CN112917891A - 大块组织的生物3d打印方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种大块组织的生物3D打印方法，将配置后的牺牲材料和实现血管化的细胞置于注射器中，得到第一混合溶液及其对应的第一凝胶材料，将配置后的基体材料与组织细胞混合，得到第二混合溶液及相应的第二凝胶材料，装入3D打印机，将3D打印机的出口连接同轴打印喷头上，使同轴打印喷头按照预定的路径轨迹根据待打印器官文件开始打印，使挤出的凝胶纤维在制冷平台上凝胶化，将凝胶纤维中的基体材料成分进行不可逆的固化，得到打印结构，浸入到第二设定温度的培养基中，形成中空流道结构，获得带血管细胞的网络结构，对血管网络结构进行动态培养，促进结构体内部的血管网络的重建，以得到保持流道有效性的血管化的三维组织结构体。

Description

大块组织的生物3D打印方法
技术领域
本发明涉及生物制造技术领域，尤其涉及一种大块组织的生物3D打印方法。
背景技术
近年来，3D打印技术逐渐被用于组织工程和再生医学方面，以此来解决器官供体缺乏的问题。传统的组织工程技术的思路，是将事先打印好的生物支架种上相应的细胞，进行体外模拟生物体内培养或移植到体内。相较于传统的组织工程来说，生物3D打印技术则在打印组织或器官中就将细胞混合在生物墨水中。从而能够实现细胞密度，多类细胞在不同结构材料中的空间分布可控.因此生物打印技术，又称细胞打印和器官打印，开始逐渐成为生物器官制造的研究热点。
2015年浙江大学贺永课题组提出了一种原创性的同轴打印工艺，打印了中空凝胶管并实现以中空管为单元的三维结构打印，为三维结构提供了营养流道网络。基于凝胶管状单元的多功能同轴生物结构体制造工艺，相比于传统打印工艺，在打印过程中在打印单元上，提供更好地打印单元思路，但是由于中空管结构强度往往不足以支撑整个结构，从而导致结构坍塌，流道有效性受到影响。另外原打印方法在打印组织内部的血管化重建，需要二次灌注内皮等血管化功能细胞，操作较为繁琐。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的不足而提供一种大块组织的生物3D打印方法，本发明首创了牺牲层材料策略，将牺牲层材料和结构体材料协同并相互促进各自的打印性能，从而保证了相应结构保证度和流道网络的完整性。
根据本发明提出的一种大块组织的生物3D打印方法，其特征在于，包括如下步骤：
分别配置牺牲材料和基体材料，将配置后的牺牲材料和实现血管化的细胞(如内皮细胞，可通过诱导分化为内皮组织的细胞)置于注射器中，放置在恒温搅拌器上均匀混合，得到第一混合溶液，将所述第一混合溶液冷凝至凝胶状态，得到第一凝胶材料；
S20，将配置后的基体材料与组织细胞混合，得到第二混合溶液，将第二混合溶液冷凝至凝胶状态，得到第二凝胶材料，将第一凝胶材料和第二凝胶材料装入3D打印机，同时将3D打印机的出口连接同轴打印喷头上；
S30，启动制冷平台，将制冷平台的表面温度调整至第一设定温度，使同轴打印喷头能够稳定出丝；所述第一设定温度的取值范围为-2～37℃；
S40，启动打印软件，使同轴打印喷头按照预定的路径轨迹根据待打印器官文件开始打印，使挤出的凝胶纤维在制冷平台上凝胶化，将凝胶纤维中的基体材料成分进行不可逆的固化，得到打印结构；
S50，将打印结构浸入到第二设定温度的培养基中，溶解在内层的牺牲材料，形成中空流道结构，同时内载的实现血管化的细胞沉积并粘附在流到网络内壁，形成内皮化的血管网络结构；所述第二设定温度的取值范围为5～37℃；
S60，对内皮化的血管网络结构进行动态培养，促进结构体内部的血管网络的重建，以得到血管化的三维组织结构体实现血管化的细胞实现血管化的细胞。
进一步地，步骤S10之前，还包括：
获取目标器官的CT数据或MRI数据，将CT数据或MRI数据转换成3D打印机可识别的格式文件，得到待打印器官文件。
进一步地，所述同轴打印喷头包括外喷头和内喷头。
进一步地，所述外喷头的内径取值范围为0.6～3mm，内喷头内径取值范围为0.15～0.5mm。
进一步地，所述制冷平台包括温度控制面板，温控系统，制冷结构；所述温度控制面板实时设读取温度设定指令，并将温度设定指令发送到温控系统；温控系统在接收温度设定指令进行制冷运作，制冷结构通过在制冷的过程中实现制冷板温度的调控同时将温度反馈给制冷系统，进一步反馈给温度控制面板进而实现温度的负反馈，从而达到温度的实时可调控。
进一步地，分别配置牺牲材料和基体材料的过程包括：
将牺牲材料的质量浓度配置为第一设定质量浓度，将基体材料的质量浓度配置为第二设定质量浓度；所述第一设定质量浓度的取值范围为4～60％；所述第二设定质量浓度的取值范围为5～40％。
进一步地，第一设定质量浓度的取值范围为4～30％；所述第二设定质量浓度的取值范围为10-25％。
进一步地，所述使挤出的凝胶纤维在制冷平台上凝胶化，将凝胶纤维中的基体材料成分进行不可逆的固化，得到打印结构还包括：
将第二凝胶材料通入喷头外管道，将第一凝胶材料通入喷头内管道，将第一凝胶材料和第二凝胶材料从3D打印机的喷头挤出形成稳定的凝胶纤维，将凝胶纤维沉积至制冷平台进行凝胶化，对凝胶化后的凝胶纤维进行不可逆固化处理，得到打印结构。
进一步地，所述牺牲材料包括明胶及其衍生物或F127。
进一步地，第一设定温度的取值范围为2～20℃。
本发明的实现原理是：上述本发明的大块组织的生物3D打印方法，通过分别配置牺牲材料和基体材料，将配置后的牺牲材料和实现血管化的细胞置于注射器中，放置在恒温搅拌器上均匀混合，得到第一混合溶液，将所述第一混合溶液冷凝至凝胶状态，得到第一凝胶材料实现血管化的细胞，将配置后的基体材料与组织细胞混合，得到第二混合溶液，将第二混合溶液冷凝至凝胶状态，得到第二凝胶材料，将第一凝胶材料和第二凝胶材料装入3D打印机，同时将3D打印机的出口连接同轴打印喷头上，启动制冷平台，将制冷平台的表面温度调整至第一设定温度，使同轴打印喷头能够稳定出丝，再启动打印软件，使同轴打印喷头按照预定的路径轨迹根据待打印器官文件开始打印，使挤出的凝胶纤维在制冷平台上凝胶化，将凝胶纤维中的基体材料成分进行不可逆的固化，得到打印结构，再将打印结构浸入到第二设定温度的培养基中，溶解在内层的牺牲材料，形成中空流道结构，同时内载的实现血管化的细胞沉积并粘附在流到网络内壁，形成内皮化的血管网络结构，然后对内皮化的血管网络结构进行动态培养，促进结构体内部的血管网络的重建，以得到保持流道有效性的血管化的三维组织结构体，其中将同轴打印和牺牲打印结合，打印三维结构，在成型后将牺牲材料从打印结构体中自动去除形成流道网络结构，牺牲材料和结构体材料协同相互促进各自的打印性能，保证了相应结构保证度和流道网络的完整性，有效地规避了传统3D生物打印技术制备的水凝胶结构体强度较差，无法有效构建组织和器官结构体模型的弊端。
本发明与现有技术相比其显著优点在于：
第一，本发明首创了牺牲层材料策略，将牺牲层材料和结构体材料协同并相互促进各自的打印性能，从而保证了相应结构保证度和流道网络的完整性，有效地规避了传统3D生物打印技术制备的水凝胶结构体强度较差，无法有效构建组织和器官结构体模型的弊端。
第二，本发明则利用三维建模，通过3D同轴打印技术，可制备得到任意尺寸的中空结构；从而克服了采用传统的模具浇筑成型技术制备得到的水凝胶材料特征取决于所使用的模具，且内部营养网络无法构建，水凝胶材料形状较为单一，无法制备较为精细的水凝胶材料的不足。
第三，本发明利用同轴喷头同时打印多种材料，利用牺牲层材料强度支撑保证在打印过程中强度得到保证，有效地解决了其他发明工艺上打印过程中出现坍塌的现象，同时保证了流道网络的完整性。如利用同轴喷头外喷头打印出细胞载体材料GelMA，拥有良好的生物兼容性，能够很好保证细胞在其中的存活率和基本功能。
第四，本发明采用内在实现血管化的细胞的牺牲层材料，让实现血管化的细胞自沉积并粘附在流道内壁，进而形成内细化流道网络，实现真正意义的内皮化血管，这种方式血管化更有效，能实现任意复杂形状流道的血管化；从而克服了传统制造的流道血管化基本采用灌注的方式，灌注方式效果有限，而且复杂流道难以血管化的不足。
附图说明
图1是本发明一个实施例的大块组织的生物3D打印方法流程图。
图2是本发明一个实施例的基于凝胶管状单元的同轴打印喷头示意图。
图3是本发明一个实施例的同轴打印载实现典型血管化的细胞(内皮细胞)的明胶示意图。
图4是本发明一个实施例的载组织细胞的GelMA示意图。
图5是本发明一个实施例的中模型、打印实物、实物电镜图示意图。
图6是本发明一个实施例的中空凝胶纤维多功能化生物兼容性细胞验证图。
图7是本发明一个实施例的基于凝胶中空单元的多组分同轴喷头打印示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，以下描述的具体实施例虽用以解释本发明，但并不用于限定本发明。
在本发明中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本发明的至少一个实施例中。在本发明说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本发明所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
实施例1：
参考图1所示，本实施例提供一种大块组织的生物3D打印方法，包括如下步骤：
S10，分别配置牺牲材料和基体材料，将配置后的牺牲材料和实现血管化的细胞(如内皮细胞，可通过诱导分化为内皮组织的细胞)置于注射器中，放置在恒温搅拌器上均匀混合，得到第一混合溶液，将所述第一混合溶液冷凝至凝胶状态，得到第一凝胶材料。
上述牺牲材料可以包括明胶等具备良好的生物兼容性，可打印性，易去除的材料。上述基体材料可以包括GelMA(甲基丙烯酸酐化明胶)等具备良好的生物兼容性，可打印性，稳定不易变形这些特征的材料。
具体地，可以将牺牲材料配置为第一设定质量浓度的溶液，将基体材料配置为第二设定质量浓度的溶液，以分别实现牺牲材料和基体材料的配置。上述步骤将配置后的牺牲材料和内皮细胞装入多路管道中，以将两种通入同一喷头，形成一股凝胶纤维，可以实现相互增强各自的打印性能。
在一个示例中，牺牲层材料和基体材料的组合可以包括明胶和GelMA，F127(泊洛沙姆)和胶原蛋白，F127和基质胶等组合。综合打印工艺及生物兼容性的考虑，目前明胶作为牺牲层和GelMA作为基体材料为最佳组合。
S20，将配置后的基体材料与组织细胞混合，得到第二混合溶液，将第二混合溶液冷凝至凝胶状态，得到第二凝胶材料，将第一凝胶材料和第二凝胶材料装入3D打印机(比如可以将第一凝胶材料和第二凝胶材料装入3D打印机地Z轴上)，同时将3D打印机的出口连接同轴打印喷头上。
上述步骤可以将第二混合溶液放置在4℃冰箱中进行冷凝，待第二混合溶液处于凝胶状态，以得到第二凝胶材料。
在一个示例中，以明胶作为牺牲层，GelMA作为基体材料为例，首先可以将明胶按质量浓度5％配置成溶液，然后将载有内皮细胞的细胞悬液与明胶溶液置于注射器中，放置在恒温搅拌器上均匀混合，GelMA与组织细胞(MC3T3-E1)同样操作混合，最后将其放置在4℃冰箱中进行冷凝，待材料处于凝胶状态既可将其装入打印机Z轴上，同时出口连接同轴喷头上。
S30，启动制冷平台，将制冷平台的表面温度调整至第一设定温度，使同轴打印喷头能够稳定出丝；第一设定温度的取值范围为-2～37℃；比如第一设定温度可以取-2℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃或37℃等温度值。
具体地，上述步骤可以启动制冷平台，将平台表面温度控制在第一设定温度左右，同时进行同轴喷头的预挤出至能够稳定出丝即可。
具体地，第一设定温度的取值范围为2～20℃
优选地，上述第一设定温度可以设置为2℃。
S40，启动打印软件，使同轴打印喷头按照预定的路径轨迹根据待打印器官文件开始打印，使挤出的凝胶纤维在制冷平台上凝胶化，将凝胶纤维中的基体材料成分进行不可逆的固化，得到打印结构。
具体地，上述步骤可以启动打印软件，使同轴打印喷头按照预定的路径轨迹根据待打印器官文件开始打印，使挤出的凝胶纤维在制冷平台上凝胶化，得到打印的器官模型，用光照射打印的器官模型设定时长，将凝胶纤维中的基体材料成分进行不可逆的固化，得到打印结构；所述设定时长的取值范围为5～40s(比如设定时长可以取5s、10s、20s、30s、或40等等时长)。照射打印的器官模型的光可以为可见光、紫外光和蓝色光等，其中蓝色光的波长可以为405nm，蓝色光可以由蓝色光源发射，上述蓝色光源的波长可以为405nm，功率可以为100mw/cm2。
进一步地，若牺牲层为明胶，GelMA作为基体材料。上述步骤可以启动3D打印机的打印软件，对模型进行切片，然后开始打印，同轴喷头依据待打印器官文件按照预定的路径轨迹开始打印，由于明胶和GelMA按照冷凝特性，挤出的凝胶纤维在制冷平台上极速凝胶化，最后用405nm蓝色光照射打印的模型20s。将打印材料GelMA进行不可逆的光固化。
S50，将打印结构浸入到第二设定温度的培养基中，溶解在内层的牺牲材料，形成中空流道结构，同时内载的内皮细胞沉积并粘附在流到网络内壁，形成内皮化的血管网络结构；所述第二设定温度的取值范围为5～37℃；比如第二设定温度可选择5℃、8℃、10℃、15℃、20℃、30℃或37℃等温度值。
优选地，上述第二设定温度可以设置为37℃。
S60，对内皮化的血管网络结构进行动态培养，促进结构体内部的血管网络的重建，以得到血管化的三维组织结构体。
若第二设定温度可以设置为37℃，上述步骤将成型的结构体浸入到37℃培养基中，溶解在内层的牺牲材料，形成中空流道结构，同时内载的内皮细胞沉积并粘附在流到网络内壁，形成内皮化的血管网络结构。然后进行动态培养，促进结构体内部的血管网络的重建，这样血管化的三维组织结构体就已经构建完毕。
上述大块组织的生物3D打印方法，通过分别配置牺牲材料和基体材料，将配置后的牺牲材料和内皮细胞置于注射器中，放置在恒温搅拌器上均匀混合，得到第一混合溶液，将所述第一混合溶液冷凝至凝胶状态，得到第一凝胶材料，将配置后的基体材料与组织细胞混合，得到第二混合溶液，将第二混合溶液冷凝至凝胶状态，得到第二凝胶材料，将第一凝胶材料和第二凝胶材料装入3D打印机，同时将3D打印机的出口连接同轴打印喷头上，启动制冷平台，将制冷平台的表面温度调整至第一设定温度，使同轴打印喷头能够稳定出丝，再启动打印软件，使同轴打印喷头按照预定的路径轨迹根据待打印器官文件开始打印，使挤出的凝胶纤维在制冷平台上凝胶化，将凝胶纤维中的基体材料成分进行不可逆的固化，得到打印结构，再将打印结构浸入到第二设定温度的培养基中，溶解在内层的牺牲材料，形成中空流道结构，同时内载的内皮细胞沉积并粘附在流到网络内壁，形成内皮化的血管网络结构，然后对内皮化的血管网络结构进行动态培养，促进结构体内部的血管网络的重建，以得到保持流道有效性的血管化的三维组织结构体，其中将同轴打印和牺牲打印结合，打印三维结构，在成型后将牺牲材料从打印结构体中自动去除形成流道网络结构，牺牲材料和结构体材料协同相互促进各自的打印性能，保证了相应结构保证度和流道网络的完整性，有效地规避了传统3D生物打印技术制备的水凝胶结构体强度较差，无法有效构建组织和器官结构体模型的弊端。
在一个优选的方式中，步骤S10之前，还包括：
获取目标器官的CT(电子计算机断层扫描)数据或MRI(磁共振成像)数据，将CT数据或MRI数据转换成3D打印机可识别的格式文件，得到待打印器官文件。
上述目标器官可以为待打印器官对应的真实器官。
具体地，本实施例可以通过扫描一个真实器官得到CT或MRI数据，将数据通过专业软件转换成打印机可识别的格式文件，然后通过上位机软件控制3D打印机进行打印。
在一个优选的方式中，所述同轴打印喷头包括外喷头和内喷头。
作为一个优选的方式，所述外喷头的内径取值范围为0.6～3mm(如选择0.6mm、1.21mm、1.60mm、2.01mm、2.50mm或3mm等)，内喷头内径取值范围为0.15～0.5mm(如选择0.15mm、0.18mm、0.26mm、0.38mm、0.45mm或0.5mm等)。
优选地，外喷头的内径可达3mm，内喷头内径可达0.5mm。
在一个优选的方式中，所述制冷平台包括温度控制面板，温控系统，制冷结构；所述温度控制面板实时设读取温度设定指令，并将温度设定指令发送到温控系统；温控系统在接收温度设定指令进行制冷运作，制冷结构通过在制冷的过程中实现制冷板温度的调控同时将温度反馈给制冷系统，进一步反馈给温度控制面板进而实现温度的负反馈，从而达到温度的实时可调控。
具体地，制冷平台由可以包括温度控制面板，温控系统，制冷结构三大系统，能够通过温控面板进行实时的温度设定，并将指令发送到温控系统，温控系统在接收指令进行制冷运作，制冷结构通过在制冷的过程中实现制冷板温度的调控同时将温度反馈给制冷系统，进一步反馈给温控面板进而实现温度的负反馈，从而达到温度的实时可调控。
在一个优选的方式中，分别配置牺牲材料和基体材料的过程包括：
将牺牲材料的质量浓度配置为第一设定质量浓度，将基体材料的质量浓度配置为第二设定质量浓度；所述第一设定质量浓度的取值范围为4～60％(如第一设定质量浓度可选择4％、10％、20％、30％、40％、50％或60％等值)；所述第二设定质量浓度的取值范围为5～40％(如第二设定质量浓度可选择5％、10％、15％、20％、25％、30％或40％等值)。
具体地，第一设定质量浓度的取值范围为4～30％；所述第二设定质量浓度的取值范围为10-25％。
优选地，上述第一设定质量浓度可以为4％，第二设定质量浓度可以设为10％。
在一个优选的方式中，所述使挤出的凝胶纤维在制冷平台上凝胶化，将凝胶纤维中的基体材料成分进行不可逆的固化，得到打印结构包括：
将第二凝胶材料通入喷头外管道，将第一凝胶材料通入喷头内管道，将第一凝胶材料和第二凝胶材料从3D打印机的喷头挤出形成稳定的凝胶纤维，将凝胶纤维沉积至制冷平台进行凝胶化，对凝胶化后的凝胶纤维进行不可逆固化处理，得到打印结构。
相应地，大块组织的生物3D打印过程的核心原理可以包括：将内皮细胞混合在牺牲层材料，组织细胞混合在基体材料中，在3D打印过程中，利用同轴喷头按照预定路径轨迹进行同轴打印，其中基体材料通入喷头外管道，牺牲材料通入喷头内管道，从而两相材料从喷头挤出形成稳定的凝胶纤维，沉积至制冷平台进行凝胶化，再通过不可逆固化，得到稳定的打印结构，而后去除牺牲层材料，形成中空流道结构，其中的内皮细胞贴附至打印单元的内壁，经过动态培养，促进结构体内部血管化网络的形成，从而得到血管化的三维组织结构。
在一个优选的方式中，所述牺牲材料包括明胶溶液。相应地，上述基体材料可以包括GelMA。
在另一个优选的方式中上述牺牲材料包括明胶及其衍生物、F127等温敏材料。
实施例2：
本实施例2中，上述大块组织的生物3D打印方法在执行过程中所涉及的装置可以包括：受控的XYZ三个坐标轴的电机模组的生物3D打印机；同轴打印喷头，外喷头内径达3mm，内喷头内径达0.5mm；一套可实时控温的制冷平台；一套可控流速的注射泵系统。
具体地，实现上述大块组织的生物3D打印方法的装置可以包括：打印系统，制冷系统组成。上述打印系统可以参考图2所示，电机为普通的两相四线步进电机是通过同轴通过模组电机座，二者通过四个螺丝固定联接，限位开关通过两个螺丝固定在电机侧的模组电机座上，用于实现定位控制和终端限位保护。一旦电机运动到零位时，限位开关开启，停止其运动，这样能够保证机构不会接着运动，出现机构损坏的可能。
图3为同轴打印载内皮细胞的明胶示意图，图4为载组织细胞的GelMA示意图。为能够实现凝胶中空纤维的打印，首先需要完成三维打印装置的配备，改装现有实验室的打印装置，即在原有控制精度不变的挤出上，在挤出方式上选择使用注射泵装置，来单独控制凝胶纤维的挤出任务，更好兼容本实验，同时对打印机控制软件进行二次开发的编写以完成整个工艺两组分材料打印的进行，对打印路径进行优化。同时为了简化中空纤维的打印工艺，设计了同轴喷头。
制冷平台包括：温度控制面板，温控系统电路，机械结构三大系统，能够通过温控面板进行实时的温度设定，并将指令发送到温控系统，温控系统在接收指令进行制冷运作，水冷结构通过在制冷的过程中实现制冷板温度的调控同时将温度反馈给制冷系统，进一步反馈给温控面板进而实现温度的负反馈，从而达到温度的实时可调控。
在打印方法上为了更好地组织结构的打印，其材料的杨氏模量，及其强度的研究必不可少，故需要探究整个过程中中空凝胶纤维内外径的尺寸对其影响，那么选择两大工艺参数即各材料的浓度配比和内外通道流道的配比对尺寸的影响。
这样的三维结构达到生物结构所需的结构强度，进而利于后续的细胞培养，为了得到不同孔隙率的结构可以通过控制牺牲材料和打印材料的流速以及喷头的大小来保证。
根据图5所示，基于中空打印单元的同轴生物结构体打印，可以很好地按照模型进行打印，很好地保证了整体打印的保真度，同时通过电镜下的切片图，可以很清晰看出结构体内布满了营养网络，呈现多孔贯通的结构，这样的结构特征为细胞生长，血管形成提供营养输送通道。
根据图6所示，血管内皮细胞沉积并粘附在血管流道上，经过短时间动态培养后，血管内皮细胞铺满血管流道形成内皮管腔。随着进一步的长时间动态培养，内皮管腔向打印的组织结构内部出芽，产生血管新生，并促进组织结构内部的细胞功能化。
根据图7所示，基于凝胶中空单元的多功能同轴多组分打印，如图所示，喷头可以通过经过改装，通入多组分，这样即可完成多组分的打印。可以按照预定模型进行多组分的打印，进而扩展多功能组织结构，电镜图下可以清晰表明细胞在多组分结构体内进行生长增殖，进而组成有功能的结构组织。所述的牺牲材料明胶所占的质量浓度为5％，打印材料GelMA所占的质量浓度为5％。其中打印期间温度保持在2℃，之后浸泡溶解的温度保持在37℃。相应的浸泡时间为3h。
与现有技术相比，本实施例的优点包括：
1.本实施例利用同轴喷头同时打印多种材料，利用牺牲层材料强度支撑保证在打印过程中强度得到保证，有效地解决了其他发明工艺上打印过程中出现坍塌的现象，同时保证了流道网络的完整性。
2.本实施例利用同轴喷头外喷头打印出细胞载体材料GelMA，拥有良好的生物兼容性，能够很好保证细胞在其中的存活率和基本功能。
3.采用传统的模具浇筑成型技术制备得到的水凝胶材料特征取决于所使用的模具，而且内部营养网络无法构建，水凝胶材料形状较为单一，无法制备较为精细的水凝胶材料。本发明则利用三维建模，通过3D同轴打印技术，可制备得到任意尺寸的中空结构。这也是本发明的一大亮点之一。
4.传统制造的流道内皮化基本采用灌注的方式，灌注方式效果有限，而且复杂流道难以内皮化。本实施例采用内在内皮细胞的牺牲材料，让内皮细胞自沉积并粘附在流道内壁，进而形成内细化流道网络，实现真正意义的内皮化血管，这种方式内皮化更有效，能实现任意复杂形状流道的内皮化。
在一个示例中，结合图3和图4，以同轴打印载内皮细胞的明胶和载组织细胞的GelMA为例，上述大块组织的生物3D打印方法具体操作如下：
对于中空三维结构的打印，将相应的组织细胞和内皮细胞置于聚苯乙烯组织培养瓶中于37℃，5％CO2中培养，每4天传代一次，每隔一天换一次培养基。为了制备用于打印的载细胞溶液，使用PBS制备了含0.5％(w/v)LAP的5％(w/v)明胶溶液和5％(w/v)GelMA溶液。将具有90％细胞饱和度的培养瓶用PBS洗涤，并在5％CO2中于37℃与0.25％胰蛋白酶-EDTA消化3分钟，以使细胞脱离培养瓶。将细胞悬液在室温下以1,000rpm离心5分钟，弃去上清液，并将相应的细胞重悬于5％(w/v)明胶溶液和5％(w/v)含0.5％(w/v)的GelMA溶液中w/v)LAP。将相应的细胞悬液装入注射器中，并置于-20℃，5分钟，制备成可以打印的预凝胶化生物墨水，期间20s翻转一次注射器，以防止细胞沉淀，均匀混合细胞。
将载有细胞的预凝胶化生物墨水泵入同轴喷嘴，并将其打开制冷设备进行预冷和紫外发射器预热机器。等机器预备完成后整个准备过程都已完成，此时就可以准备打印。开启3D打印机，运行上位机软件，通过串口模式调整预先设定的串口号和波特率，实现上位机软件与三维移动装置的通信连接。将机器全部回零，机器回到零位为了能够保证后续运动定位的精度。期间限位开关起到了保护机构的作用。将模型导入上位机软件中，进行模型切片，切片完成的模型已经被分割成一套打印流程。
开启打印，置于Z轴上的材料即可在规划的路径下进行边运动边打印，打印出的凝胶材料因为下方的制冷平台的制冷效果，迅速冷凝成型，期间打开紫外发射装置照射打印模型15秒，方便细胞载体材料GelMA能够发生不可逆的光固化反应。在此期间可通过上位机控制牺牲材料明胶和GelMA的流速，以达到控制不同中空度的细胞模型，最后打印完毕，即可将打印完成的模型至于温度为37℃的培养基下，牺牲层材料在37℃下即可分解，内含的内皮细胞在明胶溶液后自动沉积吸附在管道纤维的内壁上，与组织细胞一同动态培养，进而促进整个结构体的血管网络形成，整个模型即可完成基于中空水凝胶大块组织结构体的构建。
对于细胞形态分析：通过对F-肌动蛋白和细胞核染色来确定细胞骨架的变化，从而表征细胞骨架。按照制造商的说明，分别用TRITC鬼笔环肽和DAPI对F-肌动蛋白和细胞核进行染色。首先，将充满细胞的构建体均匀切成四等分，并在PBS中洗涤，并在4％多聚甲醛中固定40分钟。然后，用PBS洗涤充满细胞的构建体，并用0.5％Triton X-100透化10分钟。然后，用PBS洗涤载有细胞的构建体，并在黑暗中用TRITC鬼笔环肽(0.1μM，YEASEN BioTECHCo.，Ltd。，上海，中国)染色45分钟。再次用PBS洗涤载有细胞的构建体，并用DAPI(10μg/ml；Solarbio，北京，中国)染色10分钟。最后，将载有细胞的构建体在PBS中洗涤，并在共聚焦荧光显微镜(OLYMPUS FV3000)下成像。即如图6所示的效果图。
本示例提供了一种多孔结构的全新制备方法，相比于一般的凝胶材料拥有强度更高的三维结构，所有的组织工程支架都不可避免地拥有一个共同的缺点，即难以实现细胞密度，细胞种类的空间分布可控，也难以实现细胞的三维环境生长，但本示例提出的打印工艺方法却很好地解决了上述问题，将细胞混合凝胶及生长因子制成生物墨水，利用3D打印的技术定向控制细胞沉积，但由于生物打印中通常采用水凝胶材料，故其强度难以达到组织工程支架的水平。本示例将组织工程结构和生物打印技术结构起来，既可以制造出高强度组织结构。又可以实现细胞的可控沉积并营造三维的细胞培养环境，便可以满足目前复杂三维载细胞结构的要求。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
需要说明的是，本发明实施例所涉及的术语“第一\第二\第三”仅仅是区别类似的对象，不代表针对对象的特定排序，可以理解地，“第一\第二\第三”在允许的情况下可以互换特定的顺序或先后次序。应该理解“第一\第二\第三”区分的对象在适当情况下可以互换，以使这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。
本发明实施例的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或模块的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤或模块，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或模块。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种大块组织的生物3D打印方法，其特征在于，包括如下步骤：
S10，分别配置牺牲材料和基体材料，将配置后的牺牲材料和实现血管化的细胞置于注射器中，放置在恒温搅拌器上均匀混合，得到第一混合溶液，将所述第一混合溶液冷凝至凝胶状态，得到第一凝胶材料；
S20，将配置后的基体材料与组织细胞混合，得到第二混合溶液，将第二混合溶液冷凝至凝胶状态，得到第二凝胶材料，将第一凝胶材料和第二凝胶材料装入3D打印机，同时将3D打印机的出口连接同轴打印喷头上；
S30，启动制冷平台，将制冷平台的表面温度调整至第一设定温度，使同轴打印喷头能够稳定出丝；所述第一设定温度的取值范围为-2～37℃；
S40，启动打印软件，使同轴打印喷头按照预定的路径轨迹根据待打印器官文件开始打印，使挤出的凝胶纤维在制冷平台上凝胶化，将凝胶纤维中的基体材料成分进行不可逆的固化，得到打印结构；
S50，将打印结构浸入到第二设定温度的培养基中，溶解在内层的牺牲材料，形成中空流道结构，同时内载的实现血管化的细胞沉积并粘附在流到网络内壁，形成内皮化的血管网络结构；所述第二设定温度的取值范围为5～37℃；
S60，对内皮化的血管网络结构进行动态培养，促进结构体内部的血管网络的重建，以得到血管化的三维组织结构体。
2.根据权利要求1所述的大块组织的生物3D打印方法，其特征在于，步骤S10之前，还包括：
获取目标器官的CT数据或MRI数据，将CT数据或MRI数据转换成3D打印机可识别的格式文件，得到待打印器官文件。
3.根据权利要求1所述的大块组织的生物3D打印方法，其特征在于，所述同轴打印喷头包括外喷头和内喷头。
4.根据权利要求3所述的大块组织的生物3D打印方法，其特征在于，所述外喷头的内径取值范围为0.6～3mm，内喷头内径取值范围为0.15～0.5mm。
5.根据权利要求1至4任一项所述的大块组织的生物3D打印方法，其特征在于，所述制冷平台包括温度控制面板，温控系统，制冷结构；所述温度控制面板实时设读取温度设定指令，并将温度设定指令发送到温控系统；温控系统在接收温度设定指令进行制冷运作，制冷结构通过在制冷的过程中实现制冷板温度的调控同时将温度反馈给制冷系统，进一步反馈给温度控制面板进而实现温度的负反馈，从而达到温度的实时可调控。
6.根据权利要求1至4任一项所述的大块组织的生物3D打印方法，其特征在于，S10所述分别配置牺牲材料和基体材料的过程包括：
将牺牲材料的质量浓度配置为第一设定质量浓度，将基体材料的质量浓度配置为第二设定质量浓度；所述第一设定质量浓度的取值范围为4～60％；所述第二设定质量浓度的取值范围为5～40％。
7.根据权利要求6任一项所述的大块组织的生物3D打印方法，其特征在于，所述第一设定质量浓度的取值范围为4～30％；所述第二设定质量浓度的取值范围为2-25％。
8.根据权利要求1至4任一项所述的大块组织的生物3D打印方法，其特征在于，S40所述使挤出的凝胶纤维在制冷平台上凝胶化，将凝胶纤维中的基体材料成分进行不可逆的固化，得到打印结构还包括：
将第二凝胶材料通入喷头外管道，将第一凝胶材料通入喷头内管道，将第一凝胶材料和第二凝胶材料从3D打印机的喷头挤出形成稳定的凝胶纤维，将凝胶纤维沉积至制冷平台进行凝胶化，对凝胶化后的凝胶纤维进行不可逆固化处理，得到打印结构。
9.根据权利要求1至4任一项所述的大块组织的生物3D打印方法，其特征在于，所述牺牲材料包括明胶及其衍生物或F127。
10.根据权利要求1至4任一项所述的大块组织的生物3D打印方法，其特征在于，所述第一设定温度的取值范围为2～20℃。
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