-3000cm^-1处的吸收带主要由分子内或分子间氢键的OH伸缩振动控制。RS3在3100～3700cm^-1范围内的吸收强度大于天然淀粉。XRD分析显示，天然淀粉在17°、15°、22°和24°处产生强烈的衍射峰，在5°(2θ)处产生典型的衍射峰，表明存在B型晶型。制备所得的Ce-RS3保持了B型晶型结构，具有相似的(2θ)峰位，但显示出更为强烈和明确的峰位。Ce-RS3的结晶度(39.40％)，明显高于天然淀粉(34.71％)。与其它RS3和原蕉芋淀粉相比，Ce-RS具有更高的结晶度和聚合度(DP)链长。

蕉芋RS3抗性淀粉单独使用或者与药物或辅料两种或两种以上混合使用。

抗帕金森药物的剂型包括膏剂、糊剂、贴剂、滴剂、含漱剂、栓剂、舌下片剂、粘贴片、贴膜剂、泡腾片或滴丸剂中的任意一种。

本发明所保护的蕉芋RS3其类似物主要从植物蕉芋根茎中淀粉制备，但是从其他植物中制备或生物转化的方式获得的RS3及其类似物也在本发明的保护范围之内。

本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。

Claims (10)

1.一种蕉芋RS3抗性淀粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一.将蕉芋天然淀粉置于磷酸盐缓冲溶液中，并在沸水中完全糊化；

步骤二.将0.1-5U/gα-淀粉酶加入到步骤一糊化后的淀粉中，水解1-15min；

步骤三.将0.1-4ASPU/g普鲁兰酶加入到步骤二中，水解1-8h；

步骤四.将步骤三中得到的淀粉冷却至室温并在4℃下保存12h回生；

步骤五.将步骤四中的淀粉进行离心收集重结晶淀粉，干燥，研磨，并过滤，得到Ce-RS3。

2.根据权利要求1所述的蕉芋RS3抗性淀粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一.将蕉芋天然淀粉置于磷酸盐缓冲溶液中，并在沸水中完全糊化；

步骤二.将1.3-5U/gα-淀粉酶加入到步骤一糊化后的淀粉中，水解1-15min；

步骤三.将0.1-4ASPU/g普鲁兰酶加入到步骤二中，水解1-8h；

步骤四.将步骤三中得到的淀粉冷却至室温并在4℃下保存12h回生；

步骤五.将步骤四中的淀粉进行离心收集重结晶淀粉，干燥，研磨，并过滤，得到Ce-RS3。

3.根据权利要求2所述的蕉芋RS3抗性淀粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一.将蕉芋天然淀粉置于磷酸盐缓冲溶液中，并在沸水中完全糊化；

步骤二.将2.2U/gα-淀粉酶加入到步骤一糊化后的淀粉中，水解14.9min；

步骤三.将3.53ASPU/g普鲁兰酶加入到步骤二中，水解7.55h；

步骤四.将步骤三中得到的淀粉冷却至室温并在4℃下保存12h回生；

步骤五.将步骤四中的淀粉进行离心收集重结晶淀粉，干燥，研磨，并过滤，得到Ce-RS3。

4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的蕉芋RS3抗性淀粉的制备方法，其特征在于，所述步骤一中糊化时间为20min。

5.根据权利要求1-3任一权利要求所述的蕉芋RS3抗性淀粉的制备方法，其特征在于，所述步骤五中的干燥温度为105℃，过滤的粒径数为200目筛。

6.根据权利要求1-3任一权利要求所述的蕉芋RS3抗性淀粉的制备方法，其特征在于，所述步骤五中制备的蕉芋RS3抗性淀粉为B晶型结构；所述步骤五中制备的蕉芋RS3抗性淀粉的相应结晶度为39.40％。

7.根据权利要求1权利要求所述的蕉芋RS3抗性淀粉的制备方法，其特征在于，所述的蕉芋RS3抗性淀粉的含量为11.32％-49.11％。

8.一种根据以上任一权利要求所述制备方法制备蕉芋RS3抗性淀粉。

9.一种根据权利要求8所述制备方法制备的蕉芋RS3抗性淀粉在功能食品和抗帕金森药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的蕉芋RS3抗性淀粉在抗帕金森药物中的应用，其特征在于，所述蕉芋RS3抗性淀粉单独使用或者与药物或辅料两种或两种以上混合使用；所述抗帕金森药物的剂型包括膏剂、糊剂、贴剂、滴剂、含漱剂、栓剂、舌下片剂、粘贴片、贴膜剂、泡腾片或滴丸剂中的任意一种。

Images