CN112899326A - 一种利用固定化酶制备具有抑菌活性的瓜皮果胶低聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用固定化酶制备具有抑菌活性的瓜皮果胶低聚糖的方法，包括原料预处理、活性炭固定化酶法制备具有抑菌活性的瓜皮果胶低聚糖及其分离纯化。具体步骤如下：瓜皮粉加入一定量活性炭固定化酶，水解得瓜皮果胶低聚糖粗品，通过层析柱进行分离纯化，得具有抑菌活性的果胶低聚糖；分离纯化最佳条件为：以大孔树脂为柱层析填料，经95%乙醇溶液淋洗得具有抑菌效果低聚糖组分。本发明采用固定化酶法制备的果胶低聚糖，对食品行业常见的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用。该制备过程条件温和且极易控制，所得低聚糖具有优异的功能活性，可作为防腐杀菌剂应用于保健品、食品、药品行业。
Description
技术领域
本发明涉及一种果胶低聚糖的制备方法，特别是涉及一种利用固定化酶制备具有抑菌活性的瓜皮果胶低聚糖的方法。
背景技术
我国地域辽阔，气候类型复杂多样，地形起伏大，物种多样性丰富，瓜果资源更是异常丰富，但是瓜果皮等副产物多数被直接丢弃，造成极大的资源浪费和较为严重的环境污染。而被丢弃的瓜类果皮中富含对人体健康有益的优质果胶，可通过其制备一种具有可提高机体的免疫调节能力、抗毒素、抗氧化及抗菌活性等显著优势的果胶低聚糖。因此对其展开相应研究，从而在节约资源、降低环境污染的同时，为食品、药品及保健品行业的添加剂和杀菌防腐剂的开发奠定良好的基础。
目前果胶低聚糖的制备方法主要有天然提取法，化学合成法，物理制备法和酶解法。酶解法制备果胶低聚糖是一种绿色环保的方法，而且制备条件温和、易于控制，是目前最常使用的果胶低聚糖的制备方法。
发明内容
针对现有功能性低聚糖的种类少，产量低，成本高等问题，本发明的目的在于提供一种利用固定化酶制备具有抑菌活性的瓜皮果胶低聚糖的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：一种利用固定化酶制备具有抑菌活性的瓜皮果胶低聚糖的方法，按照如下步骤完成：
（1）原料预处理
选择无霉变瓜皮废料如西瓜、籽瓜、甜瓜、哈密瓜，去瓤洗净，切碎，沸水中灭酶5min，沥干水分，烘干，粉碎得到瓜皮粉；
（2）活性炭固定化酶制备瓜皮果胶低聚糖
取一定量的瓜皮粉，加入pH 3.0～5.0的缓冲溶液，搅拌至完全溶解，加入一定量的活性炭固定化酶，在30～50℃恒温条件下水解60～240 min，分离出固定化酶，终止酶解反应；酶解液高速离心，取上清液浓缩，干燥，得淡黄色瓜皮果胶低聚糖粗品；通过滤纸片法测定不同条件酶解后的果胶低聚糖粗品的抑细菌活性，根据抑细菌活性强弱，确定具有最佳抑菌活性瓜皮果胶低聚糖的制备条件为在缓冲液PH为4.0、45℃水浴180min并通过乙醇：水=95：5的淋洗液淋洗；
（3）具有抑菌活性果胶低聚糖的分离纯化
将固定化酶法水解所得果胶低聚糖粗品通过层析柱分离纯化，以不同浓度乙醇溶液淋洗，收集淋洗液，浓缩，干燥，通过测定分离后低聚糖抑菌活性的强弱，确定最佳抑菌活性低聚糖的分离条件，在最佳分离条件下得具有抑菌活性的果胶低聚糖组分；分离纯化的最佳条件为：以大孔树脂为柱层析填料，经95%乙醇溶液淋洗所得的低聚糖组分具有最佳抑菌效果。
上述技术方案中：步骤（1）中灭酶后烘干温度为60℃。
上述技术方案中：步骤（2）中，提取果胶低聚糖时，料液比为1：15，搅拌时间为30min。
上述技术方案中：步骤（2）中加入瓜皮粉与活性炭固定化果胶酶比例为20：1。
上述技术方案中：步骤（2）和步骤（3）中，所述菌种为大肠杆菌与金黄色葡萄球菌。
上述技术方案中，瓜皮果胶低聚糖制备过程中加入水解酶为固定化果胶酶。
本发明具有以下优点：
1、原料易得，成本低廉，本方法使用的瓜皮为瓜果丢弃的废料，果胶酶价格较低，缓冲盐为简单、廉价、无毒、易得的化学试剂。
2、采用活性炭固定化果胶酶进行酶解反应，反应过程更易于控制、反应步骤简单，经固定化后的果胶酶可多次重复使用，极大的降低了生产成本。
3、反应条件温和，无需使用有毒有害溶剂，重复性好；反应过后的废液仅为乙醇水混合物，经蒸馏回收后可再次使用，对环境友好。
4、该果胶低聚糖的抑菌活性与抑菌类药物相比达到了类似水平，其具有较高的抑细菌活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为瓜皮果胶低聚糖、无菌水溶液、缓冲溶液及具有抑菌性能药物头孢氨苄的抑菌活性对比图。
图2为瓜皮果胶低聚糖不同细菌的生长曲线图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
最佳pH值测定实施例
原料预处理
选择无霉变瓜皮废料如西瓜、籽瓜、甜瓜、哈密瓜，去瓤洗净，切碎，沸水中灭酶5min，沥干水分，烘干，粉碎得到瓜皮粉。
活性炭固定化酶制备瓜皮果胶低聚糖
分别取5份瓜皮粉，加入100 mL pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的缓冲溶液配制及1.0 g活性炭固定化果胶酶，45℃条件下水浴反应180 min获得果胶低聚糖，分别测定相应条件下制备的果胶低聚糖的抑菌活性。
如表1所示，在pH为4.0时制备所得的瓜皮果胶低聚糖，对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌均具有最佳的抑制效果。
表1 不同 pH 制备瓜皮果胶低聚糖的抑菌活性
实施例2
最佳水解时间测定实施例
原料预处理
选择无霉变瓜皮废料如西瓜、籽瓜、甜瓜、哈密瓜，去瓤洗净，切碎，沸水中灭酶5min，沥干水分，烘干，粉碎得到瓜皮粉。
分别取5份瓜皮粉，加入100 mL pH为4.0的缓冲溶液及1.0g活性炭固定化果胶酶，45℃条件下分别水浴反应60 min、120 min，180 min、210 min、240 min获得果胶低聚糖，分别测定相应条件下制备的果胶低聚糖的抑菌活性。
如表2所示，在酶催化水解时间为180 min时制备所得的瓜皮果胶低聚糖，对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌均具有最佳的抑制效果。
表2 不同水解时间对瓜皮果胶低聚糖制备条件的影响
实施例3
最佳酶解温度测定实施例
原料预处理
选择无霉变瓜皮废料如西瓜、籽瓜、甜瓜、哈密瓜，去瓤洗净，切碎，沸水中灭酶5min，沥干水分，烘干，粉碎得到瓜皮粉。
分别取5份瓜皮粉，加入100 mL pH为4.0的缓冲溶液及1.0 g活性炭固定化果胶酶，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条件下水浴反应180 min获得果胶低聚糖，分别测定相应条件下制备的果胶低聚糖的抑菌活性。
如表3所示，在酶催化水解温度为45℃时制备所得的瓜皮果胶低聚糖，对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌均具有最佳的抑制效果。
表3 不同温度对瓜皮果胶低聚糖制备条件的影响
实施例4
最佳酶解淋洗液浓度测定实施例
原料预处理
选择无霉变瓜皮废料如西瓜、籽瓜、甜瓜、哈密瓜，去瓤洗净，切碎，沸水中灭酶5min，沥干水分，烘干，粉碎得到瓜皮粉。
具有抑菌活性果胶低聚糖组分的分离纯化
分别取10份瓜皮粉，加入100 mL pH为4.0的缓冲溶液及1.0g活性炭固定化果胶酶，45℃条件下水浴反应180 min获得果胶低聚糖，干燥，通过柱层析法，分别以乙醇：水比例为95：5、85：15、75：25、65：35、55： 45、45：55、35：65、25：75、15：85、5：95的淋洗液淋洗进行分离，收集淋洗液并测定其抑菌活性及具有抑菌活性的具体组分。
如表4所示，乙醇：水=95：5的淋洗液淋洗时，制备所得的瓜皮果胶低聚糖对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌均具有最佳的抑制效果。
表4 不同淋洗液组成对瓜皮果胶低聚糖抑菌活性的影响
实施例5
抑制细菌实验实施例
配制Luria-Bertani培养基（主要用于培养细菌），125℃高压灭菌30 min。平板培养基上均匀接种大肠杆菌与金黄色葡萄球菌，将直径5.5 mm的滤纸片，分别在低聚糖溶液、无菌水、pH=4的缓冲溶液及头孢氨苄溶液中浸泡60 min。每组做三个平行试验，贴片，37℃恒温培养箱中倒置培养12-16 h。取出测量各组抑菌圈直径，结果参见图1，图1a为大肠杆菌培养皿，图1b为金黄色葡萄球菌培养皿。
配制Luria-Bertani液体培养基（主要用于培养细菌），125℃高压灭菌30 min。液体培养基中接种大肠杆菌与金黄色葡萄球菌，试验组加入低聚糖溶液，对照组加入等量无菌水溶液。每组做三个平行试验，37℃恒温振荡水浴培养12 h。每隔2 h测定各组光密度值，确定其生长繁殖情况，结果参见图2，说明瓜皮果胶低聚糖在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的延滞期阻止其生长繁殖。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合低聚糖制备技术领域的市售产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (5)
1.一种利用固定化酶制备具有抑菌活性的瓜皮果胶低聚糖的方法，其特征在于：按照如下步骤完成：
（1）原料预处理
选择无霉变瓜皮废料如西瓜、籽瓜、甜瓜、哈密瓜，去瓤洗净，切碎，沸水中灭酶5 min，沥干水分，烘干，粉碎得到瓜皮粉；
（2）活性炭固定化酶制备瓜皮果胶低聚糖
取一定量的瓜皮粉，加入pH 3.0～5.0的缓冲溶液，搅拌至完全溶解，加入一定量的活性炭固定化酶，在30～50℃恒温条件下水解60～240 min，分离出固定化酶，终止酶解反应；酶解液高速离心，取上清液浓缩，干燥，得淡黄色瓜皮果胶低聚糖粗品；通过滤纸片法测定不同条件酶解后的果胶低聚糖粗品的抑细菌活性，根据抑细菌活性强弱，确定具有最佳抑菌活性瓜皮果胶低聚糖的制备条件为在缓冲液PH为4.0、45℃水浴180min并通过乙醇：水=95：5的淋洗液淋洗；
（3）具有抑菌活性果胶低聚糖的分离纯化
将固定化酶法水解所得果胶低聚糖粗品通过层析柱分离纯化，以不同浓度乙醇溶液淋洗，收集淋洗液，浓缩，干燥，通过测定分离后低聚糖抑菌活性的强弱，确定最佳抑菌活性低聚糖的分离条件，在最佳分离条件下得具有抑菌活性的果胶低聚糖组分；分离纯化的最佳条件为：以大孔树脂为柱层析填料，经95%乙醇溶液淋洗所得的低聚糖组分具有最佳抑菌效果。
2.根据权利要求1所述的一种利用固定化酶制备具有抑菌活性的瓜皮果胶低聚糖的方法，其特征在于：步骤（1）中灭酶后烘干温度为60℃。
3.根据权利要求1所述的一种利用固定化酶制备具有抑菌活性的瓜皮果胶低聚糖的方法，其特征在于：步骤（2）中，提取果胶低聚糖时，料液比为1：15，搅拌时间为30 min。
4.根据权利要求1所述的一种利用固定化酶制备具有抑菌活性的瓜皮果胶低聚糖的方法，其特征在于：步骤（2）中加入瓜皮粉与活性炭固定化果胶酶比例为20：1。
5.根据权利要求1所述的一种利用固定化酶制备具有抑菌活性的瓜皮果胶低聚糖的方法，其特征在于：所述菌种为大肠杆菌与金黄色葡萄球菌。
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| CN101214031A (zh) * | 2007-12-29 | 2008-07-09 | 王旭安 | 打瓜的综合利用及从打瓜中提取果胶的方法 |
| CN103382230A (zh) * | 2013-08-02 | 2013-11-06 | 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所 | 从西瓜皮提取果胶的方法 |
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| 俞敏等: "酶法制备不饱和果胶低聚糖及其抑菌活性研究" * |
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