CN112912069A

CN112912069A - PPARδ激活剂

Info

Publication number: CN112912069A
Application number: CN201980069412.1A
Authority: CN
Inventors: 小椋利彦; 箱岛敏雄; 宫坂恒太; 久保纯
Original assignee: National Research And Development Corp Science And Technology Promotion Agency
Current assignee: National Research And Development Corp Science And Technology Promotion Agency; Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2021-06-04
Also published as: EP3871667A1; WO2020085393A1; US20220031666A1; JPWO2020085393A1; EP3871667A4; JP2023165025A; JP7397491B2; SG11202103984WA

Abstract

本发明提供一种以新型PPARδ(Peroxisome proliferator‑activatedreceptorδ)的激动剂作为有效成分的PPARδ激活剂以及以该PPARδ激活剂作为有效成分的运动耐受性改善剂。本发明为一种PPARδ激活剂以及运动耐受性改善剂，所述PPARδ激活剂以胍衍生物或双胍衍生物作为有效成分，激活PPARδ的转录活性；所述胍衍生物及所述双胍衍生物能够在胍基或双胍基与分别相当于构成PPARδ的配体结合口袋的内部表面的氨基酸残基中的人PPARδ的His413、His287、Thr253及Tyr437的氨基酸残基进行了氢键合的状态下嵌入所述配体结合口袋的内部；所述运动耐受性改善剂以所述任意PPARδ激活剂作为有效成分。

Description

PPARδ激活剂

技术领域

本发明涉及一种过氧化物酶体增殖物激活受体δ(peroxisome proliferator-activated receptorδ：PPARδ)的激活剂(也称为活化剂)。

本申请基于2018年10月23日在日本所申请的日本特愿2018-199523号主张优先权，将其内容引用至本文中。

背景技术

PPAR为核激素受体超家族之一，是配体诱导性的转录因子。在哺乳动物中，PPAR具有α、γ、δ三个家族成员。PPARα将游离脂肪酸作为内源性配体，调节与脂肪分解相关的各种基因的表达，故而被作为高脂血症改善药物的靶点。PPARγ以长链脂肪酸及前列腺素等作为内源性配体，促进脂肪细胞的分化，被作为胰岛素增敏剂噻唑烷的靶物质。PPARδ在各种组织中广泛表达，但证明其生理活性的内源性配体尚属未知，因而一般将其看做孤儿受体(orphan receptor)(例如，参见非专利文献1)。PPARδ由具有配体非依赖性转录激活能力的N-末端结构域(N-terminal domain)、具有DNA结合区的锌指结构域(Zinc finger domain)以及具有配体依赖性转录激活能力的配体结合结构域(Ligand binding domain：LBD)构成。PPARδ的LBD的氨基酸序列与PPARα的LBD具有70％的同源性(序列同一性)，并与PPARγ的LBD具有68％的同源性(序列同一性)(例如，参见非专利文献2)。

近年来，有报道称PPARδ是对于控制脂质代谢、运输及堆积等至关重要的转录调节因子(例如，参见非专利文献3)，其作为开发代谢异常等的治疗药物等的分子靶点备受关注。报道了例如：通过PPARδ的激动剂的摄取可以提高诸如运动耐受性等运动诱导型的效果；以及将PPARδ的激动剂作为运动能力改善药物(例如，参见专利文献1及非专利文献4)。另外，通过并用AMPK(5'AMP-activated protein kinase)的激动剂与PPARδ的激动剂，被测试者的运动效果更为提高(例如，参见专利文献2及非专利文献4)。此外还报道了：通过给药PPARδ的激动剂，能够抑制对心肌病的发病起到重要作用的脂质诱发性内质网(ER)应激(例如，非专利文献5)；以及针对通过给药四氯化碳所诱导的肝纤维化症，可以得到护肝效果及抗纤维化效果(例如，非专利文献6)。

作为PPARδ的激动剂，具有例如以GW501516(CAS No.:317318-70-0)为代表的苯氧乙酸(phenoxyacetic acid)衍生物。苯氧乙酸衍生物的基本骨架为羧基(-COOH)上结合有非极性烃等长链状的疏水性基团的化学结构。对PPARδ及作为其激动剂的苯氧乙酸衍生物的复合物的结构进行分析，结果判断，PPARδ的配体结合口袋是由被称为臂I、II、III(armI、arm II、arm III)的三个隧道形状的空腔构成的Y字型的口袋(例如，参见非专利文献7及8)。作为PPARδ的激动剂，还开发了诸如GW2331(CAS No.:190844-95-2)那样具有分支疏水性基团而成的骨架的药剂。

另一方面，二甲双胍(Metformin)为缩二胍(biguanide)类药剂的一种，被广泛用作口服糖尿病治疗药物。已知二甲双胍通过激活AMPK来控制骨骼肌中糖摄入的亢进及肝脏中的脂肪酸β氧化(例如，非专利文献9)。另外还报道了：在肝脏中抑制线粒体的Glycerophosphate dehydrogenase而限制糖原异生，进而降低血糖(例如，非专利文献10)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2010-514804号公报

专利文献2：日本特表2011-507970号公报

非专利文献

非专利文献1：Evans et al.,Nature Medicine 2004,vol.10(4),p.355-361.

非专利文献2：Willson et al.,Journal of Medicinal Chemistry,2000,vol.43(4),p.527-550.

非专利文献3：Barish et al.,The Journal of Clinical Investigation,2006,vol.116(3),p.590-597.

非专利文献4：Narkar et al.,Cell,2008,vol.134(3),p.405-415.

非专利文献5：Palomer et al.,International Journal of Cardiology,2014,vol.174,p.110-118.

非专利文献6：Iwaisako et al.,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,2012,vol.109(21),p.E1369-E1376.

非专利文献7：Xu et al.,Molecular Cell,1999,vol.3(3),p.397-403.

非专利文献8：Wu et al.,Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America,2017,vol.114(13),p.E2563-E2570.

非专利文献9：Zhou et al.,Journal of Clinical Investigation,2001,vol.108(8),p.1167-1174.

非专利文献10：Madiraju et al.,Nature,2014,vol.510(7506),p.542-546.

非专利文献11：Eikawa et al.,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,2015,vol.112(6),p.1809-1814.

非专利文献12：Sugden et al.,Pharmacological Research,2009,vol.60,p.141–150.

发明内容

发明想要解决的课题

本发明的主要目的在于提供一种以新型PPARδ的激动剂作为有效成分的PPARδ激活剂以及以该PPARδ激活剂作为有效成分的运动耐受性改善剂。

用于解决课题的手段

本发明人等进行了深入研究，结果发现，二甲双胍为PPARδ的激动剂，激活PPARδ的转录活性。此外，由二甲双胍与人PPARδ(hPPARδ)的LBD的共晶结构的分析结果发现，二甲双胍进入PPARδ的配体结合口袋，二甲双胍的缩二胍骨架的两个氨基与配体结合口袋的开口部附近的氨基酸残基相互作用并结合，由此PPARδ的LBD形成活性型的构象，从而完成了本发明。

即，本发明中的PPARδ激活剂及运动耐受性改善剂是下述[1]～[8]项所述的情形。

[1]一种PPARδ激活剂，其以胍衍生物或双胍衍生物作为有效成分，激活PPARδ(Peroxisome proliferator-activated receptorδ)的转录活性。

[2]如上述[1]的PPARδ激活剂，其中，所述胍衍生物及所述双胍衍生物能够在胍基或双胍基与分别相当于构成PPARδ的配体结合口袋的内部表面的氨基酸残基中的hPPARδ的第413位的组氨酸、第287位的组氨酸、第253位的苏氨酸以及第437位的酪氨酸的氨基酸残基进行了氢键合的状态下嵌入所述配体结合口袋的内部。

[3]如上述[1]或[2]的PPARδ激活剂，其中，所述胍衍生物是下列通式(1)所示的化合物，并且所述化合物不是双胍衍生物，式(1)中R¹表示一价有机基团。

[4]如上述[3]的PPARδ激活剂，其中，所述胍衍生物是下列通式(1-1-1)～(1-1-4)中任意之一所示的化合物，

式(1-1-1)及(1-1-2)中，Z¹¹表示氧原子或硫原子，n1表示0或1，R¹²表示碳原子数1～6的脂肪烃基，n12表示0～2的整数，R¹³表示氢原子或碳原子数1～6的脂肪烃基，R¹⁴表示任选取代的芳烃基，p1表示1以上的整数；

式(1-1-3)及(1-1-4)中，Z¹¹表示氧原子或硫原子，n1表示0或1，R¹⁵表示碳原子数1～6的脂肪烃基或烷氧基，n15表示0～2的整数，Z²表示二价的连接基团，R⁵表示任选取代的芳烃基或者任选取代的环烃基，p2表示1以上的整数。

[5]如上述[1]的PPARδ激活剂，其中，所述胍衍生物是下列式(A-1)～(A-4)、(B-1)～(B-3)中任意之一所示的化合物。

[6]如上述[1]～[3]中任意一种PPARδ激活剂，其中，所述双胍衍生物是下列通式(2)所示的化合物，

式(2)中，R²及R³分别独立地表示氢原子或一价有机基团；在R²及R³均为一价有机基团的情况下，两者能够通过连接而形成环结构。

[7]如上述[1]的PPARδ激活剂，其选自二甲双胍、苯乙双胍以及丁双胍构成的组中的一种以上作为有效成分。

[8]一种运动耐受性改善剂，其以上述[1]～[7]中任意一种PPARδ激活剂作为有效成分。

发明效果

本发明中的PPARδ激活剂能够激活PPARδ的转录活性，从而能够对通过PPARδ调节转录的各种生理作用产生影响。故而，该PPARδ激活剂能够用作运动耐受性改善剂的有效成分，并有望用作用于治疗或预防代谢异常等的药物组合物的有效成分。

附图说明

图1是hPPARδ的配体结合口袋的氨基酸序列。序列中，上部带有黑圈的氨基酸残基表示构成hPPARδ的配体结合口袋的内部表面的氨基酸残基，被方框包围的氨基酸残基是与胍衍生物中的胍基进行氢键合的氨基酸残基。

图2是示意性示出通式(1)所示的胍衍生物中R¹为沿箭头方向分支的有机基团的化合物与hPPARδ的结合体的结构的图。

图3为实施例1中二甲双胍向COOH FG微珠的固定化反应的示意图。

图4是在使用实施例1的Met-微珠进行亲和纯化时从Met-微珠溶出的上清(右图)与从NC-微珠溶出的上清(左图)的二维电泳后的凝胶的银染色图像。

图5是示出PPARδ的氨基酸序列与实施例1中由TOF-MS鉴定后的肽的氨基酸序列部分的图。

图6是实施例1中使用抗PPARδ抗体对向Myc-hPPARδ的纯化物及小鼠的肝脏提取液中添加Met-微珠而得到的免疫沉降物进行蛋白质印迹而得到的结果的图。

图7是示出实施例1中固定化于生物传感器的二甲双胍与连续稀释后的纯化Myc-hPPARδ的结合解离曲线的图。

图8是实施例1中所使用的PPARδ的全长及各变异体的示意图。

图9是示出实施例1中使用Met-微珠从分别强表达Myc-hPPARδ、Myc-ΔN-term以及Myc-ΔLBD的细胞的细胞提取液中得到的相对免疫沉降量(以细胞提取液中的带Myc标签的蛋白质量为100％时的相对量)的定量结果的图。

图10A是示意性示出PPARδ复合物(hPPARδ、PGC1α、RXRα)经由PPRE激活转录的机理与二甲双胍之间的关系的图。

图10B是示出实施例2中进行了二甲双胍处理或GW501516处理的细胞中的使用PPRE×2-tk-luciferase的萤光素酶测定的结果的图。

图11是示出实施例2中使用抗Myc抗体对经二甲双胍、GW501516或DMSO处理后的Myc-hPPARδ、RXRα及PGC1α的强表达细胞的细胞提取液进行免疫沉降而得到的PGC1α的免疫沉降量(免疫沉降物中PGC1α量与Myc-hPPARδ量之比：[PGC1α量]/[Myc-hPPARδ量])的测定结果的图。

图12是示出实施例3中通过低血清刺激诱导肌肉分化后的分化第6天的C2C12细胞中的经二甲双胍、GW501516或DMSO处理后的PPARδ的靶基因的相对表达量(将DMSO处理细胞的表达量设为1)的测定结果的图。

图13是示出实施例3中通过低血清刺激诱导肌肉分化后的分化第6天，使用抗FLAG抗体对经二甲双胍、GW501516或DMSO处理后的C2C12-PPARδ细胞进行染色质免疫沉降而得到的结果的图。

图14是示出实施性4中对添加了二甲双胍或GW501516的C2C12细胞的线粒体活性进行测定而得到的结果的图。

图15是实施例5中PPARδ-LBD与二甲双胍的复合物结晶(A)及PPARδ-LBD与苯乙双胍的复合物结晶(B)的显微镜照片。

图16是示出实施例5中PPARδ-LBD与二甲双胍的复合物结晶的结构的图。

图17是示出实施例5中PPARδ-LBD与二甲双胍的复合物结晶中的PPARδ-LBD的配体结合口袋中的二甲双胍分子的图。

图18是实施例5中将结合于PPARδ-LBD的二甲双胍与苯乙双胍的结构进行比较而得到的图。

图19是示出实施例6中各组从训练开始起经过各段时间后的电极接触次数(NOS)的测定结果的图。图19(A)为对照组(图中的“cont”)与二甲双胍给药组(图中的“met”)的结果，图19(B)为训练组(图中的“cont+train”)与训练+二甲双胍给药组(图中的“met+train”)的结果。

图20是示出实施例7中PPARδ与二甲双胍的复合物结晶的结构中的、二甲双胍的胍基与PPARδ的配体结合口袋的内部表面的氨基酸残基之间的相互作用的图。

图21是示出实施例7中对二甲双胍、GW0742或GW501516与位于hPPARδ的配体结合口袋的七个氨基酸残基(Tyr437、Leu433、Met417、His287、Thr253、Gln250、Phe246)之间的相互作用能进行计算而得到的结果的图。

图22是示出实施例9中使用PPRE×2-tk-luciferase对进行了化合物(A-4)处理的细胞进行萤光素酶测定而得到的结果的图。

图23A是示出了实施例10中进行了化合物(A-4)或GW0742处理的细胞中的angptl4基因的相对表达量的测定结果的图。

图23B是示出了实施例10中进行了化合物(A-4)或GW0742处理的细胞中的pdk4基因的相对表达量的测定结果的图。

图23C是示出了实施例10中进行了化合物(A-4)或GW0742处理的细胞中的cpt1a基因的相对表达量的测定结果的图。

具体实施方式

PPARδ由具有配体非依赖性转录激活能力的N-末端结构域(N-term结构域)、具有DNA结合区的锌指结构域以及具有配体依赖性转录激活能力的配体结合结构域(LBD：Ligand binding domain)构成。LBD由12个α-螺旋和3个β-折叠构成，配体结合口袋(Ligandbinding pocket)由第3个至第8个α-螺旋构成。图1示出了hPPARδ的配体结合口袋的氨基酸序列。在图1所示的氨基酸序列中，构成配体结合口袋的内部表面的是下列33个氨基酸残基：Asn191、Met192、Ile213、Leu219、Glu223、Trp228、Val245、Phe246、Arg248、Cys249、Gln250、Thr252、Thr253、Glu255、Thr256、Glu259、His287、Ile290、Phe291、Leu294、Ile297、Leu303、Val305、Ala306、Asn307、Val312、Phe316、Leu317、Ile327、Ile328、His413、Met417、Leu433、Tyr437。

通过研究hPPARδ与GW501516的复合物的结构明确了如下内容。GW501516等苯氧乙酸衍生物通过其羧基与PPARδ的配体结合口袋的入口(臂I)的氨基酸残基形成多个氢键而特异性结合。PPARδ的第12个α-螺旋(螺旋-12)通过该结合而倾倒而对配体结合口袋加盖子，剩余的疏水性基团嵌入非极性口袋中。通过使该倒下的螺旋-12形成配体结合口袋的盖子而激活PPARδ的转录活性(非专利文献7及8)。

本发明中的PPARδ激活剂是一种激活PPARδ的转录活性的药剂，以胍衍生物或双胍衍生物作为有效成分。胍衍生物表示具有胍基的化合物。双胍衍生物是指具有双胍基的化合物。本发明中的PPARδ激活剂的有效成分可以是具有双胍基的胍衍生物，也可以是具有胍基的双胍衍生物。

本发明中的PPARδ激活剂嵌入配体结合口袋，通过PPARδ的配体结合口袋的入口(臂I)的氨基酸残基与胍基或双胍基形成多个氢键，从而使螺旋-12以对配体结合口袋加盖子的方式倾倒。本发明中的PPARδ激活剂能够仅由胍基或双胍基实现激活PPARδ的转录活性所需的结构变化(螺旋-12的倾倒及固定化)。

具体而言，本发明中的PPARδ激活剂的胍基或双胍基与分别相当于构成PPARδ的配体结合口袋的内部表面的氨基酸残基中的hPPARδ的第413位的组氨酸(His413)、第287位的组氨酸(His287)、第253位的苏氨酸(Thr253)以及第437位的酪氨酸(Tyr437)的氨基酸残基进行氢键合。本发明中的PPARδ激活剂通过这些氢键被配置在PPARδ的配体结合口袋的入口。由此，螺旋-12倒下并以对配体结合口袋加盖子的状态被固定，进而激活PPARδ。

本发明中的PPARδ激活剂的胍基或双胍基也与分别相当于构成PPARδ的配体结合口袋的内部表面的氨基酸残基中的hPPARδ的第246位的苯丙氨酸(Phe246)、第417位的蛋氨酸(Met417)、第433位的亮氨酸(Leu433)及第250位的谷氨酰胺(Gln250)的氨基酸残基相互作用。胍基或双胍基与PPARδ的配体结合口袋入口(臂I)的相互作用比经由羧基结合的苯氧乙酸衍生物更稳定，能够更高效地使螺旋-12倒下并将其固定，PPARδ的激活作用有望比苯氧乙酸衍生物更高。

本发明中的PPARδ激活剂的有效成分胍衍生物只要是能够在胍基与hPPARδ的His413、His287、Thr253及Tyr437形成氢键的状态下嵌入PPARδ的配体结合口袋的内部的化合物，则不受特别限定。同理，本发明中的PPARδ激活剂的有效成分双胍衍生物只要是能够在双胍基与hPPARδ的His413、His287、Thr253及Tyr437形成氢键的状态下嵌入PPARδ的配体结合口袋的内部的化合物，则不受特别限定。

“化合物嵌入配体结合口袋的内部”只要是该化合物收纳在配体结合口袋内即可，可以占据口袋整体，也可以仅占据口袋的一部分。本发明中的PPARδ激活剂的有效成分可以是仅占据PPARδ的臂I的局部或全部的化合物，也可以是仅占据PPARδ的臂I和臂II的局部或全部的化合物，还可以是仅占据PPARδ的臂I与臂III的局部或全部的化合物。另外，还可以是占据PPARδ的臂I和臂II的局部或全部及臂III的局部或全部的具备支链结构的化合物。

在本发明中的PPARδ激活剂的有效成分中，作为胍衍生物，可列举下列通式(1)所示的化合物(其中，双胍衍生物除外)(以下称为“化合物(1)”)。在本发明中的PPARδ激活剂的有效成分中，作为双胍衍生物，可列举例如下列通式(2)所示的化合物(以下称为“化合物(2)”)。通式(1)中，R¹表示一价有机基团。通式(2)中，R²及R³分别独立地表示氢原子或一价有机基团。需要指出，化合物(2)中，R²及R³均为氢原子的化合物是二甲双胍。

R¹、R²及R³的一价有机基团只要是使化合物整体能够在胍基或双胍基与相当于构成PPARδ的配体结合口袋的内部表面的氨基酸残基中的hPPARδ的His413、His287、Thr253及Tyr437的氨基酸残基形成形成氢键的状态下嵌入PPARδ的配体结合口袋的内部的大小及形状的有机基团，则不受特别限定。例如，该一价有机基团可以是酸性基团，也可以是碱性基团。另外，可以是亲水性基团，也可以是疏水性基团。

该一价有机基团可以是直链状，也可以是支链状，还可以具备环状结构。图2是示意性示出化合物(1)中R¹为沿箭头方向分支的支链状有机基团的化合物与PPARδ的结合体的结构的图。该分支的有机基团分别沿臂II和臂III延伸。

作为该一价有机基团，可列举例如：-(Z¹)-R⁴、(Z¹表示单键、氧原子、硫原子、-NH-、-N＝CH-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NH-或-NH-CO-。R⁴表示脂肪烃基、芳烃基或杂环基)、羧基、硝基、氰基、羟基、氨基等。

在R⁴为脂肪烃基的情况下，该脂肪烃基不受特别限定，可列举例如：碳原子数1～20的饱和或不饱和的烃基。该一价的脂肪烃基可以是链状烃基，也可以是环烃基。作为一价的链状烃基，具体而言，可列举：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基、异己基、2-乙基己基、正庚基、正辛庚基、正壬辛基、正癸基等。作为一价的环烃基，可列举：从环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷、环辛烷、金刚烷、双环戊二烯等的脂环式化合物中去除一个氢原子后的基团。这些脂肪烃基任选具有一个以上的取代基。作为取代基，可列举例如：卤素原子(氟原子、氯原子、溴原子、碘原子)、三氟甲基、羧基、硝基、氰基、羟基、氨基、酮基、烷氧基、芳烃基、杂环基、杂环连接基团等。作为芳烃基、杂环基，可列举与能够选作下述的R⁴的基团相同的基团。作为杂环连接基团，可列举与能够选作下述的一价有机基团的杂环连接基团相同的基团。另外，作为烷氧基，具体而言，可列举：甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、叔戊氧基、正己氧基、异己氧基等。在脂肪烃基具有芳烃基、杂环基或杂环连接基团作为取代基的情况下，该脂肪烃基优选为碳原子数1～6。

在R⁴为芳烃基的情况下，该芳烃基不受特别限定，可列举例如：从苯、萘、蒽、菲等芳香族环式化合物中去除一个氢原子后的基团。这些芳烃基任选具有一个以上的取代基。作为取代基，可列举例如：卤素原子、三氟甲基、羧基、硝基、氰基、羟基、氨基、酮基、烷氧基、脂肪烃基等。作为脂肪烃基，可列举与能够选作所述的R⁴的基团相同的基团。作为烷氧基，可列举与作为所述的脂肪烃基的取代基所列举的基团相同的基团。

在R⁴为杂环基的情况下，该杂环基不受特别限定，可列举例如下述杂环式化合物中去除一个氢原子后的基团：吡咯烷、吡咯、咪唑、吡唑、咪唑啉、三唑、四唑、噁唑、噻唑、四氢呋喃、呋喃、二氧戊环、四氢噻吩、噻吩等5元杂环式化合物；哌啶、吡啶、嘧啶、吡嗪、哒嗪、吗啉、噻嗪、噁烷、吡喃鎓离子、二噁烷、噻烷、噻喃等6元杂环式化合物；吲哚、异吲哚、苯并咪唑、嘌呤、苯并三唑、喹啉、异喹啉、喹唑啉、喹喔啉、噌啉、蝶啶、色烯、异色烯、氧杂蒽、咔唑、苯并-C-噌啉等缩合杂环式化合物等。这些杂环基任选具有一个以上的取代基。作为取代基，可列举例如：卤素原子、三氟甲基、羧基、硝基、氰基、羟基、氨基、酮基、烷氧基、脂肪烃基等。作为脂肪烃基，可列举与能够选作所述的R⁴的基团相同的基团。作为烷氧基，可列举与作为所述的脂肪烃基的取代基所列举的基团相同的基团。

该一价有机基团可以是两个以上环通过单键或二价的连接基团连接而成的基团(杂环连接基团)。该环不受特别限定，可以是脂环式化合物，也可以是芳香族环式化合物，还可以是杂环式化合物。另外，所连接的环可以相同种类的环，也可以是不同种类的环。具体而言，能够使用与前述的脂环式化合物、芳香族环式化合物或杂环式化合物相同的化合物。

在杂环连接基团中，作为将环彼此连接的二价的连接基团，可列举例如：二价的链状脂肪烃基、-O-、-S-、-NH-、-N＝CH-、-CO-及其中的两个以上结合而成的基团。该二价的链状脂肪烃基可以是直链状，也可以是支链状。另外，还可以是仅有饱和键构成的二价脂肪烃基，还可以是具有一个以上不饱和键的二价脂肪烃基。作为该二价的链状脂肪烃基，能够使用例如碳原子数1～10的亚烷基、亚烯基等。

作为二价的链状脂肪烃基、-O-、-S-、-NH-、-N＝CH-及-CO-中的两个以上结合而成的基团，可列举例如：-CO-O-，-O-CO-，-CO-NH-，-NH-CO-，-(CH₂)_n-O-(CH₂)_m-，-(CH₂)_n-S-(CH₂)_m-(n与m分别独立地为0以上，它们是满足n+m≥1的整数；需要指出-(CH₂)₀-表示单键)等。

通式(2)中，在R²及R³均为一价有机基团的情况下，两者能够通过连接而形成环结构。作为R²及R³连接所形成的环，可以是脂环式化合物，也可以是芳香环式化合物，还可以是杂环式化合物。作为脂环式化合物、芳香环式化合物、杂环式化合物，分别可列举与能够选作所述的R⁴的基团相同的基团。此外，这些环式化合物任选具有取代基。作为该取代基，可列举与能够选作所述R¹、R²及R³中的一价有机基团的基团相同的基团。

作为化合物(1)，可列举例如下列通式(1-1)所示的化合物(化合物(1-1))。

通式(1-1)中，Z¹¹表示氧原子或硫原子，n1表示0或1。

通式(1-1)中，R¹¹表示任选取代的碳原子数1～6的脂肪烃基、任选取代的芳烃基或者任选取代的杂环连接基团。作为任选取代的碳原子数1～6的脂肪烃基及任选取代的芳烃基，分别可列举与能够选作所述的R⁴的基团相同的基团。作为任选取代的杂环连接基团，可列举与能够选作所述的一价有机基团的杂环连接基团相同的基团。

作为化合物(1-1)，可列举例如：下列通式(1-1-1)所示的化合物(化合物(1-1-1))及通式(1-1-2)所示的化合物(化合物(1-1-2))。

通式(1-1-1)中，Z¹¹及n1与通式(1-1)相同。

通式(1-1-2)中，p1为1以上的整数，优选为1～6的整数，更优选为1～3的整数，特别优选1。

通式(1-1-1)及通式(1-1-2)中，n12表示0～2的整数。

通式(1-1-1)及通式(1-1-2)中，R¹²表示碳原子数1～6的脂肪烃基。作为该脂肪烃基，可列举与能够选作所述的R⁴的基团相同的基团。

通式(1-1-1)及通式(1-1-2)中，R¹³表示氢原子或碳原子数1～6的脂肪烃基。作为该脂肪烃基，可列举与能够选作所述的R⁴的基团相同的基团。

通式(1-1-1)及通式(1-1-2)中，R¹⁴表示任选取代的芳烃基。该芳香作为族烃基，可列举与能够选作所述的R⁴的基团相同的基团。

作为化合物(1-1-1)，优选下述化合物：Z¹¹为氧原子或硫原子，n1为1，n12为0或1，R¹²为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基或异己基，R¹³为氢原子、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基或异己基，R¹⁴为任选取代的苯基。其中，优选下述化合物：Z¹¹为氧原子或硫原子，n1为1，n12为0或1，R¹²为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基或叔丁基，R¹³为氢原子、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基或叔丁基，R¹⁴为不具有取代基的苯基或者具有一个或两个选自由卤素原子、三氟甲基及甲基构成的组中的取代基的苯基，更优选为下述化合物：Z¹¹为氧原子或硫原子，n1为1，n12为0或1，R¹²为甲基，R¹³为氢原子或甲基，R¹⁴为不具有取代基的苯基或者具有一个或两个选自由卤素原子、三氟甲基及甲基构成的组中的取代基的苯基。

作为化合物(1-1-2)，优选下述化合物：p1为1，n12为0或1，R¹²为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基或异己基，R¹³为氢原子、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基或异己基，R¹⁴为任选取代的苯基。其中，优选为下述化合物：p1为1，n12为0或1，R¹²为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基或叔丁基，R¹³为氢原子、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基或叔丁基，R¹⁴为不具有取代基的苯基或者具有一个或两个选自由卤素原子、三氟甲基及甲基构成的组中的取代基的苯基，更优选为下述化合物：p1为1，n12为0或1，R¹²为甲基，R¹³为氢原子或甲基，R¹⁴为不具有取代基的苯基或者具有一个或两个选自由卤素原子、三氟甲基及甲基构成的组中的取代基的苯基。

作为化合物(1-1-1)，可列举例如下列式(A-1)～(A-2)的化合物。作为化合物(1-1-2)，可列举例如下列式(A-3)～(A-4)的化合物。

作为化合物(1-1)，也可列举例如：下列通式(1-1-3)所示的化合物(化合物(1-1-3))及下列通式(1-1-4)所示的化合物(化合物(1-1-4))。

通式(1-1-3)中，Z¹¹及n1与通式(1-1)相同。

通式(1-1-4)中，p2为1以上的整数，优选为1～6的整数，更优选1～3的整数，特别优选1。

通式(1-1-3)及通式(1-1-4)中，n15表示0～2的整数。

通式(1-1-3)及通式(1-1-4)中，R¹⁵表示碳原子数1～6的脂肪烃基或烷氧基。作为该脂肪烃基，可列举与能够选作所述的R⁴的基团相同的基团。作为烷氧基，可列举与作为所述的脂肪烃基的取代基列举的基团相同的基团。

通式(1-1-3)及通式(1-1-4)中，Z²为二价的连接基团。作为该二价的连接基团，可列举与作为所述杂环连接基团中将环彼此连接的二价的连接基团所列举的基团相同的基团。作为化合物(1-1-3)及化合物(1-1-4)，优选Z²为-(CH₂)₂-、-(CH₂)₃-、-O-CH₂-、-CH₂-O-、-CH₂-O-CH₂-、-S-CH₂-、-CH₂-S-、-CH₂-S-CH₂-、-NH-CH₂-、-CH₂-NH-或-CH₂-NH-CH₂-的化合物。

通式(1-1-3)及通式(1-1-4)中，R⁵为任选取代的芳烃基或者任选取代的环烃基。作为任选取代的芳烃基，可列举与能够选作所述的R⁴的基团相同的基团。作为任选取代的杂环连接基团，可列举与能够选作所述的一价有机基团的杂环连接基团相同的基团。作为化合物(1-1-3)及化合物(1-1-4)，优选R⁵为任选取代的苯基或者任选取代的环己基的化合物。

作为化合物(1-1-3)，优选下述化合物：Z¹¹为氧原子或硫原子，n1为1，n15为0或1，R¹⁵为甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基或丙氧基，Z²为-(CH₂)₂-、-(CH₂)₃-、-O-CH₂-、-CH₂-O-、-CH₂-O-CH₂-、-S-CH₂-、-CH₂-S-、-CH₂-S-CH₂-、-NH-CH₂-、-CH₂-NH-或-CH₂-NH-CH₂-，R⁵为任选取代的苯基或者任选取代的环己基，更优选下述化合物：Z¹¹为氧原子或硫原子，n1为1，n15为0或1，R¹⁵为甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基或丙氧基，Z²为-(CH₂)₂-、-(CH₂)₃-、-O-CH₂-、-CH₂-O-、-CH₂-O-CH₂-、-S-CH₂-、-CH₂-S-或-CH₂-S-CH₂-，R⁵为不具有取代基的环己基、不具有取代基的苯基或者具有一个或两个选自由卤素原子、三氟甲基及甲基构成的组中的取代基的苯基。特别是，作为化合物(1-1-3)，优选下述化合物：Z¹¹为硫原子，n1为1，n15为0或1，R¹⁵为甲基或甲氧基，Z²为-O-CH₂-、-CH₂-O-或-CH₂-O-CH₂-，R⁵为不具有取代基的环己基或不具有取代基的苯基。

作为化合物(1-1-4)，优选下述化合物：p2为1，n15为0或1，R¹⁵为甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基或丙氧基，Z²为-(CH₂)₂-、-(CH₂)₃-、-O-CH₂-、-CH₂-O-、-CH₂-O-CH₂-、-S-CH₂-、-CH₂-S-、-CH₂-S-CH₂-、-NH-CH₂-、-CH₂-NH-或-CH₂-NH-CH₂-，R⁵为任选取代的苯基或者任选取代的环己基，更优选为下述化合物：p2为1，n15为0或1，R¹⁵为甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基或丙氧基，Z²为-(CH₂)₂-、-(CH₂)₃-、-O-CH₂-、-CH₂-O-、-CH₂-O-CH₂-、-S-CH₂-、-CH₂-S-或-CH₂-S-CH₂-，R⁵为不具有取代基的环己基、不具有取代基的苯基或者具有一个或两个选自由卤素原子、三氟甲基及甲基构成的组中的取代基的苯基。特别是，作为化合物(1-1-3)，可列举下述化合物：p2为1，n15为0或1，R¹⁵为甲基或甲氧基，Z²为-O-CH₂-、-CH₂-O-或-CH₂-O-CH₂-，R⁵为不具有取代基的环己基或不具有取代基的苯基。

作为化合物(1-1-4)，可列举例如：N-({4-[(苄氧基)甲基]苯基}甲基)胍溴化氢酸盐(PubChem CID:51131487)(以下称为化合物(B-1))、N-({3-[(环己氧基)甲基]苯基}甲基)胍碘化氢(PubChem CID:53598567)(以下称为化合物(B-2))及N-{[4-(苄氧基)-3-甲氧基苯基]甲基}胍碘化氢(PubChem CID:16261695)(以下称为化合物(B-3))等。

作为化合物(2)，可列举例如下列通式(2-1)所示的化合物(化合物(2-1))。

通式(2-1)中，R²¹及R²²分别独立地表示氢原子或者任选取代的碳原子数1～6的脂肪烃基。作为该脂肪烃基，可列举与能够选作所述的R⁴的基团相同的基团。

作为化合物(2-1)，可列举：二甲双胍、丁双胍(Buformin)、苯乙双胍(Phenformin)等。

PPARδ的配体结合口袋的结晶结构分析的结果已公开(非专利文献7或8)。故而，化合物(1)或化合物(2)是否为能够嵌入PPARδ的配体结合口袋的内部的大小及形状能够通过利用PPARδ的配体结合口袋的结构数据来进行判断。例如，hPPARδ的配体结合口袋的形状是将下述实施例5的表1～63中的数据录入分子图形软件PyMOL(https://www.pymol.org)中而绘制的三维结构体的形状。即，具备胍基和双胍基中的至少一者，且具有可内含于该三维结构体的形状的化合物包含在本发明中的PPARδ激活剂的有效成分中。

通过将本发明中的PPARδ激活剂导入表达PPARδ的细胞内，能够激活该细胞内的PPARδ的转录活性。由本发明中的PPARδ激活剂处理的细胞可以是存在于体内的细胞，也可以是在培养容器内培养的细胞。在待处理细胞是正在培养容器内培养的细胞的情况下，通过将该细胞在包含PPARδ激活剂的培养基中进行培养，能够利用胞吞作用使该PPARδ激活剂摄入细胞内。此外，也可以通过脂质体转染法、磷酸钙沉淀法、醋酸锂法、电穿孔法等公知的导入方法使PPARδ激活剂导入细胞内。

在通过PPARδ激活剂处理的细胞为动物体内的细胞的情况下，将PPARδ激活剂给药于动物的给药途径不受特别限定。例如，作为本发明中的PPARδ激活剂的给药途径，可列举：口服给药、静脉给药、腹膜内给药、灌肠给药等。

对于本发明中的PPARδ激活剂所给药的动物不受特别限定，可以是人，也可以是除人以外的动物。作为非人动物，优选牛、猪、马、绵羊、山羊、猴子、狗、猫、兔子、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等家畜及实验动物。

本发明中的PPARδ激活剂能够通过常用的方法制成散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、咀嚼剂、缓释剂等口服用固体剂、溶液剂、糖浆剂等口服用液剂、注射剂、灌肠剂、喷雾剂、贴剂、软膏剂等制剂。可以根据制剂方面的需要，配合赋形剂、结合剂、润滑剂、崩解剂、流化剂、溶剂、溶解辅助剂、缓冲剂、悬浮剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂、矫味剂、着色剂等并通过常规方法来制成制剂。

本发明中的PPARδ激活剂的给药量只要是足以使给药后的细胞的PPARδ的转录活性比给药前更强的量即可，考虑到待处理动物的物种、性别、年龄、体重、用法(给药途径、剂型、每天的给药次数等)等适当决定。例如，对于成人(体重60kg)的有效成分的每天给药量以PPARδ激活剂的有效成分计(胍衍生物或双胍衍生物)优选0.01mg～10g，更优选1mg～5mg，进一步优选100mg～1g。能够将这样的给药量一次或者分多次给药。

本发明中的PPARδ激活剂适合作为用于治疗或预防有望通过激活PPARδ的转录活性而获得治疗效果的各种疾患的药物组合物的有效成分。作为该疾患，可列举例如：糖尿病、肥胖等各种代谢异常疾患，心肌病等因ER应激而产生的疾患，肝纤维化症等。

与其它PPARδ激动剂相同地，本发明中的PPARδ激活剂可以用作运动耐受性改善剂的有效成分。通过PPARδ激活改善运动耐受性表示，改善运动耐受性，抑制运动后的疲劳，同时增大可能的运动量，并且增大一定的运动量所带来的效果。通过服用运动耐受性改善剂，与未服药的状态相比能够更长时间进行同等负荷的运动，并且能够提高该运动带来的效果。其结果，有望改善肥胖、糖尿病等生活习惯病。此外，提高运动效果可望有助于增进健康。包含本发明中的PPARδ激活剂的运动耐受性改善剂优选进而含有AMPK或者并用AMPK。

若PPARδ活性提高，则线粒体活性也提高。故而，本发明中的PPARδ激活剂作为用于治疗或预防有望通过提高线粒体活性获得治疗效果的各种疾患的药物组合物的有效成分是优选的。例如，若线粒体活性提高，则免疫细胞被激活，由此，本发明中的PPARδ激活剂作为免疫刺激剂是有效的，能够作为用于免疫疗法的药物组合物的有效成分。另外，与二甲双胍(非专利文献11)相同，本发明中的PPARδ激活剂对于与免疫检查点抑制等癌免疫治疗药物的并用也是有效的。

实施例

接着，通过实施例等对本发明进行更详细说明，但本发明并不受这些例子限定。

[实施例1]

通过使用固定有二甲双胍的FG beads(注册商标)的亲和纯化法探索二甲双胍在体内的靶分子。探索二甲双胍的靶点时，使用来自人肝癌的细胞株HepG2细胞的细胞提取液。

＜Met-微珠的制作＞

制作固定化有二甲双胍的FG beads(以下称为“Met-微珠”)。固定化方法遵循COOHFG微珠的制造商所提供的流程来。具体而言，首先，使经N,N’-二甲基甲酰胺平衡的COOH FG微珠(多摩川精机制株式会社制造)的接头末端的羧酸与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行脱水缩合而得到NHS体。接下来，向得到的NHS体中添加二甲双胍，使二甲双胍的NH₂基与NHS酯进行反应，从而使COOH FG微珠的COOH基与二甲双胍的NH₂基进行酰胺结合而固定化。将二甲双胍向COOH FG微珠的固定化反应的示意图示于图3。COOH FG微珠中，未结合于二甲双胍的COOH基被氨基乙醇掩盖。掩盖后的Met-微珠经清洗后悬浮于50体积％甲醇水，用于之后的实验。

另外，作为对照，通过氨基乙醇掩盖COOH FG微珠，清洗后悬浮于50体积％甲醇水，并作为未固定二甲双胍的微珠(以下称为“NC-微珠”)用于之后的实验。

＜使用Met-微珠的亲和纯化＞

将所制作的Met-微珠悬浮于KCl缓冲液(100mM KCl、0.126g/mL甘油、20mM HEPES(pH7.9)、1mM MgCl₂、200μM CaCl₂、0.2mM EDTA、0.1％NP-40)之后，进行磁分离，丢弃上清。接下来，向该Met-微珠中加入200μL的KCl缓冲液，通过超声波分散装置使微珠分散之后，通过磁分离丢弃上清，反复进行该清洗处理3次。

用所述KCl缓冲液稀释来自人肝癌的细胞株HepG2细胞的细胞提取液，以使蛋白质浓度为3mg/mL，将得到的稀释液离心分离(5krpm/4℃/30分钟)，获取上清，由此去除不溶性组分。向该上清400μL中加入清洗后的Met-微珠并使之分散，利用4℃的旋转器翻转搅拌4小时使其进行反应。反应后，磁分离丢弃上清，向所回收的Met-微珠中加入200μL的KCl缓冲液，通过超声波分散装置使微珠分散之后，通过磁分离丢弃上清，反复进行该清洗处理4次。向清洗后的Met-微珠中加入40μL 2D样品缓冲液(60mM Tris-HCl(pH8.8)、7M Urea、2MThiourea、1％CHAPS、1％Triton X-100、1×protease inhibitor、10mM DTT、1×BPB)并搅拌，在室温下静置10分钟。然后，再加入4μL的丙烯酰胺水溶液(71mg/mL)使其悬浮，室温下静置10分钟之后，磁分离并回收上清。使用琼脂凝胶(PI：pH3-10，e-PAGEL，ATTO公司制造)对所回收的上清进行二维电泳，将电泳后的凝胶银染色，检测从Met-微珠溶出的蛋白质。针对未固定二甲双胍的NC-微珠也进行相同的实验，比较银染色后的凝胶，通过目测确认Met-微珠特异性显现的斑点。将从Met-微珠溶出的上清(右图)与从NC-微珠溶出的上清(左图)的二维电泳后的凝胶的银染色图像示于图4。

从Met-微珠溶出的上清的银染色图像中观察到特异性的两个斑点(图4中，箭头所示的斑点)，这两个斑点在从NC-微珠溶出的上清的银染色图像中是看不到的。分别切取回收这两个斑点的凝胶，并通过TOF-MS(飞行时间型质谱仪)进行分析。其结果，两个斑点的蛋白质均被鉴定为PPARδ(Peroxisome proliferator-activated receptorδ)。图5中示出hPPARδ的氨基酸序列(序列号1)与通过TOF-MS鉴定的肽的氨基酸序列。图5中，带有下划线的区域为通过TOF-MS所鉴定出的肽。通过TOF-MS所鉴定出的肽覆盖hPPARδ的全长的26％。

＜二甲双胍与PPARδ的利用免疫沉降法的结合实验＞

通过共免疫沉降法确认PPARδ与二甲双胍的结合。使用抗Myc抗体(sc-40，SantaCruz公司制造)，通过免疫沉降，从使来自人胎儿肾脏的细胞株HEK293细胞强表达带Myc标签的hPPARδ(Myc-hPPARδ)而成的PPARδ强表达细胞的细胞提取液中纯化出Myc-hPPARδ，并使用Met-微珠针对该Myc-hPPARδ与小鼠的肝脏提取液进行免疫沉降。

具体而言，首先，向纯化Myc-hPPARδ及小鼠的肝脏提取液中分别添加Met-微珠并翻转搅拌；然后，通过磁分离回收Met-微珠。使用识别内源性的PPARδ的抗PPARδ抗体(sc-74517，SantaCruz公司制造)对从所回收的Met-微珠溶出的蛋白质进行蛋白质印迹分析。将蛋白质印迹分析的结果示于图6。其结果，确认到Myc-hPPARδ与小鼠的肝脏提取液中的内源性PPARδ均与二甲双胍结合。

＜二甲双胍与PPARα的结合的验证＞

PPARδ为核内受体超家族之一，此外还具有家族成员α、γ。使用Met-微珠和HepG2细胞提取液进行亲和纯化，从而验证与内源性PPARα的结合。其结果，未确认到二甲双胍与PPARα结合。

＜二甲双胍与AMPK的结合的验证＞

已知二甲双胍通过激活AMPK(5’AMP-activated protein kinase)来控制骨骼肌中糖摄入的亢进及肝脏中的脂肪酸β氧化。因此，使用Met-微珠与HepG2细胞提取液进行亲和纯化，验证内源性的AMPK与二甲双胍的结合。其结果，未确认到二甲双胍与AMPK结合。

＜二甲双胍与PPARδ的亲和性的测定＞

使用分子间相互作用测定装置(产品名：BLItz(注册商标)，Pall ForteBio公司制造)测定二甲双胍与PPARδ的亲和性。使用固定化有二甲双胍的生物传感器与纯化Myc-hPPARδ，测量二甲双胍与Myc-hPPARδ的分子间相互作用。二甲双胍向分子间相互作用测定装置的生物传感器的固定化经由二甲双胍的NH₂基来进行。测定时，将Myc-PPARδ的浓度分为六个阶段稀释，通过global fitting计算由各浓度算出的平均分子间相互作用。将固定化在生物传感器上的二甲双胍与连续稀释后的纯化Myc-hPPARδ的结合解离曲线示于图7。图中，纵轴为Myc-hPPARδ蛋白质距固定化有二甲双胍的传感器前端的距离(nm)，作为Myc-hPPARδ蛋白质向传感器前端的结合量的指标。其结果，算得结合速率常数(ka)为3.40×10⁴M^-1S^-1，解离速率常数(kd)为1.03×10^-6S^-1，解离常数(KD)为3.30×10^-10M，确认到PPARδ牢固地结合于二甲双胍。

＜PPARδ上的二甲双胍的结合位点的鉴定＞

为了确定PPARδ上的二甲双胍的结合位点制作，PPARδ的缺失了N-term结构域的变异体(ΔN-term：缺失了第1～70位氨基酸区域的变异体)以及只具有第3位之前的LBD的α-螺旋，并完全缺失了配体结合口袋的变异体(ΔLBD：缺失了第237～441位氨基酸区域的变异体)。将PPARδ的全长及各变异体的结构的示意图示于图8(其中，N-terminal表示N-末端结构域，Zn finger表示锌指结构域，Ligand binding表示配体结合结构域)。

与强表达Myc-hPPARδ的PPARδ强表达细胞相同地，使用HEK293细胞制造强表达带Myc标签的ΔN-term(Myc-ΔN-term)的ΔN-term强表达细胞与强表达带Myc标签的ΔLBD(Myc-ΔLBD)的ΔLBD强表达细胞。使这些强表达细胞的细胞提取液(Lysate)分别与Met-微珠反应以进行亲和纯化，使用抗Myc抗体，对从所回收的Met-微珠溶出的蛋白质进行蛋白质印迹分析，并定量免疫沉降量。将定量结果示于图9。其结果，在将细胞提取液中的带Myc标签的蛋白质的量设为100％的情况下，作为结合于Met-微珠的带Myc标签的蛋白质的相对量(相对免疫沉降量)(％)，Myc-hPPARδ(Full)为约58％，Myc-ΔN-term为约34％，Myc-ΔLBD为0％(通过蛋白质印迹未确认到条带)。由这些结果可知，二甲双胍结合于PPARδ的LBD。

[实施例2]

PPARδ在核内与核内受体RXR(Retinoid X receptor)形成异源二聚体，并在PPARδ的配体存在下与转录激活因子PGC1α(peroxisome proliferative activated receptorgamma coactivator-1)结合，并且用作正转录调节因子。因此，进行萤光素酶测定，以对二甲双胍对PPARδ的转录控制产生的影响进行验证。

＜使用PPRE×2-tk-luciferase的萤光素酶测定＞

为了调查二甲双胍对PPARδ的转录激活，使来自人胎儿肾脏的培养细胞株HEK293细胞强表达RXRα及PGC1α以及人PPARδ。作为报告质粒，使用具有PPARδ/RXRα复合物所结合的两个DNA序列(PPAR-Response Element)的胸苷激酶启动子(tk)/萤光素酶基因报告质粒，并进行萤光素酶测定。作为PPARδ激活的阳性对照，使用作为PPARδ的激动剂的GW501516(GlaxoSmithKline公司制造)。将反应液的发光量与添加有等量的DMSO的反应液(对照)的发光量(Relative Light Unit；RLU)的比例作为相对活性值。

将萤光素酶测定的结果示于图10B。在PPARδ复合物(hPPARδ、PGC1α、RXRα)存在下，二甲双胍能够经由PPRE(PPAR-Response Element，也具有PPARδ结合序列的PPAR响应序列)浓度依赖地激活转录(图10A及B)。另外，该激活能力与GW501516程度相同。由这些结果确认到二甲双胍激活hPPARδ的转录。

＜利用共免疫沉降法测定PPARδ/PGC1α转录复合物的形成＞

已知PPARδ的激动剂通过结合于PPARδ的配体结合口袋以诱导形成与作为转录共轭因子的PGC1α的转录复合物而激活转录。因此，对经二甲双胍或GW501516处理的细胞的PPARδ/PGC1α转录复合物量进行定量。作为对照，进行DMSO(二甲基亚砜)处理。

首先，使用HEK293细胞制造强表达Myc-hPPARδ、RXRα及PGC1α的强表达细胞。将该强表达细胞用二甲双胍、GW501516或DMSO处理之后，制备细胞提取液。使用抗Myc抗体对得到的细胞提取液进行免疫沉降，使用抗PGC1α抗体(ab54481，Abcam公司制造)对得到的免疫沉降物进行蛋白质印迹，测定PGC1α的相对免疫沉降量之比例(PGC1α量与免疫沉降物(IPed)中的Myc-hPPARδ量之比例：[免疫沉降物中的PGC1α量]/[免疫沉降物中的Myc-hPPARδ量])。将结果示于图11。在二甲双胍处理细胞及GW501516处理细胞中，与DMSO处理细胞进行比较，观察到PGC1α的免疫沉降量增加。由此显示，二甲双胍结合于PPARδ的配体结合口袋，诱导形成与PGC1α的转录复合物。

[实施例3]

调查肌肉分化中二甲双胍对PPARδ的转录激活的影响。

＜PPARδ的靶基因的qPCR分析＞

对来自小鼠骨骼肌的成肌细胞株C2C12细胞进行低血清刺激以诱导肌肉分化，分化第6天，用100μM二甲双胍、1μM GW501516或DMSO进行处理。针对处理后的细胞，通过qPCR分析PPARδ的靶基因的表达。作为靶基因，测定angptl4基因、pdk4基因、plin基因及ucp3基因这四种基因。

将DMSO处理细胞的表达量设为1时的相对表达量的测定结果示于图12。其结果，虽然GW501516处理时靶基因诱导效率较差，但二甲双胍能够诱导PPARδ的靶基因的表达。

＜测定二甲双胍对PPARδ向PPRE的募集产生的影响＞

通过二甲双胍处理调查转录因子PPARδ是否向靶基因的启动子募集。

首先，制作使C2C12细胞始终表达带有FLAG标签的PPARδ(FLAG-PPARδ)的C2C12-PPARδ细胞。对C2C12-PPARδ细胞进行低血清刺激以诱导肌肉分化，分化第6天，用100μM二甲双胍、1μM GW501516或DMSO进行处理。针对处理后的细胞，使用识别FLAG标签的抗体进行染色质免疫沉降(Conventional ChIP)。

将通过染色质免疫沉降得到的免疫沉降物中的Angptl4基因、Pdk4基因、Plin2基因及Ucp3基因的DNA量(各IP中得到的染色质量与输入染色质量之比例：％)的相对值(将IgG对照的所述DNA量设为1)的测定结果示于图13。其结果显示，与通过基因表达所观察到的结果相同地，PPARδ通过二甲双胍处理或GW501516处理而募集至Angptl4基因、Pdk4基因、Plin2基因及Ucp3基因的启动子上的PPRE(PPAR响应区域)附近。

[实施例4]

已知PPARδ诱导脂质代谢相关基因的表达，特别是在骨骼肌中使脂肪酸的β氧化亢进。PPARδ激动剂有望具有提高线粒体活性的作用效果。因此，调查二甲双胍对代谢、特别是线粒体活性产生的影响。具体而言，使用C2C12细胞，通过细胞代谢测定装置(Agilemt公司制造的细胞外通量分析仪)测定细胞的耗氧速率(OCR：Oxygen Consumption Rate)。

在该代谢测定中，使用四种抑制剂，强制改变细胞内的代谢(图14)。首先，添加抑制电子传递系统的Complex V的Oligomycin。通过Oligomycin抑制ATP产生，OCR减少。接着，加入去耦剂FCCP(Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone)。FCCP将线粒体膜内的氢离子强制排出至膜外，消除质子浓度梯度。由于质子浓度梯度是产生ATP所必需的，故而若通过FCCP强制消除梯度，则TCA循环及电子传递系统被最大限度激活。由此，能够测定细胞的最大呼吸速率。已知在脂肪酸氧化亢进的细胞中，此时的OCR更为升高。最后加入Rotenone和Antimycin。Rotenone抑制电子传递系统的Complex I，Antimycin抑制Complex III。通过添加这些抑制剂，电子传递系统完全停止，细胞的OCR几乎为零。

向C2C12细胞中加入溶剂(DMSO)、100μM二甲双胍或10μMGW501516处理24小时，按照所述的顺序添加抑制剂，并测量OCR。将OCR的测定结果示于图14。其结果，抑制剂处理前的基础OCR(pmol/min)在二甲双胍处理与GW501516处理中均为产生变化。添加FCCP之后，与DMSO处理细胞相比，在二甲双胍处理细胞和GW501516处理细胞中观察到OCR升高(图14、箭头)。这表示二甲双胍也与GW501516相同地提高了线粒体的代谢活性(呼吸活性)。

[实施例5]

现有开发的以GW501516为代表的一系列PPARδ的合成激动剂(GW类药剂)为苯氧乙酸衍生物，以羧基(-COOH)上结合有非极性烃等的长链状疏水性基团的化学结构为基本骨架。而二甲双胍为缩二胍(biguanide)类药剂的一种，与现有的GW类药剂在化学结构上没有相似性，也不具有GW类药剂与PPARδ的配体结合口袋的特异性结合所必需的羧基及长链状的疏水性基团。另外，现有的GW类药剂的物性以酸性且非极性为特征，而二甲双胍是碱性且水溶性的。此外，现有的GW类药剂的分子的大小与PPARδ的配体结合口袋的大小相对应，但二甲双胍显著较小。例如，代表性的合成激动剂GW501516及GW2331的分子量为453.5和490.3，而二甲双胍为169.2，约三分之一。如此一来，二甲双胍与现有的以PPARδ为靶点的药剂均没有共通性，不能根据复合物结构已知的现有的激动剂来预测如何结合于PPARδ。因此，制作PPARδ的LBD与二甲双胍的复合物的结晶，并通过X射线结晶分析确定该复合物的三维结构。

＜PPARδ的LBD多肽的生成＞

对PPARδ的氨基酸序列的第170位谷氨酰胺至第441位酪氨酸(羧基末端、C端)的多肽(PPARδ-LBD)与二甲双胍的复合物的结晶结构进行分析。

如下制备PPARδ-LBD。首先，使大肠杆菌表达带有His×6标签的多肽之后，裂解并分别获取不溶性组分。将分别获取到的不溶性组分用可溶化溶液(20mM Tris-Cl(pH7.5)、2M尿素、2mM DTT、500mM NaCl、0.5％Tween20)可溶化，然后通过离心分离(25,000rpm，45分钟)获取上清。得到的上清进行透析去除尿素和Tween20之后，使用Ni-亲和柱(Ni-NTAAgarose，QIAGEN公司制造)进行纯化，然后用HRV3C切断His×6标签。使用Amicon(AmiconUltra tube截留分子量10,000，Merk Millipore公司制造)浓缩切断后的多肽之后，用经展开溶液(20mM TrisCl(pH7.5)，500mM NaCl，0.5mM Tris(2-carboxyethyl)phosphate(TCEP))平衡后的Superdex 75pg凝胶过滤柱(GE Healthcare公司制造)纯化。包含PPARδ-LBD的组分用Amicon浓缩至10mg/mL并作为结晶化的试样。通过质谱(MALDI-TOF MS，BrukerDaltonics公司制造)确认纯化试样为PPARδ-LBD，用液氮瞬间冷冻，在-80℃的低温下保存。

＜结晶的制备＞

通过吊滴式的蒸气扩散平衡法制作PPARδ-LBD与二甲双胍的复合物结晶。将二甲双胍盐酸盐(LKT Laboratories公司制造)溶解在蒸留纯化水中，制成100mM的二甲双胍水溶液，将该二甲双胍水溶液与纯化后的PPARδ-LBD试样混合，从而制备结晶化用试样溶液(PPARδ-LBD浓度为0.3mM，PPARδ-LBD:二甲双胍＝1：10(摩尔比)。结晶化时，将结晶化用试样溶液1μL与池液(40mM Bis-Tris-Propandiol(pH6.8)、10mM DTT、2.5％EDTA(1,2-Propanediol,1mM ethylenediaminetetraacetic acid)、0.5％HBDG(detergent n-Heptyl-β-D-thioglucoside)、200μM KCl、4％PEG8K)混合，在温度20℃下对池液进行蒸气平衡，经4天左右得到结晶。

将得到的PPARδ-LBD与二甲双胍的复合物结晶的显微镜照片示于图15(A)。图中，比例尺为100μm。作为该结晶的单位晶格常数，a为

b为

c为

α为98.07°，β为90.08°，γ为107.02°；其属于三斜晶系空间群P1。该结晶以30％甘油为防冻剂在液氮中瞬间冷冻。

＜三维结构坐标的获得＞

使用大型辐射光设施SPring-8的光束线BL41XU，在温度100K℃下利用MX300HE检测器收集X射线强度数据。通过X射线回折数据处理用软件(DENZO/SCALPACK，HKL2000程序)对所收集的X射线强度数据实施各种修正等，获得用于结构分析的X射线强度数据组(解析度：

)。作为结构分析，基于RCSB Protein Data Bank(Rutgers,UCSD)中所注册的PPARδ-LBD的公开结构(PDB编码：5U3Q)，使用程序(PHASER)，通过分子取代法确定初始位相。结构模型的修正及重构使用分子图形程序(COOT)来进行，并通过程序(PHENIX)实现精密化。反复进行以上模型修正及精密化，从而得到R-factor 18.4％、Free R-factor21.4％的复合物的原子模型。

针对PPARδ-LBD和苯乙双胍(phenformin)的复合物，也进行与二甲双胍相同的实验，得到与PPARδ-LBD和二甲双胍的复合物几乎相同晶型的结晶(单位晶格常数如下：a为

b为

c为

α为98.02°，β为90.03°，γ为107.08°；属于三斜晶系空间群P1)。将得到的结晶的显微镜照片示于图15(B)。图中，比例尺为100μm。

此外，使用二甲双胍复合物的PPARδ-LBD结构进行结构分析。其结果，得到解析度

R-factor19.3％、Free R-factor22.0％的复合物的原子模型。

＜PPARδ-LBD与二甲双胍的复合物结晶的三维结构数据＞

将PPARδ-LBD与二甲双胍的复合物结晶的结构示于图16。结晶中存在结构几乎相同的两个分子的PPARδ-LBD(图中分子A与分子B)，二甲双胍结合于位于各结构域中的配体结合口袋。用于结晶化的表面活性剂HBDG结合于各PPARδ-LBD的分子表面。

复合物结晶中的PPARδ-LBD的结构由15根α-螺旋(α-helix)H1-H12、H2’、H2”、H3’和3根β-链(β-strand)S1、S2、S3构成，3根β-链形成了一张反平行β-折叠(antiparallelβ-sheet)(图16)。分子的中心具有Y字型的配体能够结合于的空腔(配体结合口袋)。该整体结构与以往报道的PPARδLBD的基本结构大致相同(非专利文献7及8)。另外，与PPARα的LBD及PPARγ的LBD的结构也类似。

图17为示出复合物结晶中的配体结合口袋中的二甲双胍分子的图。图中，虚线表示氢键，所带有的数值表示距离。H3、H4、H11等表示形成配体结合口袋的α-螺旋。该配体结合口袋是Y字型，具有被称为臂I、II、III的三个隧道形状的空腔。二甲双胍分子结合于由α-螺旋H3、H4、H11及H12形成的臂I，二甲双胍的缩二胍骨架的两个氨基通过与α-螺旋的残基、Thr253(α-螺旋H3)、His287(α-螺旋H4)、His413(α-螺旋H11)及Tyr437(α-螺旋H12)分别直接形成氢键而被固定。激活PPAR所需的被称为AF-2片段(activation function-2segment)的肽区域(Leu429～Med441)形成α-螺旋H12并以对配体结合口袋加盖子的方式结合于LBD。这表示结合于二甲双胍的PPARδ的LBD形成了活性型的构象。该α-螺旋H12的形成是由上述的与二甲双胍的直接相互作用诱发的，因此，很好地对应了二甲双胍为PPARδ的激动剂。

除上述氢键等的极性相互作用之外，二甲双胍嵌入臂I的前端部的狭窄的空间内，由此除氢键之外全部的原子与PPARδ-LBD的原子接触，从而使结合稳定。二甲双胍的缩二胍骨架与Leu433、Phe246、Met417形成非极性接触。二甲双胍的两个甲基与Thr253、Phe291、Cys249、Ile327形成非极性接触。二甲双胍为小分子，不具有将PPARδ-LBD的配体结合口袋全部埋入的大小程度。二甲双胍的两个甲基的前端与臂II和臂III的空腔相连，但这些臂仍是空的。

在苯乙双胍与PPARδ-LBD的复合物的结构中同样观测到了上述的相互作用的特性。图18为二甲双胍与PPARδ-LBD的复合物结晶的结构和苯乙双胍与PPARδ-LBD的复合物结晶的结构重叠而成的图。图中，虚线表示氢键，所带有的数值表示距离。H3、H4、H11及H12表示形成配体结合口袋的α-螺旋。苯乙双胍的缩二胍骨架与二甲双胍的缩二胍骨架良好地重合，苯乙双胍也形成了与二甲双胍的四个氢键相同的氢键。苯乙双胍的苯基向疏水性的配体结合口袋的内部的宽大空间突出，但未与PPARδ进行紧密的非极性接触。

hPPARδ的配体结合口袋的形状能够通过向分子图形软件PyMOL中录入表1～63中的数据而绘制。

[表1]

[表2]

[表3]

[表4]

[表5]

[表6]

[表7]

[表8]

[表9]

[表10]

[表11]

[表12]

[表13]

[表14]

[表15]

[表16]

[表17]

[表18]

[表19]

[表20]

[表21]

[表22]

[表23]

[表24]

[表25]

[表26]

[表27]

[表28]

[表29]

[表30]

[表31]

[表32]

[表33]

[表34]

[表35]

[表36]

[表37]

[表38]

[表39]

[表40]

[表41]

[表42]

[表43]

[表44]

[表45]

[表46]

[表47]

[表48]

[表49]

[表50]

[表51]

[表52]

[表53]

[表54]

[表55]

[表56]

[表57]

[表58]

[表59]

[表60]

[表61]

[表62]

[表63]

[实施例6]

使用小鼠实施最终运动耐受性测试以验证二甲双胍是否能够改善运动耐受性。

对于二甲双胍给药而言，向腹腔内注射二甲双胍/PBS液(将二甲双胍溶解于PBS而得到的溶液)并且使小鼠的单位体重的二甲双胍给药量成为25mg/kg。相对于二甲双胍非给药组，向腹膜内给药等体积的PBS以替换二甲双胍/PBS液。

使用跑步机装置，按照15m/分钟的速度开始用于最终运动耐受性测试的训练，每10分钟按照1m/分钟提升速度，达到20m/分钟之后步行10分钟(合计1小时)，设置为这样的条件之后，每周5次、共计进行4周。二甲双胍给药每次下午10点进行，训练在给药12小时后(上午10点)开始，按照这样的流程进行。

首先，将20只10周龄的雄性C57BL/6小鼠分为4组(每组5只)。这4组中，对其中1组既不进行训练也不给药二甲双胍(以下称为“对照组”)，对其中1组不给药二甲双胍而仅进行训练(以下称为“训练组”)，对其中1组给药二甲双胍但不进行训练(以下称为“二甲双胍给药组”)，对剩余1组既给药二甲双胍也进行训练(以下称为“训练+二甲双胍给药组”)。需要指出，为了在各组中将小鼠个体对于运动的动力及运动的喜好平均化，在训练驯化之后进行最初的运动耐受性测试并排序，然后，以成绩平均的方式分为初始的4组。另外，在训练阶段后的测试中，将测试中的电极接触次数达到50次所需的时间(Number of Shocks:NOS50)设为跑步时间，从15m/分钟开始且每10分钟按照1m/分钟提升速度，并且达到最大速度30m/分钟之后使跑步一直持续至达到NOS50为止，评价运动耐受性。

将各组从训练开始起经过各个时间时电极接触次数(NOS)的测定结果示于图19。图19(A)中示出对照组(图中的“cont”)与二甲双胍给药组(图中的“met”)的结果，图19(B)中示出训练组(图中的“cont+train”)与训练+二甲双胍给药组(图中的“met+train”)的结果。如图19(A)所示，与对照组相比二甲双胍给药组未见运动耐受性提高，略微显示降低的趋势。与此相对，如图19(B)所示，训练+二甲双胍给药组显示出高于训练组的运动耐受性。由以上结果可知，单独给药二甲双胍不能提高运动耐受性，但在将二甲双胍给药与训练进行组合的情况下能够提高运动耐受性。

[实施例7]

利用二甲双胍/PPARδ的共晶结构的数据探索了新的PPARδ激活剂。

具体而言，基于二甲双胍/PPARδ的共晶结构的数据，进行二甲双胍与PPARδ之间的对接模式分析，对于公知的胍衍生物及双胍衍生物，考虑到溶剂效果而进行对接模式预测计算，由此探索与二甲双胍相同地能够嵌入配体结合口袋的内部的胍衍生物或双胍衍生物。基于Thermodynamic cycle计算结合自由能从而进行预测，使用分子动力学计算的轨迹提高精度(MM-PBSA：Molecular Mechanic/Poisson Boltzmann Surface Area，MM-GBSA：Molecular Mechanic/Generalized Born Surface Area)。

如图20所示，二甲双胍的胍基与位于hPPARδ的配体结合口袋的氨基酸残基相互作用并结合(将Tyr437、Leu433、Met417、His287、Thr253、Gln250、Phe246示于图中)。His413位于图中平面的前方，故未示出。另外，根据分子动力学的计算结果、溶剂条件等可知，能够与比图2所示的氨基酸残基更多的氨基酸残基进行相互作用。计算与各个氨基酸的相互作用能并与已知的PPARδ合成激动剂即GW类药剂中的GW501516及GW0742(CAS No.:317318-84-6)进行比较，将比较结果示于图21。如图21所示，与GW类药剂相同地，二甲双胍能够通过图中所示的结合能与位于hPPARδ的配体结合口袋的所述四个氨基酸残基结合。特别是关于Met417与Phe246的结合能，二甲双胍明显大于GW类药剂。这表示，二甲双胍比GW类药剂更稳定地固定于配体结合口袋入口，且螺旋-12的倾倒活性高，作为激动剂的活性高。

通过对接模式分析选拔出分子端具有胍基或双胍基，分子整体在该胍基等与hPPARδ的His413、His287、Thr253及Tyr437形成氢键的状态下进入hPPARδ的配体结合口袋内的化合物。所选拔出的化合物为PPARδ激活剂的候选化合物。

[实施例8]

调查化合物(1-1-4)中的化合物(B-1)、化合物(B-2)及化合物(B-3)对PPARδ的转录控制产生的影响。对经溶解于DMSO的各化合物10μM处理后的细胞进行萤光素酶测定，由此测定对于PPARδ的转录活性的影响。

具体而言，将来自非洲绿猴肾脏的培养细胞即CV1细胞接种于24孔板(1×10⁵细胞/孔)，培养至达到70％融合。培养用培养基使用含有10％胎牛血清及1％抗生素的DMEM。达到所需的细胞密度之后，去除全部培养基，然后，2μL的MH2004(编码上游具有Gal4激活序列的萤火虫萤光素酶基因的质粒：100ng/μL)、1μL的pRL-CMV(编码CMV启动子正向方的海肾萤光素酶基因的质粒：100ng/μL)、2μL的GAL4-Ppard(编码Gal4-DNA结合区与PPARδ基因的质粒：100ng/μL)及1.5μL的PEI(聚乙烯亚胺：invitrogen公司制造)混合于45μL的培养培养基“Opti-MEM(注册商标)”(Thermo Fisher Scientific公司制造)，将混合物添加在各孔中，培养36小时左右。然后，将培养基全部更换为包含针对二甲双胍等的PPARδ的转录激活能力进行调查的对象的待检物质的培养基，然后培养12小时。

然后，将所回收的细胞用细胞溶解缓冲液溶解之后，与发光底物(萤火虫萤光素)悬浮，用光度计测定悬浮液的发光。另外，使用剩余的悬浮液与海肾萤光素混和，用光度计测定发光量。将海肾的发光量的结果作为基因导入的内源性对照。最后，萤火虫萤光素的发光量除以海肾萤光素的发光量，作为发光强度(RLU)而算得。

将萤光素酶测定的结果(n＝3)示于表64。将添加有等量的DMSO的反应液(对照)的发光强度设为1，求得经各化合物处理的反应液的相对发光强度作为各化合物处理中的PPARδ的转录激活能力。添加有全部化合物的反应液中，相对发光强度为1.1以上，PPARδ的转录活性增大。其结果显示，这些化合物可以作为PPARδ激活剂。

[表64]

[实施例9]

合成化合物(1-1-2)中的化合物(A-4)(1-{4-[({2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]4-甲基噻唑-5-基}甲基)硫基]-2-甲基苄基}胍)，调查其对PPARδ的转录控制产生的影响。

＜化合物(A-4)的合成＞

(1)S-(4-氰基-3-甲基苯基)硫代乙酸酯的合成

将4-氟-2-甲基苯甲腈(CAS No.:147754-12-9，化合物1)(8g，59.2mmol)溶解于DMF(9mL)中，在室温、氮气氛下向得到的溶液中一次性加入Na₂S(5.08g，65.1mmol)。将该反应混合物搅拌过夜。得到的混合物冷却至0℃之后，滴加醋酸酐(9mL)，然后，在室温下搅拌1小时。随后，向该混合物中添加醋酸乙酯(100mL)和水(30mL)。将总量分层，并用饱和盐水(30mL×2)清洗有机层之后，用无水硫酸钠使其干燥。然后，在减压下去除溶剂，通过柱层析(硅胶、用己烷中的3％～40％醋酸乙酯溶出)纯化残渣，得到作为茶色油的标题化合物(1.4g，12.4％收率)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.62(d,J＝8.0Hz,1H),7.39(s,1H),7.33(dd,J＝8.0,1.1Hz,1H),2.56(s,3H),2.45(s,3H).

(2)4-[({2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]-4-甲基噻唑-5-基}甲基)硫基]-2-甲基苯甲腈的合成

使5-(氯甲基)-2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]-4-甲基噻唑(CAS No.317319-33-8，美国专利公开公报2003/0203947A1，化合物11)(2.23g，7.22mmol)，S-(4-氰基-3-甲基苯基)硫代乙酸酯(化合物2)(1.38g，7.22mmol)及碳酸钾(1.22g，8.66mmol)溶解在甲醇(20mL)中，将由此得到的溶液的混合物在室温下搅拌1小时。将得到的混合物在真空下过滤，回收滤饼将其溶解在二氯甲烷(200mL)中。用水(30mL)、盐水(30mL)清洗得到的有机物，并用无水硫酸钠干燥，减压下浓缩，得到作为白色固体的标题化合物(1.8g，收率59.1％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.72(dd,J＝13.8,9.8Hz,2H),7.67-7.61(m,1H),7.51(d,J＝8.1Hz,1H),7.22(s,1H),7.17(d,J＝8.2Hz,1H),4.32(s,2H),2.51(s,3H),2.43(s,3H).

MS-ESI(m/z)423.1[M+H]⁺.

(3)4-[({2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]-4-甲基噻唑-5-基}甲基)硫基]-2-甲基苯甲醛的合成

使4-[({2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]-4-甲基噻唑-5-基}甲基)硫基]-2-甲基苯甲腈(化合物12)(1.98g，4.69mmol)溶解在二氯甲烷(20mL)中，在0℃下向由此得到的溶液中滴加DIBAL-H(1.5M的甲苯溶液，4.69mL，7.04mmol)。将得到的反应混合物在0℃下搅拌1小时，然后用10％盐酸(34mL)淬灭。将得到的混合物剧烈搅拌30分钟。接着，用20％酒石酸钾钠(34mL)处理得到的混合物，再剧烈搅拌得到的混合物30分钟。通过15％氢氧化钠将反应混合物碱性化为pH9之后，用二氯甲烷(60mL×3)提取。将得到的有机层全部合并，用盐水(40mL)清洗，用无水硫酸钠干燥，减压下浓缩。用柱层析(硅胶，用己烷中的2％～10％醋酸乙酯溶出)纯化残渣，得到作为淡黄色固体的标题化合物(1.28g，收率64.0％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ10.19(s,1H),7.72(dd,J＝15.8,7.6Hz,3H),7.63(t,J＝7.6Hz,1H),7.24(s,1H),7.16(s,1H),4.35(s,2H),2.64(s,3H),2.45(s,3H).

MS-ESI(m/z)426.1[M+H]⁺.

(4){4-[({2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]-4-甲基噻唑-5-基}甲基}硫基)-2-甲基苯基}甲醇的合成

使4-[({2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]-4-甲基噻唑-5-基}甲基)硫基}-2-甲基苯甲醛(化合物13)(1.5g，3.53mmol)溶解在甲醇(15mL)中，在0℃下向由此得到的溶液中以少量逐步地添加硼氢化钠(NaBH₄)(295mg，7.76mmol)。将得到的混合物在0℃下搅拌30分钟。向该混合物中加入氯化铵水溶液(20mL)之后，用醋酸乙酯提取(60mL×2)。合并有机层，用盐水(20mL)清洗，用无水硫酸钠干燥，在减压下浓缩，得到作为淡黄色固体的标题化合物(1.45g，收率96.0％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.75-7.67(m,2H),7.65-7.59(m,1H),7.30(d,J＝7.7Hz,1H),7.19(d,J＝8.5Hz,2H),4.68(d,J＝5.4Hz,2H),4.21(s,2H),2.30(s,6H).

MS-ESI(m/z)428.1[M+H]⁺.

(5)5-({[4-(氯甲基)-3-甲基苯基]硫基]甲基}-2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]-4-甲基噻唑的合成

使{4-[({2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]-4-甲基噻唑-5-基}甲基)硫基]-2-甲基苯基}甲醇(化合物14)(1.45g，3.39mmol)溶解在二氯甲烷(14mL)中，并在0℃下向其中滴加DMF(1滴)及亚硫酰氯(0.37mL，5.09mmol)。将得到的混合物在0℃下搅拌1小时。向该混合物中添加水(10mL)，接下来分离有机层。所回收的有机层用盐水清洗，用无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩，得到作为黄色固体的标题化合物(1.47g，收率97.0％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.76-7.67(m,2H),7.62(t,J＝7.6Hz,1H),7.24(d,J＝7.9Hz,1H),7.19–7.12(m,2H),4.57(s,2H),4.23(s,2H),2.38(s,3H),2.32(s,3H).

MS-ESI(m/z)446.0[M+H]⁺.

(6)1,3-二-Boc-2-{4-[({2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]-4-甲基噻唑-5-基]甲基}硫基)-2-甲基苄基]胍的合成

在氮气氛、75℃下，将含有5-({[4-(氯甲基)-3-甲基苯基)硫基]甲基}-2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]-4-甲基噻唑(化合物15)(1.47g，3.3mmol)、1,3-双(叔丁氧基羰基)胍(CAS No.154476-57-0，化合物4)(1.28g，4.95mmoL)以及溶解于DMF(15mL)的碳酸钾(685mg，4.95mmol)的混合物加热1小时。接下来，用水(60mL)稀释该混合物。全部用醋酸乙酯(60mL×3)提取。合并全部回收的有机层，并用盐水清洗(30mL×2)，用无水硫酸钠干燥，在减压下浓缩。用柱层析(硅胶，用己烷中的1％～10％醋酸乙酯溶出)纯化残渣，得到作为淡绿色固体的标题化合物(1.6g，收率73％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.50(s,1H),9.35(s,1H),7.70(t,J＝10.1Hz,2H),7.62(t,J＝7.5Hz,1H),7.14-7.16(m,2H),6.90(d,J＝7.8Hz,1H),5.12(s,2H),4.19(s,2H),2.30(s,3H),2.25(s,3H),1.46(s,9H),1.22(s,9H).

MS-ESI(m/z)669.3[M+H]⁺.

(7)1-{4-[({2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]4-甲基噻唑-5-基}甲基)硫基]-2-甲基苄基}胍的合成

使1,3-二-Boc-2-{4-[({2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]-4-甲基噻唑-5-基}甲基)硫基]-2-甲基苄基}胍(化合物16)(800mg，1.2mmol)溶解在1,4-二噁烷(8mL)中后与HCl/1,4-二噁烷(4.0M，3.0mL)混合，将得到的混合物在50℃下搅拌2小时。接着，在减压下去除溶剂，使残渣溶解在甲醇(6mL)中，用碳酸钠水溶液将pH调节至8～9。向得到的混合物中添加水(15mL)，然后真空过滤。用水(10mL)清洗得到的滤饼，并在高真空干燥，得到作为白色固体的标题化合物(A-4)(350mg，收率62％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ7.92-7.84(m,3H),7.55-7.00(m,5H),4.48(s,2H),4.20(s,2H),2.31(s,3H),2.22(s,3H).

MS-ESI(m/z)469.2[M+H]⁺.

调查得到的化合物(A-4)对于PPARδ活性的影响。具体而言，将溶解于DMSO(0.1％)的化合物(A-4)作为试验物质添加在反应系中，除此之外，与实施例8相同地进行萤光素酶测定(n＝3)。将通过萤光素酶测定得到的相对转录激活能力的测定结果示于图22。其结果，观察到PPARδ的转录活性以取决于化合物(A-4)的添加量的方式增大的趋势。其中，添加量为50μM以上时，细胞死亡，无法测得PPARδ转录活性。由以上结果显示，化合物(A-4)能够成为PPARδ激活剂。

[实施例10]

调查化合物(A-4)对由PPARδ诱导表达的基因的表达产生的影响。具体而言，向来自小鼠骨骼肌的成肌细胞株即C2C12细胞中添加化合物(A-4)，测定由PPARδ诱导表达的基因中的angptl4基因、pdk4基因及cpt1a基因(非专利文献12)的表达量。另外，使用Hprt基因作为内源性对照，使用GW0742作为PPARδ激活的阳性对照。

首先，将C2C12细胞接种于24孔板(1×10⁵细胞/孔)，培养至80～90％融合。培养用培养基使用含有10％牛血清及1％抗生素的DMEM。培养36小时达到所需细胞密度之后，将全部培养基更换为包含各浓度的化合物(A-4)且不含血清的DMEM培养基，并培养16小时(n＝3)。培养之后丢弃培养基，然后直接向各孔中添加用于提取RNA的trizol试剂(invitrogen公司制造)，然后通过乙醇沉淀来提取总RNA。以得到的总RNA作为模板，使用逆转录酶“superscript”(biorad公司制造)合成cDNA。

以得到的cDNA为模板进行定量PCR。将作为模板的cDNA、用于扩增待测定的各基因的引物以及定量PCR用聚合酶混合物“ssoFast EvaGreen supermix”(biorad公司制造)混合，使用实时PCR检测系统“CFX connect(注册商标)”(biorad公司制造)进行分析。

各基因的表达量，根据所得到的基因表达数据通过除以内源性对照基因的表达量进行运算而得到相对表达量的方式来求出。

将结果示于图23A～C。其结果，在添加有10μM化合物(A-4)的细胞中，与添加有GW0742的细胞相同地，angptl4基因、pdk4基因及cpt1a基因的表达量增大。由该结果确认，化合物(A-4)具有激活PPARδ的转录活性的作用。

序列表

<110> 日本科学技术振兴机构

<120> PPARδ激活剂(PPARdelta-Agonist)

<130> PC-28795

<160> 1

<210> 1

<211> 441

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> PPARδ (PPARdelta)

<400> 1

Met Glu Gln Pro Gln Glu Glu Ala Pro Glu Val Arg Glu Glu Glu Glu

1 5 10 15

Lys Glu Glu Val Ala Glu Ala Glu Gly Ala Pro Glu Leu Asn Gly Gly

20 25 30

Pro Gln His Ala Leu Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asp Leu Ser Arg Ser

35 40 45

Ser Ser Pro Pro Ser Leu Leu Asp Gln Leu Gln Met Gly Cys Asp Gly

50 55 60

Ala Ser Cys Gly Ser Leu Asn Met Glu Cys Arg Val Cys Gly Asp Lys

65 70 75 80

Ala Ser Gly Phe His Tyr Gly Val His Ala Cys Glu Gly Cys Lys Gly

85 90 95

Phe Phe Arg Arg Thr Ile Arg Met Lys Leu Glu Tyr Glu Lys Cys Glu

100 105 110

Arg Ser Cys Lys Ile Gln Lys Lys Asn Arg Asn Lys Cys Gln Tyr Cys

115 120 125

Arg Phe Gln Lys Cys Leu Ala Leu Gly Met Ser His Asn Ala Ile Arg

130 135 140

Phe Gly Arg Met Pro Glu Ala Glu Lys Arg Lys Leu Val Ala Gly Leu

145 150 155 160

Thr Ala Asn Glu Gly Ser Gln Tyr Asn Pro Gln Val Ala Asp Leu Lys

165 170 175

Ala Phe Ser Lys His Ile Tyr Asn Ala Tyr Leu Lys Asn Phe Asn Met

180 185 190

Thr Lys Lys Lys Ala Arg Ser Ile Leu Thr Gly Lys Ala Ser His Thr

195 200 205

Ala Pro Phe Val Ile His Asp Ile Glu Thr Leu Trp Gln Ala Glu Lys

210 215 220

Gly Leu Val Trp Lys Gln Leu Val Asn Gly Leu Pro Pro Tyr Lys Glu

225 230 235 240

Ile Ser Val His Val Phe Tyr Arg Cys Gln Cys Thr Thr Val Glu Thr

245 250 255

Val Arg Glu Leu Thr Glu Phe Ala Lys Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ser

260 265 270

Leu Phe Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys Tyr Gly Val His Glu

275 280 285

Ala Ile Phe Ala Met Leu Ala Ser Ile Val Asn Lys Asp Gly Leu Leu

290 295 300

Val Ala Asn Gly Ser Gly Phe Val Thr Arg Glu Phe Leu Arg Ser Leu

305 310 315 320

Arg Lys Pro Phe Ser Asp Ile Ile Glu Pro Lys Phe Glu Phe Ala Val

325 330 335

Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp Leu Ala Leu Phe Ile

340 345 350

Ala Ala Ile Ile Leu Cys Gly Asp Arg Pro Gly Leu Met Asn Val Pro

355 360 365

Arg Val Glu Ala Ile Gln Asp Thr Ile Leu Arg Ala Leu Glu Phe His

370 375 380

Leu Gln Ala Asn His Pro Asp Ala Gln Tyr Leu Phe Pro Lys Leu Leu

385 390 395 400

Gln Lys Met Ala Asp Leu Arg Gln Leu Val Thr Glu His Ala Gln Met

405 410 415

Met Gln Arg Ile Lys Lys Thr Glu Thr Glu Thr Ser Leu His Pro Leu

420 425 430

Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp Met Tyr

435 440

Claims

1.一种PPARδ激活剂，其以胍衍生物或双胍衍生物作为有效成分，激活PPARδ(Peroxisome proliferator-activated receptorδ)的转录活性。

2.如权利要求1所述的PPARδ激活剂，其中，所述胍衍生物及所述双胍衍生物能够在胍基或双胍基与分别相当于构成PPARδ的配体结合口袋的内部表面的氨基酸残基中的人PPARδ的第413位的组氨酸、第287位的组氨酸、第253位的苏氨酸以及第437位的酪氨酸的氨基酸残基进行了氢键合的状态下嵌入所述配体结合口袋的内部。

3.如权利要求1或2所述的PPARδ激活剂，其中，所述胍衍生物是下列通式(1)所示的化合物，并且所述化合物不是双胍衍生物，

式(1)中，R¹表示一价有机基团。

4.如权利要求3所述的PPARδ激活剂，其中，所述胍衍生物是下列通式(1-1-1)～(1-1-4)中任意之一所示的化合物，

5.如权利要求1所述的PPARδ激活剂，其中，所述胍衍生物是下列式(A-1)～(A-4)、(B-1)～(B-3)

中任意之一所示的化合物。

6.如权利要求1至3中任一项所述的PPARδ激活剂，其中，所述双胍衍生物是下列通式(2)所示的化合物，

7.如权利要求1所述的PPARδ激活剂，其以选自二甲双胍、苯乙双胍以及丁双胍构成的组中的一种以上作为有效成分。

8.一种运动耐受性改善剂，其以权利要求1至7中任一项所述的PPARδ激活剂作为有效成分。